CN1234836A - 逆转录病毒载体 - Google Patents

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Abstract

逆转录病毒载体生产系统,用于生产能感染并转导非分裂靶细胞的基于慢病毒的载体颗粒;其中在HIV－1情况下诸如vpr、vif、tat和nef的一个或多个辅助基因从所述系统中缺失。所述系统和产生的逆转录病毒颗粒的安全性优于现有的系统和载体。

Description

逆转录病毒载体
本发明涉及逆转录病毒载体生产系统以及由所述系统产生的逆转录病毒载体颗粒。具体地说，本发明涉及缺失了某些逆转录病毒辅助因子的系统和载体颗粒。本发明还涉及逆转录病毒载体的使用，特别是用于基因治疗。
由于逆转录病毒载体的有效性、安全性和长期稳定的基因表达，它们一直是选择用于临床基因转移的载体。根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)RAC于1996年9月发布的报告(Ross等人，1996年)，NIH所综述的107个实验中有76个是基于由鼠白血病病毒(MLV)得到的载体系统。
这些载体的一个主要缺陷是它们不能感染非增殖细胞，如神经元、巨噬细胞和造血干细胞。而这些细胞是基因治疗的重要目标。
人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)属于逆转录病毒中的一个亚家族，即慢病毒；并且与这个家族的其它成员一样，HIV能感染静息细胞。这使得慢病毒成为基因治疗中有吸引力的载体。
据认为，HIV-1感染非分裂细胞的病毒决定簇位于p17基质蛋白(MA)和vpr上(Callay等人，1996)。MA具有由一段碱性残基组成的保守序列所赋予的亲核特性，其中所述的一段序列构成了一个核定位信号(NLS)(Bukrinsky等人，1993)。vpr也包含一段明显的NLS(Mahalingham等人，1995)。当缺少有功能的vpr基因时，MA-NLS突变病毒无法在巨噬细胞中有效复制(Heinzinger等人，1994)。据解释，这些数据意味着vpr和MA行使HIV-1的亲核决定簇的功能。当存在有功能的MA而缺少vpr时，对由单核细胞衍生的巨噬细胞的转导效率下降超过50％(Naldini等人，1996)。
自从Lever等人，1989报道的工作显示了HIV-1的包装所需的序列之后，人们对开发基于HIV-1的基因治疗载体产生了很大兴趣。Poznanski等人展示了通过一个基于HIV-1的复制缺陷型载体将外源基因转移进人类T细胞系(Poznansky等人，1991)。其他小组设计了tat可诱导的基于HIV-1的载体(Buchschacher，Jr.和Panganiban，1992)或使用了异源启动子的基于HIV-1的载体(Shimada等人，1991)。然而，使用这些载体获得的病毒滴度低(最多每ml103感染颗粒)，并且还不清楚这些载体系统能否保证产生没有辅助病毒的载体。最近，基于三质粒共转染，人们作出新的努力以产生没有辅助病毒的载体(Richardson等人，1995)。HIV载体能用水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-G)假型化(pseudotype)，并且这些颗粒在使用超速离心进行浓缩之后保留了感染性(Akkina等，1996)。用VSV-G假型化扩大了宿主范围，并去除了重组产生野生型HIV包膜的机会。已经有人展示了用三质粒共转染系统中的VSV-G假型化的HIV对非分裂神经元的体内转导(Naldini等人，1996和Naldini等人，1996a)。
