CN114848915A - 一种耳软骨组织工程复合物及其用途 - Google Patents

一种耳软骨组织工程复合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种耳软骨组织工程复合物。具体地，所述复合物包括含有耳软骨细胞的耳软骨凝胶或耳软骨膜片颗粒，和一多孔框架结构，并且所述耳软骨凝胶或耳软骨膜片颗粒负载于所述多孔框架结构，形成耳软骨凝胶/耳软骨膜片颗粒‑框架结构复合物。本发明还提供了所述耳软骨组织工程复合物的制备方法及其在关节软骨的修复与重建中的用途。

Description

一种耳软骨组织工程复合物及其用途
技术领域
本发明涉及生物医学组织工程领域，具体地，涉及一种耳软骨组织工程复合物和其制备方法，及其在修复关节缺损中的应用。
背景技术
近些年来，随着经济社会的快速发展，各类运动损伤、意外伤以及关节退行性病变等各种类型的关节软骨病变日趋多见，而软骨病变依靠患者自体能力是难以修复的，所以关节修复临床需求巨大。目前临床上对于关节软骨病变的治疗方法主要为姑息性治疗及修复性治疗。姑息性治疗主要包括关节镜下清理术和软骨成形术等，这类治疗方法可清理关节表面不平整的软骨面及移除软骨碎片等，以恢复关节面的光滑平整，此类方法创伤较小且可以一定程度缓解患者的症状，但其疗效有限，不能有效缓解关节炎的发展。修复性治疗包括微骨折治疗、骨软骨移植等，此类治疗虽使得局灶性关节软骨缺损得到一定的修复，但创伤较大易导致供区并发症。传统治疗方法总体而言疗效欠佳，自体移植缺乏供体，人工关节远期并发症难以避免。
随着组织工程学的进步，人们逐渐开始研究使用组织工程所构建的支架或组织来尝试修复软骨缺损。现有组织工程修复技术所构建的原位软骨细胞-材料复合物(自体软骨细胞移植ACI或基质诱导的自体软骨细胞移植MACI)虽已在临床治疗中逐渐开展，但仍有诸多劣势难以避免：1、细胞来源为关节软骨，在本已受损的关节部位获取细胞，难以避免的会增加原有关节的损伤。2、关节软骨细胞增殖能力有限，前期细胞-材料复合物构建周期长，患者需要等待较长时间。3、细胞-材料复合物强度低，远不及天然软骨的力学强度水平。
据此，关节修复亟需新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耳软骨组织工程复合物及其制备方法，以及在修复关节缺损中的用途。
本发明的第一方面，提供了一种耳软骨组织工程复合物，所述复合物包括：
(a)载体，所述载体包括多孔框架结构；和
(b)接种于或负载于所述载体的含有耳软骨细胞的耳软骨凝胶或耳软骨膜片颗粒。
在另一优选例中，所述的复合物包括将所述耳软骨凝胶或耳软骨膜片颗粒接种于所述载体并经成软骨培养后所形成的复合物(在所述复合物中，耳软骨细胞负载于载体并与载体形成更为紧密的一体结构)。
在另一优选例中，所述的复合物包括将所述耳软骨凝胶或耳软骨膜片颗粒接种于所述载体但未经成软骨培养后所形成的复合物。
在另一优选例中，所述耳软骨细胞来自人类或非人类哺乳动物。
在另一优选例中，所述耳软骨细胞来源于自体耳软骨细胞或异体耳软骨细胞，优选地为自体耳软骨细胞。
在另一优选例中，所述耳软骨细胞取自受试者自体耳软骨细胞。
在另一优选例中，所述受试者为人类或非人类的哺乳动物。
在另一优选例中，所述受试者具有关节缺损。
在另一优选例中，所述关节缺损为关节软骨缺损。
在另一优选例中，所述关节缺损为膝关节缺损、肘关节缺损、髋关节缺损、踝关节缺损、腕关节缺损、下颌关节缺损或其组合。
在另一优选例中，所述的耳软骨凝胶包括软骨细胞构成的细胞群以及软骨细胞所分泌的细胞外基质，其中所述细胞外基质包裹所述的细胞群，并且所述耳软骨凝胶呈凝胶态，并且软骨细胞的密度为至少1.0×108个/ml或1.0×108个/g。
在另一优选例中，所述的耳软骨凝胶是用耳软骨细胞经凝胶化培养而制备的。
在另一优选例中，所述的凝胶化培养是用凝胶化培养基进行的体外培养。
在另一优选例中，所述的凝胶化培养基含有以下组分：含4-5wt％葡萄糖的高糖DMEM培养基、10％FBS(v/v)和100U/ml青-链霉素。
在另一优选例中，所述耳软骨凝胶的粘附率≥90％，较佳地≥95％。
在另一优选例中，所述耳软骨凝胶中，软骨细胞的浓度为1.0×108个/ml-10×108个/ml，较佳地1.5-5×108个/ml。
在另一优选例中，所述耳软骨凝胶是凝胶化培养2.5-5.5天，较佳地3-5天得到的。
在另一优选例中，所述耳软骨细胞来自人类或非人类哺乳动物。
