JP7179013B2 - ヒトにおいて使用するための免疫調節薬の毒性を決定するための方法 - Google Patents

ヒトにおいて使用するための免疫調節薬の毒性を決定するための方法 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年４月１７日に出願された米国仮出願第６２／４８６，４４１号および２０１７年６月１９日に出願された米国仮出願第６２／５２１，６１７号に対する優先権の利益を主張し、その両出願の内容は、その全体が本明細書に参照により援用される。
本発明は、概して、免疫調節薬が、免疫調節薬が投与されたヒトにおいてサイトカイン放出症候群応答を誘発するか決定する方法に関する。本発明は、また、薬物候補の医薬品安全性評価における使用のための予測値を有するｉｎ ｖｉｖｏマウス方法を提供する。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、がんおよび自己免疫性疾患の処置において治療法として使用されてきた。このような治療用ｍＡｂの多くは、免疫細胞、特に、Ｔ細胞およびＢ細胞の表面におけるタンパク質に対して標的化される。しかし、ｍＡｂは、致死的となり得るサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）等、注入時に種々の有害効果を有し得る。多数のリンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）および／または骨髄系細胞（マクロファージ、樹状細胞および単球）が、投与されたｍＡｂによって活性化され、炎症性サイトカインを放出するようになると、ＣＲＳは、臨床的に顕在化する。症状発病のタイミングおよびＣＲＳ重症度は、ｍＡｂの種類および免疫細胞活性化の振幅に依存する。
一般に、薬物の臨床治験に先立ち毒性を試験するために、２種の現存している方法、動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ試験、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ全血または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）アッセイが存在する。残念ながら、これら２種の方法は、ヒトにおける毒性、特に、免疫的毒性を適切に予測することも決定することもできない。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、ヒト患者の身体を模倣することができない；潜在的薬物毒性に対する全身性応答は、ｉｎ ｖｉｖｏ以外のいかなるモデルにおいてもモデル化することができない。齧歯類や非ヒト霊長類のモデルにおけるゲノム応答は、ヒトの応答を模倣することができない。毒性の観点から、前臨床試験および臨床治験の間には相当なギャップがある。
試験のために非ヒト哺乳動物にヒト幹細胞を移植するための方法が試みられた。しかし、かかる方法は、患者から非胚性幹細胞を得ること（例えば、患者から骨髄を得ること）に関する大きな課題に悩まされ、また、幹細胞が成長し、様々な細胞へと分化するのを待つのに長過ぎる時間を要するという点が不利である。よって、かかる方法は、侵襲的であり（可能であれば）、煩雑で、かつ非実用的である。
今はなきＴｅＧｅｎｅｒｏ ＡＧ、Ｗｕｒｚｂｕｒｇによって開発されたＴＧＮ１４１２は、ヒトＴ細胞によって発現される共刺激分子ＣＤ２８に特異的なＩｇＧ４サブクラスのヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。これは、古典的なＣＤ２８特異的ｍＡｂとは異なり、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の同時係合なしでＴリンパ球を活性化することができるため、「ＣＤ２８スーパーアゴニスト」（ＣＤ２８ＳＡ）と呼ばれる（Hunig、２００７年、Adv Immunol、９５巻：１１１～１４８頁）。
２００６年３月１３日にＮｏｒｔｈｗｉｃｋ Ｐａｒｋ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｌｏｎｄｏｎにおける独立したＰａｒｅｘｅｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｕｎｉｔによって行われたヒト初回投与（ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｍａｎ）治験において、健康なヒトボランティアへの１００μｇ／ｋｇ体重のＴＧＮ１４１２の静脈内適用は、生命にかかわるサイトカイン放出症候群をもたらし、これは、ボランティアを病院の集中治療病棟に移動した後にようやく制御された（Suntharalingamら、２００６年、Engl J Med、３５５巻：１０１８～１０２８頁）。よって、抗ＣＤ２８免疫調節薬ＴＧＮ１４１２は、試験下の対象において発生するサイトカインストームのため、その第Ｉ相治験においてひどく失敗し、これにより、参加した６名の健康なボランティアの生命が著しく脅かされ、全６名が多臓器不全を患った。
しかし、当該試験における前臨床研究は、ラットＣＤ２８特異的スーパーアゴニストを使用した類似のラットモデル、およびヒトボランティアよりも最大５０倍高い用量でＴＧＮ１４１２それ自体を受けたカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において、かかる「サイトカインストーム」の証拠を示さなかった（Duff、２００６年、Expert Scientific Group on Phase One Clinical Trials Final Report.、Norwich, UK：Stationary Office）。さらに、ヒトＰＢＭＣの培養物へのＴＧＮ１４１２の添加は、サイトカイン放出をもたらさなかった。肝要なサルおよびＰＢＭＣ培養実験は全て、政府のＥｘｐｅｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｐｈａｓｅ Ｏｎｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓの代理をするＢｒｉｔｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＩＢＳＣ）によって反復され、これらの系におけるＴＧＮ１４１２の無害な挙動を確認した（Duff、２００６年）。よって、これらのラット、カニクイザルおよび培養ヒトＰＢＭＣアッセイは、ヒトボランティアによって経験されたサイトカインストームに対する警告に適切ではなかった。齧歯類およびカニクイザルが、ＣＤ２８ＳＡの注射後に毒性全身性サイトカインを放出することができないのは、かかる薬剤に対するインタクトな免疫系の反応性の種間差が原因である可能性があり、かかる差に関する具体的な提案が為された（Gogishviliら、２００９年、PLoS ONE、４巻（２号）：ｅ４６４３頁、https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004643；Nguyenら、２００６年、Proc Natl Acad Sci U S A.、１０３巻：７７６５～７７７０頁；SchravenおよびKalinke、２００８年、Immunity、２８巻：５９１～５９５頁）。
ヒトは、およそ１×１０１２個のＴリンパ球を有し、このような細胞のうち１パーセント未満が、いかなる瞬間でも血液中を循環している。培養ＰＢＭＣが、ＴＧＮ１４１２に応答することができない原因が、リンパ系組織に存する細胞（これは、ボランティアにおけるサイトカイン放出により明らかに応答した）と比較して、このような細胞における機能欠損によるものか、またはリンパ系臓器に存在するが血液には存在しない細胞型の、Ｔリンパ球のＴＧＮ１４１２媒介性活性化に対する要求によるものであるかは、現在不明である。
公知ヒトＰＢＭＣ培養物が、サイトカイン放出により可溶性ＴＧＮ１４１２に応答できないことは、この系が、身体の内側のインタクトなヒト免疫系と同じ様式で、全てのリンパ球活性化剤に応答するとは限らないことを示す。この欠損の補正は、ＴＧＮ１４１２等、ヒトＣＤ２８スーパーアゴニスト（ＳＡ）の効果の詳細な解析を可能にし得るのみならず、前臨床開発において他の一見したところ無害な薬物の反応性を明らかにすることもできる。
Hunig、２００７年、Adv Immunol、９５巻：１１１～１４８頁 Suntharalingamら、２００６年、Engl J Med、３５５巻：１０１８～１０２８頁 Duff、２００６年、Expert Scientific Group on Phase One Clinical Trials Final Report.、Norwich, UK：Stationary Office Gogishviliら、２００９年、PLoS ONE、４巻（２号）：ｅ４６４３頁、https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004643 Nguyenら、２００６年、Proc Natl Acad Sci U S A.、１０３巻：７７６５～７７７０頁 SchravenおよびKalinke、２００８年、Immunity、２８巻：５９１～５９５頁
よって、患者処置および臨床治験に先立つ、免疫調節薬の毒性試験および個体におけるサイトカイン放出症候群等の毒性の決定に有効な、新たなｉｎ ｖｉｖｏヒト化動物モデルの継続した必要がある。
非限定例の実施形態において、本発明は、免疫調節薬が、免疫調節薬の投与後にヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があるか決定する方法を提供する。例の実施形態において、本方法は、
（ａ）免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、
（ｂ）ヒトから単離された１．５～３．０×１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記マウスに生着させるステップと、
（ｃ）ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、前記マウスに免疫調節薬を投与するステップと、
（ｄ）前記マウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップであって、
ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群を示す、ステップと、
（ｅ）前記免疫調節薬が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があると決定するステップであって、
前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群の存在が、前記免疫調節薬の投与が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があることを示す、ステップと
を含む。
別の例の実施形態において、第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物が、免疫調節薬の前記組み合わせ物の投与後にヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があるか決定する方法が提供される。本方法は、
（ａ）免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、
（ｂ）ヒトから単離された１．５～３．０×１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記マウスに生着させるステップと、
（ｃ）ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、前記マウスに第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬を投与するステップと、
（ｄ）前記マウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップであって、
ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群を示す、ステップと、
（ｅ）免疫調節薬の前記組み合わせ物が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があると決定するステップであって、
前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群の存在が、免疫調節薬の前記組み合わせ物の投与が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があることを示す、ステップと
を含む。
他の例の実施形態において、本発明は、免疫調節薬の投与後にヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘発しない免疫調節薬の安全な投薬量を決定する方法を提供する。ある実施形態では、本方法は、
（ａ）第１の投薬量を有する免疫調節薬を用意するステップであって、免疫調節薬の前記第１の投薬量が、その投与後に第１のヒト化照射免疫不全マウスにおいて軽度または重度サイトカイン放出症候群を誘発すると決定される、ステップと、
（ｂ）第２の免疫不全マウスを用意するステップであって、前記第２のマウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、
（ｃ）ヒトから単離された１．５～３．０×１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記第２のマウスに生着させるステップと、
（ｄ）ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、前記第２のマウスに免疫調節薬を投与するステップであって、前記免疫調節薬が、前記第１の投薬量よりも少ない第２の投薬量で投与される、ステップと、
（ｅ）前記第２のマウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップと、
（ｆ）前記ヒトにおける投与のための前記免疫調節薬の安全な投薬量を決定するステップであって、前記安全な投薬量が、前記第２のマウスへの前記免疫調節薬の投与後に、ＩＦＮ－γが＜３００ｐｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１０が＜２５ｐｇ／ｍｌである血中濃度を生じる投薬量であり、
前記第２のマウスにおけるＩＦＮ－γ＜３００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０＜２５ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記免疫調節薬の前記安全な投薬量の投与が、前記ヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘発しない可能性があることを示す、ステップと
を含む。
他の例の実施形態において、本発明は、ヒトにおける使用のための薬物候補の免疫毒性を決定する方法を提供する。ある実施形態では、本方法は、
（ａ）免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、
（ｂ）４．５～５．５×１０７個のヒトＰＢＭＣを前記マウスに生着させるステップと、
（ｂ）生着させてから４～７日後に、薬物候補を前記マウスに投与するステップと、
（ｃ）前記マウスの血液におけるサイトカイン濃度を決定するステップであって、前記サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦからなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインである、ステップと、
（ｄ）前記薬物候補の免疫毒性を決定するステップであって、
ＩＦＮ－γ≧３００ｐｇ／ｍｌ、
ＩＬ－２≧１５ｐｇ／ｍｌ、
ＩＬ－４≧１０ｐｇ／ｍｌ、
ＩＬ－６≧１０ｐｇ／ｍｌ、
ＩＬ－１０≧２５ｐｇ／ｍｌ、および
ＴＮＦ≧５ｐｇ／ｍｌ
からなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインの前記マウスにおける血中濃度が、ヒトにおける前記薬物候補の免疫毒性を示す、ステップと
を含む。
別の実施形態では、ヒトへの免疫調節薬の投与が、ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘導する見込みを決定する方法が提供される。本方法は、
（ａ）ヒト由来の１．５～３．０×１０７個の単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させてから５～７日後に免疫調節薬を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップと、
（ｂ）マウスの血液試料に存在するＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するステップであって、ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌまたはＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの濃度が、ヒトへの免疫調節薬の投与が、重度サイトカイン放出症候群を誘導する可能性があることを示す、ステップと
を含む。
別の実施形態では、ヒトへの第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物の投与が、ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘導する見込みを決定する方法が提供される。本方法は、
（ａ）ヒト由来の１．５～３．０×１０７個の単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させてから５～７日後に第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップと、
（ｂ）マウスの血液試料に存在するＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０の濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するステップであって、ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌまたはＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの濃度が、ヒトへの第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物の投与が、重度サイトカイン放出症候群を誘導する可能性があることを示す、ステップと
を含む。
別の実施形態では、ヒトにおける薬物候補の免疫毒性を決定する方法が提供される。本方法は、
（ａ）４．５～５．５×１０７個の単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させてから４～７日後に薬物候補を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップと、
（ｂ）マウス血液試料に存在する少なくとも１種のヒトサイトカインの濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出して、薬物候補のヒト免疫毒性を決定するステップであって、少なくとも１種のヒトサイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦからなる群から選択され、マウス血液試料において低いヒトサイトカイン濃度が検出される場合、薬物候補が、低いヒト免疫毒性を有する、ステップと
を含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
免疫調節薬が、前記免疫調節薬の投与後にヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があるか決定する方法であって、
（ａ）免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、
（ｂ）ヒトから単離された１．５～３．０×１０ ７ 個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記マウスに生着させるステップと、
（ｃ）前記ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、前記マウスに免疫調節薬を投与するステップと、
（ｄ）前記マウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップであって、
ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群を示す、ステップと、
（ｅ）前記免疫調節薬が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があると決定するステップであって、
前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群の存在が、前記免疫調節薬の投与が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があることを示す、ステップと
を含む方法。
（項目２）
前記マウスが、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６またはＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記マウスが、ＮＳＧマウスである、項目１に記載の方法。
（項目４）
ステップ（ａ）における前記マウスが、１００ｃＧｙのＸ線を照射される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記生着ステップ（ｂ）が、２×１０ ７ 個のＰＢＭＣで行われる、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記投与ステップ（ｃ）が、生着させてから６日後に行われる、項目１に記載の方法。
（項目７）
ステップ（ｄ）における前記複数のサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６およびＴＮＦをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記複数のサイトカインの血中濃度が、前記免疫調節薬の投与の２～６時間後に決定される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記複数のサイトカインの血中濃度が、前記免疫調節薬の投与の６時間後に決定される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記免疫調節薬が、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、抗ＣＤ５２ ｍＡｂ；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；インターフェロン；イミキモド；サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、アプレミラスト；アザチオプリン、クラドリビン、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン、メトトレキセート、ミトキサントロン；タリモジーンラハーパレプベック；アダリムマブ、カツマキソマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ－Ｉ １３１ 、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、デノスマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ダラツムマブ、セリチニブ、エロツズマブおよび抗胸腺細胞グロブリンからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記抗ＣＤ２８ ｍＡｂが、ＴＧＮ１４１２である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記抗ＣＤ３ ｍＡｂが、ＯＫＴ３である、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記抗Ｃ２０ ｍＡｂが、リツキシマブである、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記抗ＣＤ５２ ｍＡｂが、アレムツズマブである、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物が、免疫調節薬の前記組み合わせ物の投与後にヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があるか決定する方法であって、
（ａ）免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、
（ｂ）ヒトから単離された１．５～３．０×１０ ７ 個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記マウスに生着させるステップと、
（ｃ）前記ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、前記マウスに第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬を投与するステップと、
（ｄ）前記マウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップであって、
ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群を示す、ステップと、
（ｅ）免疫調節薬の前記組み合わせ物が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があると決定するステップであって、
前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群の存在が、免疫調節薬の前記組み合わせ物の投与が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があることを示す、ステップと
を含む方法。
（項目１６）
前記マウスが、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６またはＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記マウスが、ＮＳＧマウスである、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
ステップ（ａ）における前記マウスが、１００ｃＧｙのＸ線を照射される、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記生着ステップ（ｂ）が、２×１０ ７ 個のＰＢＭＣで行われる、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記投与ステップ（ｃ）が、生着させてから６日後に行われる、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
ステップ（ｄ）における前記複数のサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６およびＴＮＦをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
前記複数のサイトカインの血中濃度が、免疫調節薬の前記組み合わせ物の投与の２～６時間後に決定される、項目１５に記載の方法。
（項目２３）
前記複数のサイトカインの血中濃度が、免疫調節薬の前記組み合わせ物の投与の６時間後に決定される、項目１５に記載の方法。
（項目２４）
前記第１の免疫調節薬および前記第２の免疫調節薬が、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、抗ＣＤ５２ ｍＡｂ；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；インターフェロン；イミキモド；サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、アプレミラスト；アザチオプリン、クラドリビン、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン、メトトレキセート、ミトキサントロン；タリモジーンラハーパレプベック；アダリムマブ、カツマキソマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ－Ｉ １３１ 、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、デノスマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ダラツムマブ、セリチニブ、エロツズマブおよび抗胸腺細胞グロブリンからなる群から独立して選択される、項目１５に記載の方法。
（項目２５）
前記第１の免疫調節薬が、ペムブロリズマブまたはニボルマブであり、前記第２の免疫調節薬が、レナリドミド、ポマリドミド、エパカドスタット、タリモジーンラハーパレプベック、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、セリチニブ、ダラツムマブまたはデュルバルマブである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記第１の免疫調節薬が、イピリムマブであり、前記第２の免疫調節薬が、レナリドミド、ポマリドミド、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、セリチニブ、ダラツムマブまたはデュルバルマブである、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記第１の免疫調節薬が、アテゾリズマブ、アベルマブまたはデュルバルマブであり、前記第２の免疫調節薬が、レナリドミド、ポマリドミド、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、リツキシマブ、セリチニブ、ダラツムマブまたはアレムツズマブである、項目２４に記載の方法。
（項目２８）
前記抗ＣＤ５２ ｍＡｂが、アレムツズマブであり、前記抗Ｃ２０ ｍＡｂが、リツキシマブであり、前記抗ＣＤ３ ｍＡｂが、ＯＫＴ３であり、または前記抗ＣＤ２８ ｍＡｂが、ＴＧＮ１４１２である、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
免疫調節薬の投与後にヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘発しない前記免疫調節薬の安全な投薬量を決定する方法であって、
（ａ）第１の投薬量を有する免疫調節薬を用意するステップであって、前記免疫調節薬の前記第１の投薬量が、その投与後に第１のヒト化照射免疫不全マウスにおいて軽度または重度サイトカイン放出症候群を誘発すると決定される、ステップと、
（ｂ）第２の免疫不全マウスを用意するステップであって、前記第２のマウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、
（ｃ）ヒトから単離された１．５～３．０×１０ ７ 個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記第２のマウスに生着させるステップと、
（ｄ）前記ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、前記第２のマウスに免疫調節薬を投与するステップであって、前記免疫調節薬が、前記第１の投薬量よりも少ない第２の投薬量で投与される、ステップと、
