WO2016136633A1 - 脱細胞化組織 - Google Patents

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WO2016136633A1
WO2016136633A1 PCT/JP2016/054911 JP2016054911W WO2016136633A1 WO 2016136633 A1 WO2016136633 A1 WO 2016136633A1 JP 2016054911 W JP2016054911 W JP 2016054911W WO 2016136633 A1 WO2016136633 A1 WO 2016136633A1
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decellularized
decellularized tissue
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淳 根岸
謙一郎 日渡
恭平 落合
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株式会社Adeka
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Definitions

  • the present invention relates to a decellularized tissue useful for regenerative medicine.
  • the degree of decellularization can be determined by the content of DNA in the decellularized tissue, and it is known that the smaller the DNA content in the decellularized tissue, the less likely the rejection reaction occurs (for example, non-patented Reference 1).
  • a method for decellularizing a living tissue a method using a surfactant (for example, see Patent Documents 1 and 2), a method using an enzyme (for example, see Patent Document 3), an oxidizing agent, and the like.
  • Patent Document 4 Method used (for example, see Patent Document 4), method by high hydrostatic pressure treatment (for example, see Patent Documents 5 to 7), method by freeze-thaw treatment (for example, see Patent Documents 8 to 9), hypertonic electrolyte
  • Patent Document 10 Method used (for example, see Patent Document 4), method by high hydrostatic pressure treatment (for example, see Patent Documents 5 to 7), method by freeze-thaw treatment (for example, see Patent Documents 8 to 9), hypertonic electrolyte
  • Patent Document 10 A method of treating with a solution (see, for example, Patent Document 10) is known.
  • JP-A-60-501540 Special table 2003-518981 gazette Japanese translation of PCT publication No. 2002-507907 Special table 2003-52562 gazette Japanese Patent Laid-Open No. 2004-094552 International Publication No. 2008/111530 Pamphlet Special table 2013-502275 gazette JP-A-2005-185507 JP 2005-21480 A JP 2010-2221012 A
  • tissue regeneration When using a decellularized tissue in regenerative medicine, in addition to not having a rejection reaction, whether or not tissue regeneration can be performed quickly becomes a problem.
  • Decellularized tissue obtained from biological tissue derived from the same organism even if it is a decellularized tissue from which cells have been removed to the same extent, if the decellularization method and procedure are different There may be differences in the rate of adhesion of host cells to decellularized tissue, the attractiveness of host cells, infiltration of host cells into decellularized tissue, etc., greatly affecting tissue regeneration .
  • the present invention has been made to solve the above-described problems, and an object of the present invention is to provide a decellularized tissue excellent in cell adhesion.
  • the present inventors have used a decellularized tissue with little change in endotherm in differential scanning calorimetry before and after decellularization of a living tissue.
  • the present invention has been completed by finding that it can be quickly reproduced. Specifically, the present invention provides the following.
  • a decellularized tissue obtained by decellularizing a living tissue A decellularized tissue, wherein a ratio of an endothermic amount per dry mass of a decellularized tissue with respect to a tissue derived from a living body before decellularization measured by differential scanning calorimetry is 0.70 or more.
  • a decellularized tissue excellent in cell adhesion is provided.
  • the decellularized tissue is expected to have a low cytotoxicity, a cell attracting effect and a differentiation inducing effect, and a high tissue regeneration effect.
  • the decellularized tissue of the present invention is characterized in that the endothermic amount measured by differential scanning calorimetry is not changed much compared to the tissue before decellularization.
  • the endothermic amount measured by differential scanning calorimetry is referred to as “DSC endothermic amount”.
  • DSC endothermic amount the endothermic amount measured by differential scanning calorimetry
  • endotherm is observed in the region of 55 to 70 ° C.
  • decellularized endothermic ratio The ratio of the endothermic amount per dry mass, measured by differential scanning calorimetry, of the decellularized tissue with respect to the biological tissue before decellularization.
  • the mass ratio of the amount of DNA per dry mass of the decellularized tissue to the tissue derived from the living body before decellularization is referred to as “decellularized DNA ratio”.
  • decellularized DNA ratio the mass ratio of the amount of DNA per dry mass of the decellularized tissue to the tissue derived from the living body before decellularization.
  • both the decellularized DNA ratio and the decellularized endothermic ratio It is based on the dry mass of the living tissue and its decellularized tissue.
  • the decellularized endothermic ratio of the decellularized tissue of the present invention is 0.70 or more, and when the decellularized endothermic ratio is lower than 0.70, cell attraction to the decellularized tissue or Cell differentiation induction is not sufficient, and regenerative treatment with decellularized tissue may be adversely affected.
  • the decellularization endothermic ratio is preferably 0.72 or more, more preferably 0.74 or more, and most preferably 0.77 or more. It is preferable that the decellularized endothermic ratio is 0.77 or more because cell adhesion to a decellularized tissue is particularly easily enhanced.
  • the upper limit value of the decellularized endothermic ratio is not particularly limited, but when it is 1.3 or less, preferably 1.27 or less, more preferably 1.25 or less, and most preferably 1.23 or less, the decellularized tissue This is preferable in that cell attractability and cell differentiation induction are likely to be favorable.
  • the decellularized endothermic ratio When calculating the decellularized endothermic ratio, after performing differential scanning calorimetry, the dry mass of the sample used for the measurement is measured, the DSC endothermic amount per dry mass is calculated, and before decellularization The decellularized endothermic ratio may be calculated from the DSC endothermic amount per dry mass of the decellularized tissue with respect to the DSC endothermic amount per dry mass of the tissue. “Drying the sample” means drying the sample until the water content in the sample becomes 5% by mass or less. The means for drying the sample is not particularly limited, and examples include the method performed in Examples.
  • the present inventors assumed that the cell attracting effect and differentiation inducing effect of the decellularized tissue correlate with the collagen content of the decellularized tissue, but there is not necessarily a correlation, and the collagen content is There is a decellularized tissue that has a low cell attracting effect and a low differentiation inducing effect even if it is high, a cell adhesion property of the decellularized tissue, a cell attracting effect, a differentiation inducing effect, and a DSC endothermic amount of the decellularized tissue We found that there can be a correlation between
  • collagen in living tissue has a triple helical structure called a collagen helix.
  • the present inventors show that the endotherm in the region of 55 to 70 ° C. of living tissue or decellularized tissue is due to the cleavage of hydrogen bond between collagen and collagen or collagen and coordination water of collagen having a triple helical structure. Therefore, it is presumed that the DSC endothermic amount of the decellularized tissue correlates with the content of collagen having a triple helical structure, not the collagen content of the decellularized tissue. Furthermore, the present inventors presume that a decellularized tissue having a triple-helical structure and a higher collagen content, which has a structure similar to that of collagen in living tissue, has a higher cell attracting effect and differentiation inducing effect. Yes.
  • the decellularized tissue has a low DNA content.
  • the decellularized DNA ratio is preferably 0.300 or less.
  • the decellularized DNA ratio of the decellularized tissue of the present invention is preferably 0.200 or less, more preferably 0.150 or less, most preferably 0.080 or less, 0.005 or less is particularly preferable. It is preferable that the decellularized DNA ratio is 0.080 or less because cell adhesion to a decellularized tissue is particularly easy to improve.
  • the lower limit of the decellularized DNA ratio is preferably as low as possible, and is preferably 0.001 or more, more preferably 0.002 or more for ease of realization.
  • the biological tissue used for the decellularized tissue of the present invention is not particularly limited as long as it is a vertebrate-derived biological tissue. However, since there are few rejection reactions, a biological tissue derived from mammals or birds is preferable and is easily available. In view of this, a living tissue derived from a mammal, a bird or a human is more preferable.
