CN107056940B

CN107056940B - 特异性结合到dll4的新型单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN107056940B
Application number: CN201610937490.7A
Authority: CN
Inventors: 金银娥; 朴商庆; 文庆德; 李东宪; 崔裕彬; 金东寅; 姜庆在
Original assignee: ABL Bio Inc
Current assignee: ABL Bio Inc
Priority date: 2012-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: KR101535341B1; CN104428319A; CN107056940A; EP2867259B1; US20150183856A1; CN104428319B; KR20140006713A; JP5982698B2; EP2867259A4; JP2015524390A; EP2867259A1; WO2014007513A1; US9598483B2

Abstract

本发明涉及特异性结合到delta样配体4(DLL4)的新型单克隆抗体，尤其涉及特异性结合到人delta样配体4以有效抑制delta样配体4和Notch受体间相互作用的单克隆抗体、编码该单克隆抗体的多核苷酸、包括该多核苷酸的表达载体、包括该表达载体的转化株、制备该单克隆抗体的方法、用于预防或治疗癌症的包括该单克隆抗体的药物组合物、包括该单克隆抗体的用于诊断癌症的组合物、使用该单克隆抗体诊断癌症的方法以及用于预防或治疗自身免疫性疾病的包括该单克隆抗体的药物组合物。

Description

特异性结合到DLL4的新型单克隆抗体及其应用

本申请是2013年7月2日提交的申请号为201380035510.6、发明名称为“特异性结合到DLL4的新型单克隆抗体及其应用”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及特异性结合到delta样配体4(DLL4)的新型单克隆抗体，尤其涉及特异性结合到人delta样配体4以有效抑制delta样配体4和Notch受体之间的结合的单克隆抗体、编码该单克隆抗体的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体、包含该表达载体的转化株、制备该单克隆抗体的方法、用于预防或治疗癌症的包含该单克隆抗体的药物组合物、包含该单克隆抗体的用于诊断癌症的组合物、使用该单克隆抗体诊断癌症的方法以及用于预防或治疗自身免疫性疾病的包含该单克隆抗体的药物组合物。

背景技术

据报道，Notch信号传导是脊椎动物和无脊椎动物进化上高度保守的，在发育初始阶段决定细胞命运上起着非常关键的作用。已知Notch信号传导是调节神经细胞、眼内细胞、淋巴细胞、肌细胞、血细胞等的分化的主要因素，也参与血管的发育。哺乳动物有四个Notch受体(Notch1、2、3和4)，且各Notch受体以300-350kDa 大小的蛋白质形式合成，并在高尔基体中被弗林样转化酶在S1位点裂解从而在细胞表面形成异质二聚体。此外，在哺乳动物中发现四个Notch配体(jagged-1/2和 delta样配体(DLL)1/3/4)。

Notch受体和配体均是膜蛋白且在两毗连细胞间的界面结合从而诱导Notch信号传导。当细胞互相接触时，胞外域直接互相接触以诱导信号传导，且出现根据配体和受体组合而不同的细胞反应。当配体和Notch受体在Notch信号传导中相互结合，Notch受体结构改变，然后经历两个连续的蛋白水解裂解。第一蛋白水解裂解开始于金属蛋白酶ADAM10/17(去整合素和金属蛋白酶10/17)/TACE(TNF-α转化酶)裂解胞外域(S2位点)。当S2位点裂解，Notch受体的跨膜区的S3位点接着被裂解。第二蛋白水解裂解由具有五个亚单位的γ-分泌酶复合物介导。γ-分泌酶复合物由早老素1、早老素2、nicastrin、Pen-2和Aph1组成。两蛋白水解裂解后，Notch 胞内域(NICD)释放并迁移入细胞核。在细胞核内，NICD结合到转录抑制因子CSL (CBF-1/无毛抑制因子/Lag-1)以替代已结合到CSL的辅抑制物(CoR)。NICD/CSL复合物募集共活化剂(CoA)MAML(mastermind样)或p300从而激活和诱导Notch 靶基因的表达，如细胞周期蛋白D1、p21、NF-κB、c-Myc、pre-Ta(前T细胞受体α链)、GATA3、NRARP和Deltex1。

已知激活的Notch信号传导在各种肿瘤模型中诱导肿瘤发生。当激活的NotchNICD在大鼠造血细胞内表达时，T细胞白血病/淋巴瘤发生，在约50％的T-ALL(T 细胞急性成淋巴细胞白血病)中发现约50％激活的Notch 1(Weng AP等,Science 2004；306:71-269)。此外，对于乳腺癌，发现Notch 4受体在引入MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)的大鼠(CzechII)内过表达，并报道在这些大鼠中发现乳腺肿瘤(Gallahan D 等,Journal of Virology1987；61:66-74)。据报道Notch受体和配体及Notch信号传导靶在各种癌症中被激活，如宫颈癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌 (Miele L等,Clin Cancer Research2006；12(4):1074-79)，且已知Notch 1受体与乳腺癌患者糟糕的预后相关(Reedijk M等,Cancer Reserach 2005；65:8530-7)，且与前列腺癌的转移相关(Santagata S等,CancerResearch 2004；64:6854-7)。

Delta样4(Dl4)或delta样配体4(DLL4)(下文称为"DLL4")是结合到血管内皮细胞中过表达的Notch蛋白的delta类配体之一。已知为调节血管生成的主要因素。 DLL4特别结合到血管内皮细胞中过表达的Notch 1或Notch 4受体。已知DLL4 在肿瘤血管中高度过表达，尽管它也在正常血管内表达(Reinacher-Schick A等,Nat Clin Pract GastroenterolHepatol 2008；5(5):250-67)。血管生成是指从已存在的血管形成新血管的机制。特别地，在肿瘤中，通过血管生成因子如VEGF引发血管生成从而提供氧气和营养物到肿瘤组织的缺氧区。已知肿瘤内的血管生成不仅在肿瘤生长而且在肿瘤转移中起着重要作用。当肿瘤内DLL4所致的Notch信号传导被阻断，不容易控制血管生成，因此可以抑制肿瘤生长。此外，当DLL4所致的Notch 信号传导被抑制，可以通过增加调节T细胞(Treg)的数量治疗自身免疫性疾病(US 专利公布号：2011-0189200)。基于这些原因，DLL4成为治疗癌症和自身免疫疾病的新靶标。

为通过靶向DLL4治疗癌症或自身免疫疾病，已经开展了对对各种不同部分中抑制Notch信号传导的研究。其中的实例包括干扰Notch/配体结合的受体诱饵，参与Notch信号传导中Notch蛋白裂解的γ-分泌酶抑制剂，以及用于抑制参与Notch 信号传导的蛋白或Notch靶基因的miRNA或siRNA。在这些各种不同的抑制Notch 信号传导的方法中，对结合Notch配体的、能在Notch信号传导初期起作用的单克隆抗体的研究已经越来越重要。特别地，为临床研究，已经需要开发可以特异性结合到人DLL4并在最大程度降低免疫原性的风险的同时有效抑制DLL4/Notch受体相互作用的人单克隆抗体。

发明内容

技术问题

因此，本发明人已付出大量劳动以开发能够特异性结合到人DLL4且同时能够有效抑制DLL4/Notch受体相互作用并可以最大程度降低免疫原性风险的人单克隆抗体。结果本发明人已经构建出特异性结合到人DLL4的人单克隆抗体，其中重链和轻链区全部是来自人抗生素库的人源的，且已经发现该人单克隆抗体可以有效抑制DLL4和Notch蛋白间的相互作用，因此可以有效用于治疗如癌症等疾病，从而完成本发明。