HIV-1含有9个基因，其中三个：gag、pol和env在所有的逆转录病毒中都有发现。这些是结构基因。其它6个：vif、vpu、vpr、nef、tat和rev被称为辅助基因。其它逆转录病毒在它们的野生型基因组中含有不同组的辅助基因。其它逆转录病毒的一些辅助基因与HIV-1的辅助基因相似，虽然它们在文献中并不总是使用同样的名称。相似的辅助基因在它们的核苷酸序列上具有同源性，并行使相同或相似的功能。HIV-2和SIV病毒株一般含有与HIV-1的辅助基因相似的env、vpr、vif、tat和nef基因。HIV-2和一些SIV病毒株还含有vpx，在一些缺少vpr的SIV病毒株中，这个基因可以被认为与vpr相似。非HIV-1的慢病毒还含有与HIV-1辅助基因不相似的辅助基因。如Tomonaga和Mikami(1996)以及在Fields Virology第2卷Joag等人综述了逆转录病毒辅助基因。
到目前为止，所有基于HIV的载体系统都包含部分或全部的HIV辅助基因。rev行使一种RNA输出蛋白的功能，而tat是原病毒长末端重复(LTR)的一种主要的反式激活蛋白。辅助基因在病毒复制和疾病发生中具有决定性的作用。辅助基因还未被完全的确定特征，它们的功能也没有被确定。
然而，据认为一些辅助基因与HIV-1的疾病发生有关。已经显示tat与Kaposi’s肉瘤的发生有关(Barillari等人，1993；Ensoli等人，1990)。已经显示HIV vpr导致细胞停滞和细胞凋亡，这被认为是AIDS患者身上出现的T细胞机能障碍的原因(Jowett等人，1995)。另外，由于vpr诱导细胞增殖和细胞分化，所以出现在外周血中的细胞外vpr被认为促使与HIV感染有关的组织特异性疾病发生(Levy等人，1993和Levy等人，1995)。
由于辅助基因的作用还不是十分清楚，并且它们有可能在疾病发生中起主要作用，因此最好是将它们从载体产生系统中除去，前提条件是能保留足够高的逆转录病毒载体滴度以及转导非增殖细胞的能力。
Naldini等人的数据显示，vpu的存在或缺失对载体颗粒滴度没有影响。也就是说，他们使用的一个包装系统在用VSV-G假型化后产生了4×105的滴度，并且这个系统是env和vpu阴性的。在另一个仅是env阴性的系统中，他们得到了同样的滴度(Naldini等人，1996和Naldini等人，1996a)。然而，正如已经讨论过的，Naldini等人的另一个vpr阴性、vpu阴性的系统与一个vpr阳性的系统相比，其转导效率下降了50％。
现在我们已经发现，将部分或全部辅助基因排除在逆转录病毒载体产生系统之外，并未显著影响载体颗粒滴度或载体颗粒转导非分裂细胞的能力。
因此，一方面，本发明提供了一种逆转录病毒载体生产系统，生产用于基因治疗的、基于慢病毒的复制缺陷型载体颗粒；所述的载体颗粒能感染并转导非分裂的哺乳类靶细胞，所述系统包含一组编码载体组份的核酸序列，其中从HIV-1辅助基因vpr、vif、tat和nef或其它慢病毒中相似的辅助基因(这些辅助基因通常出现在载体颗粒所基于的慢病毒中)中选出的一个或多个有功能的基因从所述系统中缺失。也可以缺失有功能的vpu基因，前提条件是，当所述生产系统用于产生基于HIV-1的载体并且vpr和vpu都缺失时，其中一个其它辅助基因也缺失。
另一方面，本发明提供了由这里所述的逆转录病毒载体颗粒生产系统所产生的逆转录病毒载体颗粒。
再一方面，本发明提供了这里所述的逆转录病毒载体生产系统中使用的DNA构成物，所述的DNA构成物为逆转录病毒载体颗粒编码可包装的RNA载体的基因组，并可操作地(operably)连接了一个启动子，在所述DNA构成物中缺失了除env外全部有功能的逆转录病毒辅助基因，而rev可任选地出现在所述DNA构成物中。可以将所述DNA构成物作为一组编码载体颗粒部分或全部结构组份的DNA构成物的一部分来提供。
