CN1709911A - 肿瘤坏死治疗单抗－白细胞介素2的融合蛋白及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了重组人肿瘤坏死治疗单抗(recombinant human tumor necrosis therapy monoclonal antibody，rhTNT)与白细胞介素2(Interleukin 2，IL2)的融合蛋白(rhTNT－IL2)，编码该融合蛋白的DNA序列，构建含该DNA序列的真核细胞表达载体，筛选并保存稳定高表达该融合蛋白的宿主细胞株，纯化该融合蛋白的工艺方法，以及含该融合蛋白的药物组合物。该融合蛋白具有广谱抗肿瘤的治疗作用。

Description

肿瘤坏死治疗单抗-白细胞介素2的融合蛋白及其制法和用途

技术领域

本发明涉及DNA重组技术和药物领域。更具体地，本发明涉及肿瘤坏死治疗单抗(rhTNT)与人白细胞介素2(以下简称IL2)的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的工艺方法，以及该融合蛋白在治疗肿瘤等疾病中的应用。

背景技术

目前的肿瘤治疗方案中最重要的是手术，化疗和放疗。这三大常规疗法尽管可以大大延长肿瘤病人的存活期，但是肿瘤患者仍然会因为复发或转移而死亡，或者因为化疗、放疗导致的骨髓抑制继发性发生感染或出血而死亡。为此，人们不断尝试各种生物疗法以弥补目前现存的治疗方法的不足，例如基因治疗、免疫治疗等。

细胞因子(Cytokine)是是一类由机体的活化免疫细胞或其他细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白质的统称，具有调节细胞生理功能、介导炎症反应、参与免疫应答和组织修复等多种生物学效应。根据细胞因子的功能又分为如白细胞介素(Interleukin，IL)，集落刺激因子(Colony-stimulatingFactor，CSF)，干扰素(Interferon)，肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)等等。由于细胞因子对免疫功能具有调节作用，局部应用可以增强肿瘤的免疫原性，因而作为药物应用治疗肿瘤疾病。这些细胞因子在市场上都销售多年并显示出独特的治疗效果，其缺点是：在体内半衰期短、缺乏特异性。

IL-2作为一种具有广泛的临床应用价值的基因工程产品，可提高人体对肿瘤的免疫应答，是机体抗肿瘤免疫应答中最重要的因子之一，目前除了上市用来治疗黑色素瘤和肾癌外，正在进行各期临床试验治疗其他不同类型的恶性肿瘤。表达IL-2的肿瘤疫苗、重组病毒等基因治疗或生物治疗产品也正在进行临床试验。基因工程IL-2目前主要的给药途径全身给药，全身使用IL-2的缺点是缺乏肿瘤特异性且容易导致严重毒副作用，如毛细血管渗漏综合症，给病人带来痛苦甚至危及生命。

单克隆抗体是近年来生物技术领域发展最快的技术之一，从1975年Melstein和Kohler发明鼠源性单克隆抗体，至今近30多年时间里，抗体经历了鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体四个里程碑。由于单抗独特灵活的作用机理使得它既可以发挥信号传导的拮抗作用或发挥ADCC作用直接杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖或者引起肿瘤细胞凋亡，也可以作为肿瘤特异性运输工具，将放射性核素如¹³¹I和⁹⁰Y、毒素或化学药物运输到肿瘤部位，发挥特异性治疗作用。其中，鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体这三类抗体由于或多或少含有鼠源蛋白成分，进入人体可以引起HAMA或HACA反应，影响治疗效果并可能导致严重的不良反应。

然而，迄今为止尚没有将肿瘤特异性抗体(尤其是全人抗体)与白细胞介素2融合形成高特异性和高肿瘤杀伤力的融合蛋白。因此，为了更有效的治疗肿瘤病人，尤其是传统治疗方式无能为力的病人，本领域迫切需要开发兼具肿瘤特异性抗体和IL2两者生物活性的药物。

发明内容

本发明的一个目的就是提供一种新的具有肿瘤特异性抗体和IL2两者生物活性的药物，它是rhTNT和IL2的融合蛋白。

本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。

本发明的另一目的是提供一种成本低廉和/或步骤简便的生产所述rhTNT-IL2融合蛋白的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，它包括：

(a)肿瘤坏死治疗单抗元件，该肿瘤坏死治疗单抗元件由抗体重链和抗体轻链通过二硫键连接形成，其中所述的抗体重链的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、2和3；