技术问题的解决方案

本发明的目的在于提供一种新型的单克隆抗体，该单克隆抗体特异性结合到人delta样配体4(DLL4)且同时抑制人delta样配体4和Notch受体间的相互作用。

本发明的另一目的在于提供编码上述单克隆抗体的多核苷酸，包括该多核苷酸的表达载体以及包括该表达载体的转化株。

本发明的再一目的在于提供制备上述单克隆抗体的方法。

本发明的再一目的在于提供包含上述单克隆抗体的用于治疗癌症的药物组合物。

本发明的再一目的在于提供使用上述单克隆抗体治疗癌症的方法。

本发明的再一目的在于提供用于诊断癌症的方法，该方法包括采用上述单克隆抗体，通过抗原-抗体反应检测从疑似具有癌症的患者分离的生物样本中 delta样配体4(DLL4)蛋白的步骤。

本发明的再一目的在于提供包含上述单克隆抗体的用于诊断癌症的组合物。

本发明的再一目的在于提供包括上述用于诊断癌症的组合物的诊断癌症的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供包含上述单克隆抗体的用于治疗自身免疫疾病的药物组合物。

本发明的再一目的在于提供一种使用上述单克隆抗体的用于治疗自身免疫疾病的方法。

有益效果

本发明的人单克隆抗体对人DLL4显示出强亲和力，并有效抑制DLL4结合到 Notch受体，且显示出低免疫原性，因其重链和轻链区全部是人源的。因此，本发明的人单克隆抗体可以有效用于诊断和治疗疾病，如癌症或自身免疫疾病。

附图说明

图1示出DLL4的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。在图 1中，框是指框架区，CDR是指互补决定区。

图2示出为检测单克隆抗体与DLL4结合能力而实施的酶联免疫吸附测试(ELISA)结果。

图3示出为检测HEK293细胞中单克隆抗体与DLL4结合能力而实施的流式细胞术结果，其中DLL4在HEK293细胞中人为过表达((a)MLCK-1；(b)MLCK-2； (c)MLCK-3；(d)MLCK-4)。

图4示出为检测单克隆抗体中和DLL4的能力而实施的ELISA结果。

图5示出通过使用Biacore装置检测抗原DLL4和本发明的抗DLL4抗体 MLCK-1、MLCK-2、MLCK-3和MLCK-4的亲合力的结果。

图6表明抗DLL4抗体MLCK-2阻断DLL4介导的HUVEC增殖抑制。

图7示出免疫印迹结果，表明抗DLL4抗体MLCK-2通过破坏DLL4和Notch 之间的相互作用抑制Notch信号传导。

本发明的最佳实施方式

在一方面，本发明提供一种新型的单克隆抗体，尤其一种人单克隆抗体，它特异性结合到人delta样配体4(DLL4)，同时抑制人delta样配体4和Notch受体间的相互作用

如本文所用，术语"抗体"是指起到特异性识别抗原的受体作用的蛋白分子，包括与特定抗原免疫反应的免疫球蛋白分子。该术语还包括多克隆抗体、单克隆抗体、全抗体和抗体片段。此外，该术语还包括嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、二价或双特异分子(例如，双特异抗体)、双链抗体、三链抗体和四链抗体。全抗体具有两全长轻链和两全长重链，各轻链通过二硫键连接到重链。全抗体包括IgA、IgD、 IgE、IgM和IgG，IgG具有包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄在内的亚型。抗体片段是指具有结合抗原作用的片段，包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv。Fab具有轻链和重链可变区、轻链恒定区和第一重链恒定区(CH1域)，并包括一抗原结合位点。Fab' 与Fab的不同在于它具有铰链区，在重链CH1域的C末端区至少包括半胱氨酸残基。通过Fab'铰链区的半胱氨酸残基间的二硫键制备F(ab')₂抗体。Fv(可变片段) 是指仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链Fv(dsFv)具有通过二硫键连接到轻链可变区的重链可变区，单链Fv(scFv)通常具有通过肽接头连接到轻链可变区的重链可变区。可以使用蛋白酶获得此类抗体片段(例如，可以通过用木瓜蛋白酶裂解全抗体获得Fab片段，可以通过胃蛋白酶裂解全抗体获得F(ab')₂片段)。优选地，可以通过基因重组技术构建抗体片段。

如本文所用，术语"单克隆抗体"是指具有单一分子组成的抗体分子，获自一群基本相同的抗体。该单克隆抗体显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。

典型地，免疫球蛋白具有重链和轻链。各重链和轻链包含恒定区和可变区(区域也称为"域")。轻链和重链可变区包含四个框架区，被三个超变区打断，也称为" 互补决定区"(下文称为"CDR")。CDR主要负责结合到抗原的表位。各链的CDR 通常为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始连续编号，通常也用特定CDR所处的链标识。

如本文所用，术语"人抗体"是指源自人免疫球蛋白的分子，其中，包括互补决定区和框架区的抗体的全长氨基酸序列由人免疫球蛋白的氨基酸序列构成。人抗体通常用于治疗人类疾病且可以具有三个或多个有益效果。首先，人抗体可以更容易与人免疫系统作用以致可以通过，例如补体依赖性细胞毒性反应(CDC)或抗体依赖细胞介导的细胞毒性反应(ADCC)更有效地破坏靶细胞。第二，效果在于人免疫系统不会将该抗体识别为外来抗体。第三，效果在于，即使以较小量以较低频率施用抗体，它在人循环系统中的半衰期与天然产生的抗体的半衰期相似。因此，本发明的人单克隆抗体显示对DLL4的强亲和力，有效抑制Notch 1或Notch 4受体结合到表达DLL4的细胞(如癌细胞)，还显示低免疫原性，因为它的重链和轻链区域全部是人源的。因此，本发明的单克隆抗体可以有效用于治疗如癌症或自身免疫疾病等疾病。

如本文所用，短语"特异性结合人delta样配体4(DLL4)的单克隆抗体"是指可以结合到DLL4从而抑制DLL4生物活性的抗体，在本发明中它可以与“抗-DLL4 抗体”交换使用。特异性结合到DLL4的单克隆抗体没有限制，只要它特异性结合到DLL4从而抑制DLL4和Notch受体间的相互作用。单克隆抗体的实例包括如上所述的全抗体和抗体片段。本发明的单克隆抗体可以特异性结合到人DLL4同时抑制DLL4和Notch蛋白间的相互作用，因此可以有效用于治疗涉及Notch信号传导的疾病，如癌症或自身免疫疾病。

特异性结合到DLL4的单克隆抗体可以优选为这样一种单克隆抗体，它包含 SEQID NO:2所示的重链CDR1，并特异性结合到DLL4，但不限于此。

包含SEQ ID NO:2所示重链CDR1的单克隆抗体可以优选为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，重链可变区包括SEQ ID NO:2所示的重链CDR1、SEQ ID NO:3所示的重链CDR2和SEQ ID NO:4所示的重链CDR3；轻链可变区包括SEQ ID NO:16所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:17所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:18所示的轻链CDR3。更优选地，包含SEQ IDNO:2所示重链CDR1的单克隆抗体可以为包括SEQ ID NO:1所示重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:15所示轻链可变区氨基酸序列的单克隆抗体，但不限于此。在本发明的实施例中，包括具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链可变区的人单克隆抗体命名为"MLCK-1"。

此外，包含SEQ ID NO:2所示重链CDR1的单克隆抗体可以优选为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，重链可变区包括SEQ ID NO:2所示的重链 CDR1、SEQ ID NO:6所示的重链CDR2和SEQ ID NO:7所示的重链CDR3；轻链可变区包括SEQ ID NO:20所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:21所示的轻链CDR2 和SEQ ID NO:22所示的轻链CDR3。更优选地，包含SEQ ID NO:2所示重链CDR1 的单克隆抗体可以为包括SEQ ID NO:5所示重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO: 19所示轻链可变区氨基酸序列的单克隆抗体，但不限于此。在本发明的实施例中，包括具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的重链可变区和 SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区的人单克隆抗体命名为“MLCK-2”。