（ｅ）前記第２のマウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップと、
（ｆ）前記ヒトにおける投与のための前記免疫調節薬の安全な投薬量を決定するステップであって、前記安全な投薬量が、前記第２のマウスへの前記免疫調節薬の投与後に、ＩＦＮ－γが＜３００ｐｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１０が＜２５ｐｇ／ｍｌである血中濃度を生じる投薬量であり、
前記第２のマウスにおけるＩＦＮ－γ＜３００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０＜２５ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記免疫調節薬の前記安全な投薬量の投与が、前記ヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘発しない可能性があることを示す、ステップと
を含む方法。
（項目３０）
前記第２のマウスが、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６またはＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記第２のマウスが、ＮＳＧマウスである、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
ステップ（ｂ）における前記第２のマウスが、１００ｃＧｙのＸ線を照射される、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記生着ステップ（ｃ）が、２×１０ ７ 個のＰＢＭＣで行われる、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記投与ステップ（ｄ）が、生着させてから６日後に行われる、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
ステップ（ｄ）における前記複数のサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６およびＴＮＦをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
前記複数のサイトカインの血中濃度が、前記免疫調節薬の投与の２～６時間後に決定される、項目２９に記載の方法。
（項目３７）
前記複数のサイトカインの血中濃度が、前記免疫調節薬の投与の６時間後に決定される、項目２９に記載の方法。
（項目３８）
前記免疫調節薬が、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、抗ＣＤ５２ ｍＡｂ；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；インターフェロン；イミキモド；サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、アプレミラスト；アザチオプリン、クラドリビン、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン、メトトレキセート、ミトキサントロン；タリモジーンラハーパレプベック；アダリムマブ、カツマキソマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ－Ｉ １３１ 、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、デノスマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ダラツムマブ、セリチニブ、エロツズマブおよび抗胸腺細胞グロブリンからなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３９）
前記抗ＣＤ２８ ｍＡｂが、ＴＧＮ１４１２である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記抗ＣＤ３ ｍＡｂが、ＯＫＴ３である、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記抗Ｃ２０ ｍＡｂが、リツキシマブである、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
前記抗ＣＤ５２ ｍＡｂが、アレムツズマブである、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
ヒトにおける使用のための薬物候補の免疫毒性を決定する方法であって、
（ａ）免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、
（ｂ）４．５～５．５×１０ ７ 個のヒトＰＢＭＣを前記マウスに生着させるステップと、（ｃ）生着させてから４～７日後に、薬物候補を前記マウスに投与するステップと、
（ｄ）前記マウスの血液におけるサイトカイン濃度を決定するステップであって、前記サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦからなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインである、ステップと、
（ｅ）前記薬物候補の免疫毒性を決定するステップであって、
ＩＦＮ－γ≧３００ｐｇ／ｍｌ、
ＩＬ－２≧１５ｐｇ／ｍｌ、
ＩＬ－４≧１０ｐｇ／ｍｌ、
ＩＬ－６≧１０ｐｇ／ｍｌ、
ＩＬ－１０≧２５ｐｇ／ｍｌ、および
ＴＮＦ≧５ｐｇ／ｍｌ
からなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインの前記マウスにおける血中濃度が、ヒトにおける前記薬物候補の免疫毒性を示す、ステップと
を含む方法。
（項目４４）
前記マウスが、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６またはＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスである、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記マウスが、ＮＳＧマウスである、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
ステップ（ａ）における前記マウスが、１００ｃＧｙのＸ線を照射される、項目４２に記載の方法。
（項目４７）
前記生着ステップ（ｂ）が、５×１０ ７ 個のＰＢＭＣで行われる、項目４２に記載の方法。
（項目４８）
前記投与ステップ（ｃ）が、生着させてから６日後に行われる、項目４２に記載の方法。
（項目４９）
サイトカインの血中濃度が、前記薬物候補の投与の２～６時間後に決定される、項目４２に記載の方法。
（項目５０）
サイトカインの血中濃度が、前記薬物候補の投与の６時間後に決定される、項目４２に記載の方法。
（項目５１）
ヒトへの免疫調節薬の投与が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘導する見込みを決定する方法であって、
（ａ）ヒト由来の１．５～３．０×１０ ７ 個の単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させてから５～７日後に免疫調節薬を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップと、
（ｂ）前記マウスの前記血液試料に存在するＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するステップであって、
前記マウス血液試料におけるＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌまたはＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの濃度が、前記ヒトへの前記免疫調節薬の投与が、重度サイトカイン放出症候群を誘導する可能性があることを示す、ステップと
を含む方法。
（項目５２）
ヒトへの第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物の投与が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘導する見込みを決定する方法であって、
（ａ）ヒト由来の１．５～３．０×１０ ７ 個の単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させてから５～７日後に第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップと、
（ｂ）前記マウスの前記血液試料に存在するＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するステップであって、ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌまたはＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの濃度が、前記ヒトへの前記第１の免疫調節薬および前記第２の免疫調節薬の前記組み合わせ物の投与が、重度サイトカイン放出症候群を誘導する可能性があることを示す、ステップと
を含む方法。
（項目５３）
ヒトにおける薬物候補の免疫毒性を決定する方法であって、
（ａ）４．５～５．５×１０ ７ 個の単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させてから４～７日後に薬物候補を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップと、
（ｂ）前記マウス血液試料に存在する少なくとも１種のヒトサイトカインの濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出して、前記薬物候補のヒト免疫毒性を決定するステップであって、前記少なくとも１種のヒトサイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦからなる群から選択され、前記マウス血液試料において低いヒトサイトカイン濃度が検出される場合、前記薬物候補が、低いヒト免疫毒性を有する、ステップと
を含む方法。
非限定例の実施形態が、次の添付図を参照しつつ、本明細書に記載されている。
図１Ａは、ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）、２×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスの生着後の、ＮＳＧおよびＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウス体重測定値を描写する。１群あたり１０匹のマウスが存在し、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１Ｂは、２×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウス生着後のＮＳＧマウス体重測定値を描写する。各線は、１匹のマウスを表す。
図２Ａは、ドナー３３１由来の２×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスの生着後５日目における、ヒトＰＢＭＣのＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６およびＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウス再構成を描写する。１群あたり５匹のマウスであり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図２Ｂは、ＮＳＧマウスにおける、４名の異なるドナー、３６２、２１３、３０９および３６４由来の２×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスの生着後５日目または１０日目における異なる細胞集団を描写する。各時点につき１群あたり２～５匹のマウスであり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図２Ｃは、ＮＳＧマウスにおける、ドナー３５８由来の３×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスの生着後５日目または１０日目における異なる細胞集団を描写する。各時点につき１群あたり４匹のマウスであり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図３Ａは、ドナー４６９２、５×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスを生着させた５匹のＮＳＧマウスの体重測定値を描写する。データは平均±ＳＥＭである。
図３Ｂは、ドナー３６２、５×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスを生着させた５匹のＮＳＧマウスの体重測定値を描写する。データは平均±ＳＥＭである。
図３Ｃは、ドナー３０９、２×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスを生着させた５匹のＮＳＧマウスの体重測定値を描写する。データは平均±ＳＥＭである。
図３Ｄは、ドナー３５８、３×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスを生着させた４匹のＮＳＧマウスの体重測定値を描写する。データは平均±ＳＥＭである。
図４Ａは、５日目（２×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウス生着）のヒト化マウスにおける１０名のドナーのＰＢＭＣ再構成の間の比較を描写する。フローサイトメトリーにより、示されている免疫細胞サブセット再構成に関してヒト化ＮＳＧマウスを試験した。総細胞のパーセンテージとしてのヒトＣＤ４５＋細胞、ならびにＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１４およびＣＤ５６（ＣＤ４５＋細胞においてゲーティング）を示す（ドナーＡ４６９２、Ａ４６２５およびＡ４６６８のみが、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ１４を示したが、ＣＤ５６を示さなかった）。
図４Ｂは、生着前の匿名化された患者ドナーの情報を描写する（ドナーＡ４６２５およびＡ４６６８を除く）。
図５Ａ～図５Ｆは、１０名の異なるドナーのｈＰＢＭＣ（２×１０７個のＰＢＭＣ／マウス）ヒト化ＮＳＧマウスへのｍＡｂの注射後のサイトカインの誘導を描写する。マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇ ＯＫＴ３または１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ２８（ＡＮＣ２８．１／５Ｄ１０ ｍＡｂ）またはＰＢＳ（対照）をｉ．ｖ．注射した。マウスを２および６時間目に出血させ、循環サイトカイン濃度をＢＤ ＣＢＡ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ＩＩキットによって測定した。サイトカイン濃度を図５Ａ～図５Ｆに示す。群毎のマウスの数は２～５匹であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図５Ａは、ｍＡｂ負荷に続く誘導後のＩＦＮ－γレベルを描写する：重度／高度応答：≧１，８００ｐｇ／ｍｌ；中程度／軽度応答：３００ｐｇ／ｍｌ≦ＩＦＮ－γ＜１，８００ｐｇ／ｍｌ；および低／無応答：＜３００ｐｇ／ｍｌ。
図５Ｂは、ＩＬ－１０レベルを描写する：重度／高度応答：≧１２０ｐｇ／ｍｌ；中程度／軽度応答：２５ｐｇ／ｍｌ≦ＩＬ－１０＜１２０ｐｇ／ｍｌ；および低／無応答：＜２５ｐｇ／ｍｌ。
図５Ｃは、ｍＡｂ負荷に続くサイトカイン誘導後の、ヒト化マウスのＩＬ－６レベルを描写する。
図５Ｄは、ｍＡｂ負荷に続くサイトカイン誘導後の、ヒト化マウスのＩＬ－２レベルを描写する。
図５Ｅは、ｍＡｂ負荷に続くサイトカイン誘導後の、ヒト化マウスのＩＬ－４レベルを描写する。
図５Ｆは、ｍＡｂ負荷に続くサイトカイン誘導後の、ヒト化マウスのＴＮＦレベルを描写する。
図６は、ＯＫＴ３または抗ＣＤ２８ ｍＡｂの投与を受けている１０名のドナーの間の異なる応答を描写する。抗ＣＤ２８ ｍＡｂ投与後に、ドナーＡ４６９２、Ａ４６６８および３６２は、重度／高度レベルのＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０により応答し；ドナーＡ４６２５、２６６、３４５、３０９および２１３は、中程度／軽度レベルのＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０により応答し；ドナー３６４および３５３は、低／無レベルのＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０により応答した。
図７は、１０名のドナーのｈＰＭＢＣを生着させ、続いて対照ＰＢＳ、ＯＫＴ３または抗ＣＤ２８ ｍＡｂを注射した、ヒト化ＮＳＧマウスにおける直腸温の変化を描写する。群毎のマウスの数は２～５匹であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図８は、免疫調節薬の注射後の１０名のドナーのヒト化マウスの臨床スコアを描写する。ＰＢＳ、ＯＫＴ３または抗ＣＤ２８ ｍＡｂ注射後２および６時間目に、各マウスの臨床スコアを次の判断基準により評価した：スコア：０＝正常な活動性；１＝正常な活動性、立毛、つま先歩行；２＝背中を丸め、活動性が低下しているが、依然として移動可能；３＝運動性低下だが、促されると移動可能；４＝瀕死（触れても応答しない）。群毎のマウスの数は２～５匹であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図９Ａ～図９Ｆは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウスまたは５×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるドナー２１３ヒト化マウスにおけるサイトカイン応答の比較を描写する。
図９Ａは、５×１０７個のＰＢＭＣ／マウスにおいて１，８００ｐｇ／ｍｌよりも上がるが、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウスにおいては上がらない、ＩＦＮ－γレベルを描写する。
図９Ｂは、５×１０７個のＰＢＭＣ／マウスにおいて１２０ｐｇ／ｍｌよりも上がるが、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウスにおいては上がらない、ＩＬ－１０レベルを描写する。
図９Ｃは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウスおよび５×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＬ－６レベルを描写する。
図９Ｄは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウスおよび５×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＬ－２レベルを描写する。
図９Ｅは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウスおよび５×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＬ－４レベルを描写する。
図９Ｆは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウスおよび５×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＴＮＦレベルを描写する。
図１０Ａ～図１０Ｆは、異なるヒトＰＢＭＣ濃度（ドナー３０９由来の、マウス１匹あたり２×１０７、３×１０７および４×１０７個）ヒト化ＮＳＧマウスにおける抗体の注射後のサイトカインの誘導を描写する。マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇ ＯＫＴ３、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ２８、１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）または対照としてのＰＢＳをｉｖ注射した。マウスを２および６時間目に出血させ、循環サイトカイン濃度をＢＤ ＣＢＡ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ＩＩキットによって測定した。群毎のマウスの数は３～５匹であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１０Ａは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウス、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスおよび４×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＮＦγレベルを描写する。
図１０Ｂは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウス、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスおよび４×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＬ－１０レベルを描写する。
図１０Ｃは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウス、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスおよび４×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＬ－６レベルを描写する。
図１０Ｄは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウス、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスおよび４×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＬ－２レベルを描写する。
図１０Ｅは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウス、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスおよび４×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＬ－４レベルを描写する。
図１０Ｆは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウス、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスおよび４×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＴＮＦレベルを描写する。
図１１Ａ～図１１Ｄは、ドナー３０９ ＰＢＭＣヒト化マウスにおける、ＯＫＴ３、抗ＣＤ２８およびＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）に応答した体温および臨床スコア変化を描写する。
図１１Ａは、５日目におけるドナー３０９マウス細胞集団を描写する。５匹のＮＳＧマウスに、２×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスを生着させ；５匹のＮＳＧマウスに、３×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスを生着させ、５匹のＮＳＧマウスに、４×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスを生着させた。全マウスは、１００ｃＧｙのＸ線照射の４時間後に生着させた。フローサイトメトリーによるＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１４およびＣＤ５６細胞集団試験のため、５日目にマウスを出血させた。
図１１Ｂは、薬物：対照ＰＢＳ、０．５ｍｇ／ｋｇ ＯＫＴ３、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ２８または１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）の注射後２および６時間目の、ヒト化マウスの臨床スコアを描写する。次の判断基準により臨床スコアを評価した：スコア：０＝正常な活動性；１＝正常な活動性、立毛、つま先歩行；２＝背中を丸め、活動性が低下しているが、依然として移動可能；３＝運動性低下だが、促されると移動可能；４＝瀕死。５匹のマウス／群であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１１Ｃは、ドナー３０９による２×１０７個のｈＰＭＢＣ／マウスを使用した、測定された直腸温を示す。マウスに、対照ＰＢＳ、０．５ｍｇ／ｋｇ ＯＫＴ３、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ２８または１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）を注射した。薬物注射後２および６時間目に直腸温を測定した。３～５匹のマウス／群であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１１Ｄは、ドナー３０９による３×１０７個のｈＰＭＢＣ／マウスを使用した、測定された直腸温を示す。マウスに、対照ＰＢＳ、０．５ｍｇ／ｋｇ ＯＫＴ３、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ２８または１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）を注射した。薬物注射後２および６時間目に直腸温を測定した。３～５匹のマウス／群であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１１Ｅは、ドナー３０９による４×１０７個のｈＰＭＢＣ／マウスを使用した、測定された直腸温を示す。マウスに、対照ＰＢＳ、０．５ｍｇ／ｋｇ ＯＫＴ３、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ２８または１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）を注射した。薬物注射後２および６時間目に直腸温を測定した。３～５匹のマウス／群であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１２Ａ～図１２Ｆは、異なる用量のＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）による異なるサイトカインレベルの誘導におけるＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）の用量効果を描写する。ＮＳＧマウスに、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）投薬６日前に、ドナー３５８の３×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスを生着させた。投薬日に、マウスに、ＰＢＳ、０．５ｍｇ／ｋｇ ＯＫＴ３、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）をｉｖ注射した。マウスを２および６時間目に出血させ、循環サイトカイン濃度をＢＤ ＣＢＡ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ＩＩキットによって測定した。５匹のマウス／群であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１２Ａは、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＮＦγレベルを描写する。
図１２Ｂは、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＬ－１０レベルを描写する。
図１２Ｃは、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＬ－６レベルを描写する。
図１２Ｄは、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＬ－２レベルを描写する。
図１２Ｅは、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＩＬ－４レベルを描写する。
図１２Ｆは、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるＴＮＦレベルを描写する。
図１３Ａ～図１３Ｃは、ドナー３５８ ＰＢＭＣヒト化マウスにおける、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）に応答した体温および臨床スコア変化を描写する。
図１３Ａは、５日目におけるドナー３５８マウス細胞集団を描写する。１００ｃＧｙのＸ線照射の４時間後に、四（４）匹のＮＳＧマウスに、３×１０７個のｈＰＢＭＣを生着させた。フローサイトメトリーによるＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１４およびＣＤ５６細胞集団試験のため、５日目にマウスを出血させた。
図１３Ｂは、薬物注射後のヒト化マウス臨床スコアを描写する。ＰＢＳ、０．５ｍｇ／ｋｇ ＯＫＴ３、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｋｇ／ｍｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）の２および６時間後に、次の判断基準により臨床スコアを評価した：スコア：０＝正常な活動性；１＝正常な活動性、立毛、つま先歩行；２＝背中を丸め、活動性が低下しているが、依然として移動可能；３＝運動性低下だが、促されると移動可能；４＝瀕死。５匹のマウス／群であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１３Ｃは、異なる時点でヒト化マウスにおいて測定された直腸温を描写する。マウスに、対照ＰＢＳ、０．５ｍｇ／ｋｇ ＯＫＴ３、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）を注射し、薬物注射後２および６時間目に直腸温を測定した。５匹のマウス／群であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１４Ａ～図１４Ｂは、薬物曝露後のサイトカイン放出のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ測定の異なる結果を描写する。
