CN116159188A

CN116159188A - 一种壳聚糖-柠檬酸/聚乙烯醇双网络水凝胶支架及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN116159188A
Application number: CN202111417476.1A
Authority: CN
Inventors: 郭川; 孔清泉; 吴锦荣; 王玉; 伍耶; 李韦龙
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2023-05-26

Abstract

本发明提供了一种壳聚糖‑柠檬酸/聚乙烯醇双网络水凝胶支架及其制备方法和用途，属于医药化学技术领域。该双网络水凝胶支架是由如下重量配比的原料制备而成：聚乙烯醇5～15份、壳聚糖5‑15份、柠檬酸10‑30份。本发明水凝胶支架力学性能良好，且降解速度适宜；同时该水凝胶支架具有良好的生物相容性和生物活性，其无细胞毒性，并且其内部微通道结构有利于干细胞粘附、迁移、进行软骨分化。此外，该水凝胶支架在体内进行软骨修复时具有优良的抗炎抗菌作用以及促进软骨再生功能，在组织工程软骨修复领域具有良好的应用前景。

Description

一种壳聚糖-柠檬酸/聚乙烯醇双网络水凝胶支架及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药化学技术领域，具体涉及一种壳聚糖-柠檬酸/聚乙烯醇双网络水凝胶支架及其制备方法和用途。

背景技术

关节软骨属于透明软骨，它覆盖于关节的表面，由软骨细胞和基质构成，软骨细胞占软骨组织的5％或更少，基质主要有蛋白多糖凝胶以及II型胶原构成，蛋白多糖约占软骨干重的35％，胶原约占软骨干重的60％，起着缓冲应力、吸收震荡、润滑关节表面、防止磨损等重要作用。造成关节软骨损伤的原因多种多样，包括关节受到暴力挤压或撕裂受到的急性损伤以及长期大运动量、高负荷运动对关节造成的慢性磨损。也有研究表明，关节长期缺乏活动也会造成关节软骨退行性变。软骨发生损伤后很难自行修复，因此各种关节软骨损伤修复方法逐渐被研发应用。

在损伤、缺损部位植入软骨修复支架对软骨进行修复是一种有潜力的软骨修复方法。而选择合适的软骨修复材料对软骨修复具有重要作用。合适的软骨修复材料应当具备以下性能：(1)良好的力学性能起到临时的支撑作用；2)有利于细胞浸润、黏附、增殖、迁移的的微观结构；3)与软骨细胞外基质相近的的弹性模量有利于诱导干细胞向软骨分化；(3)内源性细胞因子吸附能力以招募内源细胞；(3)炎症调控，抗瘢痕粘连；(4)抗菌、止血。

目前研究中，由于聚乙烯醇(PVA)水凝胶的高含水性及其特殊的表面结构和天然软骨组织非常相似，因而PVA水凝胶是首选的人工软骨材料之一。PVA水凝胶无毒、性质稳定、力学性能优良、亲水性好；同时，该水凝胶具有类似天然软骨的多微孔组织，内含大量的水，是一种可渗透材料，在载荷作用下，液体可以渗入和挤出，起到润滑作用，大大降低对磨表面的摩擦阻力，避免由于磨损造成的植入体短期失效和磨屑引起的并发症。但是，PVA水凝胶作为修复软骨材料时存在模量低，不能作临时的有效的支撑，难以降解，所做成的水凝胶微观结构不利于细胞黏附，缺乏生物活性的问题。因此，需要对PVA水凝胶进行改性，制备性能更加优异的软骨修复材料。论文《聚乙烯醇/壳聚糖多孔水凝胶的制备和性能研究》(柳淑婧等，辽宁医学院学报，2013年，34(2).)公开了以聚乙烯醇、壳聚糖以及聚山梨酯-80为原料，制备得到软骨修复多孔水凝胶，该水凝胶毒性低，含水量高，具有较好的细胞生长及增殖行为；但是，该水凝胶存在力学性能差、较脆、降解过快、缺乏利于细胞增殖黏附的微观结构等问题。