(b)白细胞介素2元件，该元件具有全长人白细胞介素2或其活性片段的氨基酸序列；以及

(c)位于肿瘤坏死治疗单抗元件中抗体重链和白细胞介素2元件之间的1-20个氨基酸的连接肽序列。

在另一优选例中，所述的抗体轻链的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：5、6和7；

所述的全长人白细胞介素2具有SEQ ID NO：11中第1-133位氨基酸序列，人白细胞介素2活性片段具有SEQ ID NO：11中第22-58位氨基酸序列；

所述的接头肽序列含3-10个氨基酸。

更佳地，所述的融合蛋白中的抗体部分重链的可变区具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；轻链的可变区具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述融合蛋白是由保藏号为CCTCC C200406的小鼠骨髓瘤细胞株NSO-TNTIL2产生的。

在另一优选例中，所述的抗体重链和抗体轻链为IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚类。

在另一优选例中，且连接肽位于抗体重链的羧基端和白细胞介素2元件的氨基酸之间。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本发明上述的融合蛋白。

在本发明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体和含有上述载体的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了一种产生本发明融合蛋白的方法，它包括步骤：

在表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和

分离所述的融合蛋白。

在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的(如0.001-99.99wt％)本发明的融合蛋白。较佳地，所述融合蛋白的含量是组合物总重量的0.01-99.9％。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有选自下组的抗肿瘤药物：顺铂、5-Fu、氨甲蝶呤、IFN、TNF、氮芥、环磷酰胺、阿霉素、放线菌素D、长春新碱、喜树碱类或其组合。

在本发明的第六方面，提供了本发明融合蛋白的用途，它被用于制备治疗肿瘤的药物，尤其是用于制备治疗恶性实体瘤的药物。

在本发明的第七方面，提供了一种融合多肽，所述的融合多肽实际上是上述融合蛋白中的融合重链，它包括：

(a)肿瘤坏死治疗单抗的重链元件，所述抗体重链元件的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、2和3；

(b)白细胞介素2元件，该元件具有全长人白细胞介素2或其活性片段的氨基酸序列；以及

(c)位于肿瘤坏死治疗单抗元件中抗体重链和白细胞介素2元件之间的1-20个氨基酸的连接肽序列。

在本发明的第八方面，还提供了一种化合物，它由本发明上述融合蛋白以及与所述融合蛋白偶联的PEG构成。

较佳地，PEG的分子量是5-100KD，更佳地为40-80KD。融合蛋白与PEG的摩尔比为1∶0.5-1∶10，更佳地为1∶1-1∶5。

附图说明

图1显示了表达rhTNT-IL2融合蛋白的制备示意图。

图2显示了rhTNT-IL2融合蛋白的IL2比活性。

图3显示了rhTNT-IL2融合蛋白针对肿瘤的特异结合性。

图4显示了对3个批次的还原型rhTNT-IL2融合蛋白的SDS-PAGE检测结果。其中，泳道1：Marker；泳道2：还原型；泳道3：还原型；泳道4：还原型。

图5显示了对3个批次的非还原型rhTNT-IL2融合蛋白的SDS-PAGE检测结果。其中，泳道1：Marker，泳道2：非还原型、泳道3：非还原型、泳道4：非还原型。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，将肿瘤坏死治疗单抗rhTNT基因和IL2基因融合在一起，产生由合适的氨基酸连接臂连接的rhTNT-IL2的融合蛋白。所述融合蛋白具有两者的生物学功能，既可通过rhTNT特异性地达到肿瘤部位，通过抗体依赖的细胞毒作用和补体介导的细胞溶解作用杀伤肿瘤细胞，还可以激机体局部和全身的活抗肿瘤免疫，并通过IL2的生物活性提高肿瘤部位毛细血管的通透性，提高肿瘤局部摄取化疗药物的数量，同时由于和大分子抗体蛋白的融合，IL2的半衰期得以延长。因此，本发明所得到的rhTNT-IL2融合蛋白质可以在两者的协同下增强抗肿瘤的效果，还可减少两者分别给药给患者所带来的麻烦和痛苦，为抗肿瘤等治疗提供新的化合物。在此基础上完成了本发明。

定义

如本文所用，术语“肿瘤坏死治疗单抗和白细胞介素2的融合蛋白”、“rhTNT-IL2融合蛋白”等可互换使用，都指由肿瘤坏死治疗单抗元件的氨基酸序列和白细胞介素2元件的氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在两者之间可以有或者没有连接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或没有起始的甲硫氨酸或信号肽。