在另一优选例中，所述耳软骨细胞来源于自体耳软骨细胞或异体耳软骨细胞，优选地为自体耳软骨细胞。
在另一优选例中，所述耳软骨细胞取自受试者自体耳软骨细胞。
在另一优选例中，所述受试者为人类或非人类的哺乳动物。
在另一优选例中，所述受试者具有关节缺损。
在另一优选例中，所述关节缺损为关节软骨缺损。
在另一优选例中，所述关节缺损为膝关节缺损、肘关节缺损、髋关节缺损、踝关节缺损、腕关节缺损、下颌关节缺损或其组合。
在另一优选例中，所述的耳软骨膜片颗粒包括软骨细胞构成的细胞群以及软骨细胞所分泌的细胞外基质，其中所述细胞外基质包裹所述的细胞群，并且所述耳软骨颗粒是由薄片状的耳软骨膜片剪碎制得，其中耳软骨细胞的密度为至少1.0×108个/ml或1.0×108个/g。
在另一优选例中，所述耳软骨膜片中，软骨细胞的浓度为1.0×108个/ml-10×108个/ml，较佳地1.5-5×108个/ml。
在另一优选例中，所述耳软骨膜片是凝胶化培养6-30天，较佳地7-20天，最佳地10-15天得到的。
在另一优选例中，所述的凝胶化培养是用凝胶化培养基进行的体外培养。
在另一优选例中，所述的凝胶化培养基含有以下组分：含4-5wt％葡萄糖的高糖DMEM培养基、10％FBS(v/v)和100U/ml青-链霉素。
在另一优选例中，所述耳软骨膜片的厚度为0.2-0.25mm。
在另一优选例中，所述耳软骨膜片颗粒的平均体积为0.2μl。
在另一优选例中，所述耳软骨膜片颗粒的表面积为0.05-10mm2，优选地，为1-5mm2，更优选地，平均面积为1mm2。
在另一优选例中，所述的多孔框架结构是由选自下组的生物可降解材料制成：PCL、PGA、同种异体骨修复材料、异种骨修复材料、或脱钙骨基质。
在另一优选例中，所述框架结构还可以负载有明胶、胶原、丝素、水凝胶或其组合。
在另一优选例中，所述框架结构为PCL框架。
在另一优选例中，所述框架结构为脱钙骨基质。
在另一优选例中，所述框架结构为同种异体骨修复材料。
在另一优选例中，所述同种异体骨修复材料为脱钙骨基质。
在另一优选例中，所述框架结构为异种骨修复材料。
在另一优选例中，所述异种骨修复材料为脱钙骨基质。
在另一优选例中，所述框架结构的形状包括圆柱体、长方体或其他特定形状。
在另一优选例中，所述耳软骨凝胶/耳软骨膜片颗粒-框架结构复合物在关节微环境下可转化为关节软骨。
本发明的第二方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的耳软骨组织工程复合物的方法，其包括以下步骤：将本发明第一方面所述的耳软骨凝胶或耳软骨膜片颗粒接种于多孔框架结构，经体外成软骨培养，从而获得所述的耳软骨组织工程复合物。
在另一优选例中，将所述耳软骨凝胶采用直接填充的方法接种于多孔框架结构。
在另一优选例中，将所述耳软骨膜片颗粒采用离心的方法接种于多孔框架结构。
在另一优选例中，所述离心的方法的离心体系中不加入液体，采用反复离心法使耳软骨膜片颗粒进入框架结构。
在另一优选例中，所述的成软骨培养是使用成软骨培养基进行的体外培养。
在另一优选例中，所述的成软骨培养基具有以下组分：高糖DMEM培养基、血清替代物、脯氨酸、维生素C、转化生长因子-β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子1(IGF-I)和地塞米松。
在另一优选例中，所述的血清替代物为ITS premix，其中包含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、亚油酸、牛血清清蛋白、丙酮酸、抗坏血酸磷酸盐。
在另一优选例中，所述的成软骨培养时间为3-15天，优选地为5-11天。
本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的耳软骨组织工程复合物的用途，用于制备用于修复关节缺损的医用产品。
在另一优选例中，所述关节缺损为关节软骨缺损。
在另一优选例中，所述关节缺损为膝关节缺损、肘关节缺损、髋关节缺损、踝关节缺损、腕关节缺损、下颌关节缺损或其组合。
本发明的第四方面，提供了一种修复关节缺损的方法，使用本发明第一方面所述的耳软骨组织工程复合物，移植入待修复患者的缺损关节内。
在另一优选例中，所述关节缺损为关节软骨缺损。
在另一优选例中，所述关节缺损为膝关节缺损、肘关节缺损、髋关节缺损、踝关节缺损、腕关节缺损、下颌关节缺损或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了天然弹性软骨和透明软骨的结构特点。分别显示了两种软骨的HE染色、Saf-O染色、COL-II染色和Elastin染色结果。