又一个方面，本发明提供了这里所述的逆转录病毒载体颗粒在基因治疗或制备基因治疗的药物中的应用；并提供了一种对靶细胞进行基因治疗的方法，该方法包括使用这里所述的逆转录病毒载体颗粒感染并转导靶细胞。本发明还提供了这些应用和方法得到的转导的靶细胞。这样本发明就提供了一个在医药中使用的基因传送系统。
“基于慢病毒“的表达方式表示所述载体颗粒从一种慢病毒得来。载体颗粒的基因组包含该慢病毒的组份作为骨架。总体上该载体颗粒包含与RNA基因组相容的基本载体组份，包括逆转录系统和整合系统。通常这些会包括从慢病毒得到的gag和pol蛋白。
所述逆转录病毒载体颗粒由于是从一种慢病毒得来，因此能够感染并转导非分裂细胞。这样，所述载体颗粒能够将一个或多个选定基因，如有治疗活性的基因，传送到靶细胞的基因组中。在感染过程中，慢病毒在靶细胞的胞质中形成包含整合酶、核心蛋白和原病毒DNA的整合前复合体。所述复合体借助所述蛋白上的信号序列能通过靶细胞的核膜。非慢病毒逆转录病毒不是缺少所述蛋白，就是虽然具有所述蛋白，但蛋白上缺少合适的信号序列。
慢病毒的例子有HIV-1和HIV-2、SIV、FIV、BLV、EIAV、CEV和绵羊髓鞘脱落病毒。其中HIV和SIV是目前了解的最清楚的。然而，在基因治疗中优选使用一种非免疫缺陷病毒，因为免疫缺陷病毒不可避免地伴随着安全考虑和成见。
有功能的辅助基因从逆转录病毒载体生产系统中的缺失，意味着由所述系统产生的逆转录病毒载体也将缺少这些有功能的基因。同样，本应由那些基因编码并被掺入载体颗粒中的任何辅助蛋白，将从载体颗粒中缺失。在已知的逆转录病毒载体生产系统中，辅助基因可以以编码载体基因组的DNA的一部分存在，或可以与包装组份一起出现。一个辅助基因在载体产生系统中的位置部分决定于它与其它逆转录组份的关系。例如，在一个包装细胞中，vif常常是gag-pol包装盒的一部分。这样，为本发明的目的除去一个有功能的辅助基因可能涉及将其从包装组份中除去或从载体基因组中除去，也有可能两种情况都发生。
去除一个有功能的辅助基因可以不要求将该基因完整地除去。通常除去基因的一部分，或以某种其它方法打断基因就足够了。这里缺失一个有功能的基因被理解为所述基因不以能编码有功能的辅助蛋白的形式出现。
在一个依照本发明所优选的系统中，有功能的vpr基因和tat基因或通常出现在载体颗粒所基于的慢病毒上的相似基因都缺失了。这两个基因涉及慢病毒所具有的、但对于基因治疗载体来说是特别不希望有的特性。然而，除上面给出的条件外，本发明在缺失的辅助基因的组合上并不受限制。在一个依照本发明用于产生基于HIV-1的载体颗粒的系统中，所述基因中任何三个、或更优选四个基因的组合可以丧失它们功能形式。最优选的是，所有五个辅助基因vpr、vif、tat、nef和vpu都丧失功能形式。相似的，对于涉及到其它慢病毒的系统，最优选所有辅助基因都丧失其功能形式(rev除外，它最好是存在，除非被一个类似于rev/RRE系统的系统取代)。
为保证载体基因组的RNA转录物从核有效输出到胞质，优选在载体基因组中包括有功能的rve和rev效应元件(RRE)序列，或者在基因组中包含可替代的与Fev/RRE系统行使同样功能的序列。例如，在MasonPfizer猴病毒中发现了一个rev/RRE系统的有功能的类似物。这被称为CTE并包含基因组中一个据认为与所感染细胞中一个因子相互作用的RRE型序列。所述细胞因子被认为是rev类似物。这样，CTE可用作rev/RRE系统的替代物。