因此，需要进一步研究一种具有优良的韧性，与人软骨细胞外基质具有相似的力学性能，具有内源细胞招募功能，抗瘢痕的软骨修复材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种壳聚糖-柠檬酸/聚乙烯醇双网络水凝胶支架及其制备方法和用途。

本发明提供了一种壳聚糖-柠檬酸/聚乙烯醇双网络水凝胶支架，它是由如下重量配比的原料制备而成：

聚乙烯醇5～15份、壳聚糖5-15份、柠檬酸10-30份。

进一步地，前述的双网络水凝胶支架是由如下重量配比的原料制备而成：

聚乙烯醇5～15份、壳聚糖5-15份、柠檬酸30份。

聚乙烯醇5份、壳聚糖15份、柠檬酸30份。

进一步地，所述双网络水凝胶支架是将上述原料配制成溶液后经过定向冷冻、冷冻干燥、高温处理、冷却至室温溶胀而得；

所述高温处理为真空条件下程序升温，在80℃保持1～3h、100℃保持1～3h、140℃保持1～3h；优选地，程序升温速度为1℃/min。

进一步地，所述配制成溶液的溶剂为双蒸水；所述聚乙烯醇与溶剂的质量体积比为1g：(90-100)mL；

和/或，所述溶胀的方式为浸没在PBS或生理盐水中。

进一步地，所述定向冷冻的方法为将溶液放入模具中，将模具底部接触液氮进行定向冷冻；

和/或，所述冷却速率为1℃/min。

本发明还提供了一种制备前述的双网络水凝胶支架的方法，它包括如下步骤：

(1)将聚乙烯醇、柠檬酸、壳聚糖溶于溶剂中，将溶液消除气泡后转移到模具中；

(2)将模具放入装有液氮的容器中，模具底部接触液氮，进行定向冷冻；

(3)定向冷冻得到的支架冷冻干燥；

(4)将冷冻干燥后得到的支架进行高温处理，冷却至室温后溶胀，即得；

步骤(4)中，所述高温处理为真空条件下程序升温，在80℃保持1～3h、100℃保持1～3h、140℃保持1～3h；优选地，程序升温速度为1℃/min。

进一步地，

步骤(1)中，所述消除气泡的方法为以1000～2000r/min离心5～10分钟；

和/或，步骤(2)中，所述容器置于0～4℃的环境中；

和/或，步骤(4)中，所述冷却速率为1℃/min；

和/或，步骤(4)中，所述溶胀的方式为浸没在PBS或生理盐水。

本发明还提供了前述的双网络水凝胶支架在制备软骨修复材料中的用途。

本发明还提供了一种软骨修复材料，它是由前述的双网络水凝胶支架制备而得。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、制作的水凝胶支架具有仿生软骨下骨类骨板相似的微观结构，有利于细胞黏附增殖。

2、良好的力学性能，弹性模量接近正常软骨细胞外基质，有利于诱导干细胞向软骨细胞分化。

3、具有吸附内源细胞因子功能。

4、体内体外实验表明，本水凝胶支架具有良好的生物相容性，BMSCs可沿着孔道长入，分化为软骨细胞。体内实验证明该支架可在三月内修复膝关节软骨负重区的大缺损。

综上，本发明制备了一种壳聚糖-柠檬酸/聚乙烯醇双网络水凝胶支架，该水凝胶支架力学性能良好，且降解速度适宜；同时该水凝胶支架具有良好的生物相容性和生物活性，其无细胞毒性，并且其内部微通道结构有利于干细胞粘附、迁移、进行软骨分化。此外，该水凝胶支架在体内进行软骨修复时具有优良的抗炎抗菌作用以及促进软骨再生功能，在组织工程软骨修复领域具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为SN水凝胶和DN水凝胶支架的大体观察、FITR、SEM表征结果：a为SN和DN水凝胶支架的立体显微图像；b为SN和DN水凝胶支架的FTIR表征图谱；c为软骨下层状ECM的SEM图像、SN水凝胶支架的水平和垂直截面的SEM图像、DN水凝胶支架的水平和垂直截面的SEM图像；d为SN水凝胶支架和DN水凝胶支架垂直和水平微通道尺寸的比较(n＝4，*P<0.05)。

