CN115991776B - 一种靶向cd7的全人源抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种靶向CD7的全人源抗体及其应用。所述靶向CD7的全人源抗体以高亲和力特异性结合CD7，且与异源抗体相比，具有更低的免疫原性，在包括单抗、双抗、抗体偶联药物等在内的抗体药物及包括CAR‑T，CAR‑NK等在内的细胞治疗药物的开发上有很好的应用潜力。

Description

一种靶向CD7的全人源抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向CD7的全人源抗体及其应用，尤其涉及与人CD7抗原蛋白和细胞膜表面天然状态的CD7抗原特异性结合的全人源抗体。

背景技术

CD7，又称GP40，T-cell leukemia antigen，T-cell surface antigen Leu-9，TP41，分子量为40kDa，属于免疫球蛋白超家族成员。主要在成熟T细胞、NK细胞、早期造血前体细胞等细胞中表达，通过跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路，作为共刺激蛋白辅助T细胞活化。超过95％淋巴细胞白血病和淋巴瘤，以及一些外周T细胞淋巴瘤都表达CD7。

研究表明，在鼠模型中，敲除T细胞CD7的小鼠，在发育、稳态和保护功能基本上未受影响。另外，CD7分子与抗体结合后会快速的发生内吞作用，因此，目前通过在CD7抗体分子上偶联免疫毒素来靶向人淋巴细胞白血病和淋巴瘤等，未产生严重的CD7定向毒性。

目前，在临床前T细胞恶性肿瘤研究中，CD7由于在T细胞上表达，导致CD7 CAR T的自杀及不能体外扩增。可以通过CD7基因编辑或通过阻断CD7蛋白质运输到细胞表面，这两种机制中止CD7的表达都不会影响T细胞的增殖或短期效应功能，并保留了其抗肿瘤活性。细胞表面敲除或者抑制CD7表达后，CD7 CAR T细胞在体外和体内对原发性CD7⁺T急性淋巴性白血病(T-ALL)和淋巴瘤发挥了强大的抗白血病活性。

由于CD7在超过95％ T-ALL、淋巴瘤和部分急性髓系白血病(AML)上表达，兼具了针对T-ALL的特异性，以及较好的安全性，是一个有效的治疗靶点。

因此，开发能够对CD7表达的细胞发挥临床有效的细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制效应，对CD7不表达的细胞无不良影响的全人源抗体，对研发CD7表达相关的免疫治疗产品，有非常重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种靶向CD7的全人源抗体及其应用。本发明使用全人源噬菌体进行CD7抗体筛选，直接获得全人源的单克隆抗体。与传统杂交瘤技术相比，省却了困难的鼠源抗体人源化步骤，而且全人源抗体比人源化的鼠源抗体具有更低的免疫原性，在抗体药物(包括单抗、双抗、抗体偶联药物(ADC)等)及细胞治疗药物(包括CAR-T、CAR-NK等)开发上有很好的应用潜力。另外，本发明提供的高亲和力的特异性抗体，也可以用于检测试剂的开发。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种靶向CD7的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；

HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

所述重链可变区的氨基酸序列包括与SEQ ID NO:5具有至少90％一致性的序列(例如可以是90％、92％、94％、96％、98％或100％等)。

优选地，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

优选地，所述抗体为单域抗体。

优选地，所述抗体为全人源抗体。

第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的靶向CD7的抗体或其抗原结合片段。

优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明中编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体插入有第二方面所述的核酸分子，并且所述表达载体能够在转染宿主细胞后，使得被转染的宿主细胞表达第一方面所述的靶向CD7的抗体或其抗原结合片段。

第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中包含第三方面所述的表达载体，或所述宿主细胞的基因组上整合有外源的第二方面所述的核酸分子。

第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的靶向CD7的抗体或其抗原结合片段。

本发明中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

第六方面，本发明提供一种用于检测样品中CD7抗原的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的靶向CD7的抗体或其抗原结合片段。

本发明中，所述检测可以是体外的或体内的。

第七方面，本发明提供第一方面所述的靶向CD7的抗体或其抗原结合片段、第四方面所述的宿主细胞或第五方面所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

优选地，所述癌症包括T淋巴细胞白血病或T细胞淋巴瘤。

本发明还提供了一种治疗疾病或病症的方法，所述方法为通过向有需要的患者施用治疗有效量的第一方面所述的靶向CD7的抗体或其抗原结合片段、第六方面所述的宿主细胞或第七方面所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合来消除、抑制或降低CD7活性，从而预防、减轻、改善或抑制疾病或病症。

优选地，所述疾病或病症选自：癌症或自身免疫疾病。

优选地，所述癌症为细胞表面表达CD7的癌症。

优选地，所述癌症为T淋巴细胞白血病或T细胞淋巴瘤。

本发明还提供了一种与第一方面所述的靶向CD7的抗体或其抗原结合片段竞争相同表位的抗体或片段。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本发明的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本发明的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本发明的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本发明所涉及发明的精神和范围。相应地，本发明的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明中所述靶向CD7的单域抗体的特异性强，无交叉性反应，与CD7阳性细胞系结合，与CD7阴性细胞系不结合，与无关蛋白不结合；