如本文所用，术语“肿瘤坏死治疗单抗”和“肿瘤细胞核单抗”可互换使用，都指针对肿瘤坏死组织中坏死的细胞核的单克隆抗体，这种抗体可特异性结合肿瘤坏死组织中暴露的细胞核，与正常组织没有结合，肿瘤特异性好。此外，由于所有的实体肿瘤都有坏死，因此此抗体对各种实体瘤都可特异性结合，具有广谱抗肿瘤的特点。一种代表性的肿瘤坏死治疗单抗是rhTNT。

如本文所用，术语融合蛋白中“肿瘤坏死治疗单抗元件”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长肿瘤坏死治疗单抗(rhTNT)或其活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然肿瘤坏死治疗单抗基本上相同的生物活性。应理解，本发明的肿瘤坏死治疗单抗元件由抗体重链和抗体轻链通过二硫键连接形成，并且在重链的一端(优选羧基端)与IL2连接。因此，优选的肿瘤坏死治疗单抗元件是肿瘤坏死治疗单抗，更佳地是全长的肿瘤坏死治疗单抗或其活性片段。例如，对于重链而言，代表性的例子是CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、2和3的抗体重链，更佳地是可变区具有SEQ ID NO：4所述序列的抗体重链。对于轻链而言，代表性的例子是CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别为SEQID NO：5、6和7的抗体轻链，更佳地是可变区具有SEQ ID NO：8所述序列的抗体轻链。至于重链和轻链的恒定区，可以选用人抗体的重链恒定区和轻链恒定区。

如本文所用，术语融合蛋白中“白细胞介素2元件”或“IL2元件”可互换使用，指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长白细胞介素2或其活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然白细胞介素2基本上相同的生物活性。优选的IL2元件是人白细胞介素2，更佳地是全长的白细胞介素2或其活性片段，如具有SEQ ID NO：11中第1-133位的氨基酸序列的全长IL2(突变型)，或者含有SEQ ID NO：11中第22-58位的氨基酸序列的IL2片段，简称为IL2(Q₂₂-C₅₈)。

肿瘤坏死治疗单抗和白细胞介素2的序列可以源自人，也可以源自非人的动物。然而，优选的是人的天然序列。

如本文所用，术语“连接肽”或“氨基酸连接臂”可互换使用，指位于肿瘤坏死治疗单抗元件的氨基酸序列和IL2元件的氨基酸序列之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度通常为1-20个氨基酸，较佳地为3-10个氨基酸，最佳地为4-6个氨基酸。技术人员可按照本领域常规方法(如参见PNAS 1998；95：5929-5934；Protein Eng，2000；13(5)：309-312；Protein Eng，2003；15(11)：871-879等文献)设计连接肽。通常，连接肽不影响或严重影响肿瘤坏死治疗单抗元件的氨基酸序列和IL2元件的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。

优选的连接肽例子包括(但并不限于)：为了有利于蛋白在空间折叠成相互独立的有充分生物活性的结构域，用GG、AAAGGGS、SGGGSGGG和GGGGSGGGGSGGGGS等序列作为连接臂是合适的；为了有利于纯化，可把6His作为连接臂，以用金属亲和层析纯化rhTNT-IL2融合蛋白。一种特别优选的连接肽是AAAGGGS(SEQ ID NO：9)。

抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。

本发明还包括含上述互补决定区(CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用基因工程的方法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。因此，编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得肿瘤坏死治疗单抗和或白细胞介素2的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。

在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。

如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)：能在真核细胞如CHO、COS系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体。

在本发明中，可选用本领域已知的各种哺乳动物表达载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是哺乳动物细胞。

在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的rhTNT-IL2融合蛋白既具有rhTNT针对肿瘤细胞的特异亲和力，又具有IL2的增强免疫应答的作用。

除了直接使用本发明的rhTNT与IL2的融合蛋白之外，本发明的融合蛋白还可与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)偶联，形成融合蛋白-PEG偶联物。可以采用本领域中已知的各种形成PEG化蛋白的方法来制备这些融合蛋白-PEG偶联物。

在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的新型rhTNT-IL2融合蛋白，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。

配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、皮内、鞘内(intrathecal)、侧脑室(intracerebroventricular)、腹腔(intraperitoneal)以及肿内(intraparenchymal)或局部给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明融合蛋白或其抗体施用于人，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

此外，本发明的融合蛋白还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)：各种细胞因子，如IFN、TNF、IL18等；各种肿瘤化疗药物，如5-Fu、氨甲蝶呤等影响核酸生物合成的药物，氮芥、环磷酰胺等烷化剂类，阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物，长春新碱、喜树碱类影响蛋白质合成的药物及某些激素等各类药物。