  • Mammalian livestock includes cattle, horses, camels, llamas, donkeys, yaks, sheep, pigs, goats, deer, alpaca, dogs, raccoons, weasels, foxes, cats, rabbits, hamsters, guinea pigs, rats, mice, squirrels, Raccoon etc. are mentioned.
  • avian livestock examples include parakeets, parrots, chickens, ducks, turkeys, geese, guinea fowls, pheasants, ostriches, quails, and emu.
  • bovine, porcine, rabbit, and human biological tissues are preferable from the viewpoint of availability.
  • a part having a matrix structure outside the cell can be used, and as such a part, for example, liver, kidney, ureter, bladder, urethra, tongue, tonsils, esophagus, stomach, small intestine, Examples include large intestine, anus, pancreas, heart, blood vessel, spleen, lung, brain, bone, spinal cord, cartilage, testis, uterus, fallopian tube, ovary, placenta, cornea, skeletal muscle, tendon, nerve, skin and the like.
  • cartilage, bone, liver, kidney, heart, pericardium, blood vessel, skin, small intestine submucosa, lung, brain, and spinal cord are preferable because of the high tissue regeneration effect.
  • the method for obtaining the decellularized tissue of the present invention is not particularly limited as long as it is a decellularization method in which the decellularized endothermic ratio is 0.7 to 1.3.
  • Preferred methods for obtaining the decellularized tissue of the present invention include, for example, a method by high hydrostatic pressure treatment, a method by freeze-thaw treatment, etc., and it is easy to lower the decellularized DNA ratio.
  • a method by high hydrostatic pressure treatment is preferred.
  • the high hydrostatic pressure treatment of the biological tissue is preferably performed in a cleaning solution containing a surfactant.
  • the content of the surfactant varies depending on the biological tissue to be washed and the type of the surfactant, but is preferably 0.01% by mass or more and 2.00% by mass or less, and 0.03% by mass or more and 1. 00 mass% or less is still more preferable, 0.05 mass% or more and 0.50 mass% or less are the most preferable.
  • a nucleolytic enzyme and a surfactant are used for washing a tissue derived from a living body to which a high hydrostatic pressure is applied, the washing effect can be improved. If a nucleolytic enzyme is used after using a cleaning solution containing a surfactant, the cleaning effect can be further increased.
  • a hydrostatic pressure of 50 to 1500 MPa is applied to the living body-derived tissue in a medium.
  • the applied hydrostatic pressure is lower than 50 MPa, decellularization may be insufficient, and damage to the tissue in the process of washing with a washing solution containing a surfactant after high hydrostatic pressure treatment is increased.
  • the pressure exceeds 1500 MPa, a pressure vessel that can withstand application is required, and enormous energy is required.
  • the medium used for application is an aqueous medium, ice is generated, and the tissue is damaged by the generated ice.
  • the applied hydrostatic pressure is preferably 80 to 1300 MPa, more preferably 90 to 1200 MPa, and most preferably 95 to 1100 MPa.
  • Examples of the medium used for applying the hydrostatic pressure include water, physiological saline, propylene glycol or an aqueous solution thereof, glycerin or an aqueous solution thereof, and an aqueous saccharide solution.
  • Examples of the buffer solution include acetate buffer solution, phosphate buffer solution, citrate buffer solution, borate buffer solution, tartaric acid buffer solution, Tris buffer solution, HEPES buffer solution, MES buffer solution and the like.
  • saccharide in the aqueous saccharide solution examples include erythrose, xylose, arabinose, allose, talose, glucose, mannose, galactose, erythritol, xylitol, mannitol, sorbitol, galactitol, sucrose, lactose, maltose, trehalose, dextran, alginic acid, hyaluronic acid, etc. Can be mentioned.
  • the temperature of the high hydrostatic pressure treatment is not particularly limited as long as no ice is generated and the tissue is not damaged by heat, but it is 0 to 0 because the decellularization treatment is performed smoothly and the tissue is less affected. 45 ° C is preferable, 4-37 ° C is more preferable, and 15-35 ° C is most preferable. If the time for the high hydrostatic pressure treatment is too short, cells are not sufficiently destroyed, and if it is long, energy is wasted. Therefore, the time for maintaining the target applied pressure in the high hydrostatic pressure treatment is 5 to 60 minutes is preferable, and 7 to 30 minutes is more preferable.
  • the cleaning liquid may be the same as or different from the medium for the high hydrostatic pressure treatment.
  • the cleaning liquid preferably contains a nucleolytic enzyme, an organic solvent, or a chelating agent. Nucleolytic enzymes can improve the removal efficiency of nucleic acid components from living tissues to which hydrostatic pressure is applied, organic solvents are lipids, and chelating agents can reduce calcium ions and magnesium ions in decellularized tissues. By inactivation, calcification when the particulate decellularized tissue of the present invention is applied to a diseased part can be prevented.
  • a water-soluble organic solvent is preferable because it has a high effect of removing lipids, and ethanol, isopropanol, acetone, and dimethyl sulfoxide are preferable.
  • Chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), diethylenetriminepentaacetic acid (DTPA), hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid (HEDTA), triethylenetetraminehexaacetic acid (TTHA), 1,3-propane Diamine tetraacetic acid (PDTA), 1,3-diamino-2-hydroxypropanetetraacetic acid (DPTA-OH), hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA), dihydroxyethylglycine (DHEG), glycol ether diamine tetraacetic acid (GEDTA), Iminocarboxylic acid-based chelating agents such as dicarboxymethylglutamic acid (
  • the cleaning liquid may contain a surfactant.
  • Surfactants include fatty acid soap, alkoxy carboxylate, polyoxyethylene alkoxy carboxylate, alkyl sulfonate, alkyl benzene sulfonate, alkyl sulfate ester salt, polyoxyethylene alkyl sulfate ester salt, alkyl phosphoric acid Anionic surfactants such as ester salts, ⁇ -sulfo fatty acid ester salts, N-acyl glutamate salts, acyl-N-methyl taurate salts, N-alkyl sarcosine salts, cholate salts, deoxycholate salts;
  • Cationic surfactants such as alkyldimethylamine, alkyldiethanolamine, alkyltrimethylammonium salt, dialkyldimethylammonium salt, alkylpyridium salt, alkylbenzyldimethylammonium salt;
  • Glycerin fatty acid ester sorbitan fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, trehalose fatty acid ester, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, poly Oxyethylene polyoxypropylene ether, alkyl (poly) glycerin ether, fatty acid alkanolamide, polyoxyethylene fatty acid alkanolamide, alkyl (poly) glycoside, alkylmaltoside, alkylthioglucoside, alkylmaltopyranoside, alkanoyl-N-methyl- D-glucosamine, N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) coleamide (B GCHAP), N, N- bis (3-D-gluconic acid amidopropyl) deoxycholic amide (the deoxy-B
  • Surfactants include alkyl sulfonates, alkyl sulfate esters, polyoxyethylene alkyl sulfate esters, ⁇ -sulfo fatty acid ester salts, polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene alkyl phenyl ethers in terms of cell removal.
  • Alkyl (poly) glycosides are preferred, and alkyl sulfonates, polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene alkyl phenyl ethers, and alkyl (poly) glycosides are more preferred.
  • the temperature when washing a biological tissue to which a high hydrostatic pressure is applied is not particularly limited as long as it does not damage the tissue due to heat, but it is 0 to 0 because it has good detergency and little influence on the tissue. 45 ° C is preferable, 1 to 40 ° C is more preferable, and 2 to 35 ° C is most preferable.