(2)本发明获得了一种全人源的抗体，以高亲和力特异性结合CD7(KD值<1.0E-12)，与异源抗体相比具有更低的免疫原性；在抗体药物(包括单抗、双抗、ADC等)及细胞治疗药物(包括CAR-T、CAR-NK等)的开发上有很好的应用潜力；另外所述全人源的抗体也可以用于检测试剂的开发；

(3)本发明使用了蛋白淘选的方法，能高效的富集同时结合重组CD7蛋白和细胞膜上天然结构CD7的抗体，大大降低了后期抗体筛选的难度，提高了效率。

附图说明

图1是本发明从噬菌体抗体库筛选靶向CD7的特异抗体的大体流程；

图2是实施例2中所淘选的部分噬菌体单克隆与靶抗原和对照抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)结果；

图3A是实施例2中PE anti human CD7 Ab阳性检测抗体对检测使用细胞系表达CD7抗原的检测结果；

图3B是实施例2中所淘选的部分噬菌体单克隆与CCRF-CEM和Raji细胞结合的流式细胞分析结果；

图4A是实施例3中PE anti human CD7 Ab抗体分别与CCRF-CEM、Jurkat、Raji和NALM-6细胞孵育反应后的FACS检测结果；

图4B是实施例3中所筛选的噬菌体单克隆与多种不同的CD7阳性和阴性细胞系结合的流式细胞分析结果(峰形图)；

图5是实施例4中所筛选的噬菌体单克隆与多种CD7抗原蛋白和非相关抗原的酶联免疫吸附测定分析结果；

图6是实施例5中所筛选的噬菌体单克隆在蛋白水平与靶抗原和非相关抗原的酶联免疫吸附测定分析结果；

图7A是实施例6中PE anti human CD7 Ab阳性检测抗体对检测使用细胞系表达CD7抗原的检测结果；

图7B是实施例6中所筛选的噬菌体单克隆在蛋白水平与CD7阳性和阴性细胞系的结合的流式细胞分析结果(峰形图)。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

术语

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

抗体指由浆细胞(效应B细胞)分泌、被机体免疫系统用来中和外来物质(多肽、病毒、细菌等)的免疫球蛋白。该外来物质相应地称作抗原。抗体分子的基本结构是由2个相同重链和2个相同轻链组成的4聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分为位于氨基端的可变区(V)和位于羧基端的恒定区(C)。一条重链的可变区(HCVR，也称为VH)和一条轻链的可变区(LCVR，也称为VL)相互作用形成了抗原结合部位(Fv)。在可变区中，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比可变区内的其它区域(骨架区，FR)更易变化，称为高变区(HVR)，高变区实际上是抗体与抗原结合的关键部位。由于这些高变区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区(complementarity-determining region，CDR)。重链和轻链均具有三个互补决定区，分别称为HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3。

“单链抗体”(single chain fragment variable，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠，来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成Fv段，因而scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性。

“单域抗体”是指只由重链抗体的可变区氨基酸组成的抗体，其分子量仅有12-15kDa，但却具备与传统抗体相似或更高的特异性和亲和力。此外，单域抗体理化性质稳定、亲和力高、易于重组表达制备、易于与其它靶点或表位抗体组合等特点使其备受关注。

“鼠源抗体”是由鼠类针对特异抗原产生的抗体，通常指小鼠B淋巴细胞产生的抗体。在大多情况下，所述鼠源抗体为杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。本发明的全人源抗体是从人源噬菌体抗体库筛选获得，其相对于鼠源抗体降低了免疫原性，更利于人体的治疗用途。

本发明所述的“全人源抗体或其单域抗体或抗原结合片段”通常是指能够与靶抗原结合的任何形式的抗原结合分子，例如，所述抗原结合分子可为蛋白质或多肽，包括例如抗体及其抗原结合片段、单链scFv抗体、单域抗体、基于scFv构建的各种融合物和缀合物，例如scFv-Fc抗体、免疫缀合物、抗体药物偶联物(ADC)、多/双特异性抗体。

提及氨基酸或核苷酸序列时，术语“序列一致性(Sequence identity)”(也称为“序列同一性”)指两氨基酸或核苷酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置，两序列中的氨基酸残基或碱基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的氨基酸残基或碱基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件BLAST(可在网页ncbi.nlm.nih.gov找到)，通过使用缺省设置来获得最佳序列比对，并计算出两氨基酸或核苷酸序列之间的序列一致性。在一些实施方案中，本申请所述“至少90％序列一致性”包括但不限于：至少95％、至少98％、至少99％或甚至100％序列一致性的情形。

在一些实施方案中，本发明提供的全人源抗体还包括与SEQ ID NO:9所示序列有至少90％序列一致性(例如，至少95％、至少98％、至少99％或甚至100％序列一致性)的氨基酸序列。