図１４Ａは、ＩＦＮ－γ（パネルａおよびｂ）またはＩＬ－１０（パネルｃおよびｄ）に関する４名の異なるＰＢＭＣドナーによるｉｎ ｖｉｔｒｏ（パネルａおよびｃ）またはｉｎ ｖｉｖｏ（パネルｂおよびｄ）実験によって得られた、抗ＣＤ２８処置に応答したサイトカイン放出レベルを比較するヒストグラムを提示する。データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１４Ｂは、ＩＬ６（パネルｅおよびｆ）またはＩＬ－４（パネルｇおよびｈ）に関する４名の異なるＰＢＭＣドナーによるｉｎ ｖｉｔｒｏ（パネルｅおよびｇ）またはｉｎ ｖｉｖｏ（パネルｆおよびｈ）実験によって得られた、抗ＣＤ２８処置に応答したサイトカイン放出レベルを比較するヒストグラムを提示する。データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１５は、ａ）ＩＦＮ－γ；ｂ）ＩＬ－１０；ｃ）ＩＬ－６；およびｄ）；ＩＬ－４に関するＰＢＭＣドナー２１３によるｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ実験によって得られた、抗ＣＤ２８処置に応答したサイトカイン放出レベルのヒストグラムを提示する。データは平均±ＳＥＭとして提示する。各グラフにおける点線は、抗ＣＤ２８実験の対照レベルである。
図１６は、ａ）ＩＦＮ－γ；ｂ）ＩＬ－６；ｃ）ＩＬ－４ ｄ）ＩＬ－１０；ｅ）ＩＬ－２；およびｆ）ＴＮＦに関する、ＰＢＭＣドナー２１３またはドナー３６４に関する、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドミド）または両方の薬物による処置に応答したサイトカイン放出レベルのヒストグラムを提示する。ＰＢＳによる処置は対照であった。データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１７は、ａ）ＩＦＮ－γ；ｂ）ＩＬ－１０；ｃ）ＩＬ－６ ｄ）ＩＬ－２；ｅ）ＩＬ－４；およびｆ）ＴＮＦに関する、ＰＢＭＣドナー２１３またはドナー３６４に関するＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）、ＡＴＧまたは両方の薬物による処置に応答したサイトカイン放出レベルのヒストグラムを提示する。ＰＢＳによる処置は対照であった。データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１８は、ａ）ＩＦＮ－γ；ｂ）ＩＬ－６；ｃ）ＩＬ－４ ｄ）ＩＬ－２；ｅ）ＩＬ－４；およびｆ）ＴＮＦに関する、ＰＢＭＣドナー２１３またはドナー３６４に関する抗ＣＤ－２８、ＡＴＧまたは両方の薬物による処置に応答したサイトカイン放出レベルのヒストグラムを提示する。ＰＢＳによる処置は対照であった。データは平均±ＳＥＭとして提示する。
図１９は、ヒトＰＢＭＣの生着に先立つ照射ありまたはなしのヒト化マウスの全血における５日目および１０日目細胞集団を説明する；マウスは、６名の異なるドナー：３６２、３４５および２７８５（上のグラフ）ならびに２１３、３６４および３２５１（下のグラフ）のうち１名由来のＰＢＭＣによりヒト化された。
図２０は、照射後の（ＩＲ）および照射なしの（非ＩＲ）、６名の異なるドナー：３６２、３４５および２７８５（パネルａ）ならびに２１３、３６４および３２５１（パネルｂ）のうち１名由来のＰＢＭＣによりヒト化されたマウスに関する、ＰＢＭＣ生着後日数の関数としての体重減を示す。
図２１は、ＰＢＭＣ生着後１０日目における、いかなる薬物処置もないＰＢＭＣヒト化マウスにおけるサイトカインレベルを示す。
図２２Ａ～図２２Ｂは、薬物処置後に放出されたサイトカインのレベルのグラフを提示する（ドナー３６２または２１３のいずれかのＰＢＭＣによりヒト化された照射または非照射マウスによる）。薬物（ＯＫＴ３、ＫＥＹＴＲＵＤＡまたはＡＴＧ）または陰性対照（ＰＢＳ）は、ＰＢＭＣ生着後６日目に投与した。
図２２Ａは、ＩＦＮ－γ（パネルａ）、ＩＬ－１０（パネルｂ）およびＩＬ－６（パネルｃ）のレベルのグラフを提示する。
図２２Ｂは、ＩＬ－２（パネルｄ）、ＩＬ－４（パネルｅ）およびＴＮＦ（パネルｆ）のレベルのグラフを提示する。
定義：
例の実施形態を記載する際に、分かり易くするために具体的な用語法が用いられる。しかし、実施形態は、この具体的な用語法に限定されることを意図されない。他の記述がなければ、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。
本明細書において、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数を意味することができる。本明細書において、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも第２またはそれよりも多くを意味することができる。さらに、文脈によってそれ以外が要求されない限り、単数形の用語は、複数を含み、複数形の用語は、単数形を含む。
用語「ＮＳＧ」は、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマの免疫不全マウスモデル（すなわち、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス；Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ系統番号：００５５５７）を指す。このマウスは、ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪ遺伝的背景に２個の突然変異を保有する；重症複合型免疫不全（ｓｃｉｄ）およびインターロイキン－２（ＩＬ２）受容体共通ガンマ鎖の完全ヌル型アレル（ＩＬ２ｒｇヌル）。このようなマウスは、極めて免疫不全である。
用語「ＮＳＧ－ＣＳＦ－１」は、そのゲノムがヒトＣＳＦ－１（マクロファージコロニー刺激因子－１）遺伝子を含有する、ＮＳＧマウスモデルを指し、トランスジェニックＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスは、ヒトＣＳＦ－１サイトカインを発現する（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ系統番号：０２８６５４）。
用語「ＮＳＧ－ＩＬ－６」は、そのゲノムがヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６）遺伝子を含有し、ヒトＩＬ－６サイトカインを発現する、ＮＳＧマウスモデルを指す（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ系統番号：０２８６５５）。
用語「ＣＤ」は、表面抗原分類を指す。
用語「ＣＤ３」は、表面抗原分類３を指し、成熟Ｔリンパ球におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の部分である抗原を表す。
用語「ＣＤ４」は、表面抗原分類４を指し、この抗原は、ヘルパーＴ細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞等、免疫細胞の表面に見出される糖タンパク質である。
用語「ＣＤ８」は、表面抗原分類８を指し、細胞傷害性Ｔ細胞の表面に主に発現される共受容体であるが、ナチュラルキラー細胞、皮質胸腺細胞および樹状細胞に見出すこともできる。
用語「ＣＤ１４」は、表面抗原分類１４を指し、主としてマクロファージおよび樹状細胞によって発現される抗原である。
用語「ＣＤ１９」は、表面抗原分類１９を指し、この抗原は、Ｂ細胞に見出される。
用語「ＣＤ２８」は、表面抗原分類２８を指し、Ｔ細胞活性化および生存に要求される共刺激シグナルをもたらすＴ細胞において発現されるタンパク質の１種である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えてＣＤ２８を介したＴ細胞刺激は、様々なインターロイキン（例えば、ＩＬ－６）の産生のための強力なシグナルをもたらすことができる。
用語「ＣＤ４５細胞」は、表面抗原分類４５を指し、この抗原は、ヒトリンパ球、単球および他の骨髄系細胞において存在する。
用語「ＣＤ５６」は、表面抗原分類５６を指し、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の表面に発現される同種親和性結合糖タンパク質である。
用語「末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）」は、丸い核を有する末梢血細胞を指す。このような単核血液細胞は、組織および血液の間で再循環し、感染と戦い、侵入者に適応するための免疫系における重大な構成成分である。２種の主要な型の単核細胞である、リンパ球および単球が存在する。ＰＢＭＣのリンパ球集団は典型的に、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞からなる。ＰＢＭＣは、本技術分野で周知の方法（例えば、フィコール勾配）によって全血試料から単離することができる。
用語「サイトカイン」は、細胞シグナル伝達において重要な、小型のタンパク質（ほぼ５～２０ｋＤａ）の一クラスのメンバーを指す。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインおよび腫瘍壊死因子を含む。サイトカインの例として、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦαが挙げられる。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球およびマスト細胞等の免疫細胞を含む広い範囲の細胞によって産生される；所与のサイトカインは、２種類以上の細胞によって産生され得る。その放出は、その周囲にある細胞の挙動に効果を有する。サイトカインは、免疫調節剤として自己分泌シグナル伝達、傍分泌シグナル伝達および内分泌シグナル伝達に関与すると同定された。
用語「サイトカイン放出症候群」（「ＣＲＳ」）は、「全身性炎症応答症候群」（「ＳＩＲＳ」）、「サイトカインカスケード」、「高サイトカイン血症」および「サイトカインストーム」と互換的に本明細書で使用されている。本技術分野で「高サイトカイン血症」としても公知の「サイトカインストーム」は、低血圧、発熱および／または悪寒によってとりわけ特徴付けされ、潜在的に死亡をもたらす、患者における全身性炎症応答を定義する。サイトカインストームはおそらく、高度に上昇されたレベルの様々なサイトカインをもたらす、サイトカインおよび免疫細胞の間の制御されない正のフィードパックループに起因する。これらの用語は程度が幾分異なる場合があるが、その全てが、対象へのある特定の抗体の投与の結果としての、対象によるサイトカインの許容し難く高い放出の結果である。対象は、許容し難く高いレベルのサイトカインを放出することによって処置に反応する。本明細書でこれらの用語のうち１種を参照することは、全ての用語を包含することが意図される。
用語「サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のグレード付け」は、Daniel W. Leeら、「Current Concepts in the Diagnosis and Management of Cytokine Release Syndrome」、Blood.、２０１４年７月１０日；１２４巻（２号）：１８８～１９５頁によって定義されるものに基づく：グレード１：症状は、生命にかかわるものではなく、対症処置のみを要求する（例えば、発熱、悪心、疲労、頭痛、筋痛、倦怠感）；グレード２：症状は、中等度介入を要求し、これに応答する、酸素要求＜４０％、または流体もしくは低用量の１種の昇圧剤に応答性の低血圧、またはグレード２臓器毒性；グレード３：症状は、積極的な介入を要求し、これに応答する、酸素要求≧４０％、または高用量もしくは複数の昇圧剤を要求する低血圧、またはグレード３臓器毒性もしくはグレード４高トランスアミナーゼ血症；グレード４：生命にかかわる症状、人工呼吸器支持を要求、またはグレード４臓器毒性（高トランスアミナーゼ血症を除外）；グレード５：死亡。本願の目的のため、重度ＣＲＳは、グレード４～５を指し、軽度ＣＲＳは、グレード１～３を包含する。
本発明者らは、投与された薬物または薬物候補に応答してヒト化マウスモデルにおいて放出されたある特定のサイトカインの濃度を使用して、投与された薬物または薬物候補に応答してヒトにおいて予想されるサイトカイン放出症候群の相対的重症度を予測することができることを決定した。本発明者らは、ヒト由来の１．５～３．０×１０７個のＰＢＭＣを生着させた免疫不全マウスに関して、ある特定のサイトカインのマウス血中濃度の閾値を決定して、生着から５～７日後にマウスに投与された薬物によってマウスにおいて誘導されるサイトカイン放出の重症度を決定した。次表に閾値を要約する。
Figure 0007179013000001
表１のマウスサイトカイン閾値濃度値は、利用できる文献報告と併せた実験データから決定されており、±１０％の可変性を有する。
重度／高度応答のマウスサイトカイン閾値濃度値は、ヒトＣＲＳグレード４～５に対応し；中程度／軽度応答のマウスサイトカイン閾値濃度値は、ヒトＣＲＳグレード１～３に対応し；中程度／軽度応答のマウスサイトカイン閾値濃度値は、ヒトＣＲＳグレード＜１に対応する。
マウスにおけるＰＢＭＣの１．５～３．０×１０７個の生着による開示されている方法において、本発明者らは、マウスにおいて重度／高度応答が観察される場合、例えば、ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌまたはＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌである場合、ヒトが、薬物または薬物候補の投与後に重度サイトカイン放出症候群を有し得るという可能性があることを決定した。同様に、マウスにおけるＰＢＭＣの１．５～３．０×１０７個の生着による開示されている方法において、本発明者らは、マウスにおいて低／無応答が観察される場合、例えば、ＩＦＮ－γ＜３００ｐｇ／ｍｌまたはＩＬ－１０＜２５ｐｇ／ｍｌである場合、ヒトが、薬物または薬物候補の投与後に重度サイトカイン放出症候群にならないが、その代わりに、多くても低レベルのサイトカイン放出を有する可能性があるという可能性があることを決定した。これらの閾値の間の、１．５～３．０×１０７個のＰＢＭＣを生着させたマウスにおけるＩＦＮ－γまたはＩＬ－１０の濃度は、中程度／軽度応答と命名され、ヒトが、薬物または薬物候補の投与後に中程度／軽度サイトカイン放出症候群を経験する可能性があることを示す。誘導されたＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－２またはＴＮＦαのマウスにおける閾値を同様に使用して、薬物または薬物候補に対するサイトカイン応答の重症度を評価することができる。誘導されたＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－２およびＴＮＦαのマウスにおける閾値を単独でまたはいずれかの組合せで使用して、ヒトにおける薬物または薬物候補に対するサイトカイン応答の重症度を評価することができる。
用語「ドナー（複数）」、「個体（複数）」、「ヒト（複数）」、「対象（複数）」および「患者（複数）」（およびこれらの用語の単数形）は、本明細書で若干互換的に使用されている。本発明者らによって行われる試験において、「ドナー」ＰＢＭＣが使用された。本方法において、「ドナー」よりも寧ろ、可能な投与のために免疫調節薬が考慮されている特定のヒト、個体、対象または患者由来のＰＢＭＣが使用されるであろう。本明細書におけるこれらの用語のうち１種の使用は、これらの用語のそれぞれを包含することが意図される。本方法において、個体、対象および患者は、ヒトである。しかし、おそらく、当業者によって決定され得る何らかの修正を本方法に加えて、本明細書に記載されている方法および技法を使用して、本方法が他の哺乳動物に適用され得ることが企図される。
用語「免疫調節薬」は、例えば、Ｔ細胞阻害または活性化等、リンパ球機能、例えば、Ｔ細胞機能を活性化または阻害することにより、免疫系を活性化または抑制することができるいずれかの治療剤（例えば、ｍＡｂ）を意味する。免疫調節薬もしくは剤、または免疫調節物質、または免疫療法薬は、例えば、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節性イミド薬物、または免疫療法において使用され得る他の薬剤を含むことができる。非限定例として、がん免疫療法は、腫瘍を破壊するように免疫系を刺激することを試みる。よって、免疫調節薬または剤を使用して、患者におけるがんの処置を試みることができるが、免疫調節薬の使用は、がんの処置に限定されない。免疫療法は、単品で、または他の処置方法と組み合わせて使用することができる。免疫調節薬の例の実施形態は、抗体、好ましくは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）等の免疫賦活性薬である。例えば、モノクローナル抗体は、ヒトＣＤ２８特異的スーパーアゴニストモノクローナル抗体であり得る。
免疫調節薬の例として、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；インターフェロン；イミキモド；サリドマイドおよびその誘導体またはアナログ、レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））、ポマリドミド（ＩＭＮＯＶＩＤ）（登録商標）、ならびにアプレミラスト；アザチオプリン、クラドリビン、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン、メトトレキセート、ミトキサントロン；ＩＭＬＹＧＩＣ（商標）（タリモジーンラハーパレプベック）、遺伝子改変された腫瘍溶解性ウイルス療法；ダラツムマブ（ＤＡＲＺＡＬＥＸ（登録商標））、抗ＣＤ３８抗体；アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、ＥＭＰＬＩＣＩＴＩ（商標）（エロツズマブ）、エパカドスタット、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ１）の経口利用できるヒドロキシアミジン阻害剤、カツマキソマブ（ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、トシツモマブ－Ｉ１３１（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、ブレンツキシマブベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標））、セツキシマブ（betuximab）（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、リツキシマブ（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標）またはＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ－１Ｈ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トラスツズマブエムタンシン（emtansinen）（ＫＡＤＣＹＬＡ（商標））、デノスマブ（ＰＲＯＬＩＡ（登録商標）またはＸＧＥＶＡ（登録商標））、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、オファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標））、ならびにパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））が挙げられる。
チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞等の一部の種類の免疫系細胞、および一部のがん細胞によって作製されたある特定のタンパク質を遮断する薬物である。そのようなタンパク質は、免疫応答の抑止を助け、Ｔ細胞が、がん細胞を死滅させることを防止することができる。チェックポイント阻害剤によってそのようなタンパク質が遮断されると、免疫系における「ブレーキ」が放出される。免疫「ブレーキ」のこのような放出は、Ｔ細胞が、がん細胞をより十分に死滅させることを可能にし得るが、有害効果としてＣＲＳをもたらすこともできる。
免疫調節薬の例示的なクラスは、ＦＤＡ承認がん薬物、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））およびニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））等のモノクローナル抗体であることが多い、チェックポイント阻害剤である。免疫系の重要な側面は、身体における正常細胞と、免疫系が「異物」と考慮する細胞の間を区別するその能力である。これにより、免疫系は、正常細胞に手出しすることなく、異物細胞を攻撃する。これを為すために、免疫系は、免疫応答を開始するために活性化（または不活性化）される必要がある、ある特定の免疫細胞における分子である「チェックポイント」を使用する。例示的なＦＤＡ承認チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））およびニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、ならびにＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））およびデュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））を含む。
用語「Ｔ細胞活性化」は、好ましくは、異なる種類のＴ細胞の間で僅かに変動し得る、Ｔ細胞の活性化機構を指定する。しかし、ＣＤ４＋Ｔ細胞における「２シグナルモデル」は、大部分の種類のＴ細胞に適用可能である。より詳細には、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は典型的に、主要組織適合性コード抗原提示分子による、Ｔ細胞表面におけるＴ細胞受容体およびＣＤ２８の両方と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面におけるその結合された抗原性ペプチドならびにＢ７ファミリーメンバーそれぞれとの係合を介して発生する。両方の細胞－細胞接触は一般に、有効な免疫応答の産生に要求される。例えば、ＣＤ２８共刺激の非存在下では、Ｔ細胞受容体シグナル伝達単独は、Ｔ細胞アネルギーをもたらし得る。ＣＤ２８およびＴ細胞受容体の両方から下流のさらなるシグナル伝達経路は、当業者にとって公知の多くのさらに別のタンパク質が関与する。Ｔ細胞の活性化は、本明細書で後述される通り、サイトカイン放出および／または細胞増殖、特に、Ｔ細胞の増殖によって決定することができる。
用語「臨床スコア」は、Jamie L Bradyら「Preclinical Screening for Acute Toxicity of Therapeutic Monoclonal Antibodies in a hu-SCID Model」、Clinical & Translational Immunology（２０１４年）３巻、ｅ２９頁；doi:10.1038/cti.2014.28；２０１４年１２月１９日にオンラインで発表によって定義されるものとして採用される：０＝正常な活動性；１＝正常な活動性、立毛、つま先歩行；２＝背中を丸め、活動性が低下しているが、依然として移動可能；３＝運動性低下だが、促されると移動可能；４＝瀕死（触れても応答しない）。
用語「用量」または「投薬量」は、患者によって一度に服用されるべき薬物の量を意味する。
ヒトにとっての免疫調節薬の「安全な投薬量」は、本明細書において、本明細書で開示されている方法によって決定される通り、ヒトから単離された１．５～３．０×１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させた照射免疫不全マウスへの免疫調節薬の投与後に、低／無応答に対応するマウスにおけるサイトカイン血中濃度、例えば、ＩＦＮ－γが＜３００ｐｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１０が＜２５ｐｇ／ｍｌである濃度を生じる投薬量を指す。免疫学的に安全な投薬量は、治療有効性を有する投薬量に対応しても対応しなくてもよい。
「有効性」は、患者において治療効果をもたらす、患者に投与された薬物または活性薬剤の能力を意味する。
「治療有効量」または「有効量」は、薬理学的効果を達成するための医薬剤の量である。用語「治療有効量」は、例えば、予防有効量を含む。薬物の「有効量」は、過度の有害副作用を伴わない、所望の薬理学効果または治療改善の達成に必要とされる量である。薬物の有効量は、特定の患者および疾患に応じて、当業者によって選択されるであろう。「有効量」または「治療有効量」が、薬物代謝、対象の年齢、体重、全身状態、処置されている状態、処置されている状態の重症度、および処方医師の判断における多様性により、対象間で変動し得ることが理解される。
本明細書における用語「免疫毒性」は、サイトカイン放出症候群等、有害な免疫賦活を生成する薬物または薬物候補の性向を指す。
用語「薬物候補」は、疾患、疾病、傷害、病気または状態の軽減、処置および／または治癒の治療効果を潜在的に有することが創薬スクリーニングによって同定された、抗体、小分子および／または他の化合物等、１種または複数の活性薬剤を含む、いずれかの潜在的な薬物または組成物を意味する。
一態様では、本発明者らは、前臨床試験、臨床治験および／または薬物による個体の個々の処置のために、個体における薬物免疫的毒性、特に、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）をスクリーニングおよび決定するための、ヒト化マウスモデルを考案した。本発明は、免疫調節薬に対する個体の反応性の決定に、および個体への免疫調節薬の投与の安全な投薬量の決定に有用である。
別の態様では、本ヒト化マウス方法は、薬物候補の医薬品安全性評価においても有用である。特に、開示されている方法は、ヒトにおける薬物候補の免疫毒性の改善された前臨床動物試験を提供する。
本明細書で開示されている薬物免疫毒性を決定するための方法は、所与の免疫調節薬または免疫調節薬の組合せに応答した個々の多様性を検出する能力、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＢＭＣ細胞培養方法等の先行技術方法よりも優れた応答予測精度、試験のために個体からほんの中等度の量（１００ｍｌまたはそれに満たない）の採血を要求すること、適した免疫不全マウスを商業的に入手できること、および２週間未満のターンオーバー時間の利点を有する。
薬物候補の前臨床免疫毒性試験に関して、本方法は、上述の利点の全てを有し、許容し難く高いレベルの免疫賦活（例えば、ヒトにおける当該薬物候補の投与によって誘導されるサイトカイン放出）を誘導する薬物候補の初期排除を可能にすることにより、薬物開発における時間および費用の節約を可能にする、投与後に薬物候補が誘導するであろう免疫賦活のレベルを評価するための高感度方法をさらに提供する。
有利には、本明細書でさらに記述されている通り、本発明者らは、このアッセイ系が、ｉｎ ｖｉｖｏ応答を予測し、研究および医薬品安全性評価における強力なツールを表すことを見出した。ボランティアヒト対象における新たな薬物候補の現在の臨床試験は、薬物不合格の結果となることが多い。この失敗の原因は、大部分は、現存しているｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルの不適切さのために、前臨床試験において毒性が曝露されなかったことにある。潜在的な薬物候補の有害効果を正確に予測することができるｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルに対する、長年にわたり満たされていない必要がある。本ヒト化マウスモデルは、多数の臨床的に関連する薬物候補から、サイトカイン放出を誘発する潜在的な薬物候補を同定するための高い程度の精度を有する薬物スクリーニングプラットフォームとして有用である。よって、本方法は、前臨床および臨床試験の間に必要なリンクを提供する、薬物免疫毒性試験のための頑強な予測アッセイを表す。薬物開発プログラムへの本アッセイの統合は、治療薬開発のためのＦＤＡ前等の薬物承認プロセスを加速する筈である。
一態様では、本発明は、免疫調節薬が、ヒトにおいて免疫的毒性を引き起こすか決定する方法を対象にする。換言すると、本方法は、患者が免疫調節薬を受けるのに安全である場合、免疫調節薬を受ける個々の患者のためのスクリーニングアッセイとして機能することができる。本方法は、ヒト対象から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集するステップと、照射され、該個体由来の収集されたＰＢＭＣを生着させた免疫不全非ヒト哺乳動物（例えば、ヒト化免疫不全マウス）に免疫調節薬（例えば、ｍＡｂ）を投与するステップと、放出された１種または複数のサイトカイン（ＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０により例証）を検出するステップと、これにより、免疫調節薬が免疫的毒性を引き起こすか決定するステップとを含むことができ、免疫調節薬が、非ヒト哺乳動物において重度サイトカインストームを誘発する場合、免疫調節薬は、該個体において免疫的毒性を引き起こす。
医師が、免疫調節薬の投与に先立ちヒト対象における潜在的なＣＲＳを決定するのに有用な、信頼できるｉｎ ｖｉｖｏマウス方法に対する、長年にわたり満たされていない必要がある。理想的には、本方法は、免疫調節薬を受けているヒト対象のいずれが、重度ＣＲＳ有害事象を患うことになるかを正確に決定するべきである。上に記述されている２００６年３月に報告されている通り、ｍＡｂ ＴＧＮ１４１２が関与するＮｏｒｔｈｗｉｃｋ Ｐａｒｋ Ｈｏｓｐｉｔａｌでのヒト治験において、治験下の６名のボランティアが有害事象のために入院した。患者の多くが、血管浮腫、皮膚および粘膜の腫脹と、それに続く多臓器機能障害を患ったが、この治験の前臨床研究は、ラットモデルであれカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）であれｉｎ ｖｉｖｏヒトＰＢＭＣ細胞培養アッセイであれ、ＣＲＳ示唆を示さなかった。しかし、本発明者らによって、ある特定の患者が、所与の免疫調節薬に対して重度ＣＲＳ有害事象を有する場合とそうでない場合があることが発見され、特定の患者が、特定の薬物を投与された場合にＣＲＳを患う可能性があるか予め決定するための方法が考案された。
サイトカイン放出症候群は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ならびに他の免疫細胞集団（例えば、マクロファージ等）の活性化により発生する。免疫調節物質の添加により、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の活性化は、高レベルのサイトカインの放出ならびに下流の傷害および死亡可能性をもたらし得る。Ｔ細胞活性化の役割は、ＴＧＮ１４１２臨床治験により多くの注目を集めたが、ＮＫ細胞活性化も、ある特定の免疫調節物質に応答したサイトカイン放出症候群の供給源であることが示された。例えば、抗ＣＤ５２抗体であるＣＡＭＰＡＴＨ１－Ｈによる処置は、ＮＫ細胞が関与することが示され、ｉｎ ｖｉｖｏでの高レベルのＴＮＦ、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－６の放出（Wing M.G.ら（１９９５年）Ther. Immunol.、２巻：１８３～１９０頁）ならびにＩＬ－２およびＩＬ１２の組合せによる処置に起因する毒性は、Ｂ細胞でもＴ細胞でもなく、ナチュラルキラー細胞の活性化の結果であることが示された（Carson W.E.、（１９９９年）J Immunol、１６２巻；４９４３～４９５１頁）。異なる免疫調節物質および様々な免疫細胞集団の活性化により、サイトカイン放出症候群は、様々な活性化免疫細胞集団に伴い変動し得る高レベルのサイトカイン放出により顕在化し得る。
本発明者らは、マウスモデルが、薬物誘導性ＣＲＳの正確な予測を提供できるようになる前に、この複雑な生命システムにおいて、多くの変数を慎重に選択し、最適化する必要があることを了解した。残念ながら、現時点では、本技術分野において、いずれの変数を選択するべきかまたはこれをどのように最適化するべきかに関するガイダンスは殆どない。この系の高度に入り組んだ複雑な性質を考慮すると、マウスモデルが薬物誘導性ＣＲＳの有用かつ正確な予測を提供するためには、これらの変数の間の微妙なバランスが要求される。