正如将要明了的，为行使载体的功能，这里所述的逆转录病毒载体颗粒将需要一个逆转录系统(相容的逆转录和引物结合位点)和一个整合系统(相容的整合酶和整合位点)，以便能转化为原病毒并将双链DNA整合进靶细胞的基因组。另外，载体基因组将需要包含一个包装信号。这些系统和信号一般是从载体所基于的慢病毒获得。显然，虽然依照本发明的载体基于一种慢病毒，但插入到载体中的慢病毒元件可以是野生型慢病毒元件的遗传改变或用其它方法改变的形式。可以通过操作RNA基因组或逆转录病毒载体颗粒生产系统的其它元件来进行改变。例如，可以将慢病毒基因组中对于所述载体来说不需要的部分排除在外。另外，载体生产系统可以采用如慢病毒env基因的取代物，以赋予载体一个不同的靶细胞范围(这被称为假型化(pseudotyping))。
依照本发明的逆转录病毒载体颗粒携带一个或多个选定的基因以传送给靶细胞。根据想要获得的效应来选择所述的选定的基因。为基因治疗的目的，至少要有一个有治疗活性的基因，其编码一种对所需要治疗或预防的病症的基因产物。另外可以有一个选定的基因，其通过编码一种可检测的产物以作为标记。治疗基因可以编码如一段反义RNA、一种核酶、一种靶蛋白的反式显性阴性突变体、一种毒素、一种条件毒素、一种诱导抗体或辅助性T细胞或细胞毒性T细胞的抗原、一种单链抗体或一种肿瘤抑制蛋白。
载体基因组的构建优选是这样的：在DNA原病毒中，单个或多个治疗基因处于5′LTR的转录控制之下，而不另外可操作地连接任何其它来自载体的启动子。这样，单个基因或多个基因的表达是处于一个单一的转录单位中。还优选5′LTR是一种修饰的慢病毒LTR，其启动子的功能不是tat依赖性的。这可以通过以可替代的启动子功能物取代R和U3慢病毒启动子功能物，其中所述可替代的启动子功能物是从另一种逆转录病毒得到，或者也可以来源于非逆转录病毒来源。Cannon等人1996和本发明的实施例描述了一种这样的策略。
显然，术语“基因”在这里的使用是宽松的，包括任何编码所需多肽或RNA的核酸。通常由依照本发明的载体所传送的基因是cDNA。
依照本发明的逆转录病毒载体颗粒还将能感染并转导缓慢分裂的细胞以及如MLS的非慢病毒不能有效感染并转导的细胞。缓慢分裂的细胞大约每3到4天分裂一次。哺乳类非分裂细胞和缓慢分裂的细胞包括脑细胞、干细胞、末端分化的巨噬细胞、肺上皮细胞和各种其它细胞类型。其中还包括某些肿瘤细胞。虽然肿瘤包含快速分裂的细胞，但一些肿瘤细胞，特别是那些位于肿瘤中心的细胞，只是偶尔发生分裂。
这里所述的编码载体基因组的DNA构成物优选连接到一个高效启动子上，如CMV启动子。其它高效启动子是已知的，这就通过逆转录病毒生产系统产生了载体RNA的高水平表达。
用在依照本发明的逆转录病毒载体生产系统中的合适宿主或生产细胞是为本领域所熟知的。许多逆转录病毒已经被分裂(split)成复制缺陷型基因组和包装组份。对于那些还没有被分裂的逆转录病毒，将它们分裂在技术上是办得到的。生产细胞编码不由载体基因组编码的组份，如gag、pol和env蛋白。可以将gag、pol和env基因导入生产细胞并稳定地整合进细胞基因组，以提供一个包装细胞系。接着通过转染或转导将逆转录病毒载体的基因组导入包装细胞系，产生一个具有生产逆转录病毒载体颗粒所需的全部DNA序列的稳定的细胞系。另一种方法是，通过瞬间三转染，将产生逆转录病毒载体颗粒所需的不同DNA序列(如env编码序列、gag-pol编码序列以及有缺陷的逆转录病毒基因组)同时导入细胞。在一个依照本发明所优选的系统中，结构性组份和载体基因组都由稳定地整合进宿主细胞基因组的DNA编码。
在附图中：
图1显示了一个依照本发明载体生产系统，这个系统使用对293T细胞的三质粒共转染；
图2显示了本发明中使用的基于HIV的载体基因组；