  • the washing solution may be shaken or stirred as necessary.
  • the tissue derived from a living body is kept at a temperature of ⁇ 80 to ⁇ 20 ° C., preferably ⁇ 80 to ⁇ 40 ° C. for 1 to 48 hours, preferably 10 to
  • the step of freezing by holding for 30 hours and then thawing at a temperature of 20 to 37 ° C. is repeated once or twice or more, preferably 2 to 5 times.
  • the cleaning method may be the same method as the cleaning in the high hydrostatic pressure treatment.
  • the measurement of the decellularized DNA ratio and the decellularized endothermic ratio is excellent as a method for selecting a decellularized tissue excellent in host cell attraction, adhesion, infiltration, etc.
  • a step of confirming that the mass ratio of the amount of DNA per dry mass of the decellularized tissue to the living tissue before decellularization is 0.3 or less (that is, the decellularized DNA ratio is 0.3 or less)
  • the ratio of the endothermic amount per dry mass, measured by differential scanning calorimetry, of the decellularized tissue relative to the biological tissue before decellularization is 0.7 to 1.3
  • a step for confirming the existence that is, a step for confirming that the decellularization endothermic ratio is 0.7 to 1.3
  • a good decellularized tissue can be obtained.
  • the step of confirming that the decellularized DNA ratio is 0.3 or less and the step of confirming that the decellularized endothermic ratio is 0.7 to 1.3 are the steps of washing the decellularized tissue. It is preferably after, and when there is a step of sterilizing or sterilizing the decellularized tissue, it is preferably after the step of washing the decellularized tissue and before the step of sterilizing or sterilizing.
  • the decellularized tissue of the present invention may be applied alone, or may be applied together with other components that have a regeneration / healing effect on a disease site.
  • other components include growth factors, proteoglycans or glycosaminoglycans, cells, ⁇ -1,3-glucan, mevalonic acid and the like.
  • Growth factors include insulin-like growth factor (IGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), acidic fibroblast growth factor (aFGF), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), transforming growth factor (TGF- ⁇ ), bone morphogenetic protein (BMP), platelet-derived growth factor (PDGF), keratinocyte growth factor (KGF), epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), hematopoietic promoter ( EPO), granule macrophage growth factor (GM-CSF), granule cell growth factor (G-CSF), nerve cell growth factor (NGF), heparin binding (EGF) and the like.
  • IGF insulin-like growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • aFGF acidic fibroblast growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • TGF- ⁇ transforming growth factor
  • BMP bone morphogenetic protein
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • KGF epi
  • proteoglycan or glycosaminoglycan examples include chondroitin sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparin and the like.
  • the decellularized tissue of the present invention may be used for transplantation as it is, or may be used after seeding and culturing cells.
  • the decellularized tissue of the present invention may be cut, sliced, pulverized and processed into a sheet, granular, fine powder, gel or the like.
  • the decellularized tissue is a sheet, May be used in combination with decellularized tissues or in combination with other sheet-like tissue, or may be processed into a tubular shape.
  • a decellularized tissue having an excellent cell attracting effect is provided.
  • the cell attracting effect of the decellularized tissue can be evaluated by subjecting the decellularized tissue to a cell adhesion test by the method described in the Examples.
  • Example 1 A sheet-like intima (hereinafter referred to as “intimal sheet”) collected by cutting a porcine aorta into a bag with polyethylene chuck, and physiological saline as a medium for high hydrostatic pressure treatment Then, a hydrostatic pressure of 100 MPa was applied for 15 minutes using a high-pressure treatment apparatus for research and development (manufactured by Kobe Steel, trade name: Dr. CHEF). After washing the inner membrane sheet treated with high hydrostatic pressure in physiological saline containing 20 ppm DNase as a nucleolytic enzyme by shaking at 4 ° C. for 96 hours, and further shaking in 80% ethanol at 4 ° C. for 72 hours. The decellularized tissue of Example 1 was obtained by shaking in physiological saline at 4 ° C. for 2 hours.
  • intimal sheet A sheet-like intima (hereinafter referred to as “intimal sheet”) collected by cutting a porcine aorta into a bag with polyethylene chuck, and physiological
  • Example 2 In Example 1, a decellularized tissue of Example 2 was obtained by performing the same operation as in Example 1 except that the shaking time in physiological saline containing 20 ppm of DNase was changed from 96 hours to 8 hours.
  • Example 3 The inner membrane sheet was frozen with dry ice, stored in a cold box (about ⁇ 78 ° C.) containing dry ice for 20 hours, and then melted at 25 ° C.
  • the inner membrane sheet obtained by repeating this freeze-thaw three times was subjected to an enzyme treatment by shaking for 96 hours at 4 ° C. in physiological saline containing 20 ppm of DNase as a nucleolytic enzyme, and further 72% at 4 ° C. in 80% ethanol. After shaking for 4 hours, the cells were shaken in physiological saline at 4 ° C. for 2 hours to obtain the decellularized tissue of Example 3.
  • Example 4 The inner membrane sheet was decellularized by shaking at 25 ° C. for 96 hours in physiological saline containing 0.1% by mass of sodium dodecylsulfonate (hereinafter, SDS). After the SDS-treated inner membrane sheet was shaken in physiological saline containing 20 ppm of DNase as a nucleolytic enzyme at 4 ° C. for 96 hours, and further shaken in 80% ethanol at 4 ° C. for 72 hours, The decellularized tissue of Example 4 was obtained by shaking in saline at 4 ° C. for 2 hours.
  • SDS sodium dodecylsulfonate
  • Example 5 In the same manner as in Example 1, a hydrostatic pressure of 1000 MPa was applied to the inner membrane sheet for 15 minutes.
  • the inner membrane sheet subjected to high hydrostatic pressure treatment was shaken at 25 ° C. for 8 hours in physiological saline containing 0.1% by mass sodium dodecylsulfonate (hereinafter, SDS), and then contained 20 ppm of DNase as a nucleolytic enzyme. Washed by shaking in physiological saline at 25 ° C. for 24 hours. Furthermore, after shaking in 80% ethanol at 4 ° C. for 72 hours, it was shaken in physiological saline at 4 ° C. for 2 hours to obtain the decellularized tissue of Example 5.
  • SDS sodium dodecylsulfonate
  • Example 6 In Example 5, the decellularized tissue of Example 6 was obtained by performing the same operation as in Example 5 except that the hydrostatic pressure in the high hydrostatic pressure treatment was changed from 1000 MPa to 400 MPa.
  • Example 7 the decellularized tissue of Example 6 was obtained by performing the same operation as in Example 5 except that the hydrostatic pressure in the high hydrostatic pressure treatment was changed from 1000 MPa to 600 MPa.
  • Example 8 In Example 1, the decellularized tissue of Example 8 was obtained by performing the same operation as in Example 1 except that the hydrostatic pressure in the high hydrostatic pressure treatment was changed from 100 MPa to 600 MPa.
  • Example 4 a decellularized tissue of Comparative Example 1 was obtained by performing the same operation as in Example 4 except that the concentration of SDS was changed from 0.1% by mass to 1% by mass.
  • Example 4 the physiological saline containing 0.1% by mass of SDS was changed to a physiological saline containing 1% by mass of Triton X-100 (polyoxyethylene octylphenyl ether: hereinafter referred to as TX). The same operation as in Example 4 was performed to obtain a decellularized tissue of Comparative Example 2.
  • Triton X-100 polyoxyethylene octylphenyl ether
  • Comparative Example 3 In Comparative Example 2, a decellularized tissue of Comparative Example 3 was obtained by performing the same operation as Comparative Example 3 except that the TX concentration was changed from 1% by mass to 0.1% by mass.