此外，包括SEQ ID NO:2所示重链CDR1的单克隆抗体可以优选是包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，重链可变区包括SEQ ID NO:2所示的重链 CDR1、SEQ ID NO:9所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3；轻链可变区包括SEQ ID NO:24所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:25所示的轻链CDR2 和SEQ ID NO:26所示的轻链CDR3。更优选地，包含SEQ ID NO:2所示重链CDR1 的单克隆抗体可以为包括SEQ ID NO:8所示重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO: 23所示轻链可变区氨基酸序列的单克隆抗体，但不限于此。在本发明的实施例中，包括具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链可变区和 SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的轻链可变区的人单克隆抗体命名为"MLCK-3"。

此外，特异性结合到DLL4的单克隆抗体可以优选为包括重链可变区和轻链可变区的单克隆抗体，重链可变区包括SEQ ID NO:12所示的重链CDR1、SEQ ID NO: 13所示的重链CDR2和SEQ ID NO:14所示的重链CDR3；轻链可变区包括SEQ ID NO:28所示的轻链CDR1、SEQID NO:29所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:30所示的轻链CDR3。更优选地，它可以为包括SEQID NO:11所示重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:27所示轻链可变区氨基酸序列的单克隆抗体，但不限于此。在本发明的实施例中，包括具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的轻链可变区的人单克隆抗体命名为 "MLCK-4"。

MLCK-1、MLCK-2、MLCK-3和MLCK-4重链和轻链可变区的序列如图1所示。

当本发明的人单克隆抗体包括恒定区时，它可以包括源自IgG、IgA、IgD、IgE、 IgM的恒定区或它们的组合或杂交体。

如本文所用，术语"组合"是指编码同一来源的单链免疫球蛋白恒定区的多肽连接到不同来源的单链多肽从而形成二聚体或多聚体。例如，二聚体或多聚体可由两个或多个选自下组的恒定区形成：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM恒定区。

如本文所用，术语"杂交体"是指编码不同来源的两个或多个免疫球蛋白重链恒定区的序列出现在单链免疫球蛋白重链恒定区。例如，结构域杂交体可以由选自下组的1-4个结构域构成：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的CH1、CH2、CH3和 CH4。

同时，作为IgG亚型的IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄重链可变区的组合或杂交体也是可能的。这些组合或杂交体如前所示。IgG₁重链恒定区可以是SEQ ID NO:31 所示IgG₁重链恒定区；IgG₂重链恒定区可以是SEQ ID NO:32所示 IgG₂重链恒定区；IgG₃重链恒定区可以是SEQID NO:33所示IgG₃重链恒定区；和IgG₄重链恒定区可以是SEQ ID NO:34所示IgG₄重链恒定区，但本发明的范围不限于此。

此外，当特异性结合到DLL4的单克隆抗体包括轻链恒定区时，轻链恒定区可以是拉姆达(λ)或卡帕(κ)轻链来源。当单克隆抗体的轻链恒定区是λ轻链来源时，它可以是SEQID NO:35所示λ轻链恒定区，但不限于此。

如本文所用，术语"delta样配体4(DLL4)"是指结合到Notch受体的delta类配体之一，优选是指结合到Notch 1或Notch 2的蛋白，但不限于此。DLL4可以是任何哺乳动物DLL4，但优选人DLL4。为本发明的目的，DLL4可以指可以结合到癌细胞或血管内皮细胞内表达的Notch 1或4受体从而诱导癌症生长或诱导自身免疫疾病的进展的蛋白，但不限于此。

已知DLL4在包括肿瘤血管在内的各种不同肿瘤细胞内过表达，并在癌症模型的肿瘤内通过增强血管功能参与癌症的扩散和转移。此外，已知抑制DLL4可以治疗自身免疫疾病。

DLL4蛋白包括，但不限于，野生型或突变型DLL4蛋白。本文所用的术语野生型DLL4蛋白通常是指包括野生型DLL4蛋白的氨基酸序列的多肽，短语野生型 DLL4蛋白的氨基酸序列通常是指在天然产生的DLL4中发现的氨基酸序列。关于 DLL4的信息可由已知的数据库获得，包括国立卫生研究院的基因库，可以是，但不限于，例如，基因库登记号NM_019074.3(Gene ID:54567)。

如本文所用，术语"Notch受体"是指介导Notch信号传导的蛋白，可以与Notch 互换使用。Notch受体可以是介导Notch信号传导的任何蛋白。优选地，Notch受体可以是Notch1或Notch 4受体，但不限于此。为本发明的目的，Notch受体可以是结合到哺乳动物DLL4的任何蛋白，但优选是结合到人DLL4的蛋白。如本文所用，术语"Notch"是指包括全部野生型Notch或突变型Notch蛋白。如本文所用，术语"野生型Notch"是指包括野生型Notch蛋白的氨基酸序列的多肽，短语"野生型Notch蛋白的氨基酸序列"通常是指在天然产生的Notch受体中发现的氨基酸序列。

如本文所用，短语"抑制人delta样配体4和Notch受体间相互作用"是指本发明的DLL4特异性单克隆抗体结合到DLL4从而抑制DLL4和Notch受体间相互作用。优选地，该短语是指DLL4特异性单克隆抗体结合到DLL4从而抑制DLL4和 Notch 1或Notch 4受体间相互作用，但不限于此。本发明的DLL4特异性单克隆抗体通过结合DLL4抑制DLL4和Notch受体间相互作用从而防止 Notch受体的结构改变。因此，它阻止Notch蛋白水解从而抑制Notch信号传导。已知当在肿瘤内DLL4结合到Notch受体时，它激活血管内皮细胞间的信号传导或肿瘤干细胞和血管内皮细胞间的Notch信号传导，增大血管的大小并增强肿瘤内的血管功能，从而在肿瘤扩散和转移中起作用(Ji-Liang Li等,Cancer Res 2007； 67(23):11244-53)。因此，当肿瘤内DLL4所致的Notch信号传导被抑制，血管生成不易控制，因此可以抑制肿瘤生长。此外，当DLL4被阻断，在血管生成位点末端的细胞内侧抑制的损失看来导致过度(血管)萌发，导致具有低产率的血管生成反应减少，可以减少供氧灌注以在肿瘤周围引起缺氧，导致抗肿瘤效果，甚至是对抗 VEGF治疗显示出耐受性的肿瘤(Noquera-Troise I等,Novartis Found Symp 2007；283:106-20)。因此有效抑制DLL4和Notch间相互作用的本发明DLL4特异性人单克隆抗体可以有效用于治疗癌症。此外，已知抑制DLL4可以促进调节T细胞的发育从而缓解自身免疫疾病如脑脊髓炎(Bassil等,J Immunol 2011；187(5)；2322-8)。此外已知DLL4拮抗剂可以用于治疗自身免疫疾病(US专利公布号：2011-0189200)和DLL4结合蛋白如抗体可以用于治疗自身免疫疾病(US 专利公布号：2011-0117079)。因此，有效结合到DLL4从而抑制DLL4和Notch受体之间相互作用的本发明抗体也可以有效用于治疗自身免疫性疾病。

在本发明的实施例中，构建DLL4-特异性人单克隆抗体MLCK-1、MLCK-2、 MLCK-3和MLCK-4，观察到与对照相比，这些抗体与人DLL4的结合能力分别为 47.82％、59％、52.85％和52.46％(图3)，这些抗体在0.1μM的低抗体浓度下阻断 DLL4和人Notch 1受体间的大部分结合(图4)。此外，本发明的抗-DLL4抗体， MLCK-1、MLCK-2、MLCK-3和MLCK-4对hDLL4的K_D(M)分别为2.63X10^-7M、 1.71x10^-9M、6.96X10^-9M和2.13X10^-6M(图5)。另外，DLL4(抗体)以浓度依赖方式抑制血管内皮细胞的增殖(图6)。另外，DLL4-Notch信号传导的激活导致抑制NICD产生(图7)，这些结果表明本发明的DLL4特异性人单克隆抗体可以通过有效阻断DLL4和Notch受体间结合和通过抑制Notch信号传导提供抗癌效果和对自身免疫疾病的治疗效果。