图2为SN水凝胶和DN水凝胶支架的机械、溶胀、降解表征结果：a为各水凝胶支架的压缩应力-应变曲线和相应的杨氏模量；b为各组水凝胶支架的含水量；c为各组水凝胶支架的溶胀特性；d为各组水凝胶支架的降解趋势(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns：无意义)。

图3为细胞增殖和细胞毒性试验结果：a为在支架提取物和正常完全培养基(对照)中培养的BMSCs在1、3、5天时的活死染色；b为细胞活力的定量分析；c为在第1、3、5天通过CCK-8测试进行的细胞毒性测定(ns：没有意义)。

图4为与水凝胶支架共培养后BMSCs的形态：左边黑白图片为通过SEM分析的支架上BMSCs的形态；右边彩色图片为荧光显微镜分析的BMSCs的罗丹明偶联鬼笔环肽染色细胞骨架，红色表示细胞骨架，蓝色表示细胞核。

图5为BMSCs在支架上的体外软骨分化结果；a为第2周和第3周RT-qPCR分析的软骨形成特异性标志物(CollagenⅡ、Aggrecan、Sox9)的相对mRNA表达；b为第3周Western blot检测的CollagenⅡ、Aggrecan、Sox9蛋白表达；c为第3周免疫荧光检测胶原Ⅱ、聚集蛋白聚糖、Sox9的表达，黄色表示靶蛋白，蓝色表示细胞核(*P<0.05，**P<0.01***P<0.001)。

图6为手术4、8和12周后关节缺损部位的大体和组织学分析：a为支架组和对照组缺损部位的大体照片，黄色圆圈表示缺损部位，红色箭头表示对照组中缺损周围的骨软骨组织塌陷。；b为利用ICRS和OAS分数评估再生效果。

图7为手术4、8和12周后关节缺损部位的组织学分析：利用H&E、番红-O/FastGreen、Alcian Blue(AB)染色对新生组织进行组织学评估。

图8为手术4、8和12周后新生组织的IHC分析：检测COL II、聚集蛋白聚糖、Sox-9。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1、本发明水凝胶支架的制备

制备双网络(DN)水凝胶支架的方法如下：

在90℃水浴、100r/min搅拌条件下，将0.5g聚乙烯醇(PVA)溶解在48mL双蒸水(ddH₂O)中，得到透明溶液冷却至室温。将3g柠檬酸溶解到上述透明溶液中，接着在剧烈搅拌下将1.5g壳聚糖加入溶液中。以2000r/min离心5分钟消除溶液中的气泡，将获得的溶液转移到具有厚壁(3mm)和薄底(1mm)的定制圆柱形聚四氟乙烯模具(d＝30mm，h＝50mm)中。一个装有液氮的绝热容器用作定向冷冻过程的冷源。将含有溶液的聚四氟乙烯模具放到绝热容器顶部，并将整个装置置于4℃的环境中，将溶液进行定向冷冻，大约1.5h后，将得到的冷冻支架冷冻干燥，72小时后获得冻干的雪白色圆柱体支架。随后，将雪白色圆柱体支架转移到真空烘箱中，抽真空后开始程序升温(80℃保持1h，100℃保持1h，140℃保持1h，升温速度为1℃/min)。然后，将系统逐渐冷却至室温(冷却速率为1℃/min)，获得淡黄色圆柱体支架。最后，将支架浸没在适量PBS(Gibco,上海,中国)中，并用NaHCO₃(1mol/L)将pH调节至7.35～7.45。得到DN水凝胶支架。