  • Comparative Example 4 The inner membrane sheet was subjected to ultrasonic treatment (intensity: 10 W / cm 2 , frequency: 10 kHz, action time: 2 minutes) in physiological saline. With respect to the ultrasonically treated inner membrane sheet, the same operation as in Comparative Example 2 was performed to obtain a decellularized tissue of Comparative Example 4.
  • Comparative Example 5 In Comparative Example 4, a decellularized tissue of Comparative Example 5 was obtained by performing the same operation as Comparative Example 5 except that the TX concentration was changed from 1% by mass to 0.1% by mass.
  • DNA content per dry mass of the test piece was calculated.
  • the decellularized DNA ratio was calculated from the ratio of the DNA content of the dry test piece of the inner membrane sheet and the DNA content of the dry test piece of the decellularized tissue. The results are shown in Table 1.
  • (Decellularized DNA ratio) (DNA content of dry test piece of decellularized tissue) / (DNA content of dry test piece of inner membrane sheet)
  • the endothermic amounts of the living tissue before decellularization, the decellularized tissues of Examples 1 and 4 and the decellularized tissue of Comparative Example 2 are shown in FIGS.
  • the sample pan after measuring the endotherm is punctured, stored in a thermostat at 60 ° C for 12 hours and dried, then the mass of the sample pan containing the dried test piece is measured, and tested according to the following formula The endothermic amount per dry mass of the piece was calculated.
  • (Endothermic amount per dry mass of test piece) (Endothermic amount) / ⁇ (Mass of sample pan containing dried test piece) ⁇ (Mass of sample pan) ⁇
  • Non-adherent cells were washed and removed from the test piece using phosphate buffered saline, and then the test piece was stained with Wst-8 (manufactured by Dojindo Laboratories), and the absorbance at 450 nm was measured. Separately, the number of NHDF and a calibration curve when stained with Wst-8 were prepared, and the number of NHDF adhering to the test piece was calculated from the absorbance of the test piece and the calibration curve. The results are shown in Table 1.
  • Examples 9 to 12 show production examples of the decellularized tissue of the present invention for biological tissues other than the porcine aortic intimal sheet used in Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 6. Comparative production examples are shown in Comparative Examples 7 to 10. All of the decellularized tissues of Examples had a higher cell adhesion number than the decellularized tissues of Comparative Examples, and were excellent in the cell attracting effect.
  • Example 9 In Example 8, the same operation as in Example 8 was performed except that the porcine aorta itself was used instead of the sheet-like intima (intimal sheet) collected by opening the porcine aorta. Decellularized tissue was obtained. The decellularized DNA ratio and the decellularized endothermic ratio of the obtained decellularized tissue were calculated by the above method. The results are shown in Table 2.
  • Example 10 In Example 8, the same operation as in Example 8 was performed except that porcine skin (including dermis) was used instead of the sheet-like intima (intimal sheet) collected by opening the porcine aorta.
  • porcine skin including dermis
  • the decellularized tissue of Example 10 was obtained.
  • the decellularized DNA ratio and the decellularized endothermic ratio of the obtained decellularized tissue were calculated by the above method. The results are shown in Table 2.
  • Example 11 In Example 8, the same operation as in Example 8 was performed except that porcine pericardium was used instead of the sheet-like intima (intimal sheet) collected by cutting open the porcine aorta. Decellularized tissue was obtained. The decellularized DNA ratio and the decellularized endothermic ratio of the obtained decellularized tissue were calculated by the above method. The results are shown in Table 2.
  • Example 12 In Example 8, instead of the sheet-like intima (intimal sheet) collected by opening the porcine aorta, a sheet-like intima collected by opening the bovine aorta was used. The same operation was performed to obtain the decellularized tissue of Example 12. The decellularized DNA ratio and the decellularized endothermic ratio of the obtained decellularized tissue were calculated by the above method. The results are shown in Table 2.
  • Comparative Example 7 In Comparative Example 1, the same operation as in Comparative Example 1 was carried out except that the porcine aorta itself was used instead of the sheet-like intima (intimal sheet) collected by opening the porcine aorta. Decellularized tissue was obtained. The decellularized DNA ratio and the decellularized endothermic ratio of the obtained decellularized tissue were calculated by the above method. The results are shown in Table 2.
  • Comparative Example 8 In Comparative Example 1, the same operation as in Comparative Example 1 was performed except that porcine skin (including the dermis) was used instead of the sheet-like intima (intimal sheet) collected by opening the porcine aorta. The decellularized tissue of Comparative Example 8 was obtained. The decellularized DNA ratio and the decellularized endothermic ratio of the obtained decellularized tissue were calculated by the above method. The results are shown in Table 2.
  • Comparative Example 9 In Comparative Example 1, the same operation as in Comparative Example 1 was performed except that porcine pericardium was used instead of the sheet-like intima (intimal sheet) collected by opening the porcine aorta. Decellularized tissue was obtained. The decellularized DNA ratio and the decellularized endothermic ratio of the obtained decellularized tissue were calculated by the above method. The results are shown in Table 2.
  • Comparative Example 10 In Comparative Example 1, instead of the sheet-like intima (intimal sheet) collected by opening the porcine aorta, a sheet-like intima collected by opening the bovine aorta was used, and Comparative Example 1 and The same operation was performed to obtain a decellularized tissue of Comparative Example 10. The decellularized DNA ratio and the decellularized endothermic ratio of the obtained decellularized tissue were calculated by the above method. The results are shown in Table 2.