在另一方面，本发明提供制备上述单克隆抗体的方法。

使用传统的单克隆抗体生产技术可容易制备本发明的单克隆抗体。例如，可以通过使用获自免疫动物的B淋巴细胞产生杂交瘤(Koeher和Milstein,1976,Nature, 256:495)，或可以通过使用噬菌体展示技术实施制备单克隆抗体的方法，但不限于此。

使用噬菌体展示的抗体库是采用直接获自B淋巴细胞的抗体基因在噬菌体表面表达抗体的方法，不需要制备杂交瘤。与由B细胞永生化生成单克隆抗体相关的许多难点可以通过噬菌体展示方法克服。传统的噬菌体展示包括步骤：1)将具有随机序列的寡核苷酸插入噬菌体外壳蛋白pIII(或pIV)N末端对应的区域；2)表达由所述具有随机序列的寡核苷酸编码的多肽和天然外壳蛋白的融合蛋白；3)处理能够结合到由所述寡核苷酸编码的多肽的受体材料；4)使用低pH或具有结合竞争力的分子洗脱结合到受体的肽-噬菌体颗粒；5)通过淘选在宿主细胞内扩增洗脱的噬菌体；6)重复所述步骤从而获得所需量的噬菌体；和7)采用由淘选选择的噬菌体克隆DNA序列检测活性肽的序列。

在优选的实施方式中，可通过噬菌体展示方法实施制备本发明单克隆抗体的方法。本发明所属领域的技术人员可以参考，例如在Barbas等(《方法：酶学方法指南》(METHODS:A Companion to Methods in Enzymology)2:119,1991和J.Virol. 2001Jul；75(14):6692-9)和Winter等(Ann.Rev.Immunol.12:433,1994)中公开的已知噬菌体展示技术容易地实施以上步骤。可以用于构建抗体库的噬菌体的实例包括，但不限于，丝状噬菌体如fd、M13、f1、If1、Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pf1和Pf3。此外，可以用于在丝状噬菌体表面表达异源基因的载体的实例包括，但不限于，噬菌体载体如fUSE5、fAFF1、fd-CAT1或fdtetDOG，或噬菌粒载体如 pHEN1、pComb3、pComb8或pSEX。此外，可以用于提供成功再感染重组噬菌体所需的天然外壳蛋白的辅助噬菌体的实例包括，但不限于M13K07和VSCM13。

使用常规方法可以容易分离编码本发明杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示克隆的多核苷酸并测序(例如通过使用设计用于从杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重链和轻链区域的寡核苷酸引物)。一旦分离多核苷酸，它可以置于表达载体内，然后转染入合适的宿主细胞，可以从转化的宿主细胞(即转化株)制备所需单克隆抗体。因此，用于制备本发明的人单克隆抗体的方法包括扩增含有编码人单克隆抗体的多核苷酸的表达载体的步骤，但不限于此。

在另一方面，本发明提供编码单克隆抗体的多核苷酸，包括该多核苷酸的表达载体和包括该表达载体的转化株。

单克隆抗体如上所述。

本发明的包括编码单克隆抗体的多核苷酸的表达载体没有特别限制，但可以是能在包括哺乳动物细胞(例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠细胞)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))在内的真核或原核细胞内复制和/或表达多核苷酸的载体。较佳地，它可以是载体，包括至少一选择性标记，可操作地连接到合适的启动子，以致可以在宿主细胞内表达多核苷酸。例如，载体可以包括导入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或反转录病毒载体的多核苷酸。

包括编码多核苷酸的多核苷酸的表达载体可以是包括单克隆抗体的重链或轻链的表达载体，或是包括编码单克隆抗体的重链或轻链的多核苷酸的表达载体。

导入本发明的表达载体从而形成转化株的细胞包括细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；酵母细胞；真菌细胞如毕赤酵母(Pichia pastoris)；昆虫细胞如果蝇或夜蛾Sf9细胞；动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，SP2/0(小鼠骨髓瘤)，人淋巴样母细胞，COS，NSO (小鼠骨髓瘤)，293T，Bowes黑素瘤细胞，HT-1080，BHK(幼仓鼠肾细胞)，HEK (人胚肾细胞)，PERC.6(人视网膜细胞)等；和植物细胞。

如本文所用，术语"导入"是指将包括编码单克隆抗体的多核苷酸的载体递送入宿主细胞。此导入可以通过本领域中已知的各种方法，包括磷酸钙-DNA共沉淀， DEAE-葡聚糖介导的转染，聚凝胺介导的转染，电穿孔，显微注射，脂质体介导的转染，脂质体融合，脂转染和原生质体融合进行。此外，转染是指用病毒颗粒通过感染将期望材料递送入细胞。此外，该载体可以通过基因轰击导入宿主细胞。在本发明中，导入与转染可以互换使用。

在另一方面，本发明提供用于预防或治疗癌症的包括单克隆抗体的药物组合物。

本发明的单克隆抗体可结合DLL4以抑制DLL4和Notch受体间相互作用，从而它可以参与抑制癌症生长。这里，DLL4和Notch受体如上所述。

如本文所用，术语"癌症"是指可以由本发明单克隆抗体治疗的任何类型的癌症。可以由单克隆抗体治疗的癌症的例子，包括，但不限于，食道癌，胃癌，大肠癌，直肠癌，口腔癌，咽癌，喉癌，肺癌，结肠癌，乳腺癌，子宫颈癌，子宫内膜癌，卵巢癌，前列腺癌，睾丸癌，膀胱癌，肾癌，肝癌，胰腺癌，骨癌，结缔组织癌，皮肤癌，脑癌，甲状腺癌，白血病，霍奇金病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤和血液肿瘤。

如本文所用，术语“预防”是指通过施用该组合物抑制或延缓癌症发展的所有行为，术语“治疗”是指通过施用该组合物恢复或有益改变癌症症状的所有行为。

该药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不会对生物体引起显著刺激且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。

可用于将本发明组合物配制为液体溶液形式的药学上可接受的载体包括生理盐水，无菌水，林格氏溶液，缓冲盐溶液，葡萄糖溶液，麦芽糊精溶液，甘油，乙醇，和其中两种或更多种的混合物。如果需要，本发明的组合物也可含有其它常规添加剂，如抗氧化剂，缓冲剂和抑菌剂。此外，本发明组合物还可包含稀释剂，分散剂，表面活性剂，粘合剂和润滑剂，以将它配置成可注射制剂，如水性溶液，悬浮液和乳剂，丸剂，胶囊剂，颗粒剂和片剂。

药物组合物可以是各种口服或胃肠外制剂形式。使用包括填料，填充剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂，和表面活性剂在内的常规稀释剂或赋形剂配制药物组合物。固体口服制剂包括片剂，丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊等。这些固体制剂可通过将至少一种化合物与一种或多种赋形剂，例如，淀粉，碳酸钙，蔗糖，乳糖，明胶等混合来制备。除了简单的赋形剂，也可使用润滑剂如硬脂酸镁或滑石。此外，液体口服制剂包括悬浮液，溶液，乳剂和糖浆等。除了通常用作简单稀释剂的水和液体石蜡外，还可包括各种赋形剂，例如，润湿剂，甜味剂，香料，防腐剂等。肠胃外给药的制剂包括灭菌水溶液，非水溶剂，悬浮剂，乳剂，冻干剂，栓剂等。丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射酯如油酸乙酯等可以用作非水溶剂和悬浮剂。栓剂主要成分可以包括witepsol，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂脂，甘油明胶等。