本领域技术人员可以理解的是，在本文提供的具体序列基础上，可以通过对少数氨基酸进行替换、删除、添加并验证或筛选所得产物与相应抗原CD7的结合能力或生物学活性，从而获得本发明提供的靶向CD7抗体的相应变体，这些变体也应包括在本发明的范围内。例如，本发明的全人源抗体或其单链抗体或抗原结合片段在全长或CDR序列上，可以有至少1个且不超过10，或不超过5、4、3、2或1个氨基酸的改变。

本领域技术人员还可以理解的是，在本文提供的具体重链可变区序列基础上，可以通过以CD7作为抗原筛选抗体轻链库(如人源噬菌体轻链库)，从而获得与所述重链可变区匹配并维持CD7结合能力的轻链可变区。以此方式可获得的抗CD7抗体分子也包括在本发明的范围内。

在一些实施方案中，本发明的抗原结合分子可以进一步包含转译后修饰。转译后蛋白修饰的示例包括：磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖化、泛素化、糖基化、羰基化、类泛素化、生物素化或加入多肽侧链或疏水基团。因此，经修饰的可溶性多肽可以包含非氨基酸成分，例如类脂、多聚糖或单糖、以及磷酸盐。糖基化的一种优选形式是唾液酸化修饰，将一个或多个唾液酸基团与多肽结合。唾液酸基团改善蛋白质的溶解性和血清半衰期，同时也降低蛋白质可能的免疫遗传性。具体参见Raju et al.Biochemistry.2001 31；40(30):8868-76。

提及药物组合物，所使用的“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。

“治疗有效量”指足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的活性化合物的量。本发明抗体的“治疗有效量”可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。例如，典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01mg至100mg活性成分。本发明的抗体的施用方式包括但不限于注射，例如通过静脉内、肌内、动脉内、皮下、腹膜内等。

“表位”是指受抗原结合蛋白(例如，抗体)约束的分子的部分。表位可以包含该分子的非相邻的部分(例如，多肽中，在该多肽的主要序列上不相邻、但在该多肽的三价和四价结构中彼此足够靠近以被抗原结合蛋白约束的氨基酸残基)。

研究概述

本发明使用全人源噬菌体进行CD7抗体筛选，直接获得全人源的单克隆抗体。与传统杂交瘤技术相比，省却了困难的鼠源抗体人源化步骤，而且全人源抗体比人源化的鼠源抗体具有更低的免疫原性，在抗体药物(包括单抗、双抗、抗体偶联药物(ADC)等)及细胞治疗药物(包括CAR-T、CAR-NK等)的开发上有很好的应用潜力。另外，本发明提供的高亲和力的特异性抗体，也可以用于检测试剂的开发。

在抗体筛选的过程中，本发明发现直接使用重组表达的CD7蛋白筛选到的抗体克隆，部分克隆与CD7阳性细胞系CCRF-CEM结合。这可能由于是重组表达的CD7蛋白抗原与细胞膜表面的天然状态的CD7构象和可及抗原表位比较相似。

本发明应用大容量噬菌体抗体库筛选全人源的CD7特异抗体，并通过ELISA和FACS实验来评估这些抗体在phage水平(噬菌体水平)的特异性。最终，本发明获得了若干特异性良好的全人源抗体克隆。

本发明使用不同的抗体库，经过重组CD7蛋白淘选，总共挑选了276个单克隆(包含单域抗体和单链抗体)进行酶联免疫吸附测定(ELISA)和流式细胞术(FACS)检测初筛，其中23个克隆特异结合KACTUS CD7-Bio蛋白和CD7表达阳性细胞CCRF-CEM，而不结合对照蛋白SA和CD7表达阴性细胞Raji(蛋白淘选，ELISA和FACS初筛)。测序后得到了4种不同的单克隆序列。随后，将这4种抗体与CD7阳性细胞系(CCRF-CEM，Jurkat)和阴性细胞系(Raji，NALM-6)进行流式细胞分析(FACS)鉴定，与CD7靶抗原(KACTUS CD7-Bio)，非相关蛋白(KACTUSIL10-Bio，KACTUS BAFFR-Bio，ACRO CD19-Bio，SA)进行酶联免疫吸附(ELISA)鉴定，其中4个克隆(包含单域抗体和单链抗体)在多个细胞系和多种蛋白抗原上都表现出良好的结合力和特异性。

随后，制备了这些克隆的human IgG4抗体，并在蛋白水平进一步确认了这4个抗体与CD7阳性(CCRF-CEM、Jurkat)和阴性细胞系(Raji，NALM-6)的结合能力和特异性，与CD7靶抗原(KACTUS CD7-Bio)、非相关蛋白(KACTUS IL10-Bio、KACTUS BAFFR-Bio，SA)的结合特性，且使用Fortebio分析了这4个克隆的亲和力，其中1个克隆(#53)表现出较优的亲和力，并在抗原和细胞上都具有较优的结合能力和特异性，这个克隆的获得为后续开发全人源的CD7抗体药奠定了基础。本发明从噬菌体抗体库筛选靶向CD7的特异抗体的大体流程如图1所示。