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Abstract

　本発明の課題は、細胞接着性に優れる脱細胞化組織を提供することである。本発明は、生体由来組織を脱細胞化した脱細胞化組織であって、脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、示差走査熱量測定により測定される、乾燥質量あたりの吸熱量の比が０．７０以上であることを特徴とする脱細胞化組織を提供する。脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織は、乾燥質量あたりのＤＮＡ量の質量比が０．３００以下であってもよい。

Description

脱細胞化組織
　本発明は、再生医療に有用な脱細胞化組織に関する。
　他人や異種の動物の生体組織由来の移植片を移植する場合、被移植者側組織による移植片の拒絶反応が問題となる。このような問題の解決方法として、人工組織の開発が期待されている。素材として種々の高分子が試されているが、これら素材と生体組織との適合性が低いため、移植片と生体組織との接合部位における脱落や感染症が発生する場合がある。そこで、生体組織との適合性を向上すべく、生体組織から細胞を除却して残存する支持組織である脱細胞化生体組織を移植片として使用する技術が開発されてきた。脱細胞化の程度は、脱細胞化組織中のＤＮＡの含量により判断することができ、脱細胞化組織中のＤＮＡ含量が少ないほど拒絶反応が起こりにくいことが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。また、生体組織を脱細胞化する方法としては、界面活性剤を使用する方法（例えば、特許文献１、２を参照）、酵素を使用する方法（例えば、特許文献３を参照）、酸化剤を使用する方法（例えば、特許文献４を参照）、高静水圧処理による方法（例えば、特許文献５～７を参照）、凍結融解処理による方法（例えば、特許文献８～９を参照）、高張電解質溶液で処理する方法（例えば、特許文献１０を参照）等が知られている。
特開昭６０－５０１５４０号公報 特表２００３－５１８９８１号公報 特表２００２－５０７９０７号公報 特表２００３－５２５０６２号公報 特開２００４－０９４５５２号公報 国際公開第２００８／１１１５３０号パンフレット 特表２０１３－５０２２７５号公報 特開２００５－１８５５０７号公報 特開２００５－２１１４８０号公報 特開２０１０－２２１０１２号公報
Ｔ．　Ｗ．　Ｇｉｌｂｅｒｔ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　ｏｆ　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１５２．１　（２００９）　１３５－１３９
　再生医療において脱細胞化組織を使用する場合には、拒絶反応がないことに加えて、組織の再生が速やかに行えるかどうかが問題になる。同一の生体に由来する生体組織から得られた脱細胞化組織であって、同様の程度まで細胞が除去された脱細胞化組織であっても、脱細胞化の方法や手順が異なる場合には、脱細胞化組織への宿主細胞の接着性、宿主細胞の誘引効果、脱細胞化組織内への宿主細胞の浸潤等の速度に違いがでる場合があり、組織の再生に大きな影響があった。
　本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、細胞接着性に優れる脱細胞化組織を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、生体由来組織の脱細胞化の前後の示差走査熱量測定における吸熱量の変化が少ない脱細胞化組織を使用した場合に、組織が速やかに再生されることを見出し、本発明を完成させた。具体的には、本発明は下記のものを提供する。
　（１）　生体由来組織を脱細胞化した脱細胞化組織であって、
　脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、示差走査熱量測定により測定される、乾燥質量あたりの吸熱量の比が０．７０以上であることを特徴とする脱細胞化組織。
　（２）　脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、乾燥質量あたりのＤＮＡ量の質量比が０．３００以下であることを特徴とする（１）に記載の脱細胞化組織。
　本発明によれば、細胞接着性に優れる脱細胞化組織が提供される。該脱細胞化組織は、細胞毒性が低く、細胞の誘引効果や分化誘導効果を有し、組織の再生効果が高いことが期待される。
脱細胞化前の生体由来組織のＤＳＣ吸熱量を示す図である。 実施例１の脱細胞化組織のＤＳＣ吸熱量を示す図である。 実施例４の脱細胞化組織のＤＳＣ吸熱量を示す図である。 比較例２の脱細胞化組織のＤＳＣ吸熱量を示す図である。
　以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本発明の脱細胞化組織は、脱細胞化前の組織と比較して、示差走査熱量測定により測定される吸熱量があまり変化していないところに特徴がある。以下、本明細書では、示差走査熱量測定により測定される吸熱量を「ＤＳＣ吸熱量」という。生体由来組織やその脱細胞化組織では、５５～７０℃の領域で吸熱がみられる。脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、示差走査熱量測定により測定される、乾燥質量あたりの吸熱量の比を「脱細胞化吸熱量比」という。また、脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、乾燥質量あたりのＤＮＡ量の質量比を「脱細胞化ＤＮＡ比」という。なお、生体由来組織や脱細胞化組織は、水分の吸収や乾燥により、質量が変化することがあることから、本発明では、脱細胞化ＤＮＡ比及び脱細胞化吸熱量比を、いずれも、生体由来組織及びその脱細胞化組織の乾燥質量を基準にしている。
〔脱細胞化吸熱量比〕
　本発明の脱細胞化組織の脱細胞化吸熱量比は、０．７０以上であり、脱細胞化吸熱量比が０．７０よりも低い場合には、脱細胞化組織への細胞誘引性や細胞の分化誘導性が十分ではなく、脱細胞化組織による再生治療に悪影響がでる場合がある。脱細胞化吸熱量比は０．７２以上が好ましく、０．７４以上が更に好ましく、０．７７以上が最も好ましい。脱細胞化吸熱量比が０．７７以上であると、脱細胞化組織への細胞接着性を特に高めやすい点で好ましい。
　脱細胞化吸熱量比の上限値は特に限定されないが、１．３以下、好ましくは１．２７以下、更に好ましくは１．２５以下、最も好ましくは１．２３以下であると、脱細胞化組織への細胞誘引性や細胞の分化誘導性が良好となりやすい点で好ましい。
　脱細胞化吸熱量比を算出する場合には、示差走査熱量測定を行った後、測定に用いたサンプルの乾燥質量を測定して、乾燥質量あたりのＤＳＣ吸熱量を算出し、脱細胞化前の組織の乾燥質量あたりのＤＳＣ吸熱量に対する、脱細胞化組織の乾燥質量あたりのＤＳＣ吸熱量から、脱細胞化吸熱量比を算出すればよい。なお、「サンプルを乾燥する」とは、サンプル中の水分含量が５質量％以下となるまでサンプルを乾燥させることをさす。サンプルを乾燥させる手段としては特に限定されないが、実施例で行った方法等が挙げられる。
（乾燥質量あたりのＤＳＣ吸熱量）＝（未乾燥試料のＤＳＣ吸熱量）×（乾燥後の試料の質量／（乾燥前の試料の質量））
（脱細胞化吸熱量比）＝（脱細胞化組織の乾燥質量あたりのＤＳＣ吸熱量）／（脱細胞化前の組織の乾燥質量あたりのＤＳＣ吸熱量）
　生体由来組織の示差走査熱量測定における５５～７０℃の領域の吸熱は組織中のコラーゲンの熱変形によるものと考えられる。コラーゲンは細胞外マトリクスの主成分であるが、生体由来組織中のすべてのコラーゲンが脱細胞化組織に保持されるとは限らず、脱細胞化する過程で、コラーゲンの一部が脱離する場合がある。本発明者らは、脱細胞化組織の、細胞の誘引効果や分化誘導効果は、脱細胞化組織のコラーゲンの含量と相関するものと想定していたが、必ずしも相関はなく、コラーゲンの含量が高くても細胞の誘引効果や分化誘導効果が低い脱細胞化組織があることや、脱細胞化組織の細胞接着性、細胞の誘引効果、及び分化誘導効果と、脱細胞化組織のＤＳＣ吸熱量との間に相関があり得ることを見出した。
　生体組織中のコラーゲンはコラーゲンヘリックスと呼ばれる３重螺旋構造を有することが知られている。本発明者らは、生体由来組織や脱細胞化組織の５５～７０℃の領域の吸熱は、３重螺旋構造をとるコラーゲンの、コラーゲンとコラーゲン又はコラーゲンと配位水との水素結合の開裂によるものであり、脱細胞化組織のＤＳＣ吸熱量は、脱細胞化組織のコラーゲンの含量ではなく、３重螺旋構造をとるコラーゲンの含量と相関するものと推定している。更に、本発明者らは、生体組織中のコラーゲンと同様の構造である、３重螺旋構造をとるコラーゲン含量が高い脱細胞化組織ほど、細胞の誘引効果や分化誘導効果が高いと推定している。
〔脱細胞化ＤＮＡ比〕
　一般に脱細胞化組織のＤＮＡ含量は少ないことが好ましいとされているが、本発明の脱細胞化組織では、脱細胞化ＤＮＡ比は、０．３００以下であることが好ましい。脱細胞化ＤＮＡ比が０．３００を超える場合は、再生医療に使用した場合に拒絶反応が発生する場合がある。細胞の誘引効果や分化誘導効果の点から、本発明の脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比は、０．２００以下が好ましく、０．１５０以下が更に好ましく、０．０８０以下が最も好ましく、０．００５以下が特に好ましい。脱細胞化ＤＮＡ比が０．０８０以下であると、脱細胞化組織への細胞接着性を特に高めやすい点で好ましい。