本发明的主要优点如下：

(1)如前所述，IL-2可以特异性激活T细胞、NK细胞等，具有明显治疗肿瘤的作用，但是缺乏特异性。将人源单抗与IL-2融合表达后，IL-2可以特异性地到达肿瘤部位，逆转肿瘤局部的免疫抑制状态，激活机体局部和全身的抗肿瘤免疫。因此，rhTNT-IL2融合蛋白，既具有rhTNT针对肿瘤细胞的特异亲和力，又具有IL2的增强免疫应答的作用，是一种治疗肿瘤的新型药物。

(2)抗体全部为人来源的序列，无任何鼠源性成分，进入人体无免疫原性，不会引起免疫反应。

(3)rhTNT-IL2融合蛋白不但使IL-2的不良反应局限在肿瘤周围，而且使肿瘤周围的毛细血管通透性大大增加，提高融合蛋白在肿瘤组织的摄入量。如果联合化疗，亦可使肿瘤细胞摄取化疗药物的数量显著增加，因此在构建抗肿瘤药物组合物方面有巨大的潜力。

(4)增强蛋白的稳定性，延长半衰期。重组IL-2在体内的半衰期短，临床应用病人需要每天注射。IgG的Fc段和细胞因子融合是一种常用的延长细胞因子半衰期的方法，rhTNT与IL2融合表达后，可以大大延长IL-2的半衰期，使每日注射改为每周或更长时间注射一次，大大方便了病人给药，减少了病人的痛苦和经济负担。

(5)本发明融合蛋白具有特异抗肿瘤和广谱抗肿瘤的特点。由于肿瘤坏死单体特异性结合于肿瘤坏死组织中暴露的细胞核，与正常组织没有结合，因此肿瘤特异性好。此外，由于所有的实体肿瘤都有坏死，因此，本发明融合蛋白对各种实体瘤都可特异性结合。

(6)与其他化学偶联的单抗偶联药物相比，运用基因工程方法构建抗体(或者其片段)与效应蛋白质分子融合基因，并经表达系统表达产生的融合蛋白具有均一性，同时由于蛋白质表达和工业化生产的进步，使得融合蛋白的大批量生产成为可能。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

表达rhTNT-IL2融合蛋白的高表达细胞株的构建

(a)小鼠杂交瘤细胞株NSO-TNT-1细胞的制备

以肿瘤细胞核提取物免疫小鼠，然后提取并制备小鼠B细胞单细胞悬液，通过细胞融合和选择性培养技术与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合，持续反复培养和筛选，通过细胞免疫技术胞筛选出高表达鼠源TNT单抗的杂交瘤细胞株NSO-TNT-1，低温保存。

在以下实施例中，以NSO-TNT-1细胞株所表达的嵌合型肿瘤坏死治疗单抗TNT-1作为融合蛋白rhTNT-IL2的抗体成分的实验阳性对照品。

(b)小鼠骨髓瘤细胞株NSO-TNT-IL2的构建

参见图1。

整个构建过程分两步走，首先构建表肿瘤细胞株特异性结合、并具有高亲合力的阳性细胞克隆，即NSO-rhTNT细胞株。其次构建表达融合蛋白rhTNT-IL2的高表达细胞株NSO-rhTNT-IL2。

1)NSO-RHTNT-IL2中全人单抗成分TNT的基因序列是利用常规的噬菌体展示库技术，以Raji肿瘤细胞核提取物为免疫原(Raji Burkitt s淋巴瘤细胞来源于美国细胞、菌种库，ATCC#CCL86)，筛选用常规方法构建的噬菌体人抗体文库V_H synthetic(Nissim A 1994)和large SCFv(Vaughan TJ，Willaiams AJet al.1996)。经免疫学和蛋白质杂交技术鉴定，以小鼠NSO-TNT杂交瘤细胞的表达产物TNT-1为阳性对照，获得具有和TNT-1相同结合力的单抗，获得与肿瘤细胞株特异性结合、并具有高亲合力的阳性细胞克隆。

抽提阳性细胞克隆的总RNA，从总RNA分离纯化编码单抗的轻重链基因的mRNA。回收的mRNA，通过PCR和RT-PCR扩增技术获得抗体V_H和V_L基因cDNA片段，然后将V_H和V_L克隆入已携带人IgG1或人λ链恒定区片段人的真核表达载体，从而将rhTNT的轻链和重链可变区基因序列与人γ1和λ链恒定区基因序列融合构成rhTNT-IL2基因中的全人抗体部分，构建重组抗体重链和轻链真核表达载体电穿孔法转化小鼠骨髓瘤细胞NSO(购自Peregrine Pharmaceuticals Inc.)，用ELISA法筛选得到rhTNT高表达细胞株。