图2显示了耳软骨细胞凝胶复合物和关节软骨细胞凝胶复合物植入关节软骨处6个月后取材的结果。A和D为整体关节软骨，其中植入后的再生软骨组织用虚线圈出，并在B和E中进行放大展示；C和F为植入后再生软骨组织的切面图。
图3显示了关节软骨微环境对耳软骨细胞和关节软骨细胞异位成软骨类型的影响。分别显示了两种再生软骨的HE染色、Saf-O染色、COL-II染色和Elastin染色结果。图中的标尺(bar)为150μM。
图4显示了脱钙骨基质框架的大体示意图。图中标尺为1cm。
图5显示了脱钙骨基质框架的电镜图，图中的标尺(bar)为1mm。
图6显示了耳软骨细胞培养3天和15天所得到的耳软骨凝胶和耳软骨膜片示意图。其中A-C为3天培养的耳软骨凝胶，D-E为15天培养的耳软骨膜片(D和E)及剪碎形成的耳软骨膜片颗粒(F)。
图7显示了耳软骨凝胶-框架结构复合物实物图。图中标尺为1cm。
图8显示了耳软骨膜片颗粒-框架结构复合物实物图。图中标尺为1cm。
图9显示了接种样品(细胞悬液或软骨凝胶)于脱钙骨基质上培养24小时后的粘附率比较图。
图10显示了凝胶软骨-脱钙骨复合物(A)与单纯脱钙骨(B)移植到山羊膝关节缺损部位上的对比图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现并开发了一种耳软骨组织工程复合物，该耳软骨组织工程复合物是一体化的耳软骨凝胶/耳软骨膜片颗粒-框架结构复合物。实验证明，通过获取原代耳软骨进行扩增培养，将特定数量的耳软骨细胞接种于和/或铺于平坦或基本平坦的培养表面，使得被接种的软骨细胞形成特定的层叠结构，并在合适的凝胶化培养条件下培养所述层叠的软骨细胞，因培养时间不同，可形成一种新颖的凝胶状耳软骨或膜片状耳软骨。将制得的凝胶状软骨或膜片状软骨与多孔框架结构结合，制备得到的耳软骨组织工程复合物在移植进入缺损关节后，可以在缺损的关节处转化再生为关节软骨，实现关节软骨的修复重建。在此基础上，完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“耳软骨组织工程复合物”包括如本文所述的经体外成软骨培养或未经体外成软骨培养的耳软骨凝胶-框架复合物和耳软骨膜片颗粒-框架复合物，在本发明中，可统一称为耳软骨组织工程复合物。
如本文所用，术语“接种”意指将耳软骨细胞接种于细胞培养皿中，也可意指将耳软骨凝胶/耳软骨膜片颗粒接种于指定框架结构中并使其均匀分布，本领域技术人员根据上下文可以理解所用“接种”的含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
耳软骨凝胶及其制备
如本文所用，“凝胶耳软骨”、“耳软骨凝胶”、“凝胶态耳软骨”、“凝胶状耳软骨”、“本发明的耳软骨凝胶”或“本发明的凝胶耳软骨”可互换使用，皆指本发明的呈凝胶状态的耳软骨(干)细胞，尤其是将特定浓度的耳软骨细胞接种于和/或铺于平坦或基本平坦的培养表面，使得被接种的耳软骨细胞形成层叠结构，并在合适的凝胶化培养条件下培养具有层叠结构的耳软骨细胞，从而形成凝胶状耳软骨培养物。
本发明的凝胶耳软骨是不同于游离的耳软骨细胞、离心沉淀的耳软骨细胞和耳软骨团块(pellet)的新型耳软骨。本发明的凝胶耳软骨可视为介于游离的耳软骨细胞和致密的耳软骨团块之间的一种特定形态的耳软骨。本发明凝胶耳软骨，由于在凝胶化培养过程中，耳软骨细胞不仅与平面(X-Y平面)上相邻细胞存在接触和/或相互作用，而且还与其上方和/或下方和/或侧上方或下方等多方向的相邻耳软骨细胞存在接触和/或相互作用，从而促使耳软骨细胞分泌和形成更多的细胞外基质，从而将将凝胶化培养的耳软骨细胞包裹于具有一定粘性的细胞外基质中，从而使得本发明的凝胶耳软骨既具有紧密联系，而具有一定的粘性和流动性，从而使得本发明的凝胶耳软骨更适合接种和负载于各种不同的载体材料(尤其是多孔的载体材料)上，从而形成用于修复耳软骨的复合物。
此外，本发明的凝胶耳软骨一方面具有凝胶状态，另一方面具有异乎寻常高的细胞密度(通常至少1.0×108个/ml或更高，如1.0×108个-10×108个/ml)，因此，特别适合制备修复各类耳软骨的移植物，或用于耳软骨移植或耳软骨修复手术。
