JP2010504093A - 細胞由来の細胞外基質膜の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は細胞由来の細胞外基質膜の製造方法に係り、さらに詳しくは、動物の軟骨由来軟骨細胞を高濃度にて体外において培養して適切な厚さの軟骨細胞/細胞外基質膜を形成した後に乾燥することを特徴とする、軟骨細胞由来細胞外基質膜の製造方法に関する。本発明による細胞由来細胞外基質膜支持体は、軟骨細胞が分泌した細胞外基質により構成されて生体適合性に優れているだけではなく、軟骨に特異的な免疫拒否を免除する効果があり、移植に適した引張り強度を有していることから、軟骨再生に使用される骨膜や人工的に製作したコラーゲン膜を代替することができるだけではなく、骨硬膜の移植材及び皮膚欠損を修復するための天然的な細胞外基質膜、細胞移植材及び成長因子の伝達体として使用可能である。
【選択図】図1
Description
また、本発明による細胞由来細胞外基質膜支持体は、軟骨細胞が分泌した細胞外基質により構成されて生体適合性に優れているだけではなく、軟骨に特異的な免疫拒否を免除する効果があり、移植に適した引張り強度を有していることから、軟骨再生に使用される骨膜や人工的に製作したコラーゲン膜を代替できるだけではなく、骨硬膜の移植材及び皮膚欠損を修復するための天然的な細胞外基質膜、細胞移植材及び成長因子の伝達体として使用可能である。
以下、本発明を実施例により詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
豚コレラ及びその他のウィルスや伝染病のない生後2週間経過の小豚を動物倫理法に従い過量麻酔させて致死させた。無菌環境下で豚の膝関節から軟骨のみを採取した。採取した軟骨を無菌作業台に載せて細断した後、0.1%のコラゲナーゼにより12時間処理し、0.4μmフィルターを用いて細胞のみをろ過した後、遠心分離により軟骨細胞を分離した。
実施例1において分離した軟骨細胞を6ウェル(6−well)培養容器に0.7×105cells/cm2の濃度にて接種した後、培養培地(DMEM+20%FBS+1%ペニシリン−ストレプトマイシン+5μg/mLアスコルビン酸)を入れて3週間培養した。培養培地は3日置きに1回ずつ交換した。3週間後にECMフィルムをPBSにて3回洗浄した後、6ウェル培養容器から引き剥がした。製造された細胞外基質膜は半透明の薄膜状を呈していた(図1)。
3−1:細胞外基質膜の微細構造分析
走査電子顕微鏡を用いて細胞外基質膜の微細構造を分析した。2.5%グルタルアルデヒドにより実施例2に従って製造された細胞外基質膜を1時間かけて固定した後、リン酸塩緩衝溶液により洗浄した。試料をエタノールにより脱水させた後に乾燥して電子顕微鏡(JEOL、JSM−6380、日本;20KV)により表面と断面を撮影した。その結果、表面は細胞と見られる構造体により粗く見られ、断面は約10〜20μmの厚さを示していた(図2)。
実施例2に従って製造された細胞外基質膜を4%ホルマリン溶液により24時間かけて固定し、パラフィン浸透を行った後、包埋して切片を製作した。製作された切片をヘマトキシリン・エオシンにより染色して組織を観察した結果、細胞外基質と見られる構造体の内部に核を持った細胞が散在している形態を観察することができた(図3)。
万能物性測定器(Universal Testing Machine、H5K−J、HTE、Salfords、England)を用いて細胞外基質膜の引張り強度を測定した。実施例2に従って製造された細胞外基質膜を30x5mmのサイズに切断した試料を50Nロッドのセルに垂直に固定し、10mm/分の速度にて引っ張って引裂するときの力を測定した。なお、各種の試料に対して測定を行うことで平均値を求めた後、単位面積当たりの引張り強度を計算した結果、引張り強度は約25N/mm2であり、伸び率は約10%であった。
実施例2に従って製造された細胞外基質膜の2次的な構造を豚軟骨組織と比較するために、赤外線スペクトル構造分析を行った。解像度が8cm−1のFT−IR分析機(Bomem、MB104モデル)を用いてタンパク質の主成分であるアミドを分析した結果、製造された細胞外基質膜と天然の豚軟骨組織がほとんど同様の化学的な2次構造を有することが分かった(図4)。
実施例1の方法と同様にして、約3〜4kg程度のニュージランド産の白いウサギの軟骨から軟骨細胞を分離した。分離されたウサギ軟骨細胞を1x105細胞/30mm2の濃度にて実施例2に従って製造された細胞外基質膜に接種した後、細胞の増殖能と組織の変化及び糖タンパクの発現を調査した。
通常の動物細胞培養容器(対照群、6ウェル培養プレート、BD Falcon、USA)及び細胞外基質膜に上記のようにしてウサギの軟骨細胞をそれぞれ培養した後、1、2、4、6、8、12、14日目にMTT分析(Roche、Germany)を通じて細胞の増殖能を調査した。その結果、細胞外基質膜と商用化された培養容器の両方とも5〜6日でプラトー(plateau)に到達し、このとき、OD値は両方とも約4.0程度とほとんど同様であった(図5)。前記結果から、細胞外基質膜は、既存の培養容器と同様、軟骨細胞の増殖に適した環境を提供するということが分かる。