本発明者らは、ヒト細胞数（すなわち、マウスに投与されたＰＢＭＣの数）およびマウスに存在するヒト細胞型の分布（これは、生着後の時間と共に変化する）が、この系において重大な変数であることを発見した。ヒトＰＢＭＣがマウスに注射されると、ヒトＴ細胞のみが増えることができ；他のヒト細胞型、例えば、ＮＫ細胞およびＢ細胞は、死に絶え始めるであろうことが発見された。ヒトＴ細胞計数が、マウスにおいて多くなり過ぎると、体重減少、背中を丸めた姿勢、脱毛、運動性低下、頻呼吸および最終的に死亡によって顕在化されるＧＶＨＤを引き起こすであろうことがさらに発見された。マウスが、重度ＧＶＨＤを示す場合、試験結果の精度が著しく損なわれる。
理論に制約されないが、ＰＢＭＣにおける成人ヒトＴ細胞が、異物としてマウスを認識し、マウスに攻撃を開始し、マウスに対して健康問題およびおそらく死亡を引き起こし、付随するサイトカイン放出を伴うことが予想外に発見された。これが起こる場合、マウスは、有意な体重減少を患い始め、ＣＲＳ決定においてマウスモデルを不正確なものにする病的症状を示す。
理論に制約されないが、多過ぎるＰＢＭＣの生着は、方法が不正確な予測を提供する（すなわち、偽陽性を提供する傾向がある）ように、マウスにおけるサイトカイン放出プロファイルを増加させると考えられる。生着させたＰＢＭＣの数が、５×１０７個のＰＢＭＣ／マウスを超える場合、一部のマウスが、生着後非常に急速に、おそらくＧＶＨＤ（移植片対宿主病）により有意な体重減少を患うことが観察される。マウスがＧＶＨＤを有する場合、免疫調節薬によって誘導されたそのようなマウスにおけるサイトカイン放出応答は、免疫調節薬に対するヒト対象の応答を正確に決定することができない。あるいは、生着させたＰＢＭＣの数が、ある特定の閾値（例えば、＜１×１０７個／マウス）を下回る場合、方法は、また、最適感度で免疫調節薬に対するヒト対象の応答を決定することができず、偽陰性を提供するであろう。さらに、本出願人らは、Ｘ線でマウスを照射して、生着に先立ちマウス免疫系を破壊して、拒絶を最小化し、注射されたヒトＰＢＭＣの生存を最大化する。
よって、本発明者らは、生着させたＰＢＭＣの数および免疫調節薬投与に先立つＰＢＭＣ生着時間が、マウスにおけるＧＶＨＤ発病に対して適切な集団の存在およびマウスにおけるヒト免疫細胞の分布のバランスを取ることにより、アッセイの最適精度に重大であることを決定した。
ＰＢＭＣヒト化マウスモデルは、初期のＢＬＴ（骨髄／肝臓／胸腺）または幹細胞ヒト化マウスモデルとは異なり、ヒトＰＢＭＣがマウス身体に注射されると、時間と共に他のヒト細胞型は死に絶えるが、Ｔ細胞集団のみが増えることができるため、本技術分野において、Ｔ細胞のみのモデルであると考慮されてきた。本技術分野において、ＰＢＭＣヒト化マウスは、通常、マウス１匹あたり通常百万～１千万個の細胞のＰＢＭＣ生着数による１０日間のＰＢＭＣ生着後に使用されており、これは、研究に、Ｔ細胞集団が実験を行うのに十分な多さの数まで増えるのを待つことを要求する。マウス細胞集団に存在する通常１０％ヒトＣＤ４５またはヒトＣＤ３ Ｔ細胞が、ヒト細胞の最小数の標準として使用されてきた。しかし、本発明者らは、ＰＢＭＣヒト化マウスモデルが、最適な薬物毒性試験を提供するためには、Ｔ細胞のみならず、他の細胞型、特に、ＮＫ細胞および単球も、マウスにおいて必要とされることを決定した。
したがって、本明細書におけるある特定の実施形態では、本発明は、長年にわたり満たされていない必要を満たし、免疫調節薬が、ヒト等の個体においてサイトカインストーム応答（すなわち、重度サイトカイン放出症候群）を誘発するか決定するｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、（ａ）免疫調節薬を受けることが考慮されている個々のヒトからＰＢＭＣを収集または単離するステップと、（ｂ）照射を受けた（例えば、生着させたＰＢＭＣを攻撃するためのマウス免疫細胞を機能的に抑制するために）免疫不全マウス（ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６またはＮＳＧ－ＣＳＦ－１）に１．５×１０７～３．０×１０７個の収集／単離されたＰＢＭＣを生着させるステップと、（ｃ）生着後５～７日目、好ましくは、６日目に、生着させたた免疫不全マウスに、免疫調節薬を投与するステップと、（ｄ）投与後に放出された１種または複数のサイトカインの存在を検出するステップと、（ｅ）対照薬剤（例えば、対照ｍＡｂ）と比較して、免疫調節薬に対するサイトカイン応答を評価して、マウスにおけるＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度の決定によるマウスにおけるサイトカイン放出が、重度サイトカイン放出症候群を示すレベルのものであるか決定するステップとを含む方法を対象にする。
一実施形態では、本方法は、ヒトから単離された１．５×１０７～３．０×１０７個のＰＢＭＣを、照射された免疫不全マウス（例えば、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６またはＮＳＧ－ＣＳＦ－１）に生着させるステップと、生着させてから５～７日後、好ましくは、６日後に、生着させた免疫不全マウスに免疫調節薬を投与するステップと、投与後に放出された１種または複数のサイトカインの量を検出するステップと、免疫調節薬がヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があると決定するステップであって、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群の存在は、前記免疫調節薬の投与が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があることを示す、ステップとを含む。本方法は、照射された免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射されるステップ、またはヒトからＰＢＭＣを単離するステップ、または薬物投与後に放出されたサイトカイン量を、陰性対照薬剤の投与後に放出された量と比較するステップをさらに含むことができる。適した陰性対照薬剤の例として、バッファーまたはアイソタイプ対照ｍＡｂが挙げられる。検出されるサイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＴＮＦまたは前述の組合せであり得、好ましくは、サイトカインは、ＩＦＮ－γまたはＩＬ－１０である。本アッセイは、医師に、いずれのヒト患者（複数可）が、重度ＣＲＳを患わないであろう他の患者と比較して、重度ＣＲＳを患う可能性があるか区別（または同定）させることが可能である。
好まれる例の実施形態において、生着に先立ち、免疫欠損マウスは、７５～１２５ｃＧｙのＸ線または１００ｃＧｙのＸ線を照射される。さらなる例の実施形態において、照射は、生着の少なくとも４時間前に行われる。
本発明者らは、ＰＢＭＣを個体（免疫調節薬を受けるものと思われる）から収集することができ、免疫不全マウス（例えば、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６またはＮＳＧ－ＣＳＦ－１）における生着に使用して、ヒト化マウスを得て、本明細書で開示されているアッセイを使用して１種または複数の薬物によって誘導された免疫的毒性（すなわち、サイトカイン放出）を試験することができることを確立した。有利には、本発明者は、驚いたことに、このアッセイ系が、免疫調節薬の投与を受けるであろうヒト患者におけるｉｎ ｖｉｖｏ応答を予測することを見出した。
本発明の方法において使用することができる、種々のヒトサイトカインが存在する。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－Ιβ、ＴＮＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２を含む、多くの炎症性サイトカインが、サイトカイン放出症候群において放出されることが公知である。一部のサイトカインは、サイトカイン放出症候群の決定において、他のサイトカインよりも有意な重要性を有すると考えられる。本発明において、ＣＲＳ応答を決定するための予測的サイトカインとしてＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０を含むことが特に適切となり得る（Teachey DTら、Cancer Discov.、２０１６年６月；６巻（６号）：６６４～７９頁．doi: 10.1158/2159-8290.CD-16-0040. Epub、２０１６年４月１３日）。
本発明者らは、ヒト化マウス血液におけるＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０を使用して、対象において予想され得るＣＲＳの重症度を確実に予測することができることを発見した。ＰＢＭＣヒト化マウスにおけるＩＦＮ－γレベルおよびＩＬ－１０レベルは、免疫調節薬による誘導後の他のサイトカインレベルと比較して、また、ヒトと比較して高い。他の抗体を使用して、潜在的応答の重症度の決定を助けることができることが企図される。
本発明者らは、マウスへの抗ＣＤ２８（ＡＮＣ２８．１／５Ｄ１０）等の免疫調節薬の投与６時間後に、ヒト化マウスの血液におけるそのＩＦＮ－γレベルが１，８００ｐｇ／ｍｌであったもしくはこれを上回った、および／またはＩＬ－１０レベルが１２０ｐｇ／ｍｌであったもしくはこれを上回ったドナーが、この薬物がこのヒト対象に投与されたとしたら、重度ＣＲＳ（例えば、グレード４～５）を発症する可能性があったことを発見した。ヒト化マウスの血液において、そのＩＦＮ－γレベルが３００ｐｇ／ｍｌ～１，８００ｐｇ／ｍｌの間であった、および／またはそのＩＬ－１０レベルが２５ｐｇ／ｍｌ～１２０ｐｇ／ｍｌの間であったドナーは、免疫調節薬を受けた後に、中程度ＣＲＳ（グレード１～３ ＣＲＳを発症）を発症する可能性があった（ただし、重度ＣＲＳは発症しない）。ヒト化マウスの血液において、そのＩＦＮ－γレベルが３００ｐｇ／ｍｌを下回った、および／またはＩＬ－１０レベルが２５ｐｇ／ｍｌを下回ったドナーは、免疫調節薬を受けた後に、ＣＲＳを発症しない可能性があった（Teachey DTら、２０１６年；Weissmullerら、PloS One、DOI:10.1371/journal.pone.0149093、２０１６年３月）。
ある特定の実施形態では、本発明は、後述する通り、ドナー／対象に由来する、マウス１匹あたり１千５百万～３千万個の収集／単離されたヒトＰＢＭＣの使用、およびヒト化免疫不全マウスを得るための免疫欠損マウスにおけるＰＢＭＣの生着を対象にする。ある特定の好まれる実施形態では、マウス１匹あたり１千５百万～２千５百万個の収集／単離されたヒトＰＢＭＣが使用される。ある特定の好まれる実施形態では、マウス１匹あたり２千万個の収集／単離されたヒトＰＭＢＣが使用される。生着から５～７日後に、免疫調節薬がマウスに投与され、マウスにおけるヒトサイトカイン濃度が測定されて、特定のドナー／対象が、免疫調節薬の投与後にサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を示すか否かに関する予測因子または決定因子として、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０のサイトカイン放出が、「重度もしくは高度応答」、「中程度もしくは低応答」または「無応答」のものであるか決定する。「重度／高度応答」は、ヒト化マウスへの免疫調節薬の投与後６時間目に、１，８００ｐｇ／ｍｌに等しいまたはこれを上回るＩＦＮ－γレベルおよび１２０ｐｇ／ｍｌに等しいまたはこれを上回るＩＬ－１０レベルとして測定される。ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０は、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームが発生するか否かに関して最もよく予測すると同定されたため、これらが測定される。本発明者らは、本ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系を使用して、免疫不全マウスに生着させた異なるヒトドナーＰＢＭＣが、ＣＲＳ誘導薬剤に異なって応答することを実証した。
本方法において、対象は、ヒト化マウスモデル方法において「低／無応答者」である場合、免疫調節薬投与後にサイトカイン応答を誘発する可能性は低く、この場合、この個体へのこの免疫調節薬の投与は安全である。したがって、本方法を使用して特定の個体が「低／無応答者」であると決定される場合、極めて有害なサイトカインストーム効果を有する潜在力のために、処置における使用に以前は利用できなかった免疫調節薬を、実際に当該個体に使用することができる。当該個体が、本方法により、この個体のＰＢＭＣによりヒト化されたマウスを使用して免疫調節薬に対する重度／高度ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０応答を有すると決定される場合、当該個体は、サイトカインストーム応答を誘発する可能性があり、そこで、この個体へのこの免疫調節薬の投与は安全ではない。
本方法において、免疫欠損マウス（免疫不全マウスとしても公知）が使用される。ＮＳＧマウスは、免疫不全である純系研究室マウスの系列である。ＮＳＧマウスは、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはこれらの組合せを欠く。ＮＳＧマウスはまた、複数のサイトカインシグナル伝達経路を欠損し、自然免疫に多くの欠損を有する。ＮＳＧマウスにおける複合免疫不全状態は、広い範囲の初代ヒト細胞の生着を許してヒト化マウスを得て、ヒトの生物学および疾患の多くの分野の精巧なモデル化を可能にする。本発明者らは、ＮＳＧマウスが、ＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスおよびＮＳＧ－ＩＬ－６マウスと同様の応答を有することを発見した。本明細書において、用語「ヒト化マウス」、「ヒト化免疫欠損マウス」、「ヒト化免疫不全マウス」およびこれらの複数形バージョンは、互換的に使用される。よって、これらの用語のうち１種の使用は、全てを包含するものとして解釈されるべきである。
ある特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、免疫系を欠く遺伝子改変マウス（すなわち、ヒト化免疫不全マウス）である。免疫不全マウスの例として、ＮＳＧ（すなわち、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス）、ＮＳＧ－ＣＳＦ－１、ＮＳＧ－ＩＬ－６その他が挙げられるがこれらに限定されない。本発明は、免疫不全マウスの他の具体例を包含することが意図される。免疫不全マウスは、好ましくは、それ自身のＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞またはこれらの組合せを欠く。その結果として、免疫不全マウスは、即時型移植片対宿主拒絶を伴わないヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の生着を可能にすることが予想される。
前のｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して、薬物誘導性サイトカインシグナルを実証することができるが、前のアッセイは、被験動物におけるドナー細胞の数と共にその動力学的免疫学的変化（例えば、十分な循環ＣＤ３細胞およびＮＫ細胞、ならびにＧＶＨＤの存在）の重大性を考慮することができないため、先行技術アッセイは、偽陽性および偽陰性応答の産生の影響を受け易いことが、本発明者らによって仮定される。前者は、多過ぎるドナー細胞（すなわち、ＣＤ３細胞およびＮＫ細胞）に起因し得、これにより、アッセイを過剰に高感度にし、サイトカイン放出の正確な予測を得ることができない。後者は、少な過ぎるドナー細胞（すなわち、ＣＤ３細胞およびＮＫ細胞）に起因し得、これもまた、アッセイを過剰に低感度にし、サイトカイン放出の正確な予測を得ることができない。厄介なことに、多過ぎるＣＤ３細胞は、被験動物において作動する移植片対宿主防御機構を引き起こす場合があり、マウスモデルをサイトカイン放出のスクリーニングに不適なものとする。
本発明は、ヒト対象における重度ＣＲＳを正確に決定するｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングアッセイを提供するという、長年にわたり満たされていない必要を救済する。これは、生着させるＰＢＭＣの量およびＰＢＭＣ生着後の薬物投与のタイミングを調整することにより達成される。
当業者であれば認める通り、ＰＢＭＣを収集および単離するための多くの適した仕方が存在する。非限定例として静脈内および心臓内を含む、免疫不全マウスにＰＢＭＣを導入するための多くの適した仕方も存在する。
本発明者らは、個々のヒト（免疫調節薬を受けるものと思われる）からＰＢＭＣを収集し、次いで、免疫不全マウス（例えば、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６またはＮＳＧ－ＣＳＦ－１）における生着に使用して、本明細書で開示されているアッセイを使用して、毒性（すなわち、サイトカイン放出）を試験することができることを確立した。有利には、本発明者らは、このアッセイ系が、免疫調節薬の投与を受けるであろうＰＢＭＣを提供するヒト患者におけるｉｎ ｖｉｖｏ応答を予測することを見出した。
理論に傾倒することなく、多過ぎるＰＢＭＣが、行き過ぎて不正確な予測を提供（すなわち、多くの偽陽性を提供）するように、サイトカイン放出プロファイルの感度を増強し得ると考えられる。ＰＢＭＣの数が、５×１０７個のＰＢＭＣ／マウスを超える場合、一部のマウスが、おそらくＧＶＨＤ（移植片対宿主病）により、有意な体重減少を患うことが観察される。これが起こる場合、免疫調節薬によって誘導されたこのようなマウスにおけるサイトカイン放出応答は、ヒト対象におけるＣＲＳを正確に決定することができない。あるいは、投与されたＰＢＭＣの数が、ある特定の閾値（例えば、＜１×１０７個／マウス）を下回る場合、方法は同様に、最適感度でＣＲＳを決定することができない（すなわち、多くの偽陰性を提供する）。
本方法の例の実施形態では、単離されたＰＢＭＣを免疫欠損マウスに生着させる少なくとも４時間前に、マウスは、１００ｃＧｙのＸ線（または７５ｃＧｙ～１２５ｃＧｙのＸ線）を照射される。照射は、ヒトからＰＢＭＣを収集および単離するステップの後、その前またはそれと同時に発生し得る。照射を使用することにより、Ｔ細胞は、ＮＳＧマウスにおいてより速く増えるであろうと考えられる。理論に制約されずに、照射が、ヒト細胞の生着を増強すると考えられる。正確な機構は依然として明らかでないが、照射は、骨髄破壊をもたらすことができ、これは、マウス免疫細胞を破壊し、ヒトＰＢＭＣ生存因子を増加させ、ヒトＴ細胞増大化をスピードアップする。照射は、末梢血、脾臓および骨髄におけるマウス免疫細胞の細胞死（アポトーシス）も誘導し、増加されたヒト免疫細胞を骨髄に向かわせる。照射なしでは、本方法を行うのに十分なヒト免疫細胞を得るには、より長い時間がかかるであろう。しかし、時間と共に、ヒトＰＢＭＣは、一部の細胞型、例えば、ＮＫ細胞および単球を失うであろうが、その理由として、これらの細胞型は、マウスにおいて成長することができず、単に数日間生存して、死に絶えることが挙げられる。ＮＫおよび骨髄系細胞は、一般にＣＤ３ Ｔ細胞よりも迅速にターンオーバーするが、マウスにおけるＮＫ細胞および骨髄系細胞の短い生存は、これらの生存を刺激するＩＬ１５等の因子の欠如が原因である。照射ありまたはなしで、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞（および骨髄系細胞）の短い生存により、ＰＢＭＣ生着後１０日目までに失われる筈である。Ｔ細胞のみが、ＮＳＧマウスにおいて増えることができる。アッセイは、毒性を試験するために、可能な限り多くのヒト免疫細胞型を必要とする。したがって、生着させたヒト免疫細胞の最適集団を有し、重度ＧＶＨＤを発病する前の期間、例えば、１．５×１０７～３．０×１０７個のＰＢＭＣの生着による本方法の５～７日目は、偽陰性を最小化しつつ、最適感度を達成するのに決定的に重要である。
ある特定の例の実施形態では、本発明は、免疫不全マウスへの特定の範囲のヒトＰＭＢＣ（１．５～３．０×１０７個／マウス）の生着に関する。ある特定の好まれる実施形態では、生着させるヒトＰＢＭＣの数は、２×１０７個／マウスである。
本発明者らは、特定の個体のＰＢＭＣが、照射された免疫抑制マウスにおいて生着し、次いで、免疫調節薬が、かかる生着後の重大な期間（例えば、５～７日後）（好ましくは、６日後）においてマウスに投与される場合、ＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０を使用してサイトカイン応答を測定して、この特定のヒトが、対象が、ヒトにとって潜在的に致死的となり得るサイトカイン放出症候群等の大量サイトカイン放出応答を誘発する可能性があり、したがって、免疫調節薬を投与されるべきではないことを意味する「重度」または「高度応答者」であるか決定することができることも発見した。
ある特定のＴ細胞活性化剤、特に、免疫抑制のために診療所において使用された初めてのｍＡｂであったマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ ＯＫＴ（登録商標）３（「ＯＫＴ３」）等、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に取り組むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、炎症促進性サイトカインの全身性放出を誘導することができる（Abramowicz D.ら、Transplantation、１９８９年４月；４７巻（４号）：６０６～８頁）。これらのうち最も危険なのは、ＴＮＦ、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）およびＩＬ－２である。ｍＡｂ療法を受けている患者において、かかるサイトカイン放出症候群または「サイトカインストーム」の制御は、高用量コルチコステロイド処置によってルーチンに達成される。ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ ＯＫＴ（登録商標）３は、静脈内に与えられて、心臓、腎臓および肝臓を含む移植された臓器の急性拒絶を反転する免疫抑制薬であるムロモナブ－ＣＤ３の商品名である。ＯＫＴ３は、急性移植片拒絶において主要な役割を果たす、Ｔ細胞の機能を遮断することにより作用する。ＯＫＴ３は、Ｔ細胞の膜におけるＣＤ３と呼ばれる分子と反応し、その機能を遮断する。Ｔリンパ球へのＯＫＴ３の結合は、その初期活性化をもたらし、サイトカイン放出に続くＴ細胞機能遮断をもたらす。これは、ＣＲＳの強い誘導因子である免疫抑制薬である。抗ＣＤ２８抗体ＡＮＣ２８．１／５Ｄ１０は、より弱いＣＲＳ誘導因子である。開発中の薬物候補を含む、他の抗体および免疫調節剤を本方法において使用することができる。
免疫調節薬の例として、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、抗ＣＤ５２ ｍＡｂ；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；インターフェロン；イミキモド；レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））、ポマリドミド（ＩＭＮＯＶＩＤ（登録商標））およびアプレミラスト等、サリドマイドおよびその誘導体またはアナログ；アザチオプリン、クラドリビン、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン、メトトレキセート、ミトキサントロン；ＩＭＬＹＧＩＣ（商標）（タリモジーンラハーパレプベック）；アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、カツマキソマブ（ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、トシツモマブ－Ｉ１３１（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、ブレンツキシマブベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、リツキシマブ（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標）またはＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ－１Ｈ（登録商標）、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）またはＬＥＭＴＲＡＤＡ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トラスツズマブエムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（商標））、デノスマブ（ＰＲＯＬＩＡ（登録商標）またはＸＧＥＶＡ（登録商標））、オファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））、デュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））、ダラツムマブ（ＤＡＲＺＡＬＥＸ（登録商標））、セリチニブ（ＺＹＫＡＤＩＡ（登録商標））および抗胸腺細胞グロブリン（ＴＨＹＭＯＧＬＯＢＵＬＩＮ（登録商標）（ウサギ）またはＡＴＧＡＭ（登録商標）（ウマ））が挙げられるがこれらに限定されない。
したがって、ある特定の例の実施形態では、免疫調節薬は、治療用抗体である。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）として、ＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８ ｍＡｂ）（ＴＡＢ０８）、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３ ｍＡｂ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）、ＬＥＭＴＲＡＤＡ（登録商標）（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）としても販売されるアレムツズマブ）（抗ＣＤＳ２ ｍＡｂ）、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）（イピリムマブ）、ＺＹＫＡＤＩＡ（登録商標）（セリチニブ）、ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）（アテゾリズマブ）、ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）（アベルマブ）、ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標）（デュルバルマブ）その他を挙げることができるがこれらに限定されない。他の実施形態では、免疫調節薬は、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドミド）等の小分子薬物；抗胸腺細胞グロブリン等のポリクローナル抗体；またはインターフェロン等のタンパク質等の生物学的薬物であり得る。
当業者によって認められる通り、免疫調節薬は、種々の投与経路を使用して、非ヒト免疫不全哺乳動物に投与することができる。例示的な投与経路として、静脈内、大腿内（ｉｎｔｒａｆｅｍｏｒａｌ）、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、心臓内、腹腔内投与経路その他が挙げられるがこれらに限定されない。好まれる投与経路は、静脈内注入である。
特定の理論に傾倒することなく、ヒトＰＢＭＣによるマウス生着後５～７日目のヒト化免疫不全マウスに存在する優勢な細胞は、免疫調節薬の投与後のサイトカイン放出症候群またはサイトカインストーム毒性に関して試験することができると考えられる。試験は、注射後のＰＢＭＣ細胞の数およびヒトＰＢＭＣの比を含む因子に依存する。投与される細胞の細胞型のバランスおよび細胞数（含量）は、サイトカイン放出症候群の決定において重要であると考えられる。例えば、図２Ｂに示す通り、ＮＫ細胞（ＣＤ５６）は、存在するＣＤ４５細胞の約２０～３０％であり、生着後１０日目までに１～５％に減少した。したがって、１０日目までに、このＰＢＭＣヒト化マウスにおける優勢な細胞型は、Ｔ細胞であり、ＰＢＭＣヒト化マウスは、多くの他のヒト細胞型を持たず、毒性試験のための優れたモデルではない。
本発明の非限定例の実施形態は、免疫調節薬が、個体への免疫調節薬の投与後に、個々のヒトにおけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、ＳＩＲＳまたはサイトカインストーム（ＣＲＳの重症例）を誘発する可能性があるか決定する方法を含む。例の実施形態において、本方法は、
（ａ）免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、
（ｂ）ヒトから単離された１．５～３．０×１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記マウスに生着させるステップと、
（ｃ）生着させてから５～７日後に、前記マウスに免疫調節薬を投与するステップと、
（ｄ）前記マウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップであって、ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群を示す、ステップと、
（ｅ）前記免疫調節薬が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があると決定するステップであって、
前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群の存在が、前記免疫調節薬の投与が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があることを示す、ステップと
を含む。
別の非限定例の実施形態では、本発明は、免疫調節薬が、個体への免疫調節薬の投与後に、個々のヒトにおけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、ＳＩＲＳまたはサイトカインストーム（ＣＲＳの重症例）を誘発する可能性があるか決定する方法を含む。例の実施形態において、本方法は、
（ａ）ヒトから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するステップと、
（ｂ）２×１０７個の前記単離されたＰＢＭＣを、照射された免疫不全マウスに生着させるステップと、
（ｃ）生着させてから５～７日後に、前記マウスに免疫調節薬を投与するステップと、
（ｄ）前記マウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップであって、
ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群を示し、
前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群の存在が、前記免疫調節薬の投与が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があることを示す、ステップと
を含む。
例の実施形態において、本方法は、
（ｅ）ヒトが、免疫調節薬による治療法に適しているか決定するステップであって、
マウスにおける誘発された重度サイトカイン放出症候群が、免疫調節薬による治療法に適していないヒトを示す、ステップ
をさらに含むことができる。
マウスモデルにおける免疫調節薬に応答したサイトカインＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０の濃度が、「重度／高度」として測定される場合、免疫調節薬は、重度サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを誘発する可能性があり、ヒトは、治療法に適していない。ヒトが、この特定の免疫調節薬による治療法に適していないと思われる場合、別の抗体もしくは化学療法または他の薬物を、個体／患者の処置に試みることができる。
ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０の両方の濃度が、「低／無応答」または「低応答」を示す場合、個々のヒトは、免疫調節薬による治療法に適している。「無応答」ｖｓ．「低応答」下端の決定は、識別が困難となる場合があり、アッセイの感度に依存し得るが、「無応答」および「低応答」は両者共に、ヒトが治療法に適していることを示すため、応答スペクトルのこのような末端に明瞭な境界線を設定する必要はないと思われる。
本明細書に記載されている通り、ヒト化生着マウスに、例えば、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３ ｍＡｂ）を含む様々な治療用抗体等の異なる免疫調節薬を注射し、ヒト化マウスにおける抗体の効果を観察した。抗ＣＤ２８およびＯＫＴ３処置マウスの両方が、ある特定の個体／試料に関して主要な炎症性サイトカインの有意な増加を示した。非ヒト化マウスへの投与は、サイトカイン応答を誘導しなかった。これらの知見は、ＰＢＭＣを生着させたヒト化マウスが、特定の対象／個体に対するある特定の薬物の免疫的毒性を決定することができることを示す。
本方法は、ヒトＰＢＭＣを生着させた非ヒト哺乳動物に免疫調節薬を投与するステップと、免疫調節薬が、非ヒト哺乳動物において毒性を引き起こすか決定するステップであって、薬剤が、非ヒト哺乳動物において毒性を引き起こす場合、薬剤が、ヒトにおいて免疫的毒性を引き起こすと考えられる、ステップとを含む。
免疫的毒性は、個体の免疫系の機能における薬剤の望ましくない／意図されない効果を指す。例えば、Weir, A、Journal of Immunotoxicology、５巻：３～１０頁（２００８年）；Gribble, E J.ら、Expert Opinion Drug Metab Toxicol、３巻（２号）（２００７年）を参照されたい。
一部の実例では、免疫的毒性は、ヒトにおいてサイトカインストームを生じ得る。サイトカインストーム、サイトカイン放出症候群または輸注反応は、薬剤（例えば、治療用ｍＡｂ）への初めての曝露後に通常見られる有害事象である。これは、いくつかの炎症性サイトカインの全身性放出によって特徴付けられる。症状は、軽度から重度に及び、疲労、頭痛、蕁麻疹、そう痒、気管支痙攣、呼吸困難、舌または咽頭腫脹の感覚、鼻炎、悪心、嘔吐、潮紅、発熱、悪寒、低血圧、頻拍、および無力症を含む。例えば、Wing, M.ら、Journal of Immunotoxicology、５巻：１１～１５頁（２００８年）およびWang, H.ら、American Journal of Emergency Medicine、２６巻：７１１～７１５頁（２００８年）を参照されたい。
よって、さらに別の態様では、本発明は、（１種または複数の）薬剤の投与が、それを必要とする個体（例えば、ヒト）におけるサイトカイン放出症候群を引き起こすか決定する方法を対象にする。本方法は、ある特定の数のＰＢＭＣを生着させた非ヒト哺乳動物に、ある特定の日数の後に薬剤を投与するステップと、薬剤によって誘導された非ヒト免疫不全哺乳動物内の１種または複数のヒトサイトカインのレベルを決定するステップと、薬剤が、非ヒト哺乳動物においてサイトカイン放出症候群を引き起こすか決定するステップであって、薬剤が、非ヒト哺乳動物においてサイトカイン放出症候群を引き起こす場合、薬剤が、ヒトにおいてサイトカイン放出症候群を引き起こすであろう、ステップとを含む。
本発明者らは、日数が適した細胞組成をもたらす限り、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６またはＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスにおけるＰＢＭＣの生着後に免疫調節薬を試験する日数が重大であることを発見した。この日数は、マウスにおいて最初に生着させるＰＢＭＣの数に応じて若干変動し得る。すなわち、より多くのＰＢＭＣを生着させる（本範囲内）場合、免疫調節薬を試験する前の日数は、より少ないＰＢＭＣ（本範囲内）を生着させる場合よりも若干短くなり得る（同様に本範囲内）。マウスに対する成人ヒトＴ細胞の免疫細胞同種異系間認識により、生着させたＰＢＭＣが、マウス細胞を死滅させ始めると、マウスは、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を起こすと考えられる。これが起こる場合、マウスは、有意な体重減少を患い始め、ＣＲＳの決定においてマウスモデルを不正確なものにする、重度病的症状を示す。ある特定の実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣ生着の４～７日または５～７日後の免疫調節薬の投与を提供する。ある特定の好まれる実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣ生着の６日後の免疫調節薬の投与を提供する。
本発明者らは、各マウスに注射される細胞の数（マウス１匹あたり２千万個の細胞ｖｓ．マウス１匹あたり５千万個の細胞）の関数として、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０の応答レベルを比較した（図９Ａ～図９Ｂを参照）。マウスに注射されるＰＢＭＣの数は、決定因子である。多い数のＰＢＭＣ（例えば、マウス１匹あたり５千万個のＰＢＭＣ）が注射されると、マウスは、多い放出サイトカインを示し、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０は全て、それぞれ≧１，８００ｐｇ／ｍｌおよび≧１２０ｐｇ／ｍｌに増加した。しかし、このドナー（２１３）（図９で使用）は、前にマウス１匹あたり２千万個のＰＢＭＣを注射された場合、少ないサイトカインが放出された。このデータは、マウス１匹あたり２千万個のＰＢＭＣ（またはマウス１匹あたり１千５百万～３千万個のＰＢＭＣの範囲）が、患者スクリーニングの好まれる範囲内であることを示す。本発明に従って、免疫療法薬に応答した個体のためのサイトカインストームの検出において使用されるＰＢＭＣの範囲は、１千５百万～３千万個の間のＰＢＭＣである。好ましくは、ＰＢＭＣ範囲は、２千万～２千５百万個の間のＰＢＭＣである。より好ましくは、濃度は、マウス１匹あたり２千万個のＰＢＭＣである。
本発明は、ヒト患者において有害なサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を引き起こす免疫調節薬の潜在力を決定するための改善されたｉｎ ｖｉｖｏ方法を提供する。
有利には、本明細書でさらに記述されている通り、本発明者らは、このアッセイ系が、ｉｎ ｖｉｖｏ応答を決定するものであり、研究および医薬品安全性評価における強力なツールを表すことも見出した。ボランティアヒト対象における新たな薬物候補の現在の臨床試験は、薬物不合格の結果となることが多い。この失敗は、大部分は、現存しているｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルの不適切さのために、前臨床試験において曝露されなかった毒性によるものである。潜在的薬物候補の有害効果を正確に予測することができるｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルに対し、長年にわたり満たされていない必要がある。治療薬候補へと開発するための薬物候補のスクリーニングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ前臨床試験の両方に合格する必要がある。
同様に当業者によって認められる通り、ＰＢＭＣを非ヒト哺乳動物に導入するための種々の仕方が存在する。かかる方法の非限定例は、静脈内、大腿内、脳室内、心臓内投与経路を含むことができる。好ましくは、ＰＢＭＣは、静脈内経由で導入される。
本発明者らは、ＰＢＭＣ生着時間が重大であることを発見した。特に、対象のＰＢＭＣのマウスへの生着後の特定の時間枠内に免疫調節薬を投与することができることが観察される。
生着後３日目に、不十分な細胞数が存在する。本発明者らは、５日目に、十分なヒト細胞型が存在し、このようなヒト細胞の数は、試験に最適である（ヒトＣＤ４５％＞１０％）ことを見出した。しかし、１０日目に、多くの細胞型の細胞数（総生細胞のパーセンテージ）は減少する。例えば、ＮＫ細胞は、５日目の２０～３０％から１０日目の１～５％へと減少した（図２Ｂおよび図２Ｃ）。よって、本方法は、生着後４～７日目の間にまたは５～７日目の間にまたは６日目に、ヒト化マウスに薬物を投与するステップを含む。
多くのリンパ系、骨髄系および潜在的には他のヒト免疫細胞型が、免疫的毒性応答における関与を要求され、これは、重要な役割を果たすＴ細胞およびＮＫ細胞を含むと考えられる。本ＰＢＭＣヒト化マウスモデルにおいて、本発明者らは、異なるヒト細胞型が、初期時点でマウスに存在することを見出した。ヒトＴ細胞およびＮＫ細胞は、生着５日目のこのようなマウスにおける優勢な細胞集団である（図２および図４Ａ）。
最適な毒性試験のため、マウスにおける重大な意味を持つレベルのヒト細胞を要求することも考えられる。マウスにヒトＰＢＭＣが注射されると、ヒトＴ細胞のみが増えることができる；他の細胞型は、時間と共に死に絶え始めるであろう。時間経過に伴った細胞数（すなわち、マウスに投与されたＰＢＭＣの数）および細胞型の間の入り組んだバランスが必要とされる。
その上、本発明者らは、マウスが、体重減少によって顕在化される移植片対宿主病ＧＶＨＤを発症する前に、実験が行われることが必要であることを発見した。下にさらに記述する通り、８日後に、本発明者らは、重度移植片対宿主病ＧＶＨＤを示す、ＰＢＭＣを生着させたヒト化マウスの多くの有意な体重減少を観察した。一般に、マウスにおけるヒトＴ細胞は、永久に成長することができないと考えられる；これは、Ｔ細胞数が多い場合、サイトカインの放出により、マウスを攻撃し、ＧＶＨＤを引き起こすであろう。マウスがＧＶＨＤを有する場合、ヒトＴ細胞がマウス細胞を攻撃する際にサイトカインが放出されるため、試験結果の精度に影響を与えるであろう（Ju XPら、Transplantation.、１９９７年；６３巻（９号）：１３０７～１３１３頁）。マウスは、ＧＶＨＤが原因で最終的に死ぬであろう。
ＧＶＨＤの例のデータは、図３Ａ～図３Ｄに描写されている。図３Ａおよび図３Ｂにおいて、マウスにおけるドナー４６２９および３６２由来のＰＭＢＣの生着は、５×１０７個のＰＢＭＣ生着後の早くも６日目に有意な体重減少を引き起こした。図３Ｃは、ドナー３０９について、２×１０７個のＰＭＢＣを受けているマウスは、８日目後に体重減少を開始したことを示す一方、図３Ｄは、ドナー３５８由来の３×１０７個のＰＭＢＣを受けているマウスが、７日目後に体重減少を開始したことを示す。
加えて、ＧＶＨＤを有するこれらのマウスは、８日後に病的であり、したがって、もはや試験に適していなかった。本発明者らは、体重減少を観察したのみならず、背中を丸めた姿勢、脱毛、運動性低下および頻呼吸も示された。２０％の体重減少後に、マウスは、安楽死させる必要があった。
よって、マウスが、ＧＶＨＤを患っていないまたは他の面で病的でないことを確実にするために、ＰＢＭＣの生着の８日後より前に免疫調節薬が投与されることが重大な意味を持つ。さらに、例えば３日目もの早さでは十分な細胞が存在しない可能性があるため、早過ぎる時点で薬物を投与することはできない。試験が正確となるために、十分な循環細胞が存在する必要がある。
よって、上述の因子を考慮して、ある特定の実施形態では、免疫調節薬は、マウスにＰＢＭＣを生着させてから５～７日後にマウスに投与される。一部の好まれる実施形態では、免疫調節薬は、ＰＢＭＣを生着させてから６日後にマウスに投与される。この期間において、マウスは、当業者にとって公知の通りに哺乳動物の基本的欲求（例えば、食物、水、光）を満たすことを含む、適した条件下に維持するべきである。
下に表記する例において、本発明者らは、１０名のドナーの実験のために６日目を選択した。１種または複数の炎症促進性サイトカイン（ヒトまたはマウス）の発現増加を測定するための方法も、当業者にとって公知である。炎症促進性ヒトサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－αまたは「ＴＮＦ」）、ＩＬ－１０またはこれらの組合せを含む。炎症促進性サイトカインの発現増加は、フローサイトメトリーを使用して、本明細書に記載されている通りに決定することができる。
別の態様では、免疫調節薬の組み合わせ物が、免疫調節薬の組み合わせ物の投与後にヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を誘発する可能性があるか決定する方法が開示されている。一実施形態では、組み合わせ物は、第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬を含む。別の実施形態では、本方法は、免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、ヒトから単離された１．５～３．０×１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を免疫不全マウスに生着させて、ヒト化マウスを産生するステップと、ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬をヒト化マウスに投与するステップと、ヒト化マウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップであって、ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群を示す、ステップと、免疫調節薬の組み合わせ物が、ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があると決定するステップであって、マウスにおける重度サイトカイン放出症候群の存在が、免疫調節薬の組み合わせ物の投与が、ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する能性があることを示す、ステップとを含む。
マウス１匹あたりの生着させるＰＢＭＣの数は、２×１０７個のＰＢＭＣであり得る。免疫不全マウスは、ＮＳＧマウス、ＮＳＧ－ＩＬ－６マウスまたはＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウス、好ましくは、ＮＳＧマウスであり得る。免疫不全マウスは、生着に先立ち、１００ｃＧｙのＸ線を照射することができる。薬物の投与は、生着させてから６日後に行うことができる。複数のサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６またはＴＮＦをさらに含むことができる。サイトカイン濃度は、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＴＮＦのそれぞれに対して決定することができる。複数のサイトカインの血中濃度は、免疫調節薬の前記組み合わせ物の投与の２～６時間、好ましくは、６時間後に決定される。
複数の免疫調節薬の例示的な組み合わせ物の１種では、免疫調節薬は、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、抗ＣＤ５２ ｍＡｂ；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；インターフェロン；イミキモド；レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））、ポマリドミド（ＩＭＮＯＶＩＤ（登録商標））およびアプレミラスト等、サリドマイドおよびその誘導体またはアナログ；アザチオプリン、クラドリビン、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン、メトトレキセート、ミトキサントロン；ＩＭＬＹＧＩＣ（商標）（タリモジーンラハーパレプベック）；アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、カツマキソマブ（ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、トシツモマブ－Ｉ１３１（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、ブレンツキシマブベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、リツキシマブ（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標）またはＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ－１Ｈ（登録商標）、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）またはＬＥＭＴＲＡＤＡ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トラスツズマブエムタンシン（（ＫＡＤＣＹＬＡ（商標））、デノスマブ（ＰＲＯＬＩＡ（登録商標）またはＸＧＥＶＡ（登録商標））、オファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））およびデュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））、ダラツムマブ（ＤＡＲＺＡＬＥＸ（登録商標））、セリチニブ（ＺＹＫＡＤＩＡ（登録商標））および抗胸腺細胞グロブリン（ＴＨＹＭＯＧＬＯＢＵＬＩＮ（登録商標）（ウサギ）またはＡＴＧＡＭ（登録商標）（ウマ））から独立して選択することができる。
別の例示的な組み合わせ物では、第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬は、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、抗ＣＤ５２ ｍＡｂ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；インターフェロン；イミキモド；サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、アプレミラスト；アザチオプリン、クラドリビン、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン、メトトレキセート、ミトキサントロン；タリモジーンラハーパレプベック；アダリムマブ、カツマキソマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ－Ｉ１３１、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、デノスマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ダラツムマブ、セリチニブ、エロツズマブおよび抗胸腺細胞グロブリンからなる群から独立して選択される。抗ＣＤ５２ ｍＡｂは、アレムツズマブであり得、抗Ｃ２０ ｍＡｂは、リツキシマブであり得、抗ＣＤ３ ｍＡｂは、ＯＫＴ３であり得、抗ＣＤ２８ ｍＡｂは、ＴＧＮ１４１２であり得る。
好まれる一実施形態では、第１の免疫調節薬は、ペムブロリズマブまたはニボルマブであり、第２の免疫調節薬は、レナリドミド、ポマリドミド、エパカドスタット、タリモジーンラハーパレプベック、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、セリチニブ、ダラツムマブ、エロツズマブまたはデュルバルマブである。別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、ペムブロリズマブであり、第２の免疫調節薬は、レナリドミドである。別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、ペムブロリズマブであり、第２の免疫調節薬は、ポマリドミドである。
好まれる一実施形態では、第１の免疫調節薬は、ニボルマブであり、第２の免疫調節薬は、レナリドミドである。別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、ニボルマブであり、第２の免疫調節薬は、ポマリドミドである。別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、ニボルマブであり、第２の免疫調節薬は、エロツズマブである。別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、ニボルマブであり、第２の免疫調節薬は、ダラツムマブである。好まれる一実施形態では、第１の免疫調節薬は、ニボルマブであり、第２の免疫調節薬は、イピリムマブである。
別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、イピリムマブであり、第２の免疫調節薬は、レナリドミド、ポマリドミド、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、セリチニブ、ダラツムマブまたはデュルバルマブである。
別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、アテゾリズマブ、アベルマブまたはデュルバルマブであり、第２の免疫調節薬は、レナリドミド、ポマリドミド、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、リツキシマブ、セリチニブ、ダラツムマブまたはアレムツズマブである。別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、デュルバルマブであり、第２の免疫調節薬は、レナリドミドである。別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、デュルバルマブであり、第２の免疫調節薬は、リツキシマブである。別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、デュルバルマブであり、第２の免疫調節薬は、ポマリドミドである。別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、デュルバルマブであり、第２の免疫調節薬は、ダラツムマブである。さらに別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、デュルバルマブであり、第２の免疫調節薬は、イブルチニブである。
好まれる一実施形態では、第１の免疫調節薬は、エロツズマブであり、第２の免疫調節薬は、ポマリドミドである。別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、アテゾリズマブであり、第２の免疫調節薬は、ポマリドミドである。別の好まれる実施形態では、第１の免疫調節薬は、アテゾリズマブであり、第２の免疫調節薬は、レナリドミドである。
別の態様では、本発明は、開示されている、免疫調節薬の投与後にヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘発しない免疫調節薬の安全な投薬量を決定する方法を提供する。本方法は、第１の投薬量を有する免疫調節薬を用意するステップであって、免疫調節薬の前記第１の投薬量が、その投与後に、第１の照射されたヒト化免疫不全マウスにおいて軽度または重度サイトカイン放出症候群を誘発すると決定される、ステップと、第２の免疫不全マウスを用意するステップであって、前記第２のマウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、ヒトから単離された１．５～３．０×１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記第２のマウスに生着させるステップと、ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、前記第２のマウスに免疫調節薬を投与するステップであって、前記免疫調節薬が、前記第１の投薬量よりも少ない第２の投薬量で投与される、ステップと、前記第２のマウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップと、前記ヒトにおける投与のための前記免疫調節薬の安全な投薬量を決定するステップであって、前記安全な投薬量が、前記第２のマウスへの前記免疫調節薬の投与後に、ＩＦＮ－γが＜３００ｐｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１０が＜２５ｐｇ／ｍｌである血中濃度を生じる投薬量であり、前記第２のマウスにおけるＩＦＮ－γ＜３００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０＜２５ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記免疫調節薬の前記安全な投薬量の投与が、前記ヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘発しない可能性があることを示す、ステップとを含むことができる。
別の実施形態では、本方法は、ヒトにおいて軽度または重度サイトカイン放出症候群を誘発するのではないかと疑われる免疫調節薬の安全な投薬量の最適化を提供する。本方法は、免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、ヒトから単離された１．５～３．０×１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させるステップと、ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、前記マウスに免疫調節薬を投与するステップであって、前記免疫調節薬が、軽度または重度サイトカイン放出を誘発するのではないかと疑われる投薬量よりも低い投薬量で投与される、ステップと、前記マウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップと、前記ヒトにおける投与のための前記免疫調節薬の安全な投薬量を決定するステップであって、前記安全な投薬量が、前記マウスへの前記免疫調節薬の投与後に、ＩＦＮ－γが＜３００ｐｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１０が＜２５ｐｇ／ｍｌである血中濃度を生じる投薬量であり、前記マウスにおけるＩＦＮ－γ＜３００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０＜２５ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記免疫調節薬の前記安全な投薬量の投与が、前記ヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘発しない可能性があることを示す、ステップとを含む。
マウス１匹あたりの生着させるＰＢＭＣの数は、２×１０７個のＰＢＭＣであり得る。例示的な免疫不全マウスは、ＮＳＧマウス、ＮＳＧ－ＩＬ－６マウス、ＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスその他を含む。好ましくは、免疫不全マウスは、ＮＳＧマウスである。好まれる実施形態では、免疫不全マウスは、生着に先立ち、１００ｃＧｙのＸ線を照射される。薬物の投与は、生着させてから６日後に行うことができる。複数のサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６またはＴＮＦをさらに含むことができる。複数のサイトカインの血中濃度は、免疫調節薬の投与の２～６時間後に、好ましくは、免疫調節薬の投与の６時間後に決定することができる。免疫調節薬は、本明細書で開示されているもののうちのいずれかであり得る。例えば、免疫調節薬は、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、抗ＣＤ５２ ｍＡｂ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、エパカドスタット、タリモジーンラハーパレプベック、ニボルマブ、レナリドミド、セリチニブまたは抗胸腺細胞グロブリンであり得る。
別の態様では、本発明は、ヒトへの免疫調節薬の投与が、ヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘導する見込みを決定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、ヒト由来の１．５～３．０×１０７個の単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させてから５～７日後に免疫調節薬を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップと、マウスの血液試料に存在するＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するステップであって、マウス血液試料におけるＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌまたはＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの濃度が、ヒトへの免疫調節薬の投与が、重度サイトカイン放出症候群を誘導する可能性があることを示す、ステップとを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、開示されている、ヒトへの第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物の投与が、ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘導する見込みを決定する方法を提供する。本方法は、ヒト由来の１．５～３．０×１０７個の単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させてから５～７日後に第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップと、マウスの血液試料に存在するＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するステップであって、ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌまたはＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの濃度が、ヒトへの第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物の投与が、重度サイトカイン放出症候群を誘導する可能性があることを示す、ステップとを含むことができる。
さらなる態様において、本発明は、臨床評価のために多数の臨床的に関連する薬物候補から同定するための精度を有する薬物スクリーニングプラットフォームとしてのヒト化マウスモデルを提供する。本アッセイは、ヒトにおいてサイトカイン放出を誘発する潜在的薬物候補を排除することから、薬物免疫毒性試験のための頑強な予測ツールを表す。
本アッセイは、ヒトにおける免疫系に有害に影響し得る薬物候補（複数可）のための薬物試験アッセイを表す。本アッセイは、薬物候補または薬物候補の組み合わせ物のための薬物試験を提供することもできる。モデルは、前臨床および臨床試験の間に必要なリンクを提供する。薬物開発プログラムへの本アッセイの統合は、治療薬開発のためのＦＤＡ承認プロセスを加速させる筈である。これらの方法における薬物候補または薬物候補の組合せは、本明細書における他の実施形態に関して言及されている免疫調節薬に限定されないが、疾患、疾病、病気、傷害または他の状態の処置、軽減および／または治癒に関して治療効果を有し得るいずれかの薬物候補を含むことができる。