在本发明中，修复耳软骨的复合物包括将本发明的凝胶耳软骨负载于载体材料(尤其是多孔生物框架结构)所形成的未经成耳软骨培养的复合物，也包括将本发明的凝胶耳软骨负载于载体材料(尤其是多孔生物框架结构)并经成耳软骨培养所形成的复合物。
在本发明中，适合用于移植于人体或动物体的复合物就是本发明耳软骨组织工程复合物，即将本发明的凝胶耳软骨负载于载体材料(尤其是多孔生物框架结构)并经成耳软骨培养所形成的复合物。
优选地，在本发明中，在凝胶化培养条件系下，体外培养一段时间t1，从而形成了凝胶耳软骨。优选地，所述的t1为2.5-5.5天，较佳地3-5天。
在本发明中，一个特征是层叠接种，即将特定密度的耳软骨细胞接种于培养容器后，接种的耳软骨细胞会通过例如沉积作用形成互相层叠的多层耳软骨细胞群(即具有层叠结构的耳软骨细胞群)。典型地，以培养皿(或培养容器)的培养面积计算，并设铺设单层细胞的汇合度为100％，则本发明的层叠接种的细胞数量S1是对于100％汇合度的细胞数量S0的n倍(即S1/S0＝n)，其中所述的n为1.5-20，较佳地2-10，更佳地2.5-5。
耳软骨膜片及其制备
如本文所用，“耳软骨膜片”、“膜片状耳软骨”、或“本发明的耳软骨膜片”可互换使用，皆指本发明的呈膜片状态的耳软骨(干)细胞，尤其是将特定浓度的耳软骨细胞接种于和/或铺于平坦或基本平坦的培养表面，使得被接种的耳软骨细胞形成层叠结构，并在合适的培养条件下培养具有层叠结构的耳软骨细胞，从而形成膜片状耳软骨培养物。
本发明的“耳软骨膜片”是在本发明所述的“耳软骨凝胶”的制备基础上，通过延长凝胶化培养时间所制备得到的。即，在本发明中，在凝胶化培养条件下，将接种于和/或铺于平坦或基本平坦的培养表面的耳软骨细胞体外培养一段时间t2，从而形成了耳软骨膜片。优选地，所述的t2为6-30天，较佳地7-20天，最佳地10-15天。
本发明的耳软骨膜片一方面具有异乎寻常高的细胞密度(通常至少1.0×108个/ml或更高，如1.0×108个-10×108个/ml)，另一方面它的厚度薄(仅有0.2-0.25mm)并且韧性佳，可被剪碎为平均体积0.2μl的“耳软骨膜片颗粒”，通过简单离心的方式填充于多孔框架结构中，因此，特别适合制备修复各类软骨的移植物，或用于软骨移植或软骨修复手术。
在本发明中，修复软骨的复合物包括将本发明的耳软骨膜片颗粒负载于载体材料(尤其是多孔框架结构)所形成的未经成软骨培养的复合物，也包括将本发明的耳软骨膜片颗粒负载于载体材料(尤其是多孔框架结构)并经成软骨培养所形成的复合物。
在本发明中，适合用于移植于人体或动物体的复合物就是本发明的耳软骨组织工程复合物，即将本发明的耳软骨膜片颗粒负载于载体材料(尤其是多孔框架结构)并经成软骨培养所形成的复合物。
如本文所用，“特定浓度”或“特定密度”是指在3.5cm的培养皿(例如，六孔板中的一个孔)中，接种1.0×107-2.0×107个细胞，较佳地，为1.5×107个细胞。经凝胶化培养不同的时间，最终形成所含耳软骨细胞密度为1.0×108个-10×108个/ml的耳软骨凝胶或所含耳软骨细胞密度为1.0×108个-10×108个/ml的耳软骨膜片。
在另一优选例中，所述的凝胶化培养条件为：接种特定密度的软骨细胞，使用凝胶化培养基培养，所述凝胶化培养基为含10％胎牛血清及100U/ml青-链霉素的高糖(4-5wt％葡萄糖)DMEM培养基。
如本文所用，术语“成软骨培养”是指使用成软骨培养基培养接种了耳软骨凝胶或耳软骨膜片颗粒的多孔框架结构，最终使其形成一体化的耳软骨凝胶-框架结构复合物或耳软骨膜片颗粒--框架结构复合物，即本发明的耳软骨组织工程复合物，用于移植于人体或动物体的软骨缺损处。
软骨和软骨细胞
软骨即软骨组织，由软骨细胞和细胞间质组成。软骨内的基质呈凝胶状态，具有较大韧性。软骨是以支持作用为主的结缔组织。软骨内不含血管和淋巴管，营养物由软骨膜内的血管中渗透到细胞间质中，再营养骨细胞。
根据细胞间质的不同可把软骨分为3种，即透明软骨、弹性软骨和纤维软骨。透明软骨的基质是由胶原纤维、原纤维和周围无定形的基质组成。在胚胎时期有临时支架作用，后来这种作用被骨代替。成人的透明软骨主要分布在气管和支气管壁中、肋骨的胸骨端和骨的表面(关节软骨)。弹性软骨的基质中除了胶原纤维还有弹性纤维，这种软骨弹性较大，主要分布在耳廓、外耳道壁、耳咽管和会厌、喉部等处。纤维软骨基质中有成束的胶原纤维平行或交叉排列，较坚韧。分布在椎间盘、关节盂、关节盘以及一些腱、韧带等处，以增强运动的灵活性和保护、支持等作用。
透明软骨和弹性软骨的最大区别在于前者(即透明软骨)表达丰富的弹性蛋白(Elastin)，两者的结构特点如图1所示。
