JP2015160040A - 脱細胞組織の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】界面活性剤より動物由来組織を脱細胞した場合には、組織へのダメージが大きいが、媒体中で静水圧を印加してから、界面活性剤を含有する洗浄液により洗浄することにより、ダメージの少ない脱細胞組織が製造できるようになる。本発明により、ダメージの少ない脱細胞組織が製造でき、特に、従来製造が困難だった心臓、肝臓、腎臓、肺等の大型臓器のダメージの少ない脱細胞組織が得られるようになる。
【選択図】なし
Description
本発明の脱細胞化組織の製造方法に使用する動物由来組織(生体組織ともいう。)は、脊椎動物由来の細胞を有する生体組織であれば、特に限定されないが、拒絶反応が少ないことから、哺乳類又は鳥類由来の生体組織が好ましく、入手が容易であることから、哺乳類の家畜、鳥類の家畜又はヒト由来の生体組織が更に好ましい。哺乳類の家畜としては、ウシ、ウマ、ラクダ、リャマ、ロバ、ヤク、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、アルパカ、イヌ、タヌキ、イタチ、キツネ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス、リス、アライグマ等が挙げられる。また、鳥類の家畜としては、インコ、オウム、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ガチョウ、ホロホロ鳥、キジ、ダチョウ、ウズラ等が挙げられる。これらの中でも、入手の安定性から、ブタ、ウサギ、ヒトの生体組織が好ましい。
本発明の製造方法では、動物由来組織に媒体中で100〜1500MPaの静水圧を印加する。印加する静水圧が100MPaよりも低い場合には、界面活性剤を含有する洗浄液する工程での組織へのダメージが大きくなり、1500MPaを超える場合は印加に耐えられる圧力容器が必要であり、多大なエネルギーを要するとともに、印加に用いる媒体が水性媒体の場合には氷が生成しやすくなる。印加する静水圧は300〜1300MPaが好ましく、500〜1200MPaが更に好ましく、700〜1100MPaが最も好ましい。本発明によれば、従来よりも低い値の静水圧による印加であっても効果的に脱細胞化を行うことができる。したがって、より低い圧力で印加工程を行うという観点から、印加する静水圧は100〜800MPa、好ましくは、200〜700MPa、更に好ましくは500〜700MPaであってもよい。
高静水圧が印加された生体組織は、組織中の破壊された細胞を、界面活性剤を含有する洗浄液で洗浄液により除去される。界面活性剤は、イオン性からアニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤に分類される。
両性界面活性剤としては、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルアミドプロピルスルホベタイン、アルキルイミダゾニウムベタイン、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホナート塩、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホナート塩等が挙げられる。
界面活性剤の種類によっては、核酸分解酵素が変性し失活してしまうことがあることから、界面活性剤を含有する洗浄液に核酸分解酵素を添加して洗浄するのではなく、界面活性剤を含有する洗浄液で洗浄した後に、界面活性剤を含有せず、核酸分解酵素を含有する洗浄液で洗浄する、若しくは、動物由来組織に静水圧を印加した後に、界面活性剤を含有せず、核酸分解酵素を含有する洗浄液で洗浄し、この後に界面活性剤を含有する洗浄液で洗浄することが好ましい。つまり、本発明の製造方法は、印加工程と、界面活性剤を含有する洗浄液による洗浄工程との間に、核酸分解酵素を含有する洗浄液による洗浄工程を有し得る。
界面活性剤を含有する処理液で脱細胞した脱細胞組織では、通常、物理的強度が大きく低下するのに対し、本発明の脱細胞化組織の製造方法では、界面活性剤を含有する洗浄液による洗浄工程があるにもかかわらず、物理的強度の低下が小さい。この原因についてはわかっていないが、静水圧の印加によりタンパク質が変質し、界面活性剤によるダメージを受けにくくなったためと考えられる。
ラットから腎臓を摘出し、腎臓につながる動脈と静脈にカニューレを挿入し瞬間接着剤で固定した。この腎臓を生理食塩水に浸漬し、動脈側から生理食塩水を注入し12時間灌流させたものをサンプルとして用いた。
ポリエチレン製チャック付き袋に、サンプルと、高静水圧処理の媒体として生理食塩水を入れ、研究開発用高圧処理装置(神戸製鋼製、商品名:Dr.CHEF)を用いて、500MPa又は1000MPaの静水圧を15分間印加した。
サンプルを洗浄液に浸漬し、動脈側から洗浄液を注入し24〜48時間灌流させた。なお、洗浄液としては、リン酸緩衝生理食塩水(表1中、「PBS」)、ドデシルスルホン酸ナトリウム(表1中、「SDS」)又はDNaseを表1に示す濃度で含有するリン酸緩衝生理食塩水を用いた。なお、表1中の( )内の数字は灌流を行った時間を表わし、矢印「→」は洗浄を行った順番を表わす。「→」の前に記載された工程が、先に行った工程である。
脱細胞処理したサンプルを目視し、以下の基準で脱細胞性を評価した。結果を表2に示す。
○:赤みが見られず、透明〜きれいな白色であり脱細胞性が良好である
△:やや赤みが見られ、脱細胞性がやや不良である
×:明らかに赤みが残り、脱細胞性が不良である
強度試験の評価例
脱細胞処理したサンプルを腰高シャーレに入れてサンプルの高さを測定し、この腰高シャーレを25℃恒温槽に24時間保存した後、サンプルの高さを再度測定した。高さの減少率から、下記の基準にて形状保持性を判断した。結果を表2に示す。なお、形状保持性が高いほど脱細胞組織のダメージが少ないことを示す。
○:高さの減少率が0〜20%であり形状保持性が高い
△:高さの減少率が20〜50%であり形状保持性がやや低い
×:高さの減少率が50%以上であり形状保持性が低い
Claims (4)
- 動物由来組織に、媒体中で100〜1500MPaの静水圧を印加する印加工程と、
前記静水圧を印加した動物由来組織を、界面活性剤を含有する洗浄液で洗浄する洗浄工程と、を有する脱細胞組織の製造方法。 - 前記印加工程と、前記界面活性剤を含有する洗浄液で洗浄する洗浄工程との間、又は、前記界面活性剤を含有する洗浄液で洗浄する洗浄工程の後に、前記動物由来組織を、核酸分解酵素を含有する洗浄液で洗浄する洗浄工程を有する請求項1記載の脱細胞組織の製造方法。
- 前記界面活性剤が、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、α−スルホ脂肪酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル及びアルキル(ポリ)グリコシドから選択される1種以上の界面活性剤である請求項1又は2に記載の脱細胞組織の製造方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の脱細胞組織の製造方法により得られる脱細胞組織。
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