药物组合物可具有选自下组的任意一种制剂：片剂，丸剂，粉末，颗粒，胶囊，悬浮液，溶液，乳剂，糖浆，灭菌水溶液，非水溶液，悬浮液，乳液，冻干制剂和栓剂。

本发明的药物组合物可以药学有效量施用。

如本文所用，术语“药学有效量”是指其用量足以治疗疾病，以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比率。组合物的有效剂量水平可以根据受试者的类型、疾病的严重程度、受试者的年龄和性别、药物活性、对药物的敏感性、给药时间，给药途径、排泄率、治疗时间、与组合物联用的药物和医疗领域中其他已知因素来确定。本发明的药物组合物可单独使用或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规的治疗剂依次或同时给药。可采用一种或多种剂型中施用组合物。考虑所有上述因素，在能够表现出最大效果而不引起副作用的最小量下施用组合物至关重要，该最小量可由本领域技术人员容易地确定。

在另一个方面，本发明提供了使用该单克隆抗体治疗癌症的方法。

在另一方面，本发明提供使用单克隆抗体用于治疗癌症的方法。

此处的单克隆抗体和癌症都如上所述。

用于治疗癌症的方法可以包括对患有癌症或怀疑患有癌症的对象施用包含单克隆抗体和药学上可接受的载体的药物组合物的步骤。在这方面，药学上可接受的载体如上所述。对象实例包括哺乳动物，包括牛，猪，羊，鸡，狗和人。对象可以是有待通过施用本发明的组合物来治疗癌症的任何对象。

可采用一种或多种剂型给予治疗有效量的组合物。在此，该组合物可以液体，粉末，气雾剂，胶囊，肠溶包衣片剂或胶囊剂，或栓剂的形式施用。此外，该组合物可以腹膜内，静脉内，肌内，皮下，皮内，经口，鼻内，肺内或直肠内施用，但不限于此。然而，当组合物口服给药时，肽在胃中消化，并且因为这个原因，应将口服组合物配制成包衣或保护活性成分以防在胃中分解。此外，可使用能够递送活性成分到靶细胞的任何系统施用该药物组合物。

在另一方面，本发明提供用于诊断癌症的方法，该方法包括利用上述单克隆抗体通过抗原-抗体反应检测分离自怀疑患有癌症的对象的生物样品中delta样配体 4(DLL4)蛋白的步骤。

此处的单克隆抗体，癌症，个体和DLL4蛋白如上所述。

在诊断癌症的方法中，可以通过本发明的DLL4特异性单克隆抗体与分离自怀疑患有癌症的个体的生物样本反应和检测抗原-抗体复合物的形成来检测 DLL4蛋白，由此可以提供诊断癌症的信息或可以诊断癌症。因为在包括卵巢癌细胞在内的各种癌细胞中DLL4过表达(Wei Hu等,Cancer Res 2011；71:6030-6039.)，可以通过比较生物样本和对照组如正常细胞或组织中 DLL4表达水平来诊断癌症，但不限于此。

具体地，诊断癌症的方法可以是为癌症诊断提供信息的方法或诊断癌症的方法，该方法包括以下步骤：(a)采用上述单克隆抗体处理分离自怀疑患有癌症的对象的生物样品，以通过抗原-抗体反应检测DLL4蛋白；和(b)比较步骤 (a)中检测的DLL4蛋白的水平和对照组的DLL4蛋白的水平，如果生物样品中 DLL4蛋白水平比对照组高，判断对象患有癌症。

如本文所用，术语“生物样品”是指包括组织，细胞，全血，血清，血浆，组织尸检样品(脑，皮肤，淋巴结，脊髓等)，细胞培养上清，破裂的真核细胞，以及细菌表达组织，但不限于此。这些生物样品可以在操作或非操作状态与本发明的单克隆抗体反应，以确定DLL4蛋白质的存在，或存在或不存在癌症。

如本文所用，术语“抗原-抗体复合物”是指样品中DLL4蛋白抗原和识别该DLL4蛋白抗原的本发明单克隆抗体的结合物。可以通过选自下组的任何方法检测该抗原-抗体复合物的形成：比色法，电化学法，荧光法，发光法，粒子计数法，视觉评估和闪烁计数法，但不限于此，并且各种方法都可以使用。

在本发明中，各种标记可用于检测抗原-抗体复合物。标记的具体例子包括，但不限于，酶，荧光材料，配体，发光材料，微粒，和放射性同位素。

用作检测标记的酶的例子包括乙酰胆碱酯酶，碱性磷酸酶，β-D-半乳糖苷酶，辣根过氧化物酶，β-内酰胺酶。荧光材料的实例包括Eu³⁺、Eu³⁺螯合剂、穴状化合物等。配体的实例包括生物素衍生物和类似物，发光材料的实例包括吖啶酯，异鲁米诺衍生物等。此外，微粒的例子包括胶体金，有色胶乳等等，和放射性同位素的实例包括⁵⁷Co、³H、¹²⁵I和¹²⁵I-巴顿亨特试剂(¹²⁵I-Bonton Hunter reagent)。

优选地，可通过ELISA方法检测抗原-抗体复合物。ELISA法的实例包括使用识别附着于固体载体上的抗原的标记抗体的直接ELISA，使用识别抗体复合物(识别附着于固体支持物的抗原)内的捕获抗体的标记二抗的间接ELISA，包括使用标记抗体从而识别附着于固体支持物的抗原-抗体复合物内抗原的直接夹心ELISA，以及包括附着于固体支持物的抗原-抗体复合物内的抗原与抗体反应随后标记二抗与反应抗体反应的间接夹心ELISA。

单克隆抗体可以具有检测标记。如果该单克隆抗体不具有检测标记，它可被捕获并通过用具有检测标记的另一抗体处理来检测。

在另一方面，本发明提供包括上述单克隆抗体的用于诊断癌症的组合物。

此处的单克隆抗体和癌症如上所述。

包括本发明DLL4特异性单克隆抗体的诊断组合物可以用于诊断DLL4的表达、与DLL4的表达水平相关的疾病或DLL4介导的疾病如癌症。

在又一方面，本发明提供包括上述诊断组合物的用于诊断癌症的试剂盒。

此处的组合物和癌症如上所述。

此外，用于诊断癌症的试剂盒还可包括组合物、溶剂或装置，其具有适用于分析的一种或多种其他组分。

在又一方面，本发明提供包括上述单克隆抗体的用于预防或治疗自身免疫疾病的药物组合物。

此处的单克隆抗体、预防和治疗如上所述。此外，药物组合物还可包括药学上可接受的载体。此处的药学上可接受的载体如上所述。

如本文所用，术语"自身免疫疾病"统一是指由对患病对象的抗原的免疫反应直接或间接导致的疾病。自身免疫疾病的实例包括类风湿性关节炎、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、过敏性皮炎、牛皮癣、斑秃、哮喘、克罗恩氏病、白塞病(Behcet's disease)、斯耶格仑综合征(Sjogren’s syndrome)、格-巴二氏综合征(Gillaine-Barre syndrome)、慢性甲状腺炎、多发性硬化症、多肌炎、强直性脊柱炎、脑脊髓炎、纤维组织炎和结节性多动脉炎。

如上所述，本发明的DLL4特异性人单克隆抗体可以促进调节T细胞的发育，因此可以用于治疗自身免疫疾病。

在又一方面，本发明提供使用上述单克隆抗体治疗自身免疫疾病的方法。

特别地，用于治疗自身免疫疾病的方法可包括对患有或疑似患有自身免疫疾病的对象施以包括单克隆抗体和药学上可接受的载体的药物组合物的步骤。此处的自身免疫疾病、对象和药学上可接受的载体如上所述。