本发明中涉及的氨基酸序列和核酸序列如下所示：

SEQ ID NO:1(HCDR1)：GFTFGSTY。

SEQ ID NO:2(HCDR2)：ISPSGSST。

SEQ ID NO:3(HCDR)：ARGYGMPMGHDE。

SEQ ID NO:4(#53重链可变区的核苷酸序列)：

GAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTGGCAGCACCTATATGGGTTGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGCATCAGCCCGAGCGGCAGCAGCACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCGCGCGGTTACGGTATGCCGATGGGTCATGATGAATGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCA。

SEQ ID NO:5(#53重链可变区的氨基酸序列)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSTYMGWVRQAPGKGLEWVSSISPSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGMPMGHDEWGQGTLVTVSS。

以下结合具体实施例详细说明本发明。

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1通过亲和淘选从噬菌体抗体库富集靶向CD7蛋白的特异抗体克隆

采用合适的负淘选和正淘选策略从噬菌体抗体库中富集所需的特异性抗体克隆。

(1)噬菌体抗体库的构建

构建的噬菌体抗体库包括天然库、半合成库和单域库。半合成噬菌体抗体库，与天然库一起使用，解决天然库可能缺乏CD7高亲和力抗体克隆的问题。单域噬菌体抗体库是只由重链抗体的可变区氨基酸组成的抗体库，其分子量仅有12-15kDa，但却具备与传统抗体相似或更高的特异性和亲和力。此外，单域抗体理化性质稳定、亲和力高、易于重组表达制备、易于与其它靶点或表位抗体组合等特点使其备受关注。

CD7是人体内正常细胞表达的抗原，对于这类抗原，机体会通过克隆筛选的机制，使那些能表达CD7抗体的细胞在发育过程中失活，导致正常人体内会缺乏这类抗原的高亲和力抗体。克隆筛选是机体正常的自我识别和自我保护机制。但是，最常用的噬菌体抗体库形式是天然库，它是通过直接克隆健康人淋巴细胞中抗体基因的方法构建的，其中很可能缺乏针对CD7这样人体内正常存在抗原的抗体克隆。出于这方面的考虑，在构建抗体库的时候不仅构建了天然库，同时还构建了半合成抗体库。半合成抗体库由来自天然抗体序列的轻链以及重链FR1-FR3和人工设计的重链CDR3组成，可以大大增加抗体多样性，提高筛选到针对体内正常存在抗原的高亲和力抗体的机会。

(2)CD7蛋白淘选

以靶抗原KACTUS CD7-Bio(KACTUS，CD7-HM401)作为正淘选蛋白进行多轮淘选，获得富集目的抗体克隆的噬菌体池(pool)。

实验步骤简述如下：

1)将SA磁珠先用封闭液封闭2h，然后再将靶抗原(KACTUS CD7-Bio)与封闭好的SA磁珠结合；

2)加入噬菌体文库(含5×10¹²个噬菌体颗粒)和一份干净的SA磁珠一起孵育，以便扣除非特异结合SA磁珠的噬菌体抗体克隆；

3)孵育后将上清转移到结合了靶抗原的SA磁珠中，继续孵育，使噬菌体和靶抗原结合；

4)用洗涤液洗涤磁珠，将未结合的噬菌体洗去；

5)用洗脱液将阳性噬菌体从靶抗原上洗脱下来，加入中和液中和；

6)以洗脱后的噬菌体重新感染宿主菌XL1-blue(TransGen，CD401)，扩增回收的噬菌体；留少量样品梯度稀释，感染宿主菌，涂Amp(氨苄)抗性平板，计算回收噬菌体数量；

7)重复步骤1)至6)，通常需要进行3轮至4轮淘选，直到观察到噬菌体的回收率(洗脱噬菌体数/投入噬菌体数)有明显上升。

富集好的噬菌体池可用于进行随后的单克隆挑选以及ELISA/FACS筛选。

本实施例所使用的主要材料和试剂如下所示：

全人源噬菌体抗体库，包含天然库，半合成库和单域库；

辅助噬菌体KO7，Thermo/Invitrogen，18311019；

Biotinylated Human CD7 Protein，Avitag^TM，His Tag，KACTUS，CD7-HM401(靶抗原KACTUS CD7-Bio)；

BeaverBeads^TM Streptavidin，海狸生物，22307-10；

封闭液：PBS+3％ BSA

漂洗液：PBS+0.1％ Tween20

洗脱液：0.2M Glycine，pH2.2

中和液：1M Tris，pH9.1

(3)实验结果：

使用不同的抗体库，通过3轮蛋白淘选，蛋白淘选实验结果如表1所示，每个淘选都观察到了回收率的显著上升，证明抗体克隆得到了有效富集。

表1

表1中XL-V1-2004-2是全人源天然单链噬菌体抗体库；XL-V2-2004-2是全人源天然单链噬菌体抗体库；XL-SD-1-2004-2是全人源合成单域噬菌体抗体库；XL-VH-2004-2是全人源天然单域噬菌体抗体库。

可以看到经过3轮淘选，不同的抗体库都得到了富集(第3轮回收率比上一轮显著提高)。但在后续的FACS实验中，从这些噬菌体池挑选的克隆部分与高表达CD7抗原的CCRF-CEM细胞系结合，即它们可以识别细胞表面天然状态的CD7抗原。