图3显示了本发明中使用的HIV-1gag-pol基因表达质粒；
图4显示了依照本发明缺失五种辅助因子的载体的转导效率。
为产生一个安全的没有所有非必需基因的HIV包装系统，我们开发了一个不包含vpr、nef、tat、vif或vpu的系统(图1)。包装组份位于三个独立的质粒上，并且重叠序列被最小化，以此保证不发生重组并且不产生辅助病毒。已经显示，这个HIV载体在缺乏vpr的情况下转导蚜栖菌素处理的非分裂细胞。获得的滴度与Naldini等人使用的包含所有辅助基因的系统得到的滴度相似(Naldini等人，1996a)。
这就是第一个最小化的慢病毒载体系统。使用这个系统观察到高滴度的事实表明，辅助基因(除rev外)对于产生高滴度和转导非分裂细胞是多余的。这与Naldini等人作出的假设相矛盾，所述假设是：高滴度病毒储备产生的原因是附属蛋白(如nef)插入病毒颗粒中(Naldini等人，1996)。
所述系统可能对HIV治疗有其它好处。使用一个不同的启动子，如组成型HCMV启动子取代HIV-1LTR，使得能够使用抗Tat分子如Tat反式显性突变体(Echetebu等人，1994)或TAR decoy(Lisziewicz等人，1993)作为治疗剂，因为它们不会影响载体的产生。
显然，这里所述的缺少所有野生型病毒辅助基因的最小化慢病毒载体也可以用作疫苗。
                  实施例材料与方法质粒的构建
pGP-RRE1是由pWI3(Kim等人，1989)得到的gagpol vif表达质粒。将pWI3的RRE(保藏号：U26942)通过平端化Sty I/Sty I片段(7720-8050)插入Sma I切割的pBluescript KS+，产生pBSRRE。将pWI3的NarI/Eco RI片段(637-5763)插入用Cla I和Eco RI切割的pBSRRE，产生pBSGPRRE1。将Xho I/Not I片段(包含gagpol和RRE)插入表达质粒pCI-Neo，产生pGP-RRE1。为去除vif编码区，将pBSGPRRE1用Nde I和Sma I切割、平端化并重新连接，产生pBSGPRRE2。将gagpol和RRE在Xho I位点和Not I位点插入pCI-Neo，产生pGPRRE2。已经有人描述了pTIN406、pTIN408和pTIN414的构建(Cannon等人，1996)。pH3Z和pH4Z的5′LTR含一个位于U3位置的CMV启动子、HIV R以及U5区。通过平端化HIVgpt(Page等人，1990)的Cla I位点(829)产生一个移码突变，从而产生HIVdge。将HIVdge用Bgl II和Pst I切割(473-1414)并插入pTIN406。pTIN406具有一个含有CMV、R(HIV)和U5(MLV)的LTR结构。这产生了一个名为pBS5′的杂种LTR，其包含CMV和来自HIV的R、U5。为给质粒提供rev和RRE，从HIVdgel.2上切下EcoRI/Xho I片段(5743-8897)并插入pBS5′，以产生pBS5′R；其中HIVdgel.2是HIVdge的衍生物，其包含从Nde I到Bgl II(6403-7621)的缺失。将pBS3′的Not I/Xho I片段插入pBS5′R产生pH2，以提供3′LTR。pBS3′是通过一个三步连接将pWI3的Xho I/Hind III片段和pTIN408的Hind III/Kpn I片段插入pBluescript KS+(Xho I/Kpn I)而产生的。将一个来自pSPCMV的CMV启动子(Sal I/Xho I)插入pH2的单一Xho I位点，产生pH2CMV。pSPCMC是通过将pLNCX(保藏号：M28246)(Pst I/Hind III)插入pSP72(Promega)而产生的。将来自pTIN414的β-半乳糖苷酶基因插入pSP72(Xho I/Sph I)，以产生pSPlacZ。用Xho I/Sal I消化pSPlacZ以获得β-半乳糖苷酶编码区，将其插入pH2-CMV以提供pH3Z。构建pH4Z以产生tat缺陷型载体。如下去除tat编码区的前50bp以产生pH4：用PCR引物DELT5(5′-