在本发明的优选例中，将取自具有关节缺损的受试者的自体耳软骨细胞(弹性软骨)，通过体外培养，制备成耳软骨凝胶或耳软骨膜片颗粒，并将所述耳软骨凝胶或耳软骨膜片颗粒接种于多孔框架结构上，制备得到耳软骨凝胶-框架复合物或耳软骨膜片颗粒-框架复合物，并用于关节缺损的关节软骨(透明软骨)修复。
HE染色、Saf-O染色、COL-II染色和Elastin染色
HE染色：苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
Saf-O染色：又称番红O染色，是一种常用的软骨染色方法。Saf-O染色的原理在于嗜碱性的软骨与碱性染料番红O结合呈现红色；番红O是一种结合多阴离子的阳离子染料，其显示软骨组织是基于阳离子染料与多糖阴离子基团(硫酸软骨素或硫酸角质素)结合。
COL-II染色：COL-II即II型胶原蛋白，它是一种高分子蛋白质，丝状的胶原蛋白纤维与弹性蛋白及多糖蛋白相互交织形成网状结构，产生一定的机械强度。Ⅱ型胶原蛋白主要由软骨细胞产生，多存在于骨骼、关节、肌腱等组织。
Elastin染色：Elastin即弹性蛋白，是弹性纤维的主要成分。已发现弹性蛋白的两种形式：弹性蛋白I存在项韧带、主动脉和皮肤中，弹性蛋白II可从软骨中得到。在本发明的实施例中，采用Elastin染色来反映软骨细胞中的弹性蛋白的表达情况，用以区别不同类型的软骨细胞，例如耳软骨和关节软骨。
软骨转化
如本文所用，术语“软骨转化”是指不同类型软骨之间的转化，即由一种类型的软骨转变为另一种类型的软骨，或一种类型的软骨细胞转变为另一种类型的软骨细胞。
在本发明中，经体外培养形成的耳软骨组织工程移植物中的耳软骨细胞细胞(透明软骨细胞)在被移植进入缺损的关节后，在关节组织微环境下，转化为关节软骨细胞(弹性软骨细胞)，并最终形成关节软骨。
MACI和ACI
MACI是matrix-induced autologous chondrocyte implantation的缩写，意为“基质诱导的自体软骨细胞移植”，是利用组织工程科技手段进行软骨细胞移植的技术。MACI是目前全世界最新、最好的治疗关节软骨缺损的技术。
ACI是autologous chondrocyte implantation的缩写，意为“自体软骨细胞移植”，是目前应用较广泛的治疗关节软骨损伤的组织工程技术之一。在MACI问世之后，ACI就被相应称为“传统ACI”，以便与MACI区别。
多孔框架结构
如本文所用，术语“多孔框架结构”是指其表面和内部具有一定数量的孔隙以便于使接种于其上的耳软骨凝胶或耳软骨膜片附着的由生物相容性材料制成的一载体。在本发明中，所述生物相容性材料优选生物可降解材料。
生物可降解材料是指在移植进入动物体内后，可以在体内被分解的材料。本发明的耳软骨组织工程移植物的多孔框架结构是由选自下组的生物可降解材料制成：PCL、PGA、同种异体骨修复材料、异种骨修复材料、脱钙骨基质或其组合，但不限于以上所述材料。其中同种异体骨修复材料和异种骨修复材料包括脱钙骨基质材料。在本发明的优选实施例中，所述耳软骨组织工程复合物的多孔框架结构为脱钙骨基质。
脱钙骨基质
本发明的优选实施例中使用的脱钙骨基质，其厚度为0.3～0.8cm，较佳地0.4～0.6cm，最佳地0.5cm。所述脱钙骨基质的脱钙量为30％～50％，脱钙程度合适，支持作用佳，并易于修整裁剪为合适的形状和大小。所述的脱钙骨基质的孔隙的孔径为400-800μm，易于填充软骨细胞。
脱钙骨基质(DBM)是由同种异体骨或异种骨经脱钙处理，能降低免疫原性的骨移植材料。脱钙程度不同对应的机械强度也不同。具有良好的生物学特性、骨诱导性和骨传导性和生物降解性，促进新骨形成及骨组织矿化，进而加速骨愈合，可以单独或与自体骨、其它生物材料、生长因子联合有效修复骨损伤，是比较理想的骨组织工程支架材料。然而一般的脱钙骨基质的孔径较大，接种软骨细胞悬液时细胞黏附率极低，不利于组织工程载体的构建。
在另一优选例中，本发明中所述脱钙骨基质具有400-800μm孔径，87.3％±3.7％孔隙率。
PCL
聚己内酯(Polycaprolactone，PCL)是一种全生物降解高分子材料，是由ε-己内酯在金属有机化合物(如四苯基锡)做催化剂，二羟基或三羟基做引发剂条件下开环聚合而成，属于聚合型聚酯，其分子量与歧化度随起始物料的种类和用量不同而异。其外观为白色固体粉末，无毒，不溶于水，易溶于多种极性有机溶剂。PCL具有良好的生物相容性、良好的有机高聚物相容性，以及良好的生物降解性，可用作细胞生长支持材料，可与多种常规塑料互相兼容，自然环境下6-12个月即可完全降解。此外，PCL还具有良好的形状记忆温控性质，被广泛应用于药物载体、增塑剂、可降解塑料、纳米纤维纺丝、塑形材料的生产与加工领域。