通过改变壳聚糖和聚乙烯醇的质量比制备不同DN水凝胶支架。由上述的1.5g壳聚糖、0.5g聚乙烯醇(壳聚糖和PVA的质量比为1.5/0.5，w/w)改为：1.5g壳聚糖、1.5g聚乙烯醇(壳聚糖和PVA的质量比为1.5/1.5，w/w)，1.5g壳聚糖、1.0g聚乙烯醇(壳聚糖和PVA的质量比为1.5/1.0，w/w)，1.0g壳聚糖、1.0g聚乙烯醇(壳聚糖和PVA的质量比为1.0/1.0，w/w)，1.0g壳聚糖、0.5g聚乙烯醇(壳聚糖和PVA的质量比为1.0/0.5，w/w)，0.5g壳聚糖、0.5g聚乙烯醇(壳聚糖和PVA的质量比为0.5/0.5，w/w)。

对比例1、单网络(SN)水凝胶支架的制备

将3g柠檬酸溶解到48mL双蒸水(ddH₂O)中，接着在剧烈搅拌下将1.5g壳聚糖加入溶液中。以2000r/min离心5分钟消除溶液中的气泡，将获得的溶液转移到具有厚壁(3mm)和薄底(1mm)的定制圆柱形聚四氟乙烯模具(d＝30mm，h＝50mm)中。一个装有液氮的绝热容器用作定向冷冻过程的冷源。将含有溶液的聚四氟乙烯模具放到绝热容器顶部，并将整个装置置于4℃的环境中，将溶液进行定向冷冻，大约1.5h后，将得到的冷冻支架冷冻干燥，72小时后获得冻干的圆柱体支架。随后，将圆柱体支架转移到真空烘箱中，抽真空后开始程序升温(80℃保持1h，100℃保持1h，140℃保持1h，升温速度为1℃/min)。然后，将系统逐渐冷却至室温(冷却速率为1℃/min)，获得支架。最后，将支架浸没在适量PBS(Gibco,上海,中国)中，并用NaHCO₃(1mol/L)将pH调节至7.35～7.45。得到单网络(SN)水凝胶支架。

通过改变壳聚糖用量制备不同SN水凝胶支架。壳聚糖用量分别为1.5g、1.0g和0.5g。

以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。

实施例和对比例中制备得到的DN水凝胶支架和SN水凝胶支架宏观形貌图如图1a所示；其中包括干燥支架的主视图和俯视图，以及将支架浸没在PBS中溶胀后的主视图和俯视图。

除有另外说明，下述试验例中的双网络水凝胶支架(DN水凝胶支架)都是使用实施例1中1.5g壳聚糖、0.5g聚乙烯醇制备而得的水凝胶支架；单网络水凝胶支架(SN水凝胶支架)都是使用对比例1中1.5g壳聚糖制备而得的水凝胶支架。

统计分析

所有定量数据均以平均值±标准差的形式报告。使用SPSS 25.0统计软件包进行统计分析。使用非配对学生t检验比较各组。p<0.05的值被认为具有统计学意义。数据用(*)表示0.01<p<0.05，(**)表示0.001<p≤0.01，(***)表示p≤0.001。

试验例1、本发明水凝胶支架的红外表征

采用FTIR光谱仪(Thermo Scientific Nicolet iS50 FTIR)表征本发明制备得到的水凝胶支架，用于鉴定支架的官能团，并确认壳聚糖的酰胺化。采用KBr制备成片剂表征，空气作为背景对照。

结果如图1b所示，图1b中CS1.5-HT为SN水凝胶支架，CS1.5-PVA0.5-HT为由实施例1中1.5g壳聚糖、0.5g聚乙烯醇制备而得的水凝胶支架，CS1.5-PVA1.5-HT为由实施例1中1.5g壳聚糖、1.5g聚乙烯醇制备而得的水凝胶支架。由图1b可知：3500cm^-1、1638cm^-1和1540cm^-1处的特征峰分别对应于N-H和O-H共混，C＝O，N-H。说明本发明水凝胶支架成功制备。