　脱細胞化ＤＮＡ比の下限は、低いほど好ましく、実現のしやすさから好ましくは０．００１以上、更に好ましくは０．００２以上である。
　脱細胞化ＤＮＡ比を求めるためのＤＮＡ含量の測定方法は特に限定されず、公知の方法によればよく、例えば、タンパク質部分を酵素等で分解除去した後、ＤＮＡと特異的に結合する蛍光試薬組織を反応させて、蛍光強度を測定する方法（例えば、非特許文献１を参照）等により測定することができる。脱細胞化ＤＮＡ比は、乾燥質量を基準にした比であるから、ＤＮＡ含量の測定は組織を乾燥させてから行うことが好ましい。
（脱細胞化ＤＮＡ比）＝（乾燥した脱細胞化組織のＤＮＡ含量）／（乾燥した脱細胞化前の組織のＤＮＡ含量）
　しかし、脱細胞化組織を乾燥してからＤＮＡ含量を測定する場合は、測定値の誤差が大きくなる場合があることから、別途乾燥前後の組織の質量の比（乾燥減量比）を測定しておき、未乾燥の状態で測定したＤＮＡ含量をこの乾燥減量比で補正して算出してもよい。
（乾燥減量比）＝（乾燥後の質量）／（乾燥前の質量）
（乾燥した組織のＤＮＡ含量）＝（未乾燥の組織のＤＮＡ含量）／（乾燥減量比）
〔生体組織〕
　本発明の脱細胞化組織に使用する生体組織は、脊椎動物由来の生体組織であれば、特に限定されないが、拒絶反応が少ないことから、哺乳類又は鳥類由来の生体組織が好ましく、入手が容易であることから、哺乳類の家畜、鳥類の家畜又はヒト由来の生体組織が更に好ましい。哺乳類の家畜としては、ウシ、ウマ、ラクダ、リャマ、ロバ、ヤク、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、アルパカ、イヌ、タヌキ、イタチ、キツネ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス、リス、アライグマ等が挙げられる。また、鳥類の家畜としては、インコ、オウム、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ガチョウ、ホロホロ鳥、キジ、ダチョウ、ウズラ、エミュー等が挙げられる。これらの中でも、入手の安定性から、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒトの生体組織が好ましい。
　生体組織の部位としては、細胞外にマトリクス構造を持った部位が使用でき、このような部位としては、例えば、肝臓、腎臓、尿管、膀胱、尿道、舌、扁桃、食道、胃、小腸、大腸、肛門、膵臓、心臓、血管、脾臓、肺、脳、骨、脊髄、軟骨、精巣、子宮、卵管、卵巣、胎盤、角膜、骨格筋、腱、神経、皮膚等が挙げられる。生体組織の部位として、組織再生の効果が高いことから軟骨、骨、肝臓、腎臓、心臓、心膜、血管、皮膚、小腸粘膜下組織、肺、脳、及び脊髄が好ましい。
〔本発明の脱細胞化組織を得る方法〕
　本発明の脱細胞化組織を得る方法は、脱細胞化吸熱量比が０．７～１．３となる脱細胞化方法であれば、特に限定されない。
　本発明の脱細胞化組織を得るのに好ましい方法としては、例えば、高静水圧処理による方法、凍結融解処理による方法等が挙げられ、脱細胞化ＤＮＡ比を下げることが容易であることから、高静水圧処理による方法が好ましい。
　生体由来組織の高静水圧処理は、界面活性剤を含有する洗浄液中で行うことが好ましい。かかる場合の、界面活性剤の含量は、洗浄する生体由来組織や、界面活性剤の種類により異なるが、０．０１質量％以上２．００質量％以下が好ましく、０．０３質量％以上１．００質量％以下が更に好ましく、０．０５質量％以上０．５０質量％以下が最も好ましい。なお、高静水圧が印加された生体由来組織の洗浄に、核酸分解酵素及び界面活性剤を使用すると、洗浄効果を上げることができる。界面活性剤を含有する洗浄液を使用した後に、核酸分解酵素を使用すると、更に洗浄効果を上げることができる。
　高静水圧処理による方法により、本発明の脱細胞化組織を得る場合は、生体由来組織に媒体中で５０～１５００ＭＰａの静水圧を印加する。印加する静水圧が５０ＭＰａよりも低い場合には、脱細胞化が不十分となる場合があり、高静水圧処理後に界面活性剤を含有する洗浄液で洗浄する工程での組織へのダメージが大きくなり、１５００ＭＰａを超える場合は印加に耐えられる圧力容器が必要であり、多大なエネルギーを要すると共に、印加に用いる媒体が水性媒体の場合には氷が生成し、生成した氷により組織がダメージを受ける場合がある。印加する静水圧は８０～１３００ＭＰａが好ましく、９０～１２００ＭＰａが更に好ましく、９５～１１００ＭＰａが最も好ましい。
　静水圧の印加に使用する媒体としては、水、生理食塩水、プロピレングリコール又はその水溶液、グリセリン又はその水溶液、糖類水溶液等が挙げられる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。糖類水溶液の糖類としては、エリトロース、キシロース、アラビノース、アロース、タロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、デキストラン、アルギン酸、ヒアルロン酸等が挙げられる。
　高静水圧処理の温度は、氷が生成せず、熱による組織へのダメージがない温度であれば、特に限定されないが、脱細胞処理が円滑に行われ組織への影響も少ないことから０～４５℃が好ましく、４～３７℃が更に好ましく、１５～３５℃が最も好ましい。高静水圧処理の時間は、短すぎると細胞の破壊が十分行われず、長い場合にはエネルギーの浪費につながることから、高静水圧処理において、目的とする印加圧力を維持する時間は、５～６０分が好ましく、７～３０分が更に好ましい。
　高静水圧が印加された生体組織は、組織中の細胞が破壊されており、この細胞は洗浄液により除去される。洗浄液は、高静水圧処理の媒体と同じでもよいし異なっていてもよい。洗浄液は、核酸分解酵素、有機溶媒又はキレート剤を含有することが好ましい。核酸分解酵素は、静水圧が印加された生体組織からの核酸成分、有機溶媒は脂質、それぞれの除去効率を向上させることができ、キレート剤は、脱細胞化組織中のカルシウムイオンやマグネシウムイオンを不活性化することにより、本発明の粒子化脱細胞化組織を疾患部に適用した場合の石灰化を防ぐことができる。有機溶剤としては、脂質の除去効果が高いことから、水溶性の有機溶剤が好ましく、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルホキシドが好ましい。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，３－プロパンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、１，３－ジアミノ－２－ヒドロキシプロパン四酢酸（ＤＰＴＡ－ＯＨ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸（ＣＭＧＡ）、３－ヒドロキシ－２，２’－イミノジコハク酸（ＨＩＤＡ）、ジカルボキシメチルアスパラギン酸（ＡＳＤＡ）等のイミノカルボン酸系キレート剤又はその塩；クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸等のヒドロキシカルボン酸系キレート剤又はその塩が挙げられ、これらのキレート剤の塩としては、ナトリウム塩又はカリウム塩が挙げられる。
　洗浄効率が上がることから、洗浄液は、界面活性剤を含有してもよい。界面活性剤としては、脂肪酸石鹸、アルコシキカルボン酸塩、ポリオキシエチレンアルコシキカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、α－スルホ脂肪酸エステル塩、Ｎ－アシルグルタミン酸塩、アシル－Ｎ－メチルタウリン塩、Ｎ－アルキルサルコシン塩、コール酸塩、デオキシコール酸塩等のアニオン性界面活性剤；
アルキルジメチルアミン、アルキルジエタノールアミン、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤；
アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルアミドプロピルスルホベタイン、アルキルイミダゾニウムベタイン、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）等の両性界面活性剤；
グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、トレハロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル、アルキル（ポリ）グリセリンエーテル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミド、アルキル（ポリ）グリコシド、アルキルマルトシド、アルキルチオグルコシド、アルキルマルトピラノシド、アルカノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルコサミン、Ｎ，Ｎ－ビス（３－Ｄ－グルコンアミドプロピル）コールアミド（ＢＩＧＣＨＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ビス（３－Ｄ－グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミド（ｄｅｏｘｙ－ＢＩＧＣＨＡＰ）等のノニオン性界面活性剤が挙げられる。