实施例2采用酶联免疫吸附测定(ELISA)和流式细胞术(FACS)从经富集的噬菌体池筛选特异性克隆

(1)目的和原理：

通过亲和淘选步骤富集的噬菌体池中包含各种性质的噬菌体抗体：特异克隆、非特异克隆、以及阴性克隆。为了获得特异克隆，需要从中分离单克隆，包装成单克隆的噬菌体，并通过酶联免疫检测(ELISA)和流式细胞术(FACS)对大量单克隆进行初筛，从中挑选到同时特异结合CD7蛋白和CD7阳性细胞系CCRF-CEM的单克隆。特异的单克隆再进一步通过DNA测序确定其中包含的唯一的抗体序列。

在ELISA初筛中，通过链霉亲和素Streptavidin与生物素Biotin的结合，使得生物素化的靶蛋白(KACTUS CD7-Bio)在反应液中更接近于天然状态的抗原构象。只结合KACTUSCD7-Bio而不结合链霉亲和素Streptavidin的被认定为特异克隆。FACS初筛使用CD7高表达的阳性细胞系CCRF-CEM和CD7阴性的细胞系Raji来进行，只结合CCRF-CEM细胞且不结合Raji细胞的被认定为特异克隆。通过ELISA和FACS两种初筛，可以获得既能结合重组表达的CD7蛋白，又能识别细胞表面天然状态CD7分子的候选抗体，供随后进一步筛选。

(2)ELISA实验简要步骤：

1)用深孔96孔板培养和包装单克隆噬菌体；

2)将Strepavidin用PBS稀释到2μg/mL，以100μL/孔加入到高结合酶标板中，室温结合2h；

3)弃掉包被液，每孔加入250μL封闭液，4℃封闭过夜；

4)250μL漂洗液洗板2次；

5)将带生物素标签的靶蛋白用PBS稀释至2μg/mL，以100μg/孔加入预包被Strepavidin的酶标板中，室温结合1h；

6)250μL漂洗液洗板2次；

7)加入100μL步骤1)培养好的噬菌体上清到包被好靶抗原的孔，室温结合2h；

8)250μL漂洗液洗板4次；

9)加入1:2000稀释的mouse anti M13一抗(Abcam，ab9225)，100μL/孔，室温孵育45min；

10)250μL漂洗液洗板4次；

11)加入1:2000稀释的HRP goatanti-mouse IgG(Biolegend，405306)，100μL/孔，室温孵育45min；

12)250μL漂洗液洗板6次；

13)加入100μL TMB显色底物，显色5至10min；

14)加入100μL 2M H₂SO₄终止反应，在酶标仪上读取结果。

(3)FACS初筛实验简要步骤：

1)用深孔96孔板培养和包装单克隆噬菌体；

2)CCRF-CEM和Raji细胞用PBS洗2次，用PBS重悬成1×10⁷细胞/mL浓度，以50μL分装到96孔深孔板中；

3)每孔加入50μL包装好的单克隆噬菌体，混匀后，4℃结合2h；

4)200μL PBS洗涤2次；

5)加入1:2000稀释的mouse anti M13一抗(Abcam，ab9225)，100μL/孔，吹打混匀后，室温孵育45min；

6)200μL PBS洗涤2次；

7)加入1:300稀释的FITC horse anti mouse-IgG(H+L)，100μL/孔，吹打混匀后，室温孵育45min；

8)200μL PBS洗涤2次；最后用200μL PBS重悬细胞；

9)在流式细胞仪上检测样品FITC通道的荧光强度，分析结果。

本实施例所使用的主要材料和试剂如下所示：

辅助噬菌体KO7，Thermo/Invitrogen，18311019

Streptavidin(SA蛋白)，Pierce，21125

Biotinylated Human CD7 Protein(简称KACTUS CD7-Bio)，Avitag^TM，His Tag，KACTUS，CD7-HM401；

High binding ELSIA plate，Costar，#3590

Corning 96Well Clear Round Bottom TC-Treated Microplate，Costar，#3799

封闭液：PBS+3％ BSA

漂洗液：PBS+0.1％ Tween20

可溶型单组分TMB底物溶液，Tiangen，PA-107-02

Anti-M13 Bacteriophage Coat Protein g8p antibody，abcam，ab9225

HRP Goat anti-mouse IgG(minimal x-reactivity)Antibody，Biolegend，405306

FITC horse anti mouse-IgG(H+L)，Vector，FI2000

PE anti-human CD7 Antibody，biolegend，343106

(4)实验结果：

从富集后的噬菌体抗体池随机挑选单克隆，包装成噬菌体后，通过噬菌体ELISA检测单克隆噬菌体与KACTUS CD7-Bio蛋白、SA蛋白的结合，找到KACTUS CD7-Bio特异的噬菌体抗体克隆。所淘选的部分噬菌体单克隆与靶抗原和对照抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)结果如图2所示，图中，A1-A7是随机挑选的7个克隆；Negative control是阴性对照；anti-M13 phage mouse Ab/anti-mouse HRP Ab为不加phage，只加第一抗体(Anti-M13phage mouse Ab)和第二抗体(anti-mouse HRP Ab)的阴性对照；anti-mouse HRP Ab为只加第二抗体(anti-mouse HRP Ab)的阴性对照，PE anti human CD7 Ab/anti-mouse HRPAb为加入CD7检测抗体的阳性对照；从图中可知，A1、A3-A7号克隆与靶抗原CD7(KACTUSCD7-Bio-his)结合良好，且不与对照抗原SA结合，特异性良好。A2克隆与靶抗原KACTUSCD7-Bio-his和对照蛋白SA都不结合，为阴性克隆。