CGTGAATTCGCCTAAAACTGCTTGTACCA-3′)和DELT3(5′-
GAACTAATGACCCCGTAATTG-3′)进行扩增得到的Eco RI(5881)-Spe IPCR产物，取代pH3中的Eco RI(5743)I-Spe I片段。将来自pH4的NsiI/Spe I片段插和pH3Z以产生pH4Z。
通过使用下列引物，PCR扩增pNL4.3(保藏号：U26942)的vpr编码区，以构建一个vpr表达载体：5′引物GCGAATTCGGATCCACCATGGAACAAGCCCCAGAAGAC(5563-5583)和3′引物GCGAATTCGGATCCTCTAGGATCTACTGGCTCCATT(5834-5853)。将这个扩增子克隆进pLIGATOR(R&D Systems)。将包含vpr编码区的Mlu I和Xho I片段插入pCI-Neo(Promega)，以产生表达质粒pCI-vpr。
用Bam HI切割pAC29.1，以提供插入pSA91(Bgl II)中的VSV-G编码区。细胞系
用Dulbelco改进的Eagle培养基(GIBCO)维持293T(293ts/A1609)(DuBridge等人，1987)细胞，用MEM(GIBCO)维持HeLa细胞和208F细胞，所有的培养基都含有10％(v/v)的补充了抗生素的胎牛血清。载体的生产和评估
根据我们以前公布的方法(Soneoka等人，1995)产生逆转录病毒载体原液。简要地说，将人类肾293T(15×106)细胞铺展(plate)在10cm平板上，然后采取磷酸钙DNA沉淀法，用每种质粒(gag-pol表达质粒和env表达质粒以及一种载体质粒)各15mg瞬间转染细胞(Chen和Okayama，1987)。36小时后收获培养上清液，通过0.45mm过滤，然后或立即使用或-70℃冻存。在存在8mg/ml polybrene的情况下，将病毒加入靶细胞两小时进行转导，然后加入新鲜培养基。48小时后，用5-溴-4-氯-3-吲哚基b-D-半乳糖苷(X-Gal)检测β-半乳糖苷酶的表达，正如以前所述的(Soneoka等人，1995)。计数每毫升lac z(蓝色转化灶)形成单位的数目(l.f.u./ml)以获得滴度。通过在感染前24小时和实验期间每天加入蚜栖菌素(5mg/ml)来制备Gl/S期停滞的培养物。结果HIV载体的生产
H3Z(tat阳性)和H4Z(tat阴性)是基于HIV-1的载体，经设计通过对293T细胞的三质粒共转染产生(图2)。为了被HIV核心有效地包装，所述载体包含gag的前778个碱基，但在距ATG起始密码子的第40bp引入了一个移码突变，以防止gag蛋白的表达。RRE也包括在内以提高包装效率，rev从载体上表达以支持HIV mRNA的输出。将内部CMV启动子驱动的β-半乳糖苷酶基因插入，以作为一个报告基因。对于两个载体基因组来说，都使用已用来取代了5′LTR U3的CMV启动子来驱动转录。这使得载体基因组是tat非依赖性的。制造了两个HIV gagpol构成物(图3)：pGP-RRE1(vif阳性)和pGP-RRE2(vif阴性)。由于已将gagpol基因插入一个CMV驱动的表达质粒pCI-Neo，因此gagpol的表达是tat非依赖性的。使用VSV糖蛋白的构成物pRV67进行假型化。通过将不同的基因置于不同的质粒上，通过重组产生可复制的病毒的可能性被最小化了。载体的转导效率