在一优选实施例中,本发明所述的耳软骨凝胶/耳软骨膜片颗粒可以接种于PCL框架结构上，形成耳软骨凝胶-框架复合物或耳软骨膜片颗粒-框架复合物，用于修复关节软骨。
同种异体骨修复材料
同种异体骨是目前骨科最常用的骨植入材料，主要用于修复、填充骨缺损，起到固定和支撑作用。同种异体骨取自捐献的人体骨组织，“同种”表明它来自人体，“异体”表明它不是来自患者自体。供体选定后，通常在死亡24小时内，无菌条件下取得，并立即加工处理。保存方法包括新鲜冷冻和冷冻干燥两种。新鲜冷冻骨在-20℃条件下可储存1年；冷冻干燥骨经真空包装后可在室温长时间保存，且抗原性更低。与新鲜冷冻骨相比，冷冻干燥骨的力学性能会降低50％，而且环氧乙烷或大剂量γ射线照射消毒会进一步降低骨的诱导性能。
在一优选实施例中，本发明所述的耳软骨凝胶/耳软骨膜片颗粒可以接种于同种异体骨所制备成的框架结构上(例如脱钙骨基质)，形成耳软骨凝胶-框架复合物或耳软骨膜片颗粒-框架复合物，用于修复关节软骨。
异种骨修复材料
异种骨是来源于其他物种如牛、猪等的骨修复材料。其来源广泛且价格相对低廉。但异种骨的免疫原性强，植入患者体内后容易引起免疫排斥反应。此外，异种骨无诱导间充质干细胞增殖的能力，生物活性差，需要复合其他修复材料或相关细胞因子才能达到修复效果。
在一优选实施例中，本发明所述的耳软骨凝胶/耳软骨膜片颗粒可以接种于异种骨所制备成的框架结构上(例如脱钙骨基质)，形成耳软骨凝胶-框架复合物或耳软骨膜片颗粒-框架复合物，用于修复关节软骨。
本发明所用的培养基
成软骨培养基：高糖DMEM培养基，1％1×ITS premix((ITS通用型培养混合剂，含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、亚油酸、牛血清蛋白、丙酮酸、抗坏血酸磷酸盐)，40μg/ml脯氨酸，10ng/ml TGF-β1，100ng/ml IGF-1,40ng/ml地塞米松和50μg/ml维生素C。
凝胶化培养基：含4-5wt％葡萄糖，10％FBS(v/v)和100U/ml青链霉素的DMEM培养基。
黏附率
在本发明中，当将本发明的耳软骨凝胶接种于载体材料(尤其是多孔生物框架结构)时，本发明中的耳软骨凝胶具有一定的粘附率，通过本发明提供的粘附率测定方法确定。本发明的耳软骨凝胶的粘附率≥90％，较佳的，≥95％。
本发明中的粘附率如下定义：
检测所接种样品(例如耳软骨凝胶)的DNA定量A1；检测接种后复合物(例如耳软骨凝胶-框架复合物)培养24小时后的DNA定量A2；粘附率为A2/A1*100％。
所述黏附率的测定方法包括以下步骤：
取接种样品(例如耳软骨凝胶或耳软骨凝胶-框架复合物)，使用蛋白酶K消化，消化后的样品使用使用PicoGreen试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)定量检测，使用荧光酶标仪测定520nm的吸光度，依据标准曲线公式计算出DNA含量。
本发明的主要优点包括：
(1)耳软骨凝胶较软骨细胞而言更加成熟，且具有一定的流动性。
(2)细胞来源为耳软骨，无需从关节部位取材，不会对患者关节区域二次损伤，且在关节环境中耳软骨细胞将转化为关节软骨细胞
(3)耳软骨扩增能力显著优于关节软骨，患者等待周期短。
(4)所选取的框架结构多为天然材料或降解产物为中性的材料，体内降解速率适中，机体免疫反应较低，生物安全性好。
(5)框架结构材料孔径较大，孔隙率较好，但接种软骨细胞悬液时细胞黏附率极低，使用具有一定流动性且较为粘稠的软骨凝胶样组织可有效提高黏附率。
(6)相较于其他组织工程修复方法，耳软骨凝胶/耳软骨膜片颗粒-框架结构复合物可稳定再生软骨。
(7)耳软骨凝胶/耳软骨膜片颗粒-框架结构复合物可稳定再生软骨可提供即时力学支撑，即时修复效果好
下面，通过具体的实施例对本发明做进一步说明。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
实施例1
不同类型软骨在天然关节软骨微环境中转归的研究
根据细胞外基质结构的不同，软骨组织分为弹性软骨、透明软骨、纤维软骨三种类型，其中耳软骨为弹性软骨，关节软骨为透明软骨，两者的最大区别在于前者表达丰富的弹性蛋白(见图1)。为研究不同类型软骨在天然关节软骨微环境中转归，遂进行如下实验。