所淘选的部分噬菌体单克隆与CCRF-CEM和Raji细胞结合的流式细胞分析结果如图3A和图3B所示。图3A显示了PE anti human CD7 Ab阳性检测抗体对检测使用细胞系表达CD7抗原的检测结果：CCRF-CEM为CD7阳性细胞系，Raji为CD7阴性细胞系。图3B显示了部分噬菌体单克隆CCRF-CEM和Raji细胞结合的流式细胞分析结果，其中，Negative control为阴性对照噬菌体抗体克隆，C5-C7克隆结合CCRF-CEM细胞，不结合Raji，是特异克隆；C1-C4，C8-C10克隆与2种细胞都不结合，是阴性克隆。

通过ELISA检测和FACS初筛总共获得23个特异性克隆。

实施例3采用多个细胞系通过FACS鉴定单克隆特异性

(1)实验目的和原理：

用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性，只结合靶抗原，而不结合任何无关的抗原；另一方面，不同的细胞系上同一抗原的氨基酸序列会有差异(异构体或突变体)或结合的配体不一样，也需要考察所得的抗体能否与各种靶蛋白阳性的细胞都结合。为了进一步分析这些单克隆的特异性和普适性，寻找最佳的候选克隆，本实施例通过流式细胞术进一步评估初筛克隆的特异性。在这个实验中，采用一种CD7阳性的细胞系和多种CD7阴性的细胞系与这些单克隆噬菌体抗体进行反应，分析这些克隆是否可以结合细胞系上的CD7抗原，以及是否与其它不表达CD7的细胞系有任何非特异的结合。通过这个实验获得了若干具有优良特异性的克隆。

(2)实验方法：参照FACS的实验步骤：

本实施例所使用的主要样品和试剂如下所示：

CCRF-CEM细胞系，CD7阳性细胞系(iasoin-house)；

Jurkat细胞系，CD7阳性细胞系(iasoin-house)；

Raji细胞系，CD7阴性细胞系(iasoin-house)；

NALM-6细胞系，CD7阴性细胞系(iasoin-house)；

其余试剂与FACS初筛相同。

(3)实验结果：

用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性。为了进一步分析这些单克隆抗体的特异性，将实施例2获得的唯一克隆在更多的抗原和细胞系上应用酶联免疫吸附和流式细胞术进行了鉴定。结果如图4A和图4B所示，图4A为PE anti human CD7 Ab抗体分别与CCRF-CEM、Jurkat、Raji和NALM-6细胞孵育反应后的FACS检测结果，CCRF-CEM和Jurkat为CD7阳性细胞系，Raji和NALM-6为CD7阴性细胞系。图4B为所筛选的噬菌体单克隆与多种不同的CD7阳性和阴性细胞系结合的流式细胞分析结果(峰形图)，Negative control为阴性对照噬菌体抗体克隆，Clone30、Clone 53、Clone 62、Clone 80与CD7阳性细胞系CCRF-CEM和Jurkat都结合，Clone 30、Clone 53与CD7阴性细胞系NALM6和Raji不结合，特异性良好，且Clone 53与细胞的结合能力最强；Clone 62、Clone 80与CD7阴性细胞系NALM6和Raji有弱结合，特异性交叉。

实施例4采用多种抗原通过ELISA鉴定单克隆特异性

(1)实验目的和原理：

用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性，只结合靶抗原，而不结合任何无关的抗原；为了进一步分析这些单克隆的特异性和普适性，寻找最佳的候选克隆，本实施例通过酶联免疫检测(ELISA)进一步评估初筛克隆的特异性。在这个实验中，采用CD7抗原和多种CD7不相关抗原与这些单克隆噬菌体抗体进行反应，分析这些克隆是否可以结合CD7抗原，以及是否与其它CD7不相关抗原有任何非特异的结合。通过这个实验，获得了若干具有优良特异性的克隆。

(2)实验方法：

参照ELISA初筛的实验步骤；

(3)本实施例所使用的主要样品和试剂如下所示：

Biotinylated Human CD7 Protein his-avi(简称KACTUS CD7-Bio-his)，KACTUS，CD7-HM401；

Biotinylated IL10，his tag(简称KACTUS IL10-Bio-his)，KACTUS，030301；

Biotinylated BAFFR，his tag(简称KACTUS BAFFR-Bio-his)，KACTUS，030201；

Biotinylated Human CD19，Fc Tag(简称ACRO CD19-Bio-Fc)，ACRObiosystem，CD9-H8259；

Streptavidin(简称SA)，Pierce，21125。

其余试剂与ELISA初筛相同。

(4)实验结果：

用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性。为了进一步分析这些单克隆抗体的特异性，本实施例将实施例2获得的多个克隆在多种抗原应用酶联免疫吸附(ELISA)进行了鉴定。