试验例2、本发明水凝胶支架的SEM图像

使用扫描电子显微镜(Nova NanoSEM450)观察脱钙大鼠软骨下骨切片、本发明DN水凝胶支架的水平切片和垂直切片、以及SN水凝胶支架是水平切片和垂直切片。尺寸使用Image J测量。

结果如图1c所示，由图1c可知：双网络水凝胶支架具有和天然软骨下骨类似的微通道，并且孔壁上具有与天然软骨下骨通道孔壁类似的阶梯状条纹(如箭头所指的地方)。单网络水凝胶支架具有类似的孔道，但是孔壁光滑，无阶梯状条纹。结果证明本发明构建的双网络水凝胶支架具有与软骨下骨细胞外基质相似的微观结构和形貌。

图1d为单网络水凝胶支架和双网络水凝胶支架的微通道尺寸，说明本发明制备的水凝胶支架具有大小适宜、适合细胞生长的微通道结构。

试验例3、本发明水凝胶支架的力学性能测试

压缩试验采用高50mm、直径30mm的试样。在PBS中37℃完全溶胀后，使用配备100kN传感器的Instron通用仪器(Instron 5567)在37℃的气氛中进行压缩应力-应变测试。压缩速率保持在5毫米/分钟。每个压缩过程的应变设置为85％。所有测试均重复3次。压缩杨氏模量包括10-15％应变变形下的近似线性拟合值。

结果如图2a所示，由图2a可知：双网络水凝胶支架可承受85％的形变并且保持完整。单网络水凝胶支架较脆弱。且可见双网络水凝胶支架弹性模量约为0.26MPa，显著高于单网络水凝胶支架的弹性模量，接近天然软骨细胞外基质的弹性模量。说明了：所构建的DN水凝胶支架具有完美的软骨修复的力学性能。能承受所需形变，且模量与天然软骨相近，可有效传导力学信号，有利于诱导干细胞向软骨细胞分化。

试验例4、本发明水凝胶支架的溶胀和降解特性

干燥支架称重，然后浸入PBS中。当支架完全溶胀时，测量并记录支架的重量。然后将溶胀支架置于振动台(37℃，100r/min)中。PBS每周更换一次。在每个时间点，将残留的支架冷冻干燥并测量重量。固定时间点的干样品重量记录为Wt，初始干重记录为W0。每组有四个重复(n＝4)。

支架完全溶胀后。重量记录为Ws。吸水量(Ww)＝Ws-W0。溶胀水凝胶支架中的水比例计算为Ww％＝Ww/Ws*100％。在完全溶胀后测量增加的高度和直径，并分别记录为Ds和Hs。测量初始直径和高度并分别记录为Di和Hi。增加的直径计算为增加的直径(％)＝(Ds-Di)/Di*100％。增加的高度计算为增加的高度(％)＝(Hs-Hi)/Hi*100％。

每个时间点支架的残留质量计算为残留质量(％)＝(Wt-W0)/W0*100％。

结果如图2b-2d所示，由图可知：SN水凝胶支架在3个月内就基本完全降解；而DN水凝胶支架在6个月内才基本完全降解。DN水凝胶支架降解速度显著慢于SN水凝胶支架。说明了：本发明DN水凝胶支架具有适合用于软骨修复的降解性能，可提供足够长时间的支撑，且在软骨再生同时能逐渐降解。

试验例5、本发明水凝胶支架的细胞毒性测试

使用活/死染色试剂盒(Solarbio,北京,中国)和细胞CCK-8试剂盒(Solarbio,北京,中国)评价对照组(Petri培养皿)和DN水凝胶支架(CS1.5-PVA0.5)的生物相容性。体外实验前，支架采用环氧乙烷气体法(1200mg/L,37℃,6小时)灭菌，灭菌指示条与支架一起包装，确认灭菌合格。然后，制备支架提取物。简而言之，将2g支架浸入完全培养基中，37℃培养24小时，即获得提取液。1000个BMSCs用100μl以上提取液(支架组)或正常完全培养基(对照组)重悬于96孔培养板中。在每个时间点为每组收集3个重复样品。