发明实例

以下，将参考实施例更详细地描述本发明。但是应理解，这些实施例仅用作描述的目的，并不是为了限制本发明的范围。

实施例1：抗DLL4抗体的制备

实施例1-1：DLL4抗原的制备

用于本实施例的人DLL4胞外域的抗原是购自R&D系统(R&D System)的人 DLL4蛋白(目录：1506-D4/CF)。DLL4抗原蛋白包括DLL4的第27到第522位氨基酸残基。此外，蛋白的C末端附以组氨酸标签。

然后，制备DLL4胞外域的特异性区域的另一抗原。特异性区域包括DLL4的第27到第251位氨基酸残基。该区域包括已知与Notch 1受体结合的称为 delta/serrate/lag-2(DSL)结构域的基序(Tax等,1994,Nature 368:150-4)。采用标准重组DNA技术制备哺乳动物表达质粒载体，该载体包括编码与Fc蛋白融合的DLL4 胞外域的缺失片段的多核苷酸以及上游的CMV启动子。还通过使用标准重组DNA 技术制备编码DLL4的缺失片段(与Fc蛋白融合的人DLL4的嵌合体)的其他构建体。包括与Fc蛋白融合的人DLL4第27到251位氨基酸残基的重组融合蛋白瞬时转染HEK 293E细胞并在细胞内表达。为制备抗原蛋白，每72小时收集条件化培养基，该过程重复四次。通过A蛋白亲和色谱从条件化培养基纯化抗原蛋白。

实施例1-2：文库噬菌体的制备

将10μg/ml重组人源DLL4溶液(R&D系统)加入免疫管，4℃下，DLL4蛋白在免疫管表面上吸附过夜。然后，1％牛血清白蛋白(BSA)溶液加入到免疫管，以保护DLL4未吸附的表面区域。排空免疫管后，加入分散在1％BSA溶液中的 10¹²CFU抗体噬菌体文库，这样它们可以与抗原结合。采用磷酸盐缓冲盐水-0.05 ％吐温20(PBS-T)溶液洗涤免疫管5次，以除去非特异性结合的噬菌体，用100mM 的三乙胺溶液收集剩余的抗原特异性噬菌体抗体。将收集的噬菌体用1M Tris缓冲液(pH7.4)中和，然后在37℃下转染入大肠杆菌ER2537，1小时。将转染的E.coli 细胞铺到包含羧苄青霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂培养基上，并在37℃培养过夜。第二天，将培养的大肠杆菌细胞悬浮在4毫升超级肉汤(SB)-羧苄青霉素培养基中，并加入15％甘油。然后，将一部分细胞悬浮液储存在-80℃，剩余50微升在37℃温育于20毫升添加有2％葡萄糖溶液的SB-羧苄青霉素培养基内。当细胞培养物在600纳米的吸光度达到0.6，离心除去培养基，剩下的细胞沉淀物再悬浮于20毫升SB-羧苄青霉素培养基中，并加入10¹²PFU的VCSM13辅助噬菌体。然后将细胞培养物于37℃缓慢搅拌下温育。第二天，离心细胞培养物，仅收集培养基收集并加入4％的聚乙二醇8000(PEG 8000)和3％的氯化钠(NaCl)，在4 ℃放置30分钟，然后离心。除去上清液，并将沉淀的噬菌体悬浮于1ml PBS中。使用该悬浮液作为文库，重复上述淘选过程以扩增并浓缩抗原特异性克隆。

实施例1-3：通过噬菌体展示淘选

为筛选结合到人DLL4蛋白内Notch 1结合位点的抗体，对应于人DLL4蛋白特异性区域的缺失片段(第27至第251个氨基酸残基)和人DLL4蛋白进行3轮交叉淘选。然后，将细胞铺在含有抗体基因的LB-羧苄青霉素琼脂培养基上并培养以获得单菌落，然后将其接种到400微升SB-羧苄青霉素培养基并温育，之后通过添加IPTG诱导大肠杆菌周质内scFv型蛋白的表达。大肠杆菌细胞悬浮于TES溶液(Tris，EDTA，蔗糖)，并在4℃静置1小时。接着离心悬浮液提取周质，然后使用ELISA技术将其用于检查重组人DLL4抗原和scFv间的结合(Steinberger. Rader和Barbas III.2000.噬菌体展示载体(Phage display vectors)，刊于噬菌体展示实验手册(Phage Display Laboratory Manual)，第一版.冷泉港实验室出版社.纽约. 美国.第11.9-11.12页)。使用辣根过氧化物酶(HRP)-抗HA抗体和四甲基联苯胺(TMB)底物检测结合scFv。检测到的抗原特异性抗体的克隆进行测序。

实施例2：抗DLL4抗体对DLL4的结合亲合力试验

实施例1中分离和纯化的抗体分别命名为"MLCK-1"、"MLCK-2"、"MLCK-3" 和"MLCK-4"，并发现分别包括SEQ ID NO:1所示重链可变区和SEQ ID NO:15所示轻链可变区(MLCK-1)，SEQ ID NO:5所示重链可变区和SEQ ID NO:19所示轻链可变区(MLCK-2)，SEQ IDNO:8所示重链可变区和SEQ ID NO:23所示轻链可变区(MLCK-3)，和SEQ ID NO:11所示重链可变区和SEQ ID NO:27所示轻链可变区(MLCK-4)。分离的抗体与抗原的亲合力采用以下方法分析。

使用ELISA结合试验评价抗DLL4抗体-抗原结合亲和力。4℃，采用2微克/ 毫升hDLL4-His蛋白的PBS溶液包被96孔微量滴定板(Nunc-免疫板，NUNC，罗切斯特，纽约)过夜，用BSA(牛血清白蛋白)封闭非特异性结合位点2小时。以抗体浓度范围从0nM到128nM将96孔微量滴定板上的抗DLL4抗体(纯化蛋白)转移到微量滴定板。然后温育板2小时，之后采用含0.05％吐温20的PBS洗板5次，为检测板结合的DLL4抗体，以1:10000比例稀释HRP结合的Fab多克隆抗体试剂(皮尔斯公司-Pierce)，转移到洗涤过的微量滴定板，然后在37℃反应 1小时。反应后，用比色底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺；西格玛奥德里奇公司)进行显色。用0.5摩尔/升硫酸终止酶反应，采用酶标仪(分子装置)记录450nm-650 nm的吸光度。结果表明，抗体对DLL4的结合亲和力以浓度依赖方式增加(图2)。

实施例3：检测抗DLL4抗体结合DLL4配体的能力

通过FACS分析和ELISA一起检测抗DLL4抗体结合DLL4的能力。

具体地，制备稳定表达人DLL4的人胚胎肾细胞(HEK 293)，采用制备的细胞和FACSCalibur系统(BD生物科学公司)检测抗DLL4抗体与DLL4的结合程度。分离稳定表达DLL4的HEK293细胞，用PBS洗涤，调整细胞数为1×10⁵细胞/200微升PBS，用10微克各DLL4单克隆抗体处理，然后使其在室温下反应30 分钟。反应后，将细胞用PBS洗涤，4℃下与FITC标记的Fc特异性抗体(山羊抗人IgG FITC偶联物，Fc特异性，西格玛，F9512；浓度：2.0mg/ml)以浓度为5 微升/1×10⁵细胞/200微升PBS反应1小时。反应后用PBS洗涤细胞，并使用FACSCalibur系统进行分析。对照组只用FITC标记的Fc特异性抗体处理。采用各 DLL4单克隆抗体处理的试验组中人DLL4-单克隆抗体-FITC结合的分析结果与对照组进行比较

各单克隆抗体与人DLL4抗原的(结合)程度的检测结果示于图3。从图3可看出，相比对照组，单克隆抗体与DLL4抗原的结合程度如下：MLCK-1：47.82％(图 3a)；MLCK-2：59％(图3b)；MLCK-3：52.85％(图3c)和MLCK-4：52.46％(图 3d)。