したがって、別の態様では、本発明は、薬物候補が、ヒトにおいて免疫的毒性を引き起こすか決定する方法を対象にする。本方法は、ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を生着させた非ヒト免疫不全哺乳動物（例えば、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＣＳＦ－１またはＮＳＧ－ＩＬ－６マウス）に薬物を投与するステップと、薬物が、非ヒト哺乳動物において免疫的毒性を引き起こすか決定することにより、薬物が、ヒトにおいて免疫的毒性を引き起こすか決定するステップとを含む。
したがって、本発明は、ヒトにおける使用のための薬物候補の免疫毒性を決定するｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、（ａ）免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、（ｂ）４．５～５．５×１０７～５．５×１０７個のヒトＰＢＭＣ、好ましくは、５．０×１０７個のヒトＰＢＭＣをマウス（例えば、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６またはＮＳＧ－ＣＳＦ－１）に生着させるステップと、（ｃ）生着させてから４～７日後に、マウスに薬物候補を投与するステップと、（ｄ）前記マウスの血液におけるサイトカイン濃度を決定するステップであって、前記サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦからなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインである、ステップと、（ｅ）前記薬物候補の免疫毒性を決定するステップであって、前記マウスにおける、ＩＦＮ－γ≧３００ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－２≧１５ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－４≧１０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－６≧１０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－１０≧２５ｐｇ／ｍｌまたはＴＮＦ≧５ｐｇ／ｍｌからなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインの血中濃度が、ヒトにおける前記薬物候補の免疫毒性を示す、ステップとを含む方法を提供する。免疫不全マウスは、ＮＳＧマウス、ＮＳＧ－ＩＬ－６マウスまたはＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウス、好ましくは、ＮＳＧマウスであり得る。好まれる実施形態では、免疫不全マウスは、１００ｃＧｙのＸ線を照射される。サイトカイン放出は、薬物候補投与の２～６時間後に、好ましくは、薬物候補投与の６時間後に、マウスの血液において決定することができる。
ある実施形態では、薬物候補のヒト免疫毒性を決定する方法は、４．５×１０７～５．５×１０７個のヒトＰＢＭＣを、照射された免疫不全マウスに生着させるステップと、生着させてから４～７日後、好ましくは、５～７日後に、より好ましくは、生着させてから６日後に、薬物候補を前記マウスに投与するステップと、前記マウスの血液におけるサイトカイン放出を決定するステップであって、サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦからなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインである、ステップと、低いサイトカイン放出が、マウスの血液において検出される場合、薬物候補が、低いヒト免疫毒性を有することを同定するステップとを含む。ある実施形態では、薬物候補のヒト免疫毒性を決定する方法は、４．５～５．５×１０７個の単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の生着から４～７日後、好ましくは、５～７日後に、より好ましくは、生着から６日後に、薬物候補を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップと、マウス血液試料に存在する少なくとも１種のヒトサイトカインの濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出して、薬物候補のヒト免疫毒性を決定するステップであって、少なくとも１種のヒトサイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦαからなる群から選択され、低いヒトサイトカイン濃度がマウス血液試料において検出される場合、薬物候補が、低いヒト免疫毒性を有する、ステップとを含む。免疫不全マウスは、ＮＳＧマウス、ＮＳＧ－ＩＬ－６マウスまたはＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスであり得、好ましくは、前記免疫不全マウスは、ＮＳＧマウスである。免疫不全マウスは、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射することができ、好ましくは、免疫不全マウスは、１００ｃＧｙのＸ線を照射される。サイトカイン放出は、薬物候補投与の２～６時間後に、好ましくは、薬物候補投与の６時間後に、マウスの血液において決定することができる。マウスの血液における低いサイトカイン放出は、ＩＦＮ－γ＜３００ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－１０＜２５ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－２＜１５ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－４＜１０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－６＜１０ｐｇ／ｍｌまたはＴＮＦ＜５ｐｇ／ｍｌを含むことができる。マウスの血液における低いサイトカイン放出は、陰性対照の投与によって誘導されるサイトカインの量以下のサイトカインの量を含むことができる。
本発明は、薬物候補（複数可）および／または薬物組合せが、ＦＤＡ承認に適した安全性プロファイルを有するか同定するためのステップであって、低いサイトカイン放出が、ＦＤＡ承認に適した安全性プロファイルを示す、ステップをさらに提供する。非限定例の実施形態において、４．５×１０７～５．５×１０７個のヒトＰＢＭＣが、照射された免疫不全マウスに生着する。他の非限定例の実施形態において、５．０×１０７個のヒトＰＢＭＣが、照射された免疫不全マウスに生着する。安全性プロファイルを決定する方法において生着するＰＢＭＣは、単一の個体にまたはヒトのプールに由来し得る。好まれる実施形態において、免疫欠損マウスは、ＰＢＭＣが免疫不全マウスに生着する少なくとも４時間前に、７５ｃＧｙ～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される。他の好まれる実施形態において、免疫欠損マウスは、ＰＢＭＣが免疫不全マウスに生着する少なくとも４時間前に、１１００ｃＧｙのＸ線を照射される。薬物に対する応答は、例えば対照薬剤と比較して評価することができる。本アッセイは、薬物候補が医薬品安全性評価を合格することの決定を可能にする。
他の例の実施形態において、本発明は、ヒト末梢血単核細胞を生着させたヒト化照射免疫不全マウスであって、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスであるヒト化照射免疫不全マウスを提供する。好ましくは、マウスは、１．５～３．０×１０７個のＰＢＭＣを生着させる。ＮＳＧマウスは、ヒトマクロファージコロニー刺激因子－１遺伝子（ＮＳＧ－ＣＳＦ－１）またはヒトインターロイキン－６遺伝子（ＮＳＧ－ＩＬ－６）をさらに含むことができる。より好ましくは、マウスは、２×１０７個のＰＢＭＣを生着させる。他の例の好まれる実施形態において、マウスは、４．５～５．５×１０７個のＰＢＭＣを生着させる。
他の例の実施形態において、本発明は、ヒト末梢血単核細胞を生着させたヒト化免疫不全マウスであって、ヒトマクロファージコロニー刺激因子－１遺伝子（ＮＳＧ－ＣＳＧ－１）を有するＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスであるヒト化免疫不全マウスを提供する。好ましくは、マウスは、１．５～３．０×１０７個のＰＢＭＣを生着させる。より好ましくは、マウスは、２×１０７個のＰＢＭＣを生着させる。他の例の好まれる実施形態において、マウスは、４．５～５．５×１０７個のＰＢＭＣを生着させる。
本発明の例の実施形態の追加的な態様、利点および／または他の特色は、添付の図面と併せて、次の詳細な説明を考慮することにより明らかになるであろう。当業者であれば、本明細書に提供されている記載されている実施形態は、単に例示的かつ説明的なものであり、限定的なものではないことが明らかとなる筈である。その修正の多数の実施形態は、本開示およびその均等の範囲内に収まるものとして企図される。
次の実施例は、本方法の開発において行われる実験を含む、本方法の様々な非限定的な実施形態および技法をさらに説明するために提供される。しかし、これらの実施例が、説明的であることを意味し、特許請求の範囲を限定しないことを理解されたい。当業者には明らかであろうが、多くの多様性および修正が、本発明の精神および範囲内に包含されることが意図される。
（実施例１）
ヒト化マウスにおけるヒトＰＢＭＣの生着
本試験において、２種の系列のヒト化免疫不全マウスを使用した：６週齢の雌（ｉ）ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ、ＪＡＸ系統番号００５５５７）マウスおよび（ｉｉ）ＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ系統番号：０２８６５４）。マウスに、ヒトＰＢＭＣ生着の少なくとも４時間前に、１００ｃＧｙのＸ線を照射した。同じドナー由来の精製／単離されたヒトＰＢＭＣ（Ａｓｔａｒｔｅ ＢｉｏｌｏｇｉｃｓまたはＡｌｌｃｅｌｌｓ）を、１～５×１０７個の細胞／マウスでＮＳＧまたはＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスに静脈内（ｉｖ）注射した。ｈＰＢＭＣ注射後に、体重、毛皮の全体的な外観および運動性についてマウスを毎日観察した。
図１Ａは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として提示された、２×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウスでのｈＰＢＭＣ生着後の１０匹のＮＳＧまたはＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスにおける毎日の体重変化を示す。図１Ｂは、ｈＰＢＭＣ生着後の（２×１０７個のｈＰＢＭＣ／マウス）、５匹の個々のＮＳＧマウスの体重測定値を描写する。各線は、１匹のマウスを表す。マウスの大部分が、８日目から始まる、有意な体重減少を示したことが観察された。さらに、生着後の体重の減少に加えて、マウスは、下にさらに記述する通り、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を示し始めた。
（実施例２）
生着後の異なる時点におけるヒトの生着細胞型および細胞数における動力学
本実験において、３種の異なる系列のマウスのｈＰＢＭＣ生着後に、異なるヒトドナー由来の生着させたヒト単核細胞の細胞型および細胞数を試験した。生着後５日目または／および１０日目にマウスを出血させ、ヒト細胞（型およびパーセンテージ）をフローサイトメトリーによって解析した。具体的には、マウスＰＢＭＣ（ｈＰＢＭＣとの混合物における）を、ヒト抗体：抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ５６で染色した。
ヒト細胞再構成を試験するために（すなわち、ヒト細胞は、生着後の異なる時点で異なる総生細胞のパーセンテージを示した）、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ系統番号０２８６５５）およびＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスを使用した。図２Ａは、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６およびＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウス再構成が、ドナー３３１由来のｈＰＢＭＣの生着後５日目に、匹敵するヒト細胞を示したことを示す。結果は、これら３種のマウス系列の間に有意差がなかったことを示す。マウスの全３種の系列は、生着５日目に約２０％ヒトＣＤ４５細胞再構成を有する。ヒトＣＤ４５細胞のうち、その大部分が、ＣＤ３ Ｔ細胞およびＮＫ細胞であった（図２Ａ）。
別の試験において、ＮＳＧにおける、異なるドナー（図２Ｂ、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウス）またはドナー３５８（図２Ｃ、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウス）由来のｈＰＢＭＣの生着後の２つの異なる時点において、異なる細胞集団を検討した。これらの実験において、各時点につき１群あたり２～５匹のマウスを使用し、データは平均±ＳＥＭとして提示する。図２Ｂおよび図２Ｃに示す通り、５日目にほぼ１０～１５％ヒトＣＤ４５＋が存在し、１０日目に３５～５０％ＣＤ４５＋が存在した。これらのデータは、生着させたヒトＣＤ４５細胞が、ヒト化マウスにおいて経時的に増加したことを示す。興味深いことに、５日目に、２０～３０％ＣＤ５６（ＮＫ）細胞が、ヒト化マウスにおけるＣＤ４５＋細胞の集団に存在したことが観察された。しかし、１０日目に、ＣＤ５６（ＮＫ）細胞は、１～５％へと大幅に減少した。これらのデータは、パーセントＣＤ４５の増加が、特定の単核細胞型（例えば、ＣＤ５６ ＮＫ細胞）の消失と相関することを示唆する。要するに、ｈＰＭＢＣの生着後のヒト化免疫欠損マウスにおいて、生着させた単核細胞の細胞型および細胞数に動力学的変化がある。Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、５日目の優勢な細胞型であるが、１０日目に、Ｔ細胞型のみが優勢である細胞型であり、ＮＫ細胞は時間と共に死に絶える。本方法が機能するためには、薬物試験時に（例えば、１０日目に）ＮＫ細胞の全てが死に絶える訳ではないように、バランスが存在する必要がある。
ヒトＴ細胞は、ヒト細胞再構成後に時間と共に優勢な細胞集団となるため、ｈＰＢＭＣヒト化マウスモデルは、Ｔ細胞モデルと考慮される。本実施例の結果は、これを確認した。図２Ｂおよび図２Ｃは、生着後５日目の１０～１５％から、１０日目の３５～５０％へと増加したヒトＣＤ４５細胞のうち、ＣＤ３ Ｔ細胞パーセンテージが、５日目の６５～８０％から、１０日目の９０～９５％へと増加したことを示した。
免疫的毒性応答に関与する多くの細胞型が存在する。Ｔ細胞、ＮＫ細胞および単球細胞は全て、非常に重要な役割を果たす。ｈＰＢＭＣヒト化マウスモデルにおいて、生着後初期時点のマウスにおいて、依然として異なるヒト細胞型が存在することが判明した。ヒトＴ細胞およびＮＫ細胞は、生着５日目にｈＰＢＭＣヒト化マウスにおける細胞集団において優勢である、図２Ｂおよび図２Ｃ。この知見は、本発明者らに、ｈＰＢＭＣヒト化マウスにおける免疫的毒性応答を試験する契機を与える。免疫的毒性およびＣＲＳの試験を行うために、生着後初期時点、例えば、６日目を選択した。
０日目にマウスに照射し、同日中にｈＰＢＭＣを生着させた。マウスの体重は、照射のため、１日目から３日目に下降した。４日目の後に、マウスは、体重を増し始めた。一見したところ、図１Ａに示す通り、ＮＳＧマウスは、ＮＳＧ－ＣＳＦ－１と比較してより多くの体重を有する。ＮＳＧマウスはまた、より健康でより活動的に見えた。したがって、ＮＳＧマウスを後の試験に使用した。
（実施例３）
生着時間の重大性
本試験において、ｈＰＢＭＣ生着後にヒト化マウスの一部において失われる体重の基盤を検討した。多数のマウスにおいて有意な体重減少が観察され、これらのマウスにおける移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を示す。例えば、ＧＶＨＤのデータは、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄに描写されている。
図３Ａおよび図３Ｂは、それぞれドナー４６９２およびドナー３６２に対する、ＮＳＧマウスにおける５×１０７個のＰＢＭＣ／マウスの生着後の時間の関数としての５匹のヒト化ＮＳＧマウスの体重測定値を描写する。このレベルの生着細胞は、いずれかのドナー由来のＰＢＭＣの生着後７日目の後に、有意な体重減少（ほぼ１０％）を引き起こした。ほぼ２０％体重減少は、マウスにおけるＧＶＨＤの重度の状態を表し、マウスの安楽死を要求する。
図３Ｃは、ドナー３０９生着（２×１０７個のＰＢＭＣ／マウス）後の時間の関数としての、５匹のヒト化ＮＳＧマウスの体重測定値を描写する。ＰＢＭＣの生着後８日目の後に、有意な体重減少（ほぼ１０％）が観察される。
図３Ｄは、ドナー３５８生着（３×１０７個のＰＢＭＣ／マウス）後の時間の関数としての、４匹のヒト化ＮＳＧマウスの体重測定値を示す。ドナー３５８由来のＰＭＢＣを受けているマウスは、生着後９日目に有意な体重減少（ほぼ１０％）を開始した。
ＧＶＨＤが、観察された体重減少を説明したと考えられる。マウスにおける生着ヒトＴ細胞は、成長し始めるにつれて、マウス細胞を攻撃する。上の実施例２に記述されている通り、生着後に時間と共にＣＤ４５細胞の％の増加が見られており、Ｔ細胞数が多い場合、ＧＶＨＤを有するマウスは、８日後に病的になり、もはや試験に適さなくなった。
ＧＶＨＤマウスは、体重減少を示しただけでなく、背中を丸めた姿勢、脱毛、運動性低下および頻呼吸の徴候も示した。２０％の体重減少の後に、マウスは、安楽死させる必要があり、実験を終止した。８日間の生着後のＧＶＨＤの高頻度発生は、毒性試験のための免疫調節薬の投与に先立つヒトＰＢＭＣ生着のタイミングの重大性の別の側面を明らかにする。
信頼できかつ再現性のある結果を生じさせるのに十分な循環細胞数および型がマウスに存在しない可能性があるため、免疫調節薬は、生着後の早過ぎる時点で（例えば、２～３日目に）投与することができない。
しかし、マウスが、ＧＶＨＤを有する場合、このことは、試験結果に影響を与えるであろう。したがって、その後の実験において、さらなるドナーにおける薬物投与の効果の試験のために、細胞生着後６日目を選択した。
薬物投与後の異なる時点で、異なるサイトカインが放出し得る。最も早く放出されるサイトカインは、薬物投与後１時間にまたはそれ以前に常にピークになるＴＮＦとなる筈である。さらに、臓器不全がなければ、大部分のサイトカインは、２４時間後に正常レベルに戻るであろう。したがって、マウスの出血およびサイトカイン濃度に関する血清試験の時点として、薬物投与の２および６時間後を選択した。
（実施例４）
ヒトＴ細胞およびＮＫ細胞は、生着５日目のｈＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスにおける優勢な細胞集団を表す
本試験において、十（１０）名のドナーの単核細胞再構成をヒト化マウスにおいて検討および比較した。各マウスに、ドナー由来の２×１０７個のｈＰＢＭＣを生着させた。１０名のドナーのうち７名の匿名化された患者情報を図４Ｂに表記する。
ドナー毎に５匹のヒト化ＮＳＧマウスを、示されている免疫細胞サブセット再構成に関して、フローサイトメトリーによって試験した。ｈＰＢＭＣ注射ＮＳＧマウスにおいて、再構成５日目に、全血をフローサイトメトリーによって解析した。ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１４およびＣＤ５６を測定した。総細胞のパーセンテージとしてのヒトＣＤ４５＋細胞、ならびにＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１４およびＣＤ５６（ＣＤ４５＋細胞においてゲーティング）を、１０名のドナーに関して、図４Ａに示す。ドナーＡ４６９２、Ａ４６２５およびＡ４６６８のみが、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ１４を示した。ヒト化マウスは、末梢血において平均１０～２５％のヒトＣＤ４５＋細胞を示した（図４Ａ）。ヒトＣＤ４５細胞のうち、３０～８０％Ｔ細胞および１０～４０％ＣＤ５６（ＮＫ）細胞が存在し、異なるドナーの間で多様性が示された。
その後の実験において、毒性試験のためにマウスに免疫調節薬を投与するための最適時間として、生着後５～７日目の範囲内の日を選択した。
（実施例５）
ヒト化マウスにおける免疫調節薬によって誘導されたサイトカイン放出
前臨床試験および臨床治験のために、薬物免疫的毒性、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のスクリーニングおよび決定のためのヒト化マウスモデルを確立するために、全患者に対して陽性対照が必要とされる。ムロモナブ－ＣＤ３とも称されるＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ ＯＫＴ３は、移植片レシピエントを免疫抑制するための免疫抑制薬として使用されたマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（抗ＣＤ３ ｍＡｂ）である。ＯＫＴ３は、ＣＤ３受容体に結合し、これは、サイトカインを放出するようにＴ細胞を活性化し、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を引き起こすことができる。ＯＫＴ３は、全患者に対する陽性対照として使用された。方法の特異性および感度を試験するために、その免疫的毒性を試験するための方法が殆どない標的薬物が選択されることが必要とされる。本方法の特異性および感度の評価のための標的薬物として、抗ＣＤ２８ ｍＡｂを選択した。
九（１０）名の異なるドナーのＰＢＭＣを使用して、これらの実験のためのヒト化ＮＳＧマウスを産生した。ｈＰＢＭＣ生着（２×１０７個のＰＢＭＣ／マウス）６日目に、抗体ＯＫＴ３（抗ＣＤ３ ｍＡｂ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３１７３０２）またはＡＮＣ２８．１／５Ｄ１０（「ＡＮＣ２８」、「抗ＣＤ２８ ｍＡｂ」または「抗ＣＤ２８」とも称される；Ａｎｃｅｌｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７７－８２４）のｉ．ｖ．注射によってヒトサイトカイン放出のためにマウスを誘導した。ＰＢＳバッファーは、陰性対照とした。マウスを２および６時間目に出血させ、血清を採取し、ＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ（ＢＤ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５５１８０９）を使用して、サイトカイン濃度に関して解析した（図５Ａ～図５Ｆを参照）。
図５Ａ～図５Ｆは、九（９）名の異なるドナーのためのヒト化マウスのセットへの抗体ＯＫＴ３（抗ＣＤ３ ｍＡｂ）およびＡＮＣ２８（抗ＣＤ２８）の注射後２および６時間目に測定された、異なるサイトカイン（すなわち、それぞれＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－４およびＴＮＦ）の濃度の複数のグラフを描写する。０．５ｍｇ／ｋｇ ＯＫＴ３または１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ２８および５ｍｌ／ｋｇ ＰＢＳ（陰性対照）をマウスにｉ．ｖ．注射した。マウスを２および６時間目に出血させ、循環サイトカイン濃度をＢＤ ＣＢＡ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ＩＩキットによって測定した。群毎のマウスの数は２～５匹であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
（実施例６）
薬物投与後の増強された循環サイトカイン濃度
サイトカインストームが誘導されたか確かめるために、抗体注射後２および６時間後にマウスの血清におけるサイトカイン（ヒトＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦ）をアッセイした（図５Ａ～図５Ｆを参照）。全１０名のドナーにおいて、２および６時間目の両方で、ＯＫＴ３の注射後にヒトＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＴＮＦの有意な誘導が見出された。
しかし、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ投与マウスにより、一部のドナーのみが、サイトカインの有意な放出を誘導した。全てのドナーが、抗ＣＤ２８注射後にサイトカイン放出応答を有した訳ではない。
図５Ａに示す通り、１０名のドナーは、抗ＣＤ２８注射後６時間目に、ＩＦＮ－γサイトカインに関して異なる放出プロファイルを示した：
重度／高度応答：ドナーＡ４６９２、Ａ４６６８および３６２（ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌ）、
中程度／軽度応答：ドナーＡ４６２５、３６６、３４５、３０９および２１３（ＩＦＮ－γ≧３００ｐｇ／ｍｌ～＜１，８００ｐｇ／ｍｌ）ならびに
低／無応答：ドナー３６４および３５３（ＩＦＮ－γ＜３００ｐｇ／ｍｌ）。
図５Ｂは、２×１０７個（ＰＢＭＣ／マウス）を生着させたＮＳＧマウスにおいて２または６時間目に観察された、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ ＩＬ－１０サイトカイン応答を示す。応答が重度／高度応答であるか決定することがより容易になるように、重度／高度応答および低応答の間のカットオフである１２０ｐｇ／ｍｌのＩＬ－１０レベルに、線が描写されている。６時間目の応答は次の通りであった：
重度／高度応答：ドナーＡ４６９２、Ａ４６６８および３６２（ＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌ）、
中程度／軽度応答：ドナーＡ４６２５、３６６、３４５、２１３および３０９（ＩＬ－１０≧２５ｐｇ／ｍｌ～＜１２０ｐｇ／ｍｌ）ならびに
低／無応答：ドナー３６４および３５３（＜２５ｐｇ／ｍｌ）。
本出願人らは、そのＩＦＮ－γレベルが≧１，８００ｐｇ／ｍｌである（ＯＫＴ３または抗ＣＤ２８ ｍＡｂのいずれかによる）ドナーが、ＩＬ－１０レベルの増加も示した（すなわち、≧１２０ｐｇ／ｍｌ）ことを観察した。ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０レベルの両方が、それぞれ≧１，８００ｐｇ／ｍｌおよび≧１２０ｐｇ／ｍｌを上回って増加される場合、ドナーは、この薬物を注射された場合にＣＲＳを発症する可能性が非常に高い。
図５Ｃ～図５Ｆは、２または６時間目における、それぞれＩＬ－６、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＴＮＦのサイトカイン放出を描写する。
図５Ｃは、２×１０７個（ＰＢＭＣ／マウス）を生着させたＮＳＧマウスにおいて２または６時間目に観察された、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ ＩＬ－６サイトカイン応答を示す。６時間目の応答は次の通りであった：
重度／高度応答：ドナーＡ４６９２、Ａ４６６８および３６２（ＩＬ－６≧２５ｐｇ／ｍｌ）、
中程度／軽度応答：ドナーＡ４６２５、３６６、３４５、２１３および３０９（ＩＬ－６≧１０ｐｇ／ｍｌ～＜２５ｐｇ／ｍｌ）ならびに
低／無応答：ドナー３６４および３５３（ＩＬ－６＜１０ｐｇ／ｍｌ）。
図５Ｄは、２×１０７個（ＰＢＭＣ／マウス）を生着させたＮＳＧマウスにおいて２または６時間目に観察された、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ ＩＬ－２サイトカイン応答を示す。６時間目の応答は次の通りであった：
重度／高度応答：ドナーＡ４６９２、Ａ４６６８および３６２（ＩＬ－２≧８０ｐｇ／ｍｌ）、
中程度／軽度応答：ドナーＡ４６２５、３６６、３４５、２１３および３０９（１５ｐｇ／ｍｌ≦ＩＬ－２＜８０ｐｇ／ｍｌ）ならびに
低／無応答：ドナー３６４および３５３（ＩＬ－２＜１５ｐｇ／ｍｌ）。
図５Ｅは、２×１０７個（ＰＢＭＣ／マウス）を生着させたＮＳＧマウスにおいて２または６時間目に観察された、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ ＩＬ－４サイトカイン応答を示す。６時間目の応答は次の通りであった：
重度／高度応答：ドナーＡ４６９２、Ａ４６６８および３６２（ＩＬ－４≧２５ｐｇ／ｍｌ）、
中程度／軽度応答：ドナーＡ４６２５、３６６、３４５、２１３および３０９（１０ｐｇ／ｍｌ≦ＩＬ－４＜２５ｐｇ／ｍｌ）ならびに
低／無応答：ドナー３６４および３５３（ＩＬ－４＜１０ｐｇ／ｍｌ）。
図５Ｆは、２×１０７個（ＰＢＭＣ／マウス）を生着させたＮＳＧマウスにおいて２または６時間目に観察された、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ ＴＮＦサイトカイン応答を示す。６時間目の応答は次の通りであった：
重度／高度応答：ドナーＡ４６９２、Ａ４６６８および３６２（ＴＮＦ≧２０ｐｇ／ｍｌ）、
中程度／軽度応答：ドナーＡ４６２５、３６６、３４５、２１３および３０９（５ｐｇ／ｍｌ≦ＴＮＦ＜２０ｐｇ／ｍｌ）ならびに
低／無応答：ドナー３６４および３５３（ＴＮＦ＜５ｐｇ／ｍｌ）。
図６は、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を誘導するそれらの能力の観点から、ＯＫＴ３または抗ＣＤ２８の投与後の１０名のドナーの応答を要約する。抗ＣＤ２８ ｍＡｂ投与後に、ドナーＡ４６９２、Ａ４６６８および３６２が重度／高度応答者であり；ドナーＡ４６２５、３６６、３４５、３０９および２１３が中程度／軽度応答者であり；ドナー３６４および３５３が低／無応答者であることに留意されたい。これらのデータは、ＰＢＭＣ生着モデルによるＮＳＧ／ＮＳＧ－ＣＳＦ－１／ＮＳＧ－ＩＬ－６マウスが、ヒトが、ヒトへの免疫調節薬の投与後に重度サイトカイン放出症候群応答を誘発する可能性があるか区別するのに（またはその予測因子として）有用であることを明らかに示す。
図５Ａ～図５Ｆおよび図６に示す通り、全１０名のドナー／患者のＰＢＭＣを生着させたマウスは、ＯＫＴ３注射後に大幅なサイトカイン放出を示した。しかし、抗ＣＤ２８ ｍＡｂの投与により、ドナーのＰＢＭＣを生着させたマウスの一部のみが、これらのサイトカインの有意な誘導を示した。全てのドナーが、抗ＣＤ２８注射に応答して高レベルのサイトカイン放出を有した訳ではない。これらの結果は、人間における多様性と同様である。ＯＫＴ３等、ＣＲＳの強い誘導因子に対し、全てのドナーが、応答を有したが、抗ＣＤ２８等、弱い誘導因子に対して、本方法において観察されるように、ドナーの間に莫大な多様性があることを検出することができる方法は他にない。例としてＩＦＮ－γ応答を使用することができる：３名のドナー／患者のＰＢＭＣを生着させたマウスは、抗ＣＤ２８に対して高度応答を示し、５名のドナー／患者のＰＢＭＣを生着させたマウスは、抗ＣＤ２８に対して中程度応答を示し、２名のドナー／患者のＰＢＭＣを生着させたマウスは、抗ＣＤ２８に対して低／無応答を示す。マウスはまた、サイトカイン放出が存在した場合、体温下降および増加した臨床スコアを示す。本方法を使用して、新たな薬物免疫的毒性を検出することができ、また、個々の患者に対する薬物毒性をスクリーニングすることができる。
（実施例７）
免疫調節薬処置後のＮＳＧマウスにおける体温変化