培养1、3、5天后，每组加入CCK-8(每组10μl)，在37℃孵育2小时后，在450nm处测量光密度并计算细胞活力。在提取培养基和正常培养基中培养的细胞的吸光度作为OD_Scaffold和OD_对照。

将含有Calcein-AM和碘化丙啶(PI)的混合溶液加入样品中，并在37℃下孵育30分钟。然后在倒置荧光显微镜(Olympus IX83)下观察提取物或正常培养基中细胞的活(绿色)/死(红色)染色。在第1、3、5天分析细胞增殖。

结果如图3所示，由3图可知本发明水凝胶支架无细胞毒性。

试验例6、本发明水凝胶支架对细胞形态和粘附的影响

F-肌动蛋白荧光染色用于评估在支架提取物中培养的BMSCs形态。按照试验例5所述方法培养1、3、5天后，用PBS洗涤细胞并用4％(W/V)中性多聚甲醛固定30分钟。F-肌动蛋白用罗丹明缀合的鬼笔环肽(Solarbio，北京，中国)染色。细胞核用4,6-diami-dino-2-phenylindole(DAPI,Solarbio,Beijing,China)染色。PBS洗涤3次后，在荧光显微镜(NI-E，Nikon，Tokyo，Japan)下，激发波长405nm(DAPI)和发射波长561nm(罗丹明偶联鬼笔环肽)下观察细胞形态。

进一步评估BMSCs是否会通过微通道迁移到支架中。将20,000个BMSCs接种于6孔板，培养24小时后，将准备好的圆柱支架(直径：10mm，高度：5mm)置于接种孔的BMSCs中。培养5天后，支架用4％(W/V)中性多聚甲醛固定30分钟，分级乙醇脱水。然后将样品在真空下干燥6小时，随后在扫描电子显微镜(Nova NanoSEM450)下观察。

结果如图4所示，由图可知：BMSCs在该支架上呈现黏附状态，同时BMSCs可以通过微通道迁移到支架中。说明了：该水凝胶支架不影响干细胞的黏附和迁移，并且其具有的微通道结构有利于干细胞粘附、迁移到支架中。

试验例7、体外软骨分化

将BMSC接种在本发明双网络水凝胶支架(CS1.5-PVA0.5)中，并在37℃的5％CO₂加湿气氛下在软骨形成培养基(Cyagen，广州，中国)中共培养。每3天更换一次培养基。在培养第2周和第3周通过实时定量PCR分析II型胶原、聚集蛋白聚糖、Sox9的表达。第3周，用Western-Blot和免疫荧光法进一步检测CollagenⅡ、Aggrecan、Sox9的表达。

定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)

在培养14天和21天后通过RT-qPCR进行基因表达分析(n＝3)。对于水凝胶结构，收集样品并在液氮中机械研磨。使用Trizol试剂(天根，北京，中国)提取细胞总RNA，并使用试剂盒(Thermo Fisher，上海，中国)逆转录成cDNA。使用实时qPCR系统(Biorad CFX 96)进行RT-qPCR，以评估软骨相关标志物的表达，包括Col II、Aggrecan、SOX9，管家基因GAPDH用于标准化。使用ΔΔCt方法确定相对基因表达的最终结果。

蛋白质印迹(WB)分析

培养21天后用WB检测蛋白表达水平。提取总蛋白，十二烷基硫酸钠分离-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转移到聚偏二氟乙烯膜上，将其与针对Col II(#33340，Signalway Antibody，美国)、Aggrecan(#45068，Signalway Antibody，美国)和SOX9(#49070,Signalway Antibody,USA)的一抗一起孵育，4℃过夜。洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗(1:5000稀释)在室温下孵育1小时，并在暴露前用增强型鲁米诺检测试剂(美国圣克鲁斯生物技术公司)处理膜。β-肌动蛋白的灰度值用于参考。