这样的结果表明，本发明的MLCK-1，MLCK-2，MLCK-3和MLCK-4抗体对人DLL4具有高度结合亲和力。

实施例4:抗DLL4抗体的中和作用的试验

采用ELISA溶液竞争试验评价抗DLL4抗体的中和作用。

4℃，采用100微升500ng/ml的hNotch-1-hFc蛋白(R&D系统)(PBS稀释)包被96孔微量滴定板(Nunc-免疫板，NUNC，罗切斯特，纽约)的各孔过夜，用 BSA封闭非特异性结合位点2小时。

96孔微量滴定板上的抗DLL4抗体(纯化蛋白)以抗体浓度范围从0nM至 140nM与连续稀释的抗原蛋白(DLL4抗原，600纳克/毫升)预混合。抗原/抗体混合物孵育30分钟后，为检测游离抗体将其转移至预包被有DLL4受体hNotch-1 蛋白(50ng/孔)的微量滴定板。然后，将板孵育2小时，并用含0.05％吐温20的 PBS洗涤五次。为了检测结合到板的DLL4抗原，以1：500的比例稀释HRP-偶联 His抗小鼠IgG多克隆抗体试剂(罗氏应用科学)，并且将洗涤的微量滴定板用稀释的抗体试剂处理，然后使其在37℃反应1小时。然后，用比色底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺；西格玛奥德里奇公司)进行显色，并用0.5摩尔/升硫酸终止酶反应。检测450nm-650nm的吸光度，检测结果示于图4。

实现与板包被Notch 1-Fc结合的人DLL4-His有50％降低所需的抗体的量(IC₅₀)示于下表1

表1

结果是，本发明的四种抗体均表现出0.4-3.7nM的IC₅₀值，表明这些抗体能以非常低的浓度抑制人Notch-1与DLL4配体的结合(图4和表1)。该结果表明，本发明的四种抗体可通过抑制DLL4配体和Notch间的相互作用抑制癌细胞的生长。

实施例5：分析抗DLL4抗体的结合能力

实施Biacore测定法来确定抗DLL4抗体的结合能力。

具体而言，Biacore T200用于SPR分析和HBS-EP(10mM HEPES，pH 7.4的， 150mM氯化钠，3mM EDTA，0.15％表面活性剂P20)作为电泳缓冲液。通过使用向导程序的表面处理目标固定工具完成表面处理(条件：25℃，5微升/分钟)。配体(hDLL4)用10mM乙酸钠(pH 4.5)稀释到终浓度为10微克/毫升，然后根据各测试组的目标固定水平被固定到CM5芯片的表面。在固定化过程中，两个流动池作为一组，其中第一流动池设置为空白和第二流动池具有本实验中固定到其表面的hDLL4。第一流动池用作参比以便解释非特异性结合和缓冲液影响所致的实验变化性，在分析中，减去的RU值(FC2-FC1)作为实验的结果。结合于hDLL4 的抗DLL4抗体，即MLCK1，MLCK2，MLCK-3和MLCK4在电泳缓冲液中被稀释至终浓度为100nM，连续稀释5倍，并且对5个稀释液中的每一个进行分析。将待分析的样品制备成具有高纯度，高浓度，充分稀释最低100倍以上，从而最大限度地减少缓冲液影响。全部分析是通过使用向导程序完成，每个样品重复筛选和在各分析步骤之间包括再生步骤，以使实验的标准保持不变。由BIA评估软件4.0 版分析实验结果。此时，为确定RU值(FC2-Fc1和FC4-FC3)，基线设置为零，从整个传感图减去在缓冲液注射部分测定的值(分析物，0nM)。然后，通过1:1 结合模型分析得到的RU值来确定结合亲和力。待分析的因素包括k_a(M^-1s^-1)、k_d(s^-1)、 K_a(1/M)和K_D(M)。具体而言，k_a是表明结合亲和力的缔合常数，k_d是表明稳定性的解离常数。平衡解离常数K_D(M)通过k_d除以k_a进行计算(k_d/k_a)。

结果，如图5所示，对于hDLL4，MLCK-1抗体的K_D(M)为2.63×10^-7M， MLCK-2抗体的K_D(M)为1.71×10^-9M，MLCK-3抗体的K_D(M)为6.96×10^-9M和 MLCK-4抗体的K_D(M)为2.13×10^-6M。

实施例6：分析抗DLL4抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响

为研究DLL4结合抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响，分析代表性的抗DLL4抗体，MLCK-2抗体对HUVEC增殖的影响。

具体而言，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自隆萨公司(Lonza)用于本实验。室温下，用添加有1％明胶(西格玛)的PBS缓冲液(Gibco)包被T型烧瓶(Nunc) 4至6小时，用PBS洗涤后将它用于培养HUVEC。补充有EGM-2Single Quot(隆萨公司)的EBM-2(隆萨公司)用作培养基，细胞培养物的密度保持在80％以下， 37℃，在5％CO₂培养箱内培养细胞。六代前的细胞用于本实验。通过以下方法进行HUVEC增殖测定。首先，为制备hDLL4包被板，在实验前一天，用碳酸盐缓冲液稀释rhDLL4(R&D系统)至在96孔板(BD)内的终浓度为1微克/毫升，各孔接种100微升稀释的rhDLL4，将板在4℃孵育过夜。此外，在补充有0.1％FBS的 EBM-2基本培养基中培养HUVEC 24小时以使血清影响最小化。在实验的第一天， rhDLL4包被板的各孔用PBS洗涤两次，并且对于每个测试组，将用EBM-2基本培养基稀释的MLCK-2单克隆抗体(为20微克/毫升)添加到各孔，一式三份，室温孵育20分钟。饥饿24小时的HUVEC解离成单细胞，并用EBM-2基本培养基稀释至4×10³细胞/孔。将稀释的细胞接种在用抗体处理过的孔内，37℃下在 5％CO₂培养箱内孵育96小时。一旦细胞增殖结束，10微升细胞计数成套试剂-8(CCK-8，Dojino)加入各孔，37℃下将板在5％CO₂培养箱内孵育5小时。使用仪器SpectraMax190(分子装置)检测样品在450纳米-650纳米的吸光度，并比较不同实验组之间的细胞增殖水平。

结果，如图6所示，本发明的代表性抗DLL4抗体以浓度依赖方式阻断DLL4 介导的HUVEC增殖抑制。

实施例7：分析抗DLL4抗体对DLL4/Notch信号传导通路的抑制活性

在Notch信号传导中，当DLL4结合Notch受体时，这将导致Notch受体构成变化致使其被裂解，然后Notch的胞内域(NICD)进入细胞核并介导Notch信号传导。在这方面，可以证实本发明的抗DLL4抗体是否能抑制DLL4与Notch受体间的结合，从而通过监测如下Notch受体裂解的抑制来干扰Notch信号传导。