上記のようにして細胞外基質膜に軟骨細胞を培養した後、それぞれ7日、14日目に試料を回収して実施例3−2の方法と同様にして組織切片を製作した。製作された切片を用いてヘマトキシリン・エオシン染色を行った結果、経時的に細胞外基質膜の表面に厚い細胞層が形成されることが分かる(図6のA)。また、糖タンパクに対して特異的なサフラニンO染色を行った結果、試料の全体に亘って糖タンパクの発現がはっきりと現れることを確認した(図6のB)。
5−1:細胞外基質膜の脱細胞化
細胞外基質膜に存在する軟骨細胞を除去し、純粋な細胞外基質膜を得るために下記のようにして脱細胞化過程を行った。実施例2に従って製造された細胞外基質膜を0.1%のSDS溶液に入れ、37℃及び150rpmの条件下で24時間かけて攪拌した。次に、超音波洗浄器において1分間、0.05%のトリプシン−EDTA溶液において30分間、さらに超音波洗浄器において1分間、0.07mg/mLDNase溶液において24時間、さらに超音波洗浄器において1分間処理する過程を経た後、PBSにより少なくとも5回以上洗浄した。脱細胞化処理を経た細胞外基質膜はフードにおいて12時間乾燥後に電子式デシケーターに保管した。
脱細胞化された細胞外基質膜は脱細胞化前に比べて1/3程度に厚さが薄くなったが、全体的な形状、色合い及び触感は大差なかった(図7のA)。しかしながら、実施例3−1の方法と同様にして走査電子顕微鏡を用いて表面の微細構造を調査した結果、脱細胞化前の試料(図2のA)に見られる白色の細胞状構造体がなく、全体的に滑らかな形状を示していた(図7のB)。なお、前記実施例3−2の方法と同様にしてヘマトキシリン・エオシン染色を通じて組織学的観察を行った結果、脱細胞化前の試料に見られる小さくて濃い核状構造体が現れないことが分かる(図7のC)。
実施例3−2の方法と同様にして、脱細胞前の細胞外基質膜及び脱細胞化された細胞外基質膜の試料切片を作成した後、200ng/mlのDAPI[2−(4−アミジノフェニル)−6−インドールカルバミジンドジヒドロクロライド]溶液により染色し、蛍光顕微鏡により観察した。その結果、脱細胞前の試料においては核構造体内にDNA成分がはっきり観察されたが、脱細胞化された試料においては蛍光染色されたDNA成分が全く現れなかった(図8のA)。脱細胞化された細胞外基質膜におけるDNA除去効果はHoechest 332582染色試料を用いてDNAを定量的に分析した結果においても現れた(図8のB)。
脱細胞化前の細胞外基質膜試料と脱細胞化後の細胞外基質膜試料に対して軟骨組織の主なECM成分であるコラーゲンと糖タンパクの含量及び合計のタンパク質含量を比較分析した。その結果、脱細胞化された細胞外基質膜の場合、脱細胞前に比べて単位重量当たりのコラーゲン及び糖タンパクの含量がかなり低減されていたが、タンパク質含量には大差ないことが分かる(図9)。
前記実施例3及び4の方法と同様にしてFT−IR分析を通じて脱細胞前と脱細胞後の細胞外基質膜の2次的な構造を分析した。その結果、両試料における全体的な吸光度は同様であり、アミドに対する分析においても同様な構造を有することが分かる(図10)。
実施例5の方法のように脱細胞化された細胞外基質膜をプレス圧着方法により二重、三重に重ね合わせて厚さと強度が強化された細胞外基質膜を製造した。多重に強化された細胞外基質膜の形状は以前と大差なく、厚さはそれぞれ3.3μm(一重)、6.6μm(二重)、10μm(三重)と測定されて、3重の試料の場合、脱細胞化前の細胞外基質膜と同様な値を示した。これらの細胞外基質膜の引張り強度と伸び率を実施例3−3の方法と同様にして測定した。
Claims (26)
- 下記のステップを含むことを特徴とする、軟骨細胞由来細胞外基質膜の製造方法:
(a)動物由来軟骨から軟骨細胞を分離した後、その軟骨細胞を培養するステップと、
(b)前記培養された軟骨細胞から軟骨細胞/細胞外基質膜を得るステップと、
(c)前記得られた軟骨細胞/細胞外基質膜(ECM)構造物を乾燥して細胞外基質膜を得るステップ。 - (d)前記得られた細胞外基質膜に軟骨細胞を再接種した後、再培養してより高い引張り強度を有する厚い細胞外基質膜を得るステップをさらに含むこと特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記動物が豚であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記動物が人間であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記培養ステップにおいて生体活性因子をさらに添加することを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記生体活性因子が、インシュリン類似成長因子(IGF)、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)、酸性繊維芽細胞成長因子(aFGF)、形質転換成長因子−α(TGF−α)、形質転換成長因子−β(TGF−β)、骨形成タンパク質(BMP)、血小板由来成長因子(PDGF)、角質細胞成長因子(KGF)、表皮細胞成長因子(EGF)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、造血促進因子(EPO)、顆粒大食細胞成長因子