结果显示在图5中，图5为所筛选的噬菌体单克隆与多种CD7抗原蛋白和非相关抗原的酶联免疫吸附测定分析结果。其中，Negative Control为阴性对照噬菌体抗体克隆；anti-M13 phage mouse Ab/anti-mouse HRP Ab为不加phage，只加第一抗体(Anti-M13phage mouse Ab)和第二抗体(anti-mouse HRP Ab)的阴性对照；anti-mouse HRP Ab为只加第二抗体(anti-mouse HRP Ab)的阴性对照，PE anti human CD7 Ab/anti-mouse HRPAb为靶抗原(CD7 his-Bio)的阳性抗体对照，anti-human IgG HRP和anti-his HRP为检测抗原标签的阳性抗体对照。图5中每个测试抗体和对照组对应的柱形图从左至右依次表示与试剂KACTUS-CD7-Bio-his、KACTUS-IL10-Bio-his、KACTUS-BAFFR-Bio-his、ACRO-CD19-Bio-Fc、SA的测试结果。Clone 30、Clone 53、Clone 62、Clone 80与CD7抗原都结合，与非相关抗原KACTUS-IL10-Bio-his、KACTUS-BAFFR-Bio-his、ACRO-CD19-Bio-Fc和SA都不结合，说明这4个克隆能够结合CD7抗原且特异性良好。

实施例5在蛋白水平通过ELISA和FACS进一步确定单克隆的结合特异性

(1)实验目的和原理

通过亲和淘选从噬菌体抗体库富集靶向CD7抗原的特异抗体克隆并进行筛选和鉴定，获得了具有和CD7抗原结合的克隆，但从原核系统表达的抗体分子转换成真核系统表达的IgG抗体分子后，其结合能力和特异性还需要进一步确认。为此，本实施例制备了这些克隆的IgG表达质粒，并通过瞬时转染CHOS细胞(Gibco，A29127)表达，Protein A纯化到抗体。然后，通过ELISA和FACS进一步确定单克隆的结合特异性。

(2)在蛋白水平通过ELISA进一步确定单克隆在抗体水平的结合特异性

参照实施例2中的phage水平的ELISA的步骤。

本实施例所使用的主要样品和试剂如下所示：

与phage水平的ELISA试剂相同；

anti-human IgG HRP Ab，biolegend，406401

anti-his tag HRP Ab，Cwbio，CW0285

PE anti human CD7 Ab，Biolegend，343106

anti-mouse HRP Ab，Biolegend，405306

(3)实验结果：

为了进一步分析这些单克隆抗体在真核系统中表达为IgG形式的抗体后是否仍然保持原有抗体的结合能力和特异性，本实施例将实施例3获得的4个克隆通过CHOS表达，Protein A纯化到IgG形式的抗体在多种抗原应用酶联免疫吸附(ELISA)进行了鉴定。结果显示在图6中，图6为所筛选的噬菌体单克隆在蛋白水平与靶抗原和非相关抗原的酶联免疫吸附测定分析结果，anti-human IgG HRP Ab为只加二抗的阴性抗体对照，anti-his tagHRP Ab(anti-his HRP Ab)为检测抗原标签的阳性抗体对照，PE anti human CD7 Ab/anti-mouse HRP Ab为靶抗原(CD7-his-Bio)的阳性抗体对照。图6中PE anti-human CD7Ab为靶抗原(CD7)的阳性抗体对照，与靶抗原结合，与对照抗原不结合，Anti-human IgGHRP Ab为只加二抗的阴性抗体对照，anti-his HRP Ab为检测抗原标签的阳性抗体对照，与his标签的抗原结合，说明包被的抗原已经结合到板子上。Clone 30、Clone 53、Clone 62、Clone 80与CD7抗原都结合，与3种非相关抗原都不结合，说明Clone 30、Clone 53、Clone62、Clone 80能够结合CD7抗原且特异性良好。

(4)在蛋白水平通过FACS进一步确定单克隆在抗体水平的结合特异性

参照实施例2中的FACS初筛的步骤。

本实施例所使用的主要样品和试剂如下所示：

PE anti-human CD7 Antibody，Biolegend，343106

Fluorescein(FITC)AffiniPure Goat Anti-Human IgG，Fcγfragmentspecific，Jackson ImmunoReseach，109-095-190