　界面活性剤としては、細胞の除去の点から、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、α－スルホ脂肪酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキル（ポリ）グリコシドが好ましく、アルキルスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキル（ポリ）グリコシドが更に好ましい。
　高静水圧が印加された生体組織を洗浄する場合の温度は、熱による組織へのダメージがない温度であれば、特に限定されないが、洗浄性が良好で組織への影響も少ないことから０～４５℃が好ましく、１～４０℃が更に好ましく、２～３５℃が最も好ましい。洗浄する場合には、必要に応じて、洗浄液を振盪又は撹拌してもよい。
　凍結融解処理による方法により、本発明の脱細胞化組織を得る場合は、生体由来組織を－８０～－２０℃、好ましくは－８０～－４０℃の温度で１～４８時間、好ましくは１０～３０時間保持して凍結させた後、２０～３７℃の温度で融解する工程を、１回又は２回以上、好ましくは２～５回繰り返して行う。凍結融解処理された生体組織は、組織中の細胞が破壊されており、この細胞は洗浄液により除去される。洗浄の方法は、高静水圧処理における洗浄と同様の方法でよい。
　脱細胞化ＤＮＡ比及び脱細胞化吸熱量比の測定は、宿主細胞の誘引、接着、浸潤等に優れた脱細胞化組織の選別方法として優れていることから、脱細胞化を製造する場合に、脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、乾燥質量あたりのＤＮＡ量の質量比が０．３以下であることを確認する工程（即ち、脱細胞化ＤＮＡ比が０．３以下であることを確認する工程）と脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、示差走査熱量測定により測定される、乾燥質量あたりの吸熱量の比が０．７～１．３であることを確認する工程（即ち、脱細胞化吸熱量比が０．７～１．３であることを確認する工程）を組み込むことにより、良好な脱細胞化組織得を製造することができる。脱細胞化ＤＮＡ比が０．３以下であることを確認する工程及び脱細胞化吸熱量比が０．７～１．３であることを確認する工程は、脱細胞化組織を洗浄する工程の後であることが好ましく、脱細胞化組織を殺菌又は滅菌する工程がある場合には、脱細胞化組織を洗浄する工程の後、殺菌又は滅菌する工程の前であることが好ましい。
　本発明の脱細胞化組織は、単独で適用してもよいし、疾患部位の再生・治癒効果のある他の成分と共に適用してもよい。このような他の成分としては、成長因子、プロテオグリカン又はグリコサミノグリカン、細胞、β－１，３－グルカン、メバロン酸等が挙げられる。
　成長因子としては、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、形質転換成長因子－α（ＴＧＦ－α）、形質転換成長因子（ＴＧＦ－β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、角質細胞成長因子（ＫＧＦ）、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、造血促進因子（ＥＰＯ）、顆粒大食細胞成長因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒細胞成長因子（Ｇ－ＣＳＦ）、神経細胞成長因子（ＮＧＦ）、ヘパリン結合（ＥＧＦ）等が挙げられる。プロテオグリカン又はグリコサミノグリカンとしては、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン等が挙げられる。
　本発明の脱細胞化組織は、そのまま移植に用いてもよいし、細胞を播種し培養してから用いてもよい。また、本発明の脱細胞化組織は、切断、スライス、粉砕してシート状、粒状、微粉末状、ゲル状等に加工して用いてもよく、脱細胞化組織がシート状である場合には、脱細胞化組織同士又は他のシート状のものと組み合わせて多層化して用いてもよく、管状に加工してもよい。
　本発明によれば、細胞の誘引効果に優れる脱細胞化組織が提供される。脱細胞化組織の細胞の誘引効果は、実施例に記載した方法で脱細胞化組織を細胞接着性試験に供することで評価できる。
　以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。なお、特に限定のない限り、実施例中の「部」や「％」は質量基準によるものである。
〔実施例１〕
　ポリエチレン製チャック付き袋に、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（以下、該シート状の内膜を「内膜シート」という。）と、高静水圧処理の媒体として生理食塩水と、を入れ、研究開発用高圧処理装置（神戸製鋼製、商品名：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）を用いて、１００ＭＰａの静水圧を１５分間印加した。高静水圧処理した内膜シートを、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを２０ｐｐｍ含有する生理食塩水中、４℃で９６時間振盪することにより洗浄し、更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振盪した後、生理食塩水中、４℃で２時間振盪して、実施例１の脱細胞化組織を得た。
〔実施例２〕
　実施例１において、ＤＮａｓｅを２０ｐｐｍ含有する生理食塩水中での振盪時間を９６時間から８時間に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い実施例２の脱細胞化組織を得た。
〔実施例３〕
　内膜シートを、ドライアイスで凍結させ、ドライアイスを入れた保冷箱中（約－７８℃）で２０時間保存した後、２５℃で溶解させた。この凍結融解を３回繰り返した内膜シートを、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを２０ｐｐｍ含有する生理食塩水中、４℃で９６時間振盪することにより酵素処理し、更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振盪した後、生理食塩水中、４℃で２時間振盪して、実施例３の脱細胞化組織を得た。
〔実施例４〕
　内膜シートを、０．１質量％のドデシルスルホン酸ナトリウム（以下、ＳＤＳ）を含有する生理食塩水中、２５℃で９６時間振盪することにより脱細胞した。ＳＤＳ処理した内膜シートを、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを２０ｐｐｍ含有する生理食塩水中、４℃で９６時間振盪することにより酵素処理し、更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振盪した後、生理食塩水中、４℃で２時間振盪して、実施例４の脱細胞化組織を得た。
〔実施例５〕
　実施例１と同様の方法で、内膜シートに対し、１０００ＭＰａの静水圧を１５分間印加した。高静水圧処理した内膜シートを、０．１質量％のドデシルスルホン酸ナトリウム（以下、ＳＤＳ）を含有する生理食塩水中、２５℃で８時間振盪し、次いで、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを２０ｐｐｍ含有する生理食塩水中、２５℃で２４時間振盪することにより洗浄した。更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振盪した後、生理食塩水中、４℃で２時間振盪して、実施例５の脱細胞化組織を得た。
〔実施例６〕
　実施例５において、高静水圧処理の静水圧を１０００ＭＰａから４００ＭＰａに変更した以外は実施例５と同様の操作を行い実施例６の脱細胞化組織を得た。
〔実施例７〕
　実施例５において、高静水圧処理の静水圧を１０００ＭＰａから６００ＭＰａに変更した以外は実施例５と同様の操作を行い実施例６の脱細胞化組織を得た。
〔実施例８〕
　実施例１において、高静水圧処理の静水圧を１００ＭＰａから６００ＭＰａに変更した以外は実施例１と同様の操作を行い実施例８の脱細胞化組織を得た。
〔比較例１〕
　実施例４において、ＳＤＳの濃度を０．１質量％から、１質量％に変更した以外は実施例４と同様の操作を行い比較例１の脱細胞化組織を得た。
〔比較例２〕
　実施例４において、０．１質量％のＳＤＳを含有する生理食塩水を１質量％のトリトンＸ－１００（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル：以下、ＴＸ）を含有する生理食塩水に変更した以外は実施例４と同様の操作を行い比較例２の脱細胞化組織を得た。
〔比較例３〕
　比較例２において、ＴＸの濃度を１質量％から、０．１質量％に変更した以外は比較例３と同様の操作を行い比較例３の脱細胞化組織を得た。
〔比較例４〕
　内膜シートを、生理食塩水中で、超音波処理（強度：１０Ｗ／ｃｍ２　、周波数：１０ｋＨｚ、作用時間：２分間）した。超音波処理した内膜シートについて、比較例２と同様の操作を行い、比較例４の脱細胞化組織を得た。