実施例５および６のマウスの直腸温は、処置前に、また、各時点の出血の直前に測定した。温度データを図７に示す。ヒト化ＮＳＧマウスは、薬物処置後に一部の動物において僅かに下降した体温を示した。体温が、高いＩＦＮ－γ放出を有したマウスにおいてより頻繁に下降したことが認められた（図７）。ＯＫＴ３および抗ＣＤ２８群におけるマウスに関して、体温は、６時間の時点で３７～３８℃から３６℃未満へと下降した。図７は、薬物の注射後の低体温誘導を示す。対照ＰＢＳ、ＯＫＴ３および抗ＣＤ２８を注射された、１０名のドナーのｈＰＭＢＣヒト化マウスにおいて、直腸温を測定した。群毎のマウスの数は２～５匹であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
（実施例８）
薬物の注射後のマウスの臨床スコアの評価
次の通りに徴候およびスコアのグレード付けを行うことにより、マウスにおける臨床スコアをモニターした：スコア：０＝正常な活動性；１＝正常な活動性、立毛、つま先歩行；２＝背中を丸め、活動性が低下しているが、依然として移動可能；３＝運動性低下だが、促されると移動可能；４＝瀕死（危篤状態）。臨床スコア４を有するマウスは安楽死させた。群毎のマウスの数は２～５匹であり、データは平均±ＳＥＭとして提示する。
ＯＫＴ３または抗ＣＤ２８ ｍＡｂ処置群におけるサイトカイン放出を有するマウスの大部分は、６時間の時点で１にスコア付けされた。サイトカイン放出がないまたは低いサイトカイン放出を有するマウスは、臨床スコアがなかった。薬物の注射後のマウスの臨床スコアは、図８に描写されている。マウスの大部分は、臨床スコア１を有した。
（実施例９）
ＰＢＭＣ（５×１０７個／マウス）の生着は、薬物候補毒性スクリーニングのためのヒト化マウスモデルを提供する
本出願人らは、発見において潜在的な薬物をスクリーニングするための毒性試験に有用なヒト化マウスモデルを開発した。薬物候補開発の初期相において、潜在的な薬物候補が毒性活性を保持し得るかスクリーニングすることが要求される。このマウスモデルにおいて、潜在的な薬物候補に関連するいかなる毒性（例えば、サイトカイン放出症候群）もスクリーニングすることができるように、サイトカイン応答感度は、故意に増強された。
これを行うため、多数のＰＢＭＣ（すなわち、５×１０７個／マウス）をヒト化ＮＳＧマウスに生着させた。６日目に、マウスは薬物を受け、サイトカイン放出プロファイルを決定した。そこで、上述の実験と同様に、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウスを使用して、ＩＦＮ－γおよびＩｌ－１０レベルを評価した。
図９Ａおよび図９Ｂは、薬物注射後のＩＦＮ－γまたはＩＬ－１０レベルに対する２×１０７ｖｓ．５×１０７個のＰＢＭＣ／マウスを比較するドナー２１３を描写する。ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０レベルが、同じ量のｍＡｂ（すなわち、ＯＫＴ３ ｍＡｂ＝０．５ｍｇ／ｋｇおよび抗ＣＤ２８ ｍＡｂ＝１ｍｇ／ｋｇ）を使用して、６日目に、ＯＫＴ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂの投与後に、より高いＰＢＭＣ生着により増加したことが観察された。５×１０７個のＰＭＢＣ／マウスによるこの増強されたサイトカイン放出は、前臨床薬物開発におけるスクリーニングアッセイに適していると考えられる。図９Ｃ～図９Ｆは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウスおよび５×１０７個のＰＢＭＣ／マウスによるドナー２１３におけるサイトカイン応答（それぞれＩＬ－６、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＴＮＦ）の比較を描写する。これらのデータは、薬物毒性スクリーニングのため、多数のＰＢＭＣが、信頼できかつ高感度の試験方法を提供することを示す。
（実施例１０）
変動するＰＢＭＣ生着濃度によるサイトカイン放出の比較
本実験において、本出願人らは、３種の濃度のうち１種のＰＢＭＣを生着させたヒト化マウスを使用して、サイトカイン放出を比較して、細胞濃度の効果を決定した。特に、本出願人らは、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウス、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウスまたは４×１０７個のＰＢＭＣ／マウスを生着させたヒト化ＮＳＧマウスにおいて生成されたサイトカインレベルを、免疫療法薬（すなわち、ｍＡｂ ＯＫＴ３、抗ＣＤ２８またはＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ））によるかかるマウスにおける処置後に比較した。
生着後６日目に、マウスは免疫療法薬（ｍＡｂ）を受け、これら３群のマウスにおけるサイトカイン放出プロファイルを決定した。マウスを２および６時間目に出血させ、循環サイトカイン濃度をＢＤ ＣＢＡ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ＩＩキットによって測定した。図１０Ａ～図１０Ｆは、２×１０７、３×１０７または４×１０７個のＰＢＭＣ／マウスを生着させたドナー３０９ヒト化ＮＳＧマウスにおける薬物注射後のサイトカインレベルを描写する。図１０Ａは、マウスの各群のＩＮＦγレベルを描写する。図１０Ｂは、マウスの各群のＩＬ－１０レベルを描写する。図１０Ｃは、マウスの各群のＩＬ－６レベルを描写する。図１０Ｄは、マウスの各群のＩＬ－２レベルを描写する。図１０Ｅは、マウスの各群のＩＬ－４レベルを描写する。図１０Ｆは、マウスの各群のＴＮＦレベルを描写する。
本出願人らは、これらの実験条件下で、サイトカインレベルが、より低い生着レベル、マウス１匹あたり２×１０７または３×１０７個のＰＢＭＣで、２つのマウス群において、同じ量のｍＡｂ（すなわち、ＯＫＴ３ ｍＡｂ＝０．５ｍｇ／ｋｇ、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ＝１ｍｇ／ｋｇおよびＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）＝１０ｍｇ／ｋｇ）を使用して、６日目に、ＯＫＴ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂおよびＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）の投与後に同様の増加を示したことを観察した。しかし、マウス１匹あたり４×１０７個のＰＢＭＣの生着により、これらの実験条件下で、薬物注射のそれぞれに対するサイトカイン応答は、最適な感度で個々の応答を区別するには高過ぎることが判明した。対照的に、マウス１匹あたり２×１０７および３×１０７個の細胞のＰＢＭＣの生着は、これらの条件下で、個々のヒトにおける薬物に応答したサイトカインストームの発生をスクリーニングするための高感度試験を提供する。
（実施例１１）
異なる濃度のＰＢＭＣ生着における体温および臨床スコア
本試験において、本出願人らは、異なるＰＢＭＣ濃度での生着後のヒト化マウスにおける異なる細胞型、体温および臨床スコアを測定した。本試験において使用したＰＢＭＣは、ドナー３０９から得た。図１１Ａは、ＰＢＭＣ生着後５日目の細胞集団を描写する。総ヒトＣＤ４５＋細胞パーセンテージは、マウスにおける増加するレベルのＰＢＭＣ生着に伴い増加したが、ＣＤ４５集団内の異なる細胞型のパーセンテージは同様であった。図１１Ｂは、ＯＫＴ３ ｍＡｂ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＤ２８（１ｍｇ／ｋｇ）およびＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ；１０ｍｇ／ｋｇ）による投与後のヒト化マウスにおける臨床スコアを描写する。図１１Ｃ、図１１Ｄおよび図１１Ｅは、マウス体温変化を描写する。図１１Ｃおよび図１１Ｄに示す通り、２×１０７個のＰＢＭＣ／マウス群と比較して、３×１０７個のＰＢＭＣ／マウス群において僅かな体温下降が見られた。
（実施例１２）
サイトカインレベルは、薬物投薬量増加に伴い増加する
薬物耐性は、個人間で異なることが多い。ヒト化免疫不全マウスモデルを使用して、個々の患者におけるサイトカイン放出の薬物濃度依存を試験することができる。
本試験において、本発明者らは、異なる濃度のＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）を検討して、ヒト化マウスにおけるＣＲＳに投薬量依存が存在するか決定した。６週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ、ＪＡＸ系統番号００５５５７）マウスに、ヒトＰＢＭＣ生着の少なくとも４時間前に、１００ｃＧｙのＸ線を照射した。ＰＢＭＣは、これらの実験において、ドナー３５８に由来した。精製／単離されたヒトＰＢＭＣを、３×１０７個の細胞／マウスでマウスに静脈内注射した。ＰＢＭＣ生着から６日後に、マウスに、ＰＢＳ（陰性対照）、０．５ｍｇ／ｋｇ ＯＫＴ３（陽性対照）、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）をｉｖ注射した。１群あたり５匹のマウスが存在した。これらのＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）投薬量は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）の米国処方情報（Ｕ．Ｓ．ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に記述されている臨床治験において試験された投薬量の範囲内にある。ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）投与後の重度サイトカイン放出症候群の有害効果報告は殆ど記述されていない。マウスを２および６時間目に出血させ、ＢＤ ＣＢＡ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ＩＩキットを使用して、循環サイトカイン濃度を測定した。図１２Ａ～図１２Ｆに示す通り、陽性対照ＯＫＴ３の注射後に測定されたレベルは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＴＮＦのそれぞれに対して非常に高かった。図１２Ａ～図１２Ｆに示す通り、サイトカインレベルは、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）の増加する投薬量と共に増加した。２．５ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）において、サイトカインレベルは、陰性対照群（すなわち、ＰＢＳ対照群）と同様であり、サイトカイン放出は殆どなかった。対照的に、サイトカインレベルは、増加するＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）投薬量に伴い増加し、１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）が使用された場合に高度サイトカイン応答であった。
図１２Ａ～図１２Ｆから分かる通り、投薬６時間後のサイトカインレベルは、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）の量における用量依存性応答を示し、増加する用量に伴い増加した。２．５ｍｇ／ｋｇのＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）濃度において、各サイトカインのレベルは、ＰＢＳ対照群のために測定されたレベルの誤差範囲内であり、サイトカイン放出が殆どなかったことを示す。１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）において、各サイトカインのレベルは、ＣＲＳを予測するための中程度範囲内にあった。よって、ドナー３５８のため、２．５ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）の投与は、１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）の投与よりも低い、ＣＲＳを生じるリスクを有するであろう。
サイトカイン放出の用量依存は、ｉｎ ｖｉｖｏヒト化マウスモデルを使用して、個々の患者に対し、免疫的毒性の回避に関して、最良の薬物濃度をスクリーニングすることができることを示す。次に、かかる情報は、患者を苦しめる障害の処置に有効な投薬範囲に関する他の知識と併せて使用して、薬物の有効だが安全な用量を決定することができる。
（実施例１３）
異なる用量のＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）のための体温および臨床スコア
本試験において、本発明者らは、実施例１２に記載されているヒト化マウスにおける様々な細胞型、体温および臨床スコアを測定した。図１３Ａは、細胞生着後５日目の細胞集団を描写する。本発明者らは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞が、これらのマウスにおける優勢な細胞型を表すことを観察した。図１３Ｂは、異なる用量のＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）により、免疫療法薬（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ））の投与後の臨床スコアを描写する。投薬６時間後の臨床スコアは、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）により投薬された場合、陽性対照（ＯＫＴ投与）と同じであった。図１３Ｃは、異なる用量のＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）によるマウス体温変化を描写する。
（実施例１４）
比較 － ｉｎ ｖｉｖｏヒト化マウス方法対ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ全血またはＰＢＭＣアッセイは現在、薬物スクリーニングのためにサイトカイン放出を試験するための主要なアッセイである。本実施例において、同じＰＢＭＣドナーに対する２種の方法、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＢＭＣアッセイおよびｉｎ ｖｉｖｏヒト化マウス方法によって、薬物処置に応答したサイトカイン放出を決定した。
ｉｎ ｖｉｖｏ方法
０日目：６週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ、ＪＡＸ系統番号００５５５７）マウスに、ヒトＰＢＭＣ生着の少なくとも４時間前に、１００ｃＧｙのＸ線を照射した。精製／単離されたヒトＰＢＭＣを、３×１０７個の細胞／マウスでマウスに静脈内注射した。ＰＢＭＣは、ドナー２１３、３０９、３４５または３６６に由来した。５日目、ヒト細胞生着試験のためにマウスを出血させた。６日目、マウスに薬物を投与し；ＢＤ ＣＢＡ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ＩＩキットを使用して、薬物投与６時間後にマウス血清におけるサイトカインレベルを決定する。これらの実験において、１群あたり５匹のマウスを使用した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法
－１日目：薬物でプレートをコーティングした：ＰＢＳにおいて薬物（例えば、抗体）を希釈し；ドラフト内でプレートを開けたままにする。
０日目：各ドナー由来のＰＢＭＣを加工する。ＰＢＭＣは、ドナー２１３、３０９、３４５または３６６に由来した。補充ＲＰＭＩにおいてＰＢＭＣを解凍し、１回洗浄する。細胞を計数し、１×１０６個の細胞／ｍｌとなるよう補充ＲＰＭＩに再懸濁する。コーティングされたウェルを２００μｌのＰＢＳで２回、次いで２００μＬの補充ＲＰＭＩで１回洗浄する。各ウェルに１００μｌの細胞を蒔く（１ウェルあたり総計１×１０５個の細胞のため）。
２日目：各ウェルから上清を収集し、ＢＤ ＣＢＡ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ＩＩキットを使用してサイトカインレベルを測定する。
結果
薬物処置後のサイトカイン放出レベルを決定するための２種の方法を、抗ＣＤ２８抗体（Ａｎｃｅｌｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７７－８２４）による４名の異なるドナー由来のＰＢＭＣの処置に関して比較した。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのため、９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ウェルで抗ＣＤ２８を投薬した。ｉｎ ｖｉｖｏ方法のため、１ｍｇ／ｋｇで抗ＣＤ２８を投薬した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＢＭＣ培養ウェルの上清およびマウス由来の血清を採取し、サイトカインレベルを測定した。抗体ＯＫＴ３（ｉｎ ｖｉｖｏアッセイのために０．５ｍｇ／ｋｇまたはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのために１ｍｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用し、それぞれｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ＰＢＳまたはアイソタイプ抗体のいずれかを陰性対照として使用した。決定されたサイトカインレベルは、平均値±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として図１４Ａ（ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０）および図１４Ｂ（ＩＬ－６およびＩＬ－４）に提示する。図１４Ａおよび図１４Ｂは、４名のＰＢＭＣドナーのそれぞれのため、いずれか所定のサイトカインに対して、２種のアッセイによって異なるレベルが決定されたことを示す。
図１５は、ドナー２１３の図１４Ａおよび図１４Ｂのサイトカインレベルデータを再プロットして、２種の試験において決定されたサイトカインレベルの差のより容易な比較を可能にする。４種のサイトカイン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－６およびＩＬ－４のそれぞれに関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、抗ＣＤ－２８による投薬後にドナー２１３細胞において相対的に少ないサイトカイン放出が生じたことを示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、抗ＣＤ２８による投薬後に測定されたサイトカインレベルは、抗ＣＤ２８に対する対照アイソタイプ抗体（「媒体２」）による投薬後に決定されたレベルと殆ど異ならなかった一方、対照ＯＫＴ３抗体による投薬後のサイトカインレベルは、ＯＫＴ３に対する対照アイソタイプ抗体（「媒体１」）による投薬後に決定されたレベルよりもはるかに高かった。対照的に、ｉｎ ｖｉｖｏ試験方法によって、４種のサイトカイン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－６およびＩＬ－４のそれぞれに関して、抗ＣＤ－２８またはＯＫＴ３のいずれかによる投薬後にドナー２１３細胞において産生されたサイトカインレベルは、陰性対照において測定されたレベルよりもはるかに高かった。
これらの結果は、一部のヒトに関して、ｉｎ ｖｉｖｏ試験は、当該個体が、免疫活性薬による投薬後にサイトカインストームと反応し得ることを示すが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、免疫活性薬による投薬後にサイトカインストームと反応するであろうことを示すことができない可能性があることを示す。ｉｎ ｖｉｖｏヒト化マウス方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイよりも高感度であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験が見逃し得る、ヒトにおけるサイトカインストームの潜在力を予測することができる。
（実施例１５）
薬物組合せによる処置後のサイトカイン放出
ＰＢＭＣヒト化マウスモデルは、単一の薬物が、個体においてサイトカインストームを誘導することができるか有効に試験することができる。しかし、薬物スクリーニングおよび臨床治療法のため、薬物組合せを使用する必要がある場合もある。本実施例は、ＰＢＭＣヒト化マウスモデルを使用して、サイトカイン放出に関して薬物組合せを試験することができることを示す。モデルにより得た結果は、ドナー特異的であることが示される。
６週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ、ＪＡＸ系統番号００５５５７）マウスに、ヒトＰＢＭＣの生着の少なくとも４時間前に、１００ｃＧｙのＸ線を照射した。それぞれのドナー由来の単離されたヒトＰＢＭＣを、３×１０７個の細胞／マウスでマウスに静脈内注射した。ＰＢＭＣは、ドナー２１３またはドナー３６４に由来した。ＰＢＭＣ生着後６日目に、本出願人らは、マウスに薬物の組合せを投与し、ＢＤ ＣＢＡ Ｔｈ１／Ｔｈ２ ＩＩキットを使用して、薬物投与６時間後にマウス血清におけるサイトカインレベルを決定した。全実験群において５匹のマウスを使用した。
試験した薬物組合せは、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）およびＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドミド）；ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）および抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）（ＴＨＹＭＯＧＬＯＢＵＬＩＮ（登録商標）（ウサギ））；ならびに抗ＣＤ２８およびＡＴＧであった。
ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））は、がん免疫療法において使用されるヒト化抗体である。レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））は、がん処置において使用される経口免疫調節性小分子薬である、サリドマイドの誘導体である。ＴＨＹＭＯＧＬＯＢＵＬＩＮ（登録商標）（ウサギ）として販売される抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）は、腎臓移植片等、移植片を受ける患者における身体の自然の免疫の低下に使用される免疫抑制薬である。
ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）およびＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドミド）実験において、ヒト化ＮＳＧマウスは、経口投与される１００ｍｇ／ｋｇレナリドミドにつき、５ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）を静脈内（ｉｖ）注射された、または両方の薬物を受けた。ｉｖの５ｍｌ／ｋｇ ＰＢＳによる処置を対照として使用した。
ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）およびＡＴＧ実験において、ヒト化ＮＳＧマウスは、５ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、１ｍｇ／ｋｇ ＡＴＧを静脈内注射された、または両方の薬物を受けた。ｉｖの５ｍｌ／ｋｇ ＰＢＳによる処置を対照として使用した。
抗ＣＤ２８およびＡＴＧ実験において、ヒト化ＮＳＧマウスは、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ２８、１ｍｇ／ｋｇ ＡＴＧを静脈内注射された、または両方の薬物を受けた。ｉｖの５ｍｌ／ｋｇ ＰＢＳによる処置を陰性対照として使用した。
ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）およびＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドミド）実験において決定されたサイトカインレベルを、両方のドナーに関して図１６に示す。レベルが測定されたサイトカインは、ＩＦＮ－γ（パネルａ）；ＩＬ－１０（パネルｂ）；ＩＬ－６（パネルｃ）；ＩＬ－２（パネルｄ）；ＩＬ－４（パネルｅ）；およびＴＮＦ（パネルｆ）であった。
多発性骨髄腫を処置するためにデキサメタゾンおよび免疫調節剤ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドミド）と組み合わせたＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）を評価する、２種の停止された臨床治験からのデータに基づき、ＦＤＡは、ＫＥＹＴＲＵＤＡおよびレナリドミドの組合せによる処置が、重度毒性および死亡のリスク増加をもたらしたとの声明を２０１７年に発表した。
図１６に示す通り、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－２およびＴＮＦはそれぞれ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）およびＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドミド）が組み合わせて使用された場合、各薬物単独による処置によって産生されたレベルを上回って、サイトカイン放出の有意な増加を示したが、この結果はドナー２１３に関してであって、ドナー３６４に関してはそうではなかった。
抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）は、臓器移植における急性拒絶の予防および処置ならびに再生不良性貧血の治療法において使用される。ＡＴＧは、臨床毒性を刺激することが以前に実証された。図１７は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）単独、ＡＴＧ単独、ならびにＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）およびＡＴＧの組合せによる処置後のサイトカイン結果を示す。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦのレベルは、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）およびＡＴＧの組合せによる処置後に、いずれかの薬物単独による処置後よりも高かったが、この結果は、ドナー２１３に関してであって、ドナー３６４に関してはそうではなかった。
図１８は、抗ＣＤ２８単独、ＡＴＧ単独、ならびに抗ＣＤ２８およびＡＴＧの組合せによる処置後のサイトカイン結果を示す。ドナー２１３に関して、ＩＦＮ（IIFN）－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－２およびＴＮＦのレベルは、いずれかの薬物単独による処置後と比較して、薬物の組合せによる処置後により高かったが、ドナー３６４に関しては、いずれかの薬物単独による処置後と比較して薬物の組合せによる処置後に、ＩＬ－２およびＴＮＦのみが増加した。
これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏヒト化マウスモデルが、単一の薬物による、および同様に薬物組合せに関する、高いサイトカイン放出の見込みを予測することができることを示す。加えて、異なるＰＢＭＣドナーは、併用療法に対し異なるサイトカイン放出応答を示した。
本試験は、臨床投与に先立ち、患者への薬物の特定の組合せが、重度サイトカイン放出を誘導する可能性があり得るかスクリーニングするためのｉｎ ｖｉｖｏ方法における患者自身のＰＢＭＣの使用の利点を実証する。同様に、本方法は、薬物組合せの投与に伴う可能な薬物関連の毒性のスクリーニングに有用である。
（実施例１６）
照射ヒト化マウスにおけるヒト免疫細胞集団および細胞型分布
本実施例において、本出願人らは、照射ヒト化マウスにおけるヒト免疫細胞集団および細胞型分布を評価した。マウス内のヒト細胞集団における免疫不全マウスへのヒトＰＢＭＣ生着前のＸ線照射および生着後の時間の効果が実証される。
６週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ、ＪＡＸ系統番号００５５５７）マウスを、ヒトＰＢＭＣの生着に使用した。照射処置に付されるマウスのため、マウスに、ヒトＰＢＭＣの生着の少なくとも４時間前に、１００ｃＧｙのＸ線を照射した。ドナー由来の精製／単離されたヒトＰＢＭＣを、２×１０７個の細胞／マウスでマウスに静脈内注射した。ＰＢＭＣは、６名の異なるドナー：３６２、３４５、２７８５、２１３、３６４または３２５１のうち１名に由来した。生着後５日目および１０日目にマウスを出血させ、マウス血液におけるヒト細胞をフローサイトメトリーによって解析して、存在するヒト細胞型および各型のパーセンテージを決定した。具体的には、ヒトＰＢＭＣとの混合物中のマウスＰＢＭＣは、ヒト抗体：抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ５６ ｍＡｂで染色した。結果を図１９に示し、図１９は、ヒト細胞集団が、５日目および１０日目に照射ありおよびなしのマウスの間で異なることを説明する。
図１９に示す通り、５日目に、総ヒト白血球細胞集団（ＣＤ４５＋）は、照射マウスにおいて約８～１５％であったが、非照射マウスにおいては１～３％のみであり、総集団に関してドナーの間に多様性があった。図１９は、５日目に、照射または非照射マウスに関する総ヒト細胞（ＣＤ４５＋）集団内の白血球細胞型の分布は、殆ど同一であったことをさらに示し、それぞれにおける優勢な細胞型は、ＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）およびＣＤ５６＋（ＮＫ細胞）であり、少ないパーセンテージのＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）およびＣＤ１４＋細胞（単球）があった。
図１９は、１０日目に、総ヒト細胞（ＣＤ４５＋）集団が、照射マウスにおいて生細胞の約３０～８５％に成長したが、非照射マウスにおいては生細胞の８～１７％のみになったことを示し、個々のドナーの間に多様性があった。
図１９は、１０日目に、総ヒト細胞（ＣＤ４５＋）集団内の白血球細胞型の分布はまたしても、照射または非照射マウスで同様であったことをさらに示す。照射または非照射マウスのいずれかにおいて、優勢な細胞型は、マウスにおいてその集団を成長させ増やした、ＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）であった。ごく僅かなまたは無視できるパーセンテージの生存ＣＤ５６＋（ＮＫ細胞）、ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）およびＣＤ１４＋細胞（単球）が、照射または非照射マウスに存在した － すなわち、これらの細胞は、マウスにおいてその集団を成長させず増やさなかった。
照射マウスにおいて５日目または１０日目に存在するヒト細胞の絶対数は、非照射マウスにおいて同日に存在するヒト細胞の絶対数の約３～１５倍多かったため、照射マウスは、存在するヒト白血球の型のそれぞれの、より多い数を示した。重要なことに、５日目に、照射マウスは、ヒトＣＤ４５＋細胞集団内に、より多い絶対数の生存ＣＤ５６＋（ＮＫ細胞）、ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）およびＣＤ１４＋細胞（単球）を有し、サイトカイン放出症候群の試験の感度および精度を増強するヒト免疫系の優れたモデル化を提供する。