(5)实验结果：

为了进一步分析这些单克隆抗体在真核系统中表达为IgG形式的抗体后是否仍然保持原有抗体的结合能力和特异性，将实施例3获得的4个克隆通过CHOS表达，Protein A纯化到IgG形式的抗体在更多的抗原和细胞系上应用酶联免疫吸附和流式细胞术进行了鉴定。结果显示图7A和图7B中，图7A为PE anti human CD7 Ab阳性检测抗体对检测使用细胞系表达CD7抗原的检测结果。图7B为所筛选的噬菌体单克隆在蛋白水平与CD7阳性和阴性细胞系的结合的流式细胞分析结果(峰形图)，FITC anti-human IgG Ab为只加二抗的阴性对照，图7B中CCRF-CEM和Jurkat为CD7表达阳性的细胞，NALM6和Raji为CD7表达阴性的细胞；图7B表明Clone 30、Clone 53、Clone 62、Clone 80与CD7阳性细胞系CCRF-CEM和Jurkat都结合，Clone 30、Clone 53与CD7阴性细胞系NALM6和Raji不结合，特异性良好，且Clone 53与细胞的结合能力最强；Clone 62、Clone 80与CD7阴性细胞系NALM6和Raji有弱结合，特异性交叉；FITC anti-human IgG Ab为只加二抗的阴性对照，与两种细胞系都不结合。

实施例6抗CD7 mAbs亲和力的测定

(1)实验目的和原理：

CD7 mAb与抗原间的亲和力大小可能对CAR-T或者抗体药在患者体内发挥杀伤作用及存续时间有着重要影响，为了确定这一重要性质，本实施例采用了Sartorius公司的分子相互作用技术(BLI)对其进行了测定。该系统所运用的生物膜干涉技术，是一种免标记技术，实时提供高通量的生物分子相互作用信息。该仪器发射白光到传感器表面并收集反射光，不同频率的反射光谱受到生物传感器的光膜层厚度的影响，一些频率的反射光形成了相长干涉(蓝色)，而另一些受到了相消干涉(红色)。这些干涉被光谱仪所检测到，并形成一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相位位移强度(nm)显示。因此，结合到传感器表面的分子一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移，而这种位移直接反应出传感器表面生物膜的厚度，从中可以获取生物分子相互作用的高质量的数据，从而进行生物分子间相互作用动力学参数测定(Kon，Kdis和KD)，为研发过程提供重要的信息。

(2)简要实验步骤：

1)用上样缓冲液(1×PBS，pH7.4，0.01％ BSA和0.02％ Tween 20)将抗CD7 IgG(将CD7的ScFv或者VHH序列与human IgG4 Fc融合构成)稀释至10μg/mL，并在生物传感器上上样。

2)在60s平衡阶段后，在多种抗原浓度下监测CD7抗原的结合动力学。在每个浓度下分别进行至160s结合和300s解离。

3)用10mM Glycine-HCl，pH1.5洗涤3次使芯片再生。

4)通过使用1:1结合位点模型(Biacore X-100评估软件)分析结合常数。

(3)实验结果：

亲和力系指单个分子与其配体结合的强度，通常通过平衡解离常数(KD)进行测定和报告，平衡解离常数可用于评估两分子间相互作用的强度并对此进行排序。抗体与其抗原的结合是一个可逆的过程，结合反应的速率与反应物的浓度成正比。KD值越小，抗体对其靶标的亲和力越大。抗CD7 IgG亲和力测定结果如表2所示：Clone 30、Clone 53、Clone 62和Clone 80均可与CD7抗原结合，且Clone 53亲和力高于其他克隆。

表2

分析物	KD(M)	Kon(1/Ms)	Kdis(1/s)
				Clone 30IgG	1.20E-09	6.45E+05	7.71E-04
Clone 53IgG	<1.0E-12	3.89E+05	<1.0E-07
				Clone 62IgG	1.54E-08	3.29E+04	5.06E-04
Clone 80IgG	9.26E-10	1.64E+05	1.52E-04

综上，本发明使用全人源噬菌体库进行抗体筛选，直接获得全人源的单克隆抗体。与传统杂交瘤技术相比，省却了困难的鼠源抗体人源化步骤，而且全人源抗体比人源化的鼠源抗体具有更低的免疫原性，亲和力高，在抗体药物，检测试剂等应用上有更好的潜力。本发明使用了蛋白淘选的方法，能高效的富集同时结合重组CD7蛋白和细胞膜上天然结构CD7的抗体，大大降低了后期抗体筛选的难度，提高了效率。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (11)

1.一种靶向CD7的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体只包括重链可变区，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；

HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单域抗体。

4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为全人源抗体。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-4中任一项所述的靶向CD7的抗体或其抗原结合片段。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体插入有权利要求5或6所述的核酸分子，并且所述表达载体能够在转染宿主细胞后，使得被转染的宿主细胞表达权利要求1-4中任一项所述的靶向CD7的抗体或其抗原结合片段。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中包含权利要求7所述的表达载体，或所述宿主细胞的基因组上整合有外源的权利要求5或6所述的核酸分子。

9.一种用于检测样品中CD7抗原的组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-4中任一项所述的靶向CD7的抗体或其抗原结合片段。

10.一种用于检测样品中CD7抗原的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的靶向CD7的抗体或其抗原结合片段。

11.权利要求1-4中任一项所述的靶向CD7的抗体或其抗原结合片段、权利要求8所述的宿主细胞或权利要求9所述的用于检测样品中CD7抗原的组合物中任意一种或至少两种的组合在制备用于检测样品中CD7抗原的试剂中的用途。