然后用常规方法对产生的rhTNT单抗进行测序。结果表明，该rhTNT单抗的抗体重链可变区的序列为SEQ ID NO：4，具有SEQ ID NO：1-3所示的CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)；rhTNT单抗的抗体轻链可变区的序列为SEQID NO：8，具有SEQ ID NO：5-7所示的CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)。恒定区为IgG1亚类。

2)在得到具有生物活性的rhTNT高表达细胞株之后，开始构建rhTNT-IL2表达载体和高表达细胞株。

rhTNT-IL2表达载体的基本构建路线如下：

人白细胞介素2(IL-2)基因购自ATCC(#pBC12/HIV/IL-2)。利用特异设计的引物扩增IL-2基因，并在IL-2基因的5端加上一个接头肽的编码序列(接头肽的的氨基酸序列分别为GG、AAAGGGS、SGGGSGGG和GGGGSGGGGSGGGGS等)，在IL-2在基因的3端加上一个限制性内切酶NotI位点。回收PCR产物，限制性内切酶SmaI-EcoRI切割PCR产物，将携带有接头肽的人IL2基因融合于抗体重链真核表达载体中TNT重链基因的COOH端，构成含有融合蛋白的重链-IL2的融合基因序列的真核表达载体。随后同轻链真核表达载体共转化NSO细胞，并筛选得到rhTNT-IL2高表达细胞株。

rhTNT和rhTNT-IL2的大量表达采用谷氨酰胺合成酶(GlutamineSynthetase，GS)基因表达系统，所用真核表达载体为pEE12(购自CelltechBiologics公司)。

结果获得了连接肽为2肽(GG)、7肽(AAAGGGS)、8肽(SGGGSGGG)和15肽(GGGGSGGGGSGGGGS)的rhTNT和IL2融合蛋白，其分子量与预测值相符。其中，含有优化连接肽AAAGGGS的融合蛋白被命名为rhTNT-IL2。

制得的小鼠骨髓瘤细胞株NSO-TNTIL2于2003年11月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为CCTCC No.200406，该细胞株表达连接肽为AAAGGGS的融合蛋白rhTNT-IL2。

实施例2

rhTNT-IL2融合蛋白的表达和纯化

(a)表达

取冷冻的小鼠骨髓瘤细胞株NSO-TNT-IL2(约1×10⁷个细胞)，在37℃复苏2-3分钟，将冻存管内的细胞移到装有10ml选择性培养基的15ml离心管中，悬浮细胞以1500rpm的转速离心10分钟，弃上清液，将离心沉淀细胞接种于选择培养基开始细胞扩增培养直至3L旋转培养瓶，细胞数＞2.0×10⁶个细胞/ml。

大规模培养表达方法：

30L的培养基通过一个孔径0.2μm的过滤装置过滤，直接滤入无菌生物反应器中，温度保持在37±0.5℃。所有3L旋转培养瓶中的rhTNT-IL2细胞用蠕动泵转移到生物反应器中。在培养基过滤并移入生物反应器的36小时后进行接种。

在生物反应器中的接种结束后，每天都可以获得一份源自细胞混悬液的样本。样本的抗体浓度由ELISA方法来测定，用Trypan蓝拒染法检测培养体系中细胞的浓度和活细胞的比例。

取样、细胞计数和培养步骤进行重复，直到总细胞数量(TCC)＞2.0×10⁶个细胞/ml，活细胞总数(VCC)＞80％总细胞数(TCC)。在无菌条件下，将含有大量表达产物的细胞培养基利用蠕动泵5μm预过滤和0.22μm终过滤从生物反应器中排出到一个50L的收集器中。

融合蛋白的表达量约为10mg/ml。

(b)纯化

在使用前2小时内准备一支蛋白A柱(柱床体积100ml)。柱子先用1L(10倍于柱体积)无菌注射用水(SWFI)以流速25ml/分钟进行洗涤，再用1.5LPBS(pH4.2，50mM)以流速为20ml/分钟进行平衡。

在室温下及无菌条件下，rhTNT-IL2抗体进行蛋白A柱纯化。rhTNT-IL2抗体经蠕动泵作用以20ml/分钟的流速进入蛋白A柱，流出的液体弃去。接着再用8.0L PBS(50mM)(40倍于柱体积)以40ml/分钟的流速进行洗柱。最后融合蛋白用pH10的蛋白A纯化洗脱液洗脱，流速为40ml/分钟。当A₂₈₀升高到0.2时，将经过洗脱的溶液收集到一个无菌、密封的瓶子中，抗体收集进行到A₂₈₀降回到0.2为止。