免疫荧光

制备好的BMSCs支架在软骨形成培养基中培养21天。用PBS轻轻洗涤后，将构建体在4％多聚甲醛中固定30分钟。随后，将构建体在液氮中冷冻并切成3μm的切片。切片用5％BSA封闭。然后，将切片与Col II(#33340，Signalway Antibody，美国)、Aggrecan(#45068，Signalway Antibody，美国)和SOX9(#49070，Signalway Antibody，美国)的一抗在4℃下孵育过夜。第二天复温后，将切片与罗丹明缀合的山羊抗大鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，美国)一起孵育，细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Solarbio，中国北京)所有切片均通过荧光显微镜(Nikon Ni-E)进行观察。

结果如图5所示，由图可知：BMSC可在所合成支架上向软骨分化。说明了：该支架不影响干细胞向软骨细胞分化。

试验例8、软骨的体内再生

本研究中使用的所有SD大鼠均按照四川大学华西医院伦理委员会批准的指南(20211169A)。18只(每组n＝9)12周龄SD大鼠(2.5-3.0kg)制作全层软骨缺损模型，评价DN水凝胶支架(CS1.5-PVA0.5)修复效果。将大鼠单独饲养在笼中并用戊巴比妥(W/V 1.5％)进行全身麻醉。消毒程序已完成。随后，在与前交叉韧带股骨附着点相邻的承重区域产生骨软骨缺损(直径：2.0毫米，深度：3毫米)，以便在该区域观察到大部分早期软骨缺损。试验组将制备好的支架植入缺损处。空白对照组不作处理。两个后膝都参与了手术。手术后，对任何动物都没有进行活动限制。未使用抗生素预防感染。术后4、8、12周腹腔注射过量戊巴比妥(W/V 1.5％)处死大鼠，取膝关节进行大体观察和组织学分析。随后，用宏观评估评估再生组织。此外，苏木精伊红(HE)、番红-O/Fast Green、Alcian Blue(AB)分别用于对各组标本进行染色以进一步研究再生效果。此外，采用免疫组化技术观察CollagenⅡ、Aggrecan、Sox9的表达，并在显微镜(Nikon，Ni-E)下进行评估。

由对各组不知情的3名研究人员分析宏观和组织学结果。评估了国际软骨修复协会(ICRS)评分和Oswestry关节镜评分(OAS)。

结果如图6a所示，由图可知：和对照组相比，大体上，植入4周后，DN水凝胶支架植入的缺损处被新鲜柔软的组织填充，但仍未重塑。在植入DN水凝胶支架的关节中未发现软骨磨损和骨软骨塌陷。此外，在DN水凝胶支架组中未观察到免疫排斥或滑膜增殖。但是，对照组的缺损处充满了薄的纤维组织，这些组织是不规则的，与周围的软骨有明显的区别。此外，在对照组中观察到周围软骨的磨损和缺损周围的骨软骨塌陷。

植入8周后，DN水凝胶支架组植入的缺损处被更成熟和重塑的组织填充，类似于天然软骨。然而，在对照组中，缺损处充满了更多的纤维组织。塌陷区域也被纤维组织取代。

植入12周后，DN水凝胶支架显着修复了软骨缺损(图7)。然而，在对照组中，观察到严重的关节炎、缺陷以及周围塌陷被纤维组织取代。

图6b为ICRS和OAS评估结果，由图可知：DN水凝胶支架组ICRS和OAS评分显著高于对照组，说明本发明DN水凝胶支架对软骨的再生效果好。

大体可视化可能不能彻底反映新生组织的成熟程度。为了对情况进行更彻底的评估，进行组织学和IHC分析以进一步分析新生组织。手术后4、8、12周膝关节股骨脱钙部位涉及苏木精和伊红(H&E)，Safranin-O(Saf-O)/Fast Green和Alcian Blue(AB)染色。为了评估新生组织中软骨特异性标志物的体内表达，通过IHC分析检测COL II、聚集蛋白聚糖(Agg)、Sox-9。