(1)两种软骨细胞的取材分离与培养:山羊在麻醉完成后,无菌条件下切取一部分耳廓、同时刮取关节非负重区软骨。在无菌条件下分别将其剪成1mm×lmm大小,配置浓度为0.15％胶原酶；将软骨碎片加入配置好的胶原酶中消化8小时；8小时后将胶原酶溶液过滤离心得到耳软骨细胞，进行原代及传代培养，扩增到所需细胞量。
(2)Pluronic温敏凝胶的制备:将pluronic粉剂与H-DMEM按3:10的比例在室温下混合,然后在4℃冰箱里搅拌过夜,最后用高温消毒灭菌待用。
(3)细胞凝胶混合物的制备:分别以0.25％胰蛋白酶消化收集细胞,计数,取100×106的细胞与Pluronic温敏凝胶充分混合,静置在培养箱中30min,PBS清洗两遍弃上清。将细胞沉淀在冰盒中预冷，每100×106的细胞加入1ml凝胶充分混合后,用1ml注射器装20ml针头抽取细胞凝胶混合物,手握注射器让凝胶迅速呈半固态以保持细胞在凝胶中均匀分布的状态。
(4)将三种软骨细胞凝胶复合物回植入关节软骨微环境中:山羊在麻醉完成后。手术侧裸关节以下用无菌巾包裹好。伸屈膝关节以确定髌骨活动的位置,沿髌韧带后缘做一长约8-10cm纵向弧形切口,上方达髌骨上缘上约2-3cm,下端达腔骨结节下1cm,向内侧掀起皮肤,以大血管巧及脑膜剪分层剪开皮下、浅筋膜、深筋膜,沿酿初带后缘打开关节囊及滑膜,注意不要损伤初带。充分暴露滑车部位,用5mm直径的环钻造成软骨全层的圆形缺损,分别将不同的软骨细胞凝胶混合物注入缺损中。体内培养六个月。
(5)取材结果：体内六个月取材发现，耳软骨细胞凝胶复合物和关节软骨细胞凝胶复合物在关节软骨微环境中均形成半透明样软骨组织(见图2A-C，D-F)，且均无弹性蛋白表达(见图3)。
实施例2
耳软骨凝胶-框架结构复合物制备
在本实施例中，制备耳软骨凝胶-框架复合物。具体操作方法如下：
(1)取受试者自体部分耳软骨组织，无菌切取2.5×2.5cm2的耳软骨组织,使用无菌器械将软骨表面的黏膜及纤维组织剥离；
(2)将耳软骨组织剪为1.5×1.5mm2大小软骨碎片；配置浓度为0.15％胶原酶；将软骨碎片加入配置好的胶原酶中消化8小时；
(3)8小时后将胶原酶溶液过滤离心得到耳软骨细胞，使用含有10％的FBS的高糖DMEM培养基进行原代及传代培养；
(4)扩增后收集细胞重悬，按照8×106/10ml至30×106/10ml/孔的细胞量接种于六孔板中，以凝胶化培养基(含4-5wt％葡萄糖，10％FBS(v/v)和100U/ml青链霉素的DMEM培养基)培养；
(5)在接种72小时(3天)后将六孔板中培养基吸去，可见六孔板底部的凝胶状耳软骨组织(图6A)，使用镊子将六孔板底部的凝胶状耳软骨聚集(图6B)，一个孔的凝胶软骨产量为0.1-0.2ml，收集至5ml注射器中；该凝胶软骨中，细胞密度为1.0×108个/ml-10×108个/ml，较佳地1.5-5×1010个/ml。将其与0.15ml培养基混合，制成含耳软骨凝胶的制剂，如图6C所示；
(6)将耳软骨凝胶制剂(步骤(5)制备，体积约0.25-0.35ml)，接种于框架结构(脱钙骨基质框架(图4和图5)，具有约400-800μm孔径，约87.3％±3.7％孔隙率)中，于37℃、95％湿度、5％二氧化碳静置2小时；
(7)静置后加入成软骨培养基继续体外培养3-11天，形成耳软骨凝胶-框架结构复合物，如图7所示；
当用于关节缺损修复时，可根据前期MRI、CT等辅助检查确定所需修复的软骨形状、大小切割耳软骨凝胶-框架结构复合物。
实施例3
耳软骨膜片颗粒-框架结构复合物制备
在本实施例中，制备耳软骨膜片颗粒-框架复合物。具体操作方法如下：
(1)无菌切取2.5×2.5cm2的耳软骨组织；使用无菌器械将软骨表面的黏膜及纤维组织剥离；
(2)将耳软骨组织剪为1.5×1.5mm2大小软骨碎片；配置浓度为0.15％胶原酶；将软骨碎片加入配置好的胶原酶中消化8小时；
(3)8小时后将胶原酶溶液过滤离心得到耳软骨细胞，进行原代及传代培养；
(4)扩增后收集细胞重悬，按照8×106/10ml至30×106/10ml/孔的细胞量接种于六孔板中，以凝胶化培养基(含4-5wt％葡萄糖，10％FBS(v/v)和100U/ml青链霉素的DMEM培养基)培养；培养24小时或48小时后更换新鲜凝胶化培养基，继续体外培养至15天；
(6)吸去六孔板中的培养基，可见六孔板底部的耳软骨膜片组织(图6D)，其中耳软骨膜片组织中的细胞密度约为1.0×108个/ml-10×108个/ml；