蛋白A柱先用2.0L(10倍柱体积)的0.5M HCL以40ml/分钟的流速进行洗涤，再用2.0L(10倍于柱体积)的无菌注射用水(SWFI)以40ml/分钟的流速进行洗涤。无菌注射用水洗涤完成后，再用1.0L(10倍于柱体积)的70％乙醇(含70％乙醇和30％SWFI)以30ml/分钟的流速进行洗涤。最后在4℃下保存在35％的乙醇中。

洗脱的融合蛋白溶液用无菌注射用水稀释到电导11.3-15.3ms/cm，并移入pH10.0的磷酸缓冲液(50mM)中使pH达到10.0。该溶液再通过Ultipor VF病毒过滤膜直接过滤到消毒好的容器中。

CM阳离子交换柱(柱床体积20ml)先200ml SWFI以20ml/分钟的流速进行洗涤准备，再用200ml(10倍于柱体积)的CM结合缓冲液以20ml/分钟的流速进行平衡。

经蛋白A柱纯化的rhTNT-IL2溶液以5ml/分钟的流速装入CM阳离子交换柱。先用200mlSP结合缓冲液以5ml/分钟的流速进行洗涤，接着再用300ml50mM NaAC以5ml/分钟的流速进行洗涤。

结合在离子交换柱上的rhTNT-IL2抗体用磷酸缓冲液(50mM)以5ml/分钟的流速进行洗提。当A₂₈₀到达0.3时开始收集抗体，当A₂₈₀再降回到0.3时停止收集。

DEAE阴离子交换柱(Bio-Rad High Q，Cat#732-0026)先用100ml SWFI以5ml/分钟的流速进行洗涤，接着再用200ml磷酸缓冲液(50mM)5ml/分钟的流速进行平衡处理。

经过CM纯化后的rhTNT-IL2溶液以15ml/分钟的流速通过DEAE阳离子交换柱。当A₂₈₀达0.3时开始收集抗体，当A₂₈₀再降回到0.3时停止收集。

收集的rhTNT-IL2抗体取样后测定蛋白浓度。

实施例3

rhTNT-IL2融合蛋白的检测

(a)IL2效价测定

用常规的CTLL-2依赖细胞株/MTT比色法进行。方法如下：

(1)制备细胞悬液：取足量CTLL-2细胞(ATCC TIB-214)培养物离心收集，用基础液(RPMI1640+10％小牛血清)洗涤3次，然后重悬于基础培养液，配制成5×10⁵/ml的细胞悬液，放37℃保存。

(2)制备标准液：取1支标准品(2000IU)按说明书要求溶解后，用基础培养液稀释至200IU/ml。

(3)将待检样品(原液，按照1×10⁶IU/mg计算)用基础培养液稀释至200IU/ml。

(4)在96孔细胞培养板中，将配好的标准液(200IU/ml)和样品(200IU/ml)溶液继续以倍比稀释做梯度稀释，标准品和样品同做8个稀释度，每个梯度做3个复孔。

(5)加入细胞悬浮液并培养：每孔加入50ul细胞悬液，置37℃，5％CO2培养19小时。

(6)加入MTT并培养：每孔加入20ul MTT溶液，37℃，5％CO2培养5小时。

(7)加入裂解液并保温：每孔加入150ul裂解液，37℃保温20小时。

(8)在酶标仪上比色，测定波长570nm，记录测定结果。

(9)用计算机程序或直线回归计算法进行处理。分别计算各待检样品的半效稀释倍数(即从待检样本溶液至相当于标准品50％最大效应点的稀释倍数)，并按下列公式计算结果：

待检样品效价＝标准品效价×(待检样品预稀释倍数/标准品预稀释倍数)×(待检样品半效稀释倍数/标准品半效稀释倍数)