〔比較例５〕
　比較例４において、ＴＸの濃度を１質量％から、０．１質量％に変更した以外は比較例５と同様の操作を行い比較例５の脱細胞化組織を得た。
〔比較例６〕
　リン酸緩衝液に、ＣＨＡＰＳ、塩化ナトリウム及びＥＤＴＡをそれぞれ、８ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｏｌ／Ｌ、２５ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加した液を、脱細胞化液とした。内膜シートを、この脱細胞化液中、２５℃で９６時間振盪することにより脱細胞し、核酸分解酵素としてＤＮａｓｅを２０ｐｐｍ含有する生理食塩水中、２５℃で２４時間振盪することにより酵素処理し、更に、８０％エタノール中、４℃で７２時間振盪した後、生理食塩水中、４℃で２時間振盪して、比較例６の脱細胞化組織を得た。
〔脱細胞化ＤＮＡ比の算出〕
　各脱細胞化組織の質量を測定し、これを試験片とし、タンパク質分解酵素溶液に浸漬して溶解した後、フェノール／クロロホルムで処理してタンパク質を除去し、エタノール沈殿法によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをピコグリーン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により蛍光染色して蛍光強度を測定することによりＤＮＡを定量し、試験片の質量とＤＮＡの量から、試験片のＤＮＡ含量を算出した。なお、ＤＮＡの定量には、ピコグリーンに添付された標準ＤＮＡを用いて作成した検量線を用いた。別の試験片を用いて、試験片の質量と乾燥した試験片（６０℃の恒温槽に１２時間保存したもの）の質量とから、乾燥減量比を求め、試験片のＤＮＡ含量と乾燥減量比から、試験片の乾燥質量あたりのＤＮＡ含量を算出した。
（試験片のＤＮＡ含量）＝（ＤＮＡの量）／（試験片の質量）
（乾燥減量比）＝（乾燥した試験片の質量）／（試験片の質量）
（乾燥試験片のＤＮＡ含量）＝（試験片のＤＮＡ含量）／（乾燥減量比）
　内膜シートの乾燥試験片のＤＮＡ含量と脱細胞化組織の乾燥試験片のＤＮＡ含量の比から脱細胞化ＤＮＡ比の算出した。結果を表１に示す。
（脱細胞化ＤＮＡ比）＝（脱細胞化組織の乾燥試験片のＤＮＡ含量）／（内膜シートの乾燥試験片のＤＮＡ含量）
〔脱細胞化吸熱量比の算出方法〕
　３ｍｍ×３ｍｍに切断した試験片を、質量を測定したアルミ製の試料パンに入れ、示差走査熱量測定機（ＭＥＴＴＬＥＲ　ＴＯＲＥＤＯ社製、型式ＤＳＣ１）を用い、測定開始温度２５℃、昇温速度３℃／分、測定終了温度９０℃の条件で示差走査熱量を測定した。５５～６８℃の領域にコラーゲン由来とみられる吸熱がみられることから、この吸熱量を試験片の吸熱量とした。脱細胞化前の生体由来組織、実施例１及び４の脱細胞化組織、比較例２の脱細胞化組織の吸熱量をそれぞれ図１～４に示す。吸熱量の測定後の試料パンは穴を開けて、６０℃の恒温槽に１２時間保存して乾燥させてから、乾燥した試験片が入った試料パンの質量を測定し、下記の式より試験片の乾燥質量あたりの吸熱量を算出した。
（試験片の乾燥質量あたりの吸熱量）＝（吸熱量）／｛（乾燥した試験片が入った試料パンの質量）－（試料パンの質量）｝
　内膜シートの乾燥質量あたりの吸熱量と脱細胞化組織の乾燥質量あたりの吸熱量から下記の式により脱細胞化吸熱量比を算出した。結果を表１に示す。
（脱細胞化吸熱量比）＝（脱細胞化組織の乾燥質量あたりの吸熱量）／（内膜シートの乾燥質量あたりの吸熱量）
〔細胞接着性試験〕
　実施例１～７又は比較例１～６の脱細胞化組織を、直径６ｍｍの生検トレパンを用いて円盤状に切り抜いたものを試験片とした。円盤状試験片の内膜側を上にして９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ　ｄｉｓｈに設置し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＭＥＭ培地で３７℃で１２時間、前培養した。ＭＥＭ培地を除去した後、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を播種（２．７×１０３細胞／ｗｅｌｌ）し、３７℃で３時間培養した。試験片から、付着していない細胞をリン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄及び除去した後、試験片をＷｓｔ－８（同人化学研究所製）で染色し、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。別途、ＮＨＤＦの数と、Ｗｓｔ－８により染色した場合の検量線を作成しておき、試験片の吸光度と検量線から、試験片に付着したＮＨＤＦ数を算出した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果から、実施例の脱細胞化組織はいずれも、比較例の脱細胞化組織に比べて細胞接着数が多く、細胞の誘引効果に優れて、組織の再生効果が高いことが示唆される。
〔実施例９～１２、比較例７～１０〕
　実施例１～８、比較例１～６で使用したブタ大動脈内膜シート以外の生体組織について、本発明の脱細胞化組織の製造例を実施例９～１２に示す。また比較の製造例を比較例７～１０に示す。実施例の脱細胞化組織はいずれも、比較例の脱細胞化組織に比べて細胞接着数が多く、細胞の誘引効果に優れていた。
〔実施例９〕
　実施例８において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ブタの大動脈そのものを使用した以外は、実施例８と同様の操作を行い実施例９の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。
〔実施例１０〕
　実施例８において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ブタの皮膚（真皮を含む）を使用した以外は、実施例８と同様の操作を行い実施例１０の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。
〔実施例１１〕
　実施例８において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ブタの心膜を使用した以外は、実施例８と同様の操作を行い実施例１１の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。
〔実施例１２〕
　実施例８において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ウシの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜を使用した以外は、実施例８と同様の操作を行い実施例１２の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。
〔比較例７〕
　比較例１において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ブタの大動脈そのものを使用した以外は、比較例１と同様の操作を行い比較例７の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。
〔比較例８〕
　比較例１において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ブタの皮膚（真皮を含む）を使用した以外は、比較例１と同様の操作を行い比較例８の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。
〔比較例９〕
　比較例１において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ブタの心膜を使用した以外は、比較例１と同様の操作を行い比較例９の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。
〔比較例１０〕
　比較例１において、ブタの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（内膜シート）の替わりに、ウシの大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜を使用した以外は、比較例１と同様の操作を行い比較例１０の脱細胞化組織を得た。得られた脱細胞化組織の脱細胞化ＤＮＡ比と脱細胞化吸熱量比を、上記方法で算出した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Claims (2)

  1. 　生体由来組織を脱細胞化した脱細胞化組織であって、
    　脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、示差走査熱量測定により測定される、乾燥質量あたりの吸熱量の比が０．７０以上であることを特徴とする脱細胞化組織。
  2. 　脱細胞化前の生体由来組織に対する脱細胞化組織の、乾燥質量あたりのＤＮＡ量の質量比が０．３００以下であることを特徴とする請求項１に記載の脱細胞化組織。
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