(GM−CSF)、顆粒細胞成長因子(G−CSF)、神経細胞成長因子(NGF)、ヘパリン結合(EGF)、インターフェロン、組織活性化ペプチド、インターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−2(IL−2)、インターロイキン−6(IL−6)及びインターロイキン−8(IL−8)より成る群から選択されるいずれか1種以上であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記培養ステップにおいて培養液を超音波で処理するか、または培養液に物理的な圧力を加えることを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記ステップ(c)における乾燥が、軟骨細胞/細胞外基質(ECM)膜構造物を−15〜−25℃の温度条件下で冷凍及び解凍する手続きを3〜5回繰り返し行った後、自然乾燥若しくは凍結乾燥することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記軟骨細胞を培養するステップにおいて、筋源細胞、筋肉細胞、心筋細胞、神経細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、骨細胞及び幹細胞よりなる群から選ばれるいずれか1種以上の細胞と一緒に培養することを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 請求項1または請求項2に記載の方法によって製造された細胞外基質膜(ECM)。
- 請求項10に記載の細胞外基質膜から細胞を除去することを特徴とする脱細胞化された細胞外基質膜の製造方法。
- 前記脱細胞化が、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、変性剤、低張性溶液、DNase、RNase及び超音波よりなる群から選ばれるいずれか1種以上によって処理することを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 請求項11に記載の方法によって製造された、細胞化された細胞外基質膜。
- 下記のステップを含む、脱細胞化された細胞外基質膜の製造方法:
(a)動物由来軟骨から軟骨細胞を分離した後に培養することによって、軟骨細胞/細胞外基質膜を生成するステップと、
(b)前記生成された軟骨細胞/細胞外基質膜から軟骨細胞を除去して脱細胞化された細胞外基質(ECM)膜構造物を得るステップと、
(c)前記の脱細胞化された細胞外基質(ECM)膜構造物を乾燥して脱細胞化された細胞外基質膜を得るステップ。 - (b)ステップの 軟骨細胞の除去が、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、変性剤、低張性溶液、DNase、RNase及び超音波よりなる群から選ばれるいずれか1種以上によって処理することを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 請求項14に記載の方法により製造された、脱細胞化された細胞外基質膜。
- 請求項10に記載の細胞外基質膜(ECM)、請求項13及び請求項16に記載の脱細胞化された細胞外基質膜よりなる群から選ばれるいずれか1種以上を多重に重ね合わせて膜厚を増加させることを特徴とする、強化細胞外基質膜の製造方法。
- 請求項10に記載の細胞外基質膜(ECM)、請求項13及び請求項16に記載の脱細胞化された細胞外基質膜の中よりなる群から選ばれるいずれか1種以上を加工することを特徴とする、種々の形状の細胞外基質膜の製造方法。
- 請求項10に記載の細胞外基質膜(ECM)、請求項13及び請求項16に記載の脱細胞化された細胞外基質膜の中いずれか1種以上を軟骨細胞培養皿において乾燥させた後、前記細胞外基質膜または前記脱細胞化された細胞外基質膜の表面に細胞を接種することを特徴とする、細胞が付着された細胞外基質膜の製造方法。
- 前記細胞が軟骨細胞、皮膚細胞、神経細胞、筋肉細胞、膵臟細胞、肝細胞及び幹細胞よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 請求項19に記載の方法によって、製造された細胞が接種された細胞外基質膜を含む細胞治療剤。
- 脳硬膜欠損補完用または再生用、皮膚再生用、軟骨再生用、内部臓器止血用及び内部臓器組織再生用であることを特徴とする、請求項21に記載の細胞治療剤。
- 請求項10に記載の細胞外基質膜(ECM)、請求項13及び請求項16に記載の脱細胞化された細胞外基質膜よりなる群から選ばれるいずれか1種以上に成長因子を付着することを特徴とする、成長因子が付着された細胞外基質膜の製造方法。
- 請求項23に記載の方法によって製造された成長因子が付着された細胞外基質膜を重ね合わせることを特徴とする、成長因子放出用の強化細胞外基質膜。
- 請求項23に記載の方法により製造された成長因子が付着された細胞外基質膜を含む、成長因子放出用の薬物伝達体。
- 請求項24に記載の成長因子放出用の強化細胞外基質膜を含む、成長因子放出用の薬物伝達体。
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