比活性计算：

所测的活性效价与其蛋白浓度之比即为比活性，其单位为IU/mg

检测结果如图2所示，IL2比活性4×10⁶IU/mg，与IL2标准品相近(白介素2的比活1×10⁷IU/mg)，两者相差2-3倍。

(b)rhTNT-IL2的特异结合活性

采用常规的“固定Raji细胞流式细胞仪检测”测定。方法如下：

(1)固定Raji细胞：

a.将培养的Raji细胞离心1000rpm 6分钟；

b.用PBS清洗1次1000rpm 6分钟；

c.将配好含有2％多聚甲醛的PBS加入Raji细胞中固定，室温15分钟，在此其间要不断地轻轻地吹打细胞；

d.15分钟后，离心1000rpm  6分钟；

e.去上清，加入含有0.02％叠氮钠的PBS中；

f.细胞计数，调节细胞浓度至6×10⁶/ml

(2)吸上述固定细胞，实验细胞所需量为每管2×10⁶，将细胞放入eppdorf管中，细胞离心1000rpm 6分钟，弃上清；

(3)加入一抗(即rhTNT-IL2融合蛋白浓度为1mg/ml的样品)，每管5ul，冰箱4℃保存，25分钟；

(4)加入PBS清洗2次，离心1000rpm 6分钟；

(5)离心弃上清，加入二抗(抗人IgG抗体-FITC偶联物，购自Sigma Co公司)2ul，避光保存4℃ 25分钟；

(6)用PBS清洗2次，准备上机作流式细胞仪检测。

实验结果如图3所示，特异结合活性分别为98.24％，98.27％和98.59％。

(c)分子量鉴定

用常规的5％、8％和15％的SDS-PAGE测定rhTNT-IL2融合蛋白的分子量。

结果如图4和图5所示。经计算，还原条件下，三批原液的分子量和纯度分别为：

0202重链61.17KD，轻链27.31KD，纯度100％

0203重链60.40KD，轻链27.31KD，纯度100％

0204重链62.35KD，轻链28.02KD，纯度100％

(d)纯度检测

用常规的HPLC法测定测定，条件如下：

色谱柱：Bio-Sil SEC 250 7.8×300mm

流动相：0.025M NaH₂PO₄，0.025M Na₂HPO₄，0.4M NaCIO₄ PH6.1

流速：1.0ml/min

检测：Waters 486 280nm

仪器：Waters HPLC 510

原液过滤后取样10ul进行HPLC分析。

测定结果表明纯度为97.40％。

(e)半衰期测定

取Wistar大鼠和猕猴两种动物测定¹²⁵I标记rhTNT-IL2的血药浓度时间-曲线。实验动物在受试前3天开始喂食碘溶液，以封闭甲状腺，该处理直至试验结束。试验设高、中、低3个剂量组，氯胺酮浅麻醉，给药体积为0.5ml。

猕猴给药剂量如下

高剂量组：10mg/kg，中剂量组：1mg/kg，低剂量组：0.1mg/kg

Wistar大鼠给药剂量如下

高剂量组：5mg/kg，中剂量组：0.5mg/kg，低剂量组：0.05mg/kg

在给药后30秒到96小时共设置10个时间点取血测定血药浓度。

检测方法：

将血样在5000rpm下离心10分钟，分离血浆，取10μl，测量沉淀前放射性计数率，然后以TCA沉淀，弃去上清液，测量沉淀后的放射性计数率，用γ放射免疫计数器测量放射性计数率，计算沉淀后与沉淀前放射性计数率之比为TCA沉淀率，同时以TCA沉淀后的放射性计数率，通过TCA沉淀后的标准曲线，得到受试药物浓度，绘制血药-浓度曲线。

数据处理

用DAS1.0软件拟合，Wistar大鼠和猕猴的血药浓度-时间曲线各点数据代入得到药物动力学的数学模型，并计算各参数，结果显示Wistar大鼠和猕猴体内的rhTNT-IL2平均半衰期分别为9-17小时和24-28小时。

         表1测定结果汇总表

蛋白含量	1.29mg/ml
		IL2比活性	4×106IU/mg
特异结合活性	合格
		SDS-PAGE纯度	100％
HPLC纯度	97.40％
		分子量	重链61.17KD
轻链27.31KD
	残留外源性DNA		合格
细菌内毒素含量		合格
	等电点		6.8

实施例4

在本实施例中，用类似实施例1-3中的方法制备含不同IgG亚类重链恒定区或IL2片段的融合蛋白，然后检测各融合蛋白的免疫学和生物学活性(见下表2)。其中，以实施例1的rhTNT-IL2(其IgG重链恒定区为IgG1亚类)为对照。

表2不同肿瘤坏死治疗单抗-白细胞介素2的融合蛋白的活性

IgG重链恒定区	IL2	IL2生物活性	融合蛋白抗原结合活性	融合蛋白作用后靶组织/正常组织血管通透性比值
					IgG1	全长	100％	100％	3.0
IgG2	全长	100％	100％	5.0
					IgG3	全长	100％	100％	5.0
IgG4	全长	100％	100％	3.0
					IgG1	IL2(Q22-C58)	20％	100％	10.0
IgG2	IL2(Q22-C58)	20％	100％	10.0
					IgG3	IL2(Q22-C58)	20％	100％	15.0
IgG4	IL2(Q22-C58)	20％	100％	5.0