使用镊子将耳软骨膜片夹起(图6E)，将其切割为1×1mm2大小的耳软骨膜片颗粒后，收集至50ml离心管，如图6F所示；
(7)将需要接种的框架材料(脱钙骨基质框架(图4和图5))置于装有耳软骨膜片颗粒的离心管中，确保框架材料被完全浸没过；将装有框架材料及耳软骨膜片颗粒的离心管放于离心机中，600转/分钟，离心2分钟；
(8)将接种好的框架材料于37℃、95％湿度、5％二氧化碳静置一定时间；静置后加入成软骨培养基继续体外培养3-11天，形成耳软骨膜片颗粒-框架结构复合物，如图8所示；
当用于关节缺损修复时，可根据前期MRI、CT等辅助检查确定所需修复的软骨形状、大小切割耳耳软骨膜片颗粒-框架结构复合物。
对比例1
软骨细胞悬液与软骨凝胶的黏附率测定
提供一脱钙骨基质框架(如图4所示)。将凝胶软骨制剂(实施例2制备，体积约0.25-0.35ml)接种于上述脱钙骨基质框架中，接种前测定凝胶软骨制剂的DNA含量。
取原代培养的软骨细胞于37℃、95％湿度、5％二氧化碳传代4次，加入细胞培养基制备成细胞悬液，并测定制备的软骨细胞悬液的DNA含量。将细胞悬液接种于上述脱钙骨基质框架中。
将接种好的软骨凝胶-脱钙骨基质复合物与软骨细胞悬液-脱钙骨基质复合物于37℃、95％湿度、5％二氧化碳的培养箱中静置24小时。分别取样两种复合物，测定其DNA含量。
如图9所示，通过说明书中所述的粘附率测定方法计算粘附率。与细胞悬液相比，本发明的凝胶软骨粘附率为92％±2％，约为细胞悬液黏附率的3倍。
对比例2
修复关节软骨的动物移植实验
在实验动物膝关节的关节面制造直径7.5mm的软骨缺损，分别将实施例1中制备的耳软骨凝胶-框架复合物(凝胶软骨-脱钙骨复合体)与单纯脱钙骨基质基质植入A缺损处和B缺损处。
植入后立即观察动物体内软骨缺损的修复情况。
结果如图10所示：
A处缺损部位光滑，质实，周围包绕软组织膜，有一定弹性，具有优异的即时修复效果。
B处缺损部位创面粗糙，仅有物理支撑作用，无法起到即使修复作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种耳软骨组织工程复合物，其特征在于，所述复合物包括：
(a)载体，所述载体包括多孔框架结构；和
(b)接种于或负载于所述载体的含有耳软骨细胞的耳软骨凝胶或耳软骨膜片颗粒。
2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述的耳软骨凝胶包括软骨细胞构成的细胞群以及软骨细胞所分泌的细胞外基质，其中所述细胞外基质包裹所述的细胞群，并且所述耳软骨凝胶呈凝胶态，并且软骨细胞的密度为至少1.0×108个/ml或1.0×108个/g。
3.如权利要求2所述的复合物，其特征在于，所述耳软骨凝胶是凝胶化培养2.5-5.5天，较佳地3-5天得到的。
4.如权利要求2所述的复合物，其特征在于，所述耳软骨凝胶的粘附率≥90％，较佳地≥95％。
5.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述耳软骨膜片颗粒包括软骨细胞构成的细胞群以及软骨细胞所分泌的细胞外基质，其中所述细胞外基质包裹所述的细胞群，并且所述耳软骨颗粒是由薄片状的耳软骨膜片剪碎制得，其中耳软骨细胞的密度为至少1.0×108个/ml或1.0×108个/g。
6.如权利要求5所述的复合物，其特征在于，所述耳软骨膜片是凝胶化培养6-30天，较佳地7-20天，最佳地10-15天得到的。
7.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述多孔框架结构是由选自下组的生物可降解材料制成：PCL、PGA、同种异体骨修复材料、异种骨修复材料、或脱钙骨基质。
8.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述耳软骨凝胶/耳软骨膜片颗粒-框架结构复合物在关节微环境下可转化为关节软骨。
9.一种制备如权利要求1所述的耳软骨组织工程复合物的方法，其包括以下步骤：将权利要求2所述的耳软骨凝胶或权利要求5所述的耳软骨膜片颗粒接种于多孔框架结构，经体外成软骨培养，从而获得所述的耳软骨组织工程复合物。
10.一种如权利要求1所述的耳软骨组织工程复合物的用途，其特征在于，用于制备用于修复关节缺损的医用产品。
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