（実施例１７）
照射または非照射ヒト化マウスにおけるＧＶＨＤの指標としての体重減少
本試験において、本出願人らは、ヒト化マウスにおけるＧＶＨＤの指標として体重減少を使用した。６名の異なるヒトドナー（３６２、３４５、２７８５、２１３、３６４または３２５１）のそれぞれに由来する２千万個のＰＢＭＣを生着させたヒト化マウスにおいて、体重測定を毎日行った。マウスは、実施例１６の手順に従って、ドナーＰＢＭＣの生着に先立ち照射したまたは照射しなかった。ドナー毎の照射および非照射群の体重測定値を図２０のパネルａ（ドナー３６２、３４５および２７８５）；パネルｂ（ドナー２１３、３６４および３２５１）に示す。図２０は、全ドナーに関して、体重減少は、照射マウスに、非照射マウスよりも初期に発生することを示し、ＧＶＨＤが、照射ヒト化マウスに、非照射ヒト化マウスよりも速く発症することを実証する。全６名のヒトドナーに関して、８日目の後の照射ヒト化マウスの体重減少は有意であり（少なくとも約１０％）、８日目の後の有意なＧＶＨＤを示す。非照射マウスは、ＰＢＭＣ生着の１２～１４日後であっても有意な体重減少を示さず、有意なＧＶＨＤのはるかにより遅い発病を示す。
（実施例１８）
ＧＶＨＤは、単独で（薬物処置の非存在下で）ヒト化マウスにおいてヒトサイトカイン放出を引き起こす
本実施例は、有意なＧＶＨＤを経験するマウスが、ＧＶＨＤの結果としてヒトサイトカインを分泌したことを実証する。ＧＶＨＤは、照射ヒト化マウスに、非照射ヒト化マウスよりも速く発症した。
図２１は、いずれの薬物処置も非存在下で、ＰＢＭＣ生着後１０日目にヒト化マウスに存在するヒトサイトカインレベルを示す。サイトカイン測定値は、ＰＢＭＣ生着に先立つ照射ありまたはなしで、６名のドナー（３６２、３４５、２７８５、２１３、３６４および３２５１）のヒト化マウスに関してＩＦＮ－γ（パネルａ）、ＩＬ－１０（パネルｂ）およびＩＬ－６（パネルｃ）に示す。ドナー毎に、生着後１０日目に、非照射マウスよりも多くの３種のサイトカインのそれぞれが照射マウスの血液に存在した。１０日目に、実施例１７に開示されている体重測定値に基づき、照射マウスは、存在するヒト白血球からのヒトサイトカインの結果的ＧＶＨＤ関連分泌により、非照射マウスよりも重度のＧＶＨＤを有した。
（実施例１９）
照射および非照射ヒト化マウスにおけるサイトカイン放出
本実施例は、薬物誘導性ヒトサイトカイン放出におけるマウスのＸ線照射（ＰＢＭＣ生着に先立つ）の効果を評価する。
マウスに、ドナー３６２（高度応答者）またはドナー２１（中程度応答者）由来の２千万個のＰＢＭＣを生着させた。マウスは、ドナーｈＰＢＭＣの生着に先立ち照射したまたは照射しなかった。生着から６日後に、マウスは、免疫調節薬（０．５ｍｇ／ｋｇ ＯＫＴ３、１０ｍｇ／ｋｇＫＥＹＴＲＵＤＡ、１ｍｇ／ｋｇ ＡＴＧまたは５ｍｌ／ｋｇ ＰＢＳ（陰性対照）のｉｖ注射）で処置した。薬物処置の６時間後に得たマウス血液におけるサイトカインレベルを決定した。照射および非照射ヒト化マウスにおける薬物誘導性サイトカインレベルを比較する結果を図２２Ａ～図２２Ｂに示す。図２２Ａは、ＩＦＮ－γ（パネルａ）、ＩＬ－１０（パネルｂ）およびＩＬ－６（パネルｃ）のデータを提示する一方、図２２Ｂは、ＩＬ－２（パネルｄ）、ＩＬ－４（パネルｅ）およびＴＮＦ（パネルｆ）のデータを提示する。図２２Ａ～図２２Ｂは、各サイトカインに関して、いずれかのドナーにおいて、非照射マウスにおけるサイトカインレベルは、所与の薬物処置後に、同じ薬物処置後の照射マウスにおいて決定されたものと比較して一貫してより低いことを示す。
照射マウスにおいて産生されたより高いサイトカインレベルは、実施例１６に開示されている通り、当該マウスに存在するより多い数のヒト免疫細胞（Ｔ細胞およびＮＫ細胞）が原因である可能性がある。よって、照射ヒト化マウスモデルは、所与の薬物に応答した免疫賦活における個々の多様性の検出のためのより優れた感度を提供する。
材料＆方法
１．ＰＢＭＣヒト化マウス再構成
６週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ、ＪＡＸ系統番号００５５５７）マウスおよびその派生系統、ＮＳＧ－ＣＳＦ－１、ＮＳＧ－ＩＬ－６マウスに、ヒトＰＢＭＣ生着の少なくとも４時間前に、１００ｃＧｙのＸ線を照射した。精製されたヒトＰＢＭＣは、商業的に購入した（Ａｓｔａｒｔｅ ＢｉｏｌｏｇｉｃｓまたはＡｌｌｃｅｌｌｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。解凍後にＰＢＭＣをＰＢＳで２回洗浄し、次いで１千万～５千万個の細胞／マウスをＮＳＧマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ｈＰＢＭＣ注射後に、毛皮の全体的な外観および運動性についてマウスを毎日観察した。ｈＰＢＭＣ生着後の別の日に、フローサイトメトリーによってヒト細胞パーセンテージを試験するためにマウスを出血させた。ヒト抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ５６でマウスＰＢＭＣを染色した。
２．ヒト化マウスにおけるサイトカイン放出の誘導および測定
ｈＰＢＭＣ生着の６日目に、マウスは、抗体ＯＫＴ３（抗ＣＤ３ ｍＡｂ）およびＡＮＣ２８（抗ＣＤ２８ ｍＡｂ）、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）（抗ＰＤ－１）、ＡＴＧ、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドミド）ならびにベースライン対照としてのＰＢＳバッファーのｉｖ注射によってヒトサイトカイン放出を誘導された。２および／または６時間目にマウスを出血させ、血清を採取し、ＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ（ＢＤ Ｃａｔ．Ｎｏ．５５１８０９）を使用して、サイトカイン濃度に関して解析した。様々なサイトカインに関する本アッセイの検出限界を次に示す：ＩＦＮ－γ、７ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ－２、２．６ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ－４、２．６ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ－６、３．０ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ－１０、２．８ｐｇ／ｍｌ；およびＴＮＦ、２．８ｐｇ／ｍｌ。
３．体温の測定
処置前に、また、各時点の出血の直前に、マウスの直腸温を測定した。温度は、直腸熱電対プローブを挿入し、安定した読み取り値が得られるまで待つことによって測定した。
４．臨床スコアの評価
Bradyら、Clinical & Translational Immunology、２０１４年による参考文献と同様に、本発明者らは、次の通りに徴候およびスコアのグレード付けを行った：スコア：０＝正常な活動性；１＝正常な活動性、立毛、つま先歩行；２＝背中を丸め、活動性が低下しているが、依然として移動可能；３＝運動性低下だが、促されると移動可能；４＝瀕死（危篤状態）。臨床スコア４を有するマウスは安楽死させた。
５．統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０を使用して結果を解析した。
本開示は、次の態様をさらに包含する。
態様１．免疫調節薬が、免疫調節薬の投与後にヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があるか決定する方法であって、（ａ）免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、（ｂ）ヒトから単離された１．５～３．０×１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記マウスに生着させるステップと、（ｃ）ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、前記マウスに免疫調節薬を投与するステップと、（ｄ）前記マウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップであって、ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群を示す、ステップと、（ｅ）前記免疫調節薬が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があると決定するステップであって、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群の存在が、前記免疫調節薬の投与が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があることを示す、ステップとを含む方法。
態様２．ヒトへの免疫調節薬の投与が、ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘導する見込みを決定する方法であって、（ａ）ヒト由来の１．５～３．０×１０７個の単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させてから５～７日後に免疫調節薬を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップと、（ｂ）マウスの血液試料に存在するＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するステップであって、マウス血液試料におけるＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌまたはＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの濃度が、ヒトへの免疫調節薬の投与が、重度サイトカイン放出症候群を誘導する可能性があることを示す、ステップとを含む方法。
態様３．第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物が、免疫調節薬の前記組み合わせ物の投与後にヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があるか決定する方法であって、（ａ）免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、（ｂ）ヒトから単離された１．５～３．０×１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記マウスに生着させるステップと、（ｃ）ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、前記マウスに第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬を投与するステップと、（ｄ）前記マウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップであって、ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群を示す、ステップと、（ｅ）免疫調節薬の前記組み合わせ物が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があると決定するステップであって、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群の存在が、免疫調節薬の前記組み合わせ物の投与が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があることを示す、ステップとを含む方法。
態様４．ヒトへの第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物の投与が、ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘導する見込みを決定する方法であって、（ａ）ヒト由来の１．５～３．０×１０７個の単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させてから５～７日後に第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップと、（ｂ）マウスの血液試料に存在するＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するステップであって、ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌまたはＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの濃度が、ヒトへの第１の免疫調節薬および第２の免疫調節薬の組み合わせ物の投与が、重度サイトカイン放出症候群を誘導する可能性があることを示す、ステップとを含む方法。
態様５．免疫調節薬の投与後にヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘発しない免疫調節薬の安全な投薬量を決定する方法であって、（ａ）第１の投薬量を有する免疫調節薬を用意するステップであって、免疫調節薬の前記第１の投薬量が、その投与後に第１のヒト化照射免疫不全マウスにおいて軽度または重度サイトカイン放出症候群を誘発すると決定される、ステップと、（ｂ）第２の免疫不全マウスを用意するステップであって、前記第２のマウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、（ｃ）ヒトから単離された１．５～３．０×１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記第２のマウスに生着させるステップと、（ｄ）ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、前記第２のマウスに免疫調節薬を投与するステップであって、前記免疫調節薬が、前記第１の投薬量よりも少ない第２の投薬量で投与される、ステップと、（ｅ）前記第２のマウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０を含む複数のサイトカインの血中濃度を決定するステップと、（ｆ）前記ヒトにおける投与のための前記免疫調節薬の安全な投薬量を決定するステップであって、前記安全な投薬量が、前記第２のマウスへの前記免疫調節薬の投与後に、ＩＦＮ－γが＜３００ｐｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１０が＜２５ｐｇ／ｍｌである血中濃度を生じる投薬量であり、前記第２のマウスにおけるＩＦＮ－γ＜３００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０＜２５ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記免疫調節薬の前記安全な投薬量の投与が、前記ヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘発しない可能性があることを示す、ステップとを含む方法。
態様６．ヒトにおける使用のための薬物候補の免疫毒性を決定する方法であって、（ａ）免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、７５～１２５ｃＧｙのＸ線を照射される、ステップと、（ｂ）４．５～５．５×１０７個のヒトＰＢＭＣを前記マウスに生着させるステップと、（ｃ）生着させてから４～７日後に、薬物候補を前記マウスに投与するステップと、（ｄ）前記マウスの血液におけるサイトカイン濃度を決定するステップであって、前記サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦからなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインである、ステップと、（ｅ）前記薬物候補の免疫毒性を決定するステップであって、ＩＦＮ－γ≧３００ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－２≧１５ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－４≧１０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－６≧１０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ－１０≧２５ｐｇ／ｍｌ、またはＴＮＦ≧５ｐｇ／ｍｌからなる群から選択される少なくとも１種のサイトカインの前記マウスにおける血中濃度が、ヒトにおける前記薬物候補の免疫毒性を示す、ステップとを含む方法。
態様７．ヒトにおける薬物候補の免疫毒性を決定する方法であって、（ａ）４．５～５．５×１０７個の単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させてから４～７日後に薬物候補を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップと、（ｂ）マウス血液試料に存在する少なくとも１種のヒトサイトカインの濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出して、薬物候補のヒト免疫毒性を決定するステップであって、少なくとも１種のヒトサイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦからなる群から選択され、マウス血液試料において低いヒトサイトカイン濃度が検出される場合、薬物候補が、低いヒト免疫毒性を有する、ステップとを含む方法。
態様８．前記マウスが、ＮＳＧ、ＮＳＧ－ＩＬ－６またはＮＳＧ－ＣＳＦ－１マウスである、態様１～７のいずれか一態様に記載の方法。
態様９．前記マウスが、ＮＳＧマウスである、態様１～８のいずれか一態様に記載の方法。
態様１０．前記マウスが、１００ｃＧｙのＸ線を照射される、態様１～９のいずれか一態様に記載の方法。
態様１１．前記生着ステップが、２×１０７個のＰＢＭＣで行われる、態様１～５および８～１０のいずれか一態様に記載の方法。
態様１２．前記投与ステップが、生着させてから６日後に行われる、態様１～１１のいずれか一態様に記載の方法。
態様１３．前記複数のサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６およびＴＮＦをさらに含む、態様１～１２のいずれか一態様に記載の方法。
態様１４．複数のサイトカインの血中濃度が、前記免疫調節薬または免疫調節薬の前記組み合わせ物の投与の２～６時間後に決定される、態様１～１３のいずれか一態様に記載の方法。
態様１５．複数のサイトカインの血中濃度が、前記免疫調節薬または免疫調節薬の前記組み合わせ物の投与の６時間後に決定される、態様１～１４のいずれか一態様に記載の方法。
態様１６．前記免疫調節薬が、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、抗ＣＤ５２ ｍＡｂ；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；インターフェロン；イミキモド；サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、アプレミラスト；アザチオプリン、クラドリビン、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン、メトトレキセート、ミトキサントロン；タリモジーンラハーパレプベック；アダリムマブ、カツマキソマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ－Ｉ１３１、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、デノスマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ダラツムマブ、セリチニブ、エロツズマブおよび抗胸腺細胞グロブリンからなる群から選択される、態様１～１５のいずれか一態様に記載の方法。
態様１７．前記抗ＣＤ２８ ｍＡｂが、ＴＧＮ１４１２である、態様１６に記載の方法。
態様１８．前記抗ＣＤ３ ｍＡｂが、ＯＫＴ３である、態様１６に記載の方法。
態様１９．前記抗Ｃ２０ ｍＡｂが、リツキシマブである、態様１６に記載の方法。
態様２０．前記抗ＣＤ５２ ｍＡｂが、アレムツズマブである、態様１６に記載の方法。
態様２１．前記第１の免疫調節薬および前記第２の免疫調節薬が、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、抗ＣＤ５２ ｍＡｂ；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；インターフェロン；イミキモド；サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド）、アプレミラスト；アザチオプリン、クラドリビン、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン、メトトレキセート、ミトキサントロン；タリモジーンラハーパレプベック；アダリムマブ、カツマキソマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ－Ｉ１３１、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、デノスマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ）、デュルバルマブ、ダラツムマブ、セリチニブ、エロツズマブおよび抗胸腺細胞グロブリンからなる群から独立して選択される、態様３～４および５～１５のいずれか一態様に記載の方法。
態様２２．前記第１の免疫調節薬が、ペムブロリズマブまたはニボルマブであり、前記第２の免疫調節薬が、レナリドミド、ポマリドミド、エパカドスタット、タリモジーンラハーパレプベック、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、セリチニブ、ダラツムマブまたはデュルバルマブである、態様３～４、５～１５および２１のいずれか一態様に記載の方法。
態様２２．前記第１の免疫調節薬が、イピリムマブであり、前記第２の免疫調節薬が、レナリドミド、ポマリドミド、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、セリチニブ、ダラツムマブまたはデュルバルマブである、態様３～４、５～１５および２１のいずれか一態様に記載の方法。
態様２３．前記第１の免疫調節薬が、アテゾリズマブ、アベルマブまたはデュルバルマブであり、前記第２の免疫調節薬が、レナリドミド、ポマリドミド、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、リツキシマブ、セリチニブ、ダラツムマブまたはアレムツズマブである、態様３～４、５～１５および２１のいずれか一態様に記載の方法。
態様２４．前記抗ＣＤ５２ ｍＡｂが、アレムツズマブであり、前記抗Ｃ２０ ｍＡｂが、リツキシマブであり、前記抗ＣＤ３ ｍＡｂが、ＯＫＴ３であり、または前記抗ＣＤ２８ ｍＡｂが、ＴＧＮ１４１２である、態様３～４、５～１５および２１のいずれか一態様に記載の方法。
態様２５．前記生着ステップ（ｂ）が、５×１０７個のＰＢＭＣで行われる、態様６または７に記載の方法。
本明細書で言及されているいずれかの刊行物または参考文献は、本発明が属する技術分野の当業者の水準を示す。本明細書におけるあらゆる特許、刊行物および／または参考文献は、あたかも個々の刊行物のそれぞれが、その全体が参照により組み込まれたと特にかつ個々に示されているのと同じ程度まで、参照により組み込む。
例の実施形態が、ヒトにおいて許容し難く高度なサイトカイン応答を誘発することなく免疫調節薬をヒトに投与することができるか決定するためのヒト化免疫抑制マウスの使用に関して本明細書に記載されているが、本方法を、様々な哺乳動物および／もしくは薬物と共に使用することができる、ならびに／またはヒト以外の哺乳動物の処置に使用することができることを理解されたい。したがって、本発明は、本実施例に限定されない。本明細書に提供されている教示を考慮して、当業者は、本発明が使用され得る他の適用を認識するであろう。よって、当業者は、他の適用において本発明の方法を使用することができるであろう。したがって、このような代替使用は、本発明の一部であることが意図されている。
前述の明細書において、本発明は、その特定の実施形態を参照しつつ記載されてきた。しかし、本発明のより広い精神および範囲から逸脱することなく、そこに様々な修正および変更を為すことができることが明らかであろう。したがって、かかる変更および修正が、本明細書に添付されている特許請求の範囲によって定義されている本発明の範囲内に収まることが意図される。したがって、本明細書および図面は、制限的ではなく説明的な意味で考慮するべきである。

Claims (17)

  1. 免疫調節薬が、前記免疫調節薬の投与後にヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があるか決定する方法であって、前記方法が、
    （ａ）ヒト化照射免疫不全マウスを用意するステップであって、前記マウスが、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ遺伝的背景を有する、ステップと、
    （ｂ）ヒトから単離された１．５～３．０×１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を前記マウスに生着させるステップと、
    （ｃ）前記ＰＢＭＣを生着させてから５～７日後に、前記マウスに免疫調節薬を投与するステップと、
    （ｄ）前記マウス由来の血液試料における、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１０の血中濃度を決定するステップと
    を含み、
    ＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの血中濃度が、前記マウスにおける重度サイトカイン放出症候群を示し、かつ前記免疫調節薬が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘発する可能性があることを示す、方法。
  2. 前記生着ステップ（ｂ）が、２×１０７個のＰＢＭＣで行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記投与ステップ（ｃ）が、生着させてから６日後に行われる、請求項１に記載の方法。
  4. ステップ（ｄ）における前記決定が、前記免疫調節薬の投与の２～６時間後である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記免疫調節薬が免疫賦活性薬である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記免疫調節薬が抗体である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記免疫調節薬が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターフェロン、イミキモド、サリドマイドおよびその誘導体またはアナログ、レナリドミド、ポマリドミド、アプレミラスト；アザチオプリン、クラドリビン、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン、メトトレキセート、ミトキサントロン；タリモジーンラハーパレプベック、抗ＣＤ３８抗体、アダリムマブ、エパカドスタット、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ１）の経口利用できるヒドロキシアミジン阻害剤、カツマキソマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ－Ｉ１３１、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、デノスマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、イピリムマブ、ダラツムマブ、およびエロツズマブからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記免疫調節薬が、チェックポイント阻害剤から選択される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、およびＰＤ－Ｌ１阻害剤から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブから選択される、請求項９に記載の方法。
  11. ヒトへの免疫調節薬の投与が、前記ヒトにおいて重度サイトカイン放出症候群を誘導する見込みを決定する方法であって、
    （ａ）ヒト由来の１．５～３．０×１０７個の単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を生着させてから５～７日後に免疫調節薬を投与されたヒト化照射免疫不全マウスから、血液試料を用意するステップであって、前記マウスがＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ遺伝的背景を有する、ステップと、
    （ｂ）前記マウスの前記血液試料に存在するＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１０の濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するステップであって、
    前記マウス血液試料におけるＩＦＮ－γ≧１，８００ｐｇ／ｍｌまたはＩＬ－１０≧１２０ｐｇ／ｍｌの濃度が、前記ヒトへの前記免疫調節薬の投与が、重度サイトカイン放出症候群を誘導する可能性があることを示す、ステップと
    を含む方法。
  12. 前記免疫調節薬が免疫賦活性薬である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記免疫調節薬が抗体である、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記免疫調節薬が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターフェロン、イミキモド、サリドマイドおよびその誘導体またはアナログ、レナリドミド、ポマリドミド、アプレミラスト；アザチオプリン、クラドリビン、シクロホスファミド、静脈内免疫グロブリン、メトトレキセート、ミトキサントロン；タリモジーンラハーパレプベック、抗ＣＤ３８抗体、アダリムマブ、エパカドスタット、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ１）の経口利用できるヒドロキシアミジン阻害剤、カツマキソマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ－Ｉ １３１ 、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、デノスマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ダラツムマブ、およびエロツズマブからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記免疫調節薬が、チェックポイント阻害剤から選択される、請求項１１に記載の方法。
  16. 前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＰＤ－１阻害剤、およびＰＤ－Ｌ１阻害剤から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブから選択される、請求項１５に記載の方法。

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