从图7的H&E染色可知：DN水凝胶组的缺陷由均匀光滑的再生组织填充，植入4周时，新生组织类似软骨样组织，随着时间推移，直到术后8、12周，新生组织越来越成熟，形成软骨样组织。相反，对照组在第4周时，缺损处被薄纤维组织填充，几乎没有软骨样组织，随着时间的推移，在术后8周和12周，缺损处发现越来越多的纤维组织，但仍然发现很少的软骨样组织。

Safranin-O/Fast Green、Alcian Blue染色用于更好地区分新生组织中的软骨组织成分。Safranin-O会将软骨组织染成红色，而Fast Green会将骨组织染成绿色。AlcianBlue将软骨组织特异性染色为蓝色。如图7所示，4周时，DN水凝胶支架组缺损处可见少量软骨组织。随着时间的推移，在缺损处发现越来越多的软骨组织。手术后12周，缺损处几乎被软骨组织填满。在对照组中，在所有3个时间点的缺损处均发现很少的软骨组织。

此外，IHC分析被用来分析cartage特定标志物，包括胶原蛋白II、聚集蛋白聚糖(Agg)和Sox9。如图8所示，DN水凝胶支架组的再生软骨在ECM上显示出更多的胶原蛋白II、聚集蛋白聚糖和Sox9。此外，DN水凝胶支架组中的细胞保持形态并垂直排列为柱状，这与天然软骨中的相似。在DN水凝胶支架组中，更深部分的骨组织也被重塑。与DN水凝胶组相比，软骨特异性标志物的表达较差，表面更不规则。

试验结果说明了：DN水凝胶支架从几个方面具有促进关节承重区软骨再生的巨大潜力：1)为缺损周围的组织提供临时机械支撑，避免周围的骨软骨组织塌陷。2)进行内源性细胞的浸润、附着、增殖、迁移以及促进软骨分化。3)避免了缺陷的纤维置换。

Claims

1.一种壳聚糖-柠檬酸/聚乙烯醇双网络水凝胶支架，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成：

聚乙烯醇5～15份、壳聚糖5-15份、柠檬酸10-30份。

2.根据权利要求1所述的双网络水凝胶支架，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成：

聚乙烯醇5～15份、壳聚糖5-15份、柠檬酸30份。

3.根据权利要求2所述的双网络水凝胶支架，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成：

聚乙烯醇5份、壳聚糖15份、柠檬酸30份。

4.根据权利要求1～3任一项所述的双网络水凝胶支架，其特征在于：所述双网络水凝胶支架是将上述原料配制成溶液后经过定向冷冻、冷冻干燥、高温处理、冷却至室温溶胀而得；

5.根据权利要求4所述的双网络水凝胶支架，其特征在于：所述配制成溶液的溶剂为双蒸水；所述聚乙烯醇与溶剂的质量体积比为1g：(90-100)mL；

和/或，所述溶胀的方式为浸没在PBS或生理盐水中。

6.根据权利要求4所述的双网络水凝胶支架，其特征在于：所述定向冷冻的方法为将溶液放入模具中，将模具底部接触液氮进行定向冷冻；

和/或，所述冷却速率为1℃/min。

7.一种制备权利要求1～6任一项所述的双网络水凝胶支架的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(3)定向冷冻得到的支架冷冻干燥；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

和/或，步骤(2)中，所述容器置于0～4℃的环境中；

和/或，步骤(4)中，所述冷却速率为1℃/min；

和/或，步骤(4)中，所述溶胀的方式为浸没在PBS或生理盐水。

9.权利要求1～6任一项所述的双网络水凝胶支架在制备软骨修复材料中的用途。

10.一种软骨修复材料，其特征在于：它是由权利要求1～6任一项所述的双网络水凝胶支架制备而得。