实施例5

药物组合物

按制药领域中常用的混合法配制以下药物组合物。

单用rhTNT-IL2的配方：

白蛋白1％        1g/100ml

甘露醇5％        5g/100ml

土温80 0.02％    20mg/100ml

rhTNT-IL2        1mg/ml

缓冲液PBS

适应症：非小细胞肺癌。

rhTNT-IL2和5-氟尿嘧啶(5-Fu)的复方制剂配方：

5-氟尿嘧啶       500mg/100ml

白蛋白1％        1g/100ml

甘露醇5％        5g/100ml

土温80 0.02％    20mg/100ml

rhTNT-IL2        1mg/ml

缓冲液PBS

适应症：非小细胞肺癌、肝癌和肾细胞癌等多种实体瘤。

菌株保藏

本发明的小鼠骨髓瘤细胞株NSO-TNTIL2于2003年11月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为CCTCC No.200406。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                     序列表

<110>上海美恩生物技术有限公司

<120>肿瘤坏死治疗单抗-白细胞介素2的融合蛋白及其制法和用途

<130>041299

<160>11

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>6

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly

1               5

<210>2

<211>16

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1               5                   10                  15

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

Gly Lys Trp Ser Lys Phe Asp Tyr

1               5

<210>4

<211>111

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

1               5                   10                  15

Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile

            20                  25                  30

Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr His

        35                  40                  45

Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile

    50                  55                  60

Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val

65                  70                  75                  80

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Trp Ser

                85                  90                  95

Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

            100                 105                 110

<210>5

<211>11

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser

1               5                   10

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser

1               5

<210>7

<211>11

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val

1               5                   10

<210>8

<211>107

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr

1               5                   10                  15

Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser

            20                  25                  30

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly

        35                  40                  45

Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser

    50                  55                  60

Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Val Glu Asp

65                  70                  75                  80

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val

                85                  90                  95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105

<210>9

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(7)

<223>连接肽1

<400>9

Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ser

1               5

<210>10

<211>402

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>10

gcacttactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat     60

ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc    120

acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa    180

gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta     240

agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa     300

acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga     360

tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactaactt ga                        402

<210>11

<211>133

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>11

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

            20                  25                  30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65                  70                  75                  80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

                85                  90                  95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

            100                 105                 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

        115                 120                 125

Ile Ser Thr Leu Thr

    130

Claims (15)

1.一种融合蛋白，其特征在于，它包括：

(a)肿瘤坏死治疗单抗元件，该肿瘤坏死治疗单抗元件由抗体重链和抗体轻链通过二硫键连接形成，其中所述的抗体重链的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、2和3；

(b)白细胞介素2元件，该元件具有全长人白细胞介素2或其活性片段的氨基酸序列；以及

(c)位于肿瘤坏死治疗单抗元件中抗体重链和白细胞介素2元件之间的1-20个氨基酸的连接肽序列。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的抗体轻链的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：5、6和7；

所述的全长人白细胞介素2具有SEQ ID NO：11中第1-133位氨基酸序列，人白细胞介素2活性片段具有SEQ ID NO：11中第22-58位氨基酸序列；

所述的接头肽序列含3-10个氨基酸。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白中的抗体部分重链的可变区具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；轻链的可变区具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是由保藏号为CCTCC C200406的小鼠骨髓瘤细胞株NSO-TNTIL2产生的。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的抗体重链和抗体轻链为IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚类，且连接肽位于抗体重链的羧基端和白细胞介素2元件的氨基酸之间。

6.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述融合蛋白。

7.一种载体，其特征在于，它含有权利要求6所述的DNA分子。

8.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，它是小鼠骨髓瘤细胞株NSO-TNTIL2，保藏号为CCTCC C200406。

10.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤：

在表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和

分离所述的融合蛋白。

11.一种药物组合物，其特征在于，包括安全有效量的权利要求1所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂。

12.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，还含有选自下组的抗肿瘤药物：顺铂、5-Fu、氨甲蝶呤、IFN、TNF、氮芥、环磷酰胺、阿霉素、放线菌素D、长春新碱、喜树碱类或其组合。

13.权利要求1所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备治疗恶性实体瘤的药物。

14.一种融合多肽，其特征在于，它包括：

(a)肿瘤坏死治疗单抗的重链元件，所述抗体重链元件的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、2和3；

(b)白细胞介素2元件，该元件具有全长人白细胞介素2或其活性片段的氨基酸序列；以及

(c)位于肿瘤坏死治疗单抗元件中抗体重链和白细胞介素2元件之间的1-20个氨基酸的连接肽序列。

15.一种化合物，其特征在于，它由权利要求1所述的融合蛋白以及与所述融合蛋白偶联的PEG构成。

Images