具体而言，为了检测DLL4结合抗体对DLL4/Notch信号传导通道的抑制活性，本实验中分析HUVEC内信号传导通道的抑制。实验前一天，重组人DLL4(rhDLL4， R&D系统)用碳酸盐缓冲液稀释至1微克/毫升的终浓度，然后以1ml/孔将稀释的 rhDLL4加入6孔板(BD)，并于4℃孵育过夜。对于未用rhDLL4处理的对照组，仅将1ml/孔碳酸盐缓冲液加入板并于4℃孵育过夜。第二天，从4℃冰箱取出DLL4 包被的板，用PBS洗涤一次，并将1ml的EGM-2培养基加入该板的各孔中。然后，各抗体，20μg/ml抗VEGF mAb、0.08nM DBZ和20μg/ml MLCK-2mAb加入实验组的各孔。各孔中培养基终体积为2毫升。抗体的加入体积是培养基体积的两倍。将板孵育20分钟。抗体处理期间，取出含有第2代-第5代HUVEC的75T板，从板去除培养基后，将细胞解离成单细胞。通过离心，用新鲜的EGM-2培养基洗涤并重悬HUVEC。细胞计数后，将样品稀释至5×10⁵细胞/ml并将1毫升细胞样品接种到各孔中，37℃下在5％CO₂培养箱内孵育一天。培养HUVEC后，去除每个孔中的培养基，将细胞用PBS洗涤一次，并用2ml的包括0.2％FBS的EBM-2 基本培养基处理。各孔中另添加浓度相同的各抗体，前一天处理的20μg/ml抗VEGF mAb、0.08nM DBZ和20μg/ml MLCK-2mAb，37℃下将细胞在5％CO₂培养箱内孵育一天。然后，含有用抗体处理的HUVEC的各孔用100纳克/毫升hVEGF(R&D 系统)处理，并在37℃孵育5分钟。然后取出板，快速去除培养基。将细胞用PBS 洗涤一次，将150微升细胞溶解缓冲液(1％NP-40，20nM Tris，137mM氯化钠， 10％甘油，2mM EDTA，1mM的原钒酸钠，1×蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物) 加入各孔，并振荡板以铺散溶解缓冲液。

接着，将板置于冰上，使用刮刀从各孔收集HUVEC，放入1.5ml管中并储存在冰上。每5分钟，将含细胞的1.5毫升管涡旋3次，并再次置于冰上用于细胞溶解。然后将样品在4℃以14000rpm离心10分钟，分离的上清液转移到新管中并称重。对于SDS-PAGE分析，将上清液加入到5×SDS样品缓冲液并在100℃煮沸 10分钟，通过SDS-PAGE分析。此时，将制备的蛋白质样品通过4％-12％的Bis-Tris 凝胶进行电泳，根据其大小分离，并且用下列抗体对分离的蛋白质进行蛋白印迹： NICD(CS公司-Cell signaling)、P-ERK(CS公司)、ERK(CS公司)、VEGFR2(CS 公司)、P-VEGFR2(CS公司)和肌动蛋白(SC公司-Santa Cruz)。

结果，如图7所示，采用本发明的代表性抗体，MLCK-2mAb作细胞处理降低NICD水平(泳道7)，该水平之前通过DLL4处理被增加(泳道4和5)。

尽管为说明已描述本发明优选实施方式，本领域技术人员应理解，在不脱离所附权利要求公开的本发明的范围和实质的情况下，各种修改、增加和替换是可能的。

序列表

<110> 韩华石油化学株式会社

<120> 特异性结合到DLL4的新型单克隆抗体及其应用

<130> P2016-1708

<150> KR 10-2012-0071996

<151> 2012-07-02

<150> KR 10-2013-0071261

<151> 2013-06-20

<160> 35

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-1的重链可变区

<400> 1

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Asp Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-1, 2, 3的重链可变区的CDR1

<400> 2

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-1的重链可变区的CDR2

<400> 3

Trp Ile Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-1的重链可变区的CDR3

<400> 4

Ala Asp Pro Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210> 5

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-2的重链可变区

<400> 5

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Asp Trp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-2的重链可变区的CDR2

<400> 6

Trp Ile Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-2的重链可变区的CDR3

<400> 7

Ala Asp Trp Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210> 8

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-3的重链可变区

<400> 8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Asp Leu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-3的重链可变区的CDR2

<400> 9

Trp Ile Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-3的重链可变区的CDR3

<400> 10

Ala Asp Leu Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210> 11

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-4的重链可变区

<400> 11

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Tyr His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Thr Phe Gly Lys Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-4的重链可变区的CDR1

<400> 12

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-4的重链可变区的CDR2

<400> 13

Trp Ile Tyr His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-4的重链可变区的CDR3

<400> 14

Gly Pro Asn Tyr Thr Phe Gly Lys Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 15

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-1的轻链可变区

<400> 15

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Asn Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-1的轻链可变区的CDR1

<400> 16

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asn Val Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-1的轻链可变区的CDR2

<400> 17

Ser Asp Asn Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-1的轻链可变区的CDR3

<400> 18

Ala Thr Trp Asp Ser Ser Leu Asn Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 19

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-2的轻链可变区

<400> 19

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Asp Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 20

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-2的轻链可变区的CDR1

<400> 20

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asp Val Thr

1 5 10

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-2的轻链可变区的CDR2

<400> 21

Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-2的轻链可变区的CDR3

<400> 22

Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Ala Tyr Val

1 5 10

<210> 23

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-3的轻链可变区

<400> 23

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ala Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-3的轻链可变区的CDR1

<400> 24

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Thr

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-3的轻链可变区的CDR2

<400> 25

Ser Asp Asn His Arg Pro Ser

1 5

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-3的轻链可变区的CDR3

<400> 26

Gly Thr Trp Asp Ala Ser Leu Ser Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 27

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-4的轻链可变区

<400> 27

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Gly Ser Pro Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Thr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MLCK-4的轻链可变区的CDR1

<400> 28

Arg Gly Ser Pro Ser Asn Ile Gly Asn Asn Thr Val Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CMLCK-4的轻链可变区的CDR2

<400> 29

Ser Asp Ser Gln Arg Pro Ser

1 5

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CMLCK-4的轻链可变区的CDR3

<400> 30

Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Ala Tyr Val

1 5 10

<210> 31

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1的重链恒定区

<400> 31

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 32

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG2的重链恒定区

<400> 32

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 33

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG3的重链恒定区

<400> 33

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg

115 120 125

Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys

130 135 140

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

145 150 155 160

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

165 170 175

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

180 185 190

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

195 200 205

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

210 215 220

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

225 230 235 240

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

245 250 255

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

260 265 270

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

275 280 285

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

290 295 300

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

305 310 315 320

Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

325 330 335

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile

340 345 350

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln

355 360 365

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210> 34

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4的重链恒定区

<400> 34

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 35

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> λ轻链的恒定区

<400> 35

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser

100 105

Claims

1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合到人delta样配体4 (DLL4)以抑制人delta样配体4 (DLL4)和Notch受体间的相互作用，

且所述单克隆抗体包括：

重链可变区，包括SEQ ID NO: 2所示的重链CDR1、SEQ ID NO: 6所示的重链CDR2和SEQID NO: 7所示的重链CDR3；和

轻链可变区，包括SEQ ID NO: 20所示的轻链CDR1、SEQ ID NO: 21所示的轻链CDR2和SEQ ID NO: 22所示的轻链CDR3。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括SEQ ID NO: 5所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO: 19所示的轻链可变区氨基酸序列。

3.一种编码权利要求1或2所述的单克隆抗体的多核苷酸。

4.一种制备单克隆抗体的方法，所述单克隆抗体特异性结合到人delta样配体4(DLL4)以抑制人delta样配体4 (DLL4)和Notch受体间相互作用，所述方法包括表达含有权利要求3所述的多核苷酸的表达载体。

5.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，包括权利要求1或2所述的单克隆抗体。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症选自下组：食道癌、胃癌、结直肠癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、结缔组织癌症、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症选自下组：直肠癌、结肠癌、何杰金氏病。

8.一种用于诊断癌症的组合物，包括权利要求1或2所述的单克隆抗体。

9.一种用于预防或治疗自身免疫疾病的药物组合物，包括权利要求1或2所述的单克隆抗体。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述自身免疫疾病选自下组：类风湿性关节炎、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、过敏性皮炎、牛皮癣、斑秃、哮喘、克罗恩氏病、白塞病、斯耶格仑综合征、格-巴二氏综合征、慢性甲状腺炎、多发性硬化症、多肌炎、强直性脊柱炎、脑脊髓炎、纤维组织炎和结节性多动脉炎。