如上所述用三质粒瞬间共转染人类肾293T细胞，产生复制缺陷型逆转录病毒颗粒，立即使用或-70℃冻存。使用不同的载体构成物产生病毒。已经发现最小化的构成物(H4Z和pGP-RRE2)产生与vif、vpr、nef和tat阳性病毒相当的滴度(表1)。
当在不同的细胞系上测试所述最小化系统时，滴度是不同的(表2)。在293T细胞上，当用polybrene处理时，所述载体产生了3.2×105l.f.u./ml的滴度；当不用polybrene处理时，所述载体产生了9.1×104l.f.u./ml的滴度。相同的载体，当不用polybrene处理时，在HeLa细胞和208F细胞上分别产生了9.6×103l.f.u./ml和8.3×103l.f.u./ml的滴度。这些滴度与Naldini等人，1996(Naldini等人，1996)得到的滴度相当，而他们的滴度是目前公布的最高的滴度。vpr在对蚜栖菌素处理细胞的转导中的效应
为测试vpr在对非分裂细胞的转导中的效应，通过将质粒pCI-vpr与质粒pH4Z、pGP-RRE2和pRV67共转染，将vpr包括进包装系统。在正在生长和生长停滞的293T细胞和HeLa细胞上，评估所产生的病毒颗粒的转导效率(图4)。将从MLV得到的包装和转导载体(Soneoka，1995)作为对照。通过蚜栖菌素处理使HeLa细胞和293T细胞停滞在Gl/S期。最小化HIV载体H4Z对Gl/S停滞的HeLa细胞和293T细胞的转导和其对正在增殖的HeLa细胞和293T细胞的转导同样有效率，而基于MLV的载体的效率仅是H4Z的0.002％。
vpr缺陷型H4Z能与包含vpr的载体同样有效地转导生长停滞的细胞，这表明HIV-1MA足以提供载体以转导非增殖细胞的能力。结论
基于三质粒共转染的方法，我们已经建立了一个基于HIV-1的载体生产系统，其不包含vpr、vpu、nef、vif和tat。这个载体能转导正在增殖的细胞，其滴度达到3.2×105l.f.u./ml，这个滴度与其它基于MLV的载体相当，并且还可以通过起速离心进行浓缩而轻易地提高(数据未显示)。没有检测到辅助病毒(数据未显示)。
已经证明，这个最小化的载体与包含vpr、vif、nef和tat的载体同样有效率地转导生长停滞的HeLa细胞和293T细胞。因此可以得到结论：只有rev是产生高滴度基于HIV的载体所必需的，并且这些载体能转导非分裂细胞。
这是构建高滴度的能转导非分裂细胞的最小化慢病毒载体的第一份报告。六个辅助基因中五个基因的去除(除rev外)和质粒之间最小化的序列重叠，使得这个系统成为至今最安全的用于生产基因治疗的HIV载体的系统。图例
图2.HIV载体基因组。数字代表从HXB2开始的坐标。HCMV启动子(-597到-1)。从HXB2开始的HIV序列(455到1415；5743(H3Z)或5881(H4Z)到6403；7621到8897；8897到9720)。作为一个内部启动子的HCMV启动子900(bp)。克隆位点(Xho I)。骨架：pBluescriptKS+。
图3.HIV-1gag-pol基因表达质粒。HIV gag-pol编码区和RRE在Xho I位点和Not I位点克隆进pCI-neo(PROMEGA)。
图4.对非增殖细胞的转导。用X-gal染色检测H4Z载体的转导效率，并在Y轴上以l.f.u./ml显示出来。通过用蚜栖菌素(5μg/ml)处理细胞，来制备Gl/S期停滞的细胞。参考资料Akkina，R.K.，Walton，R.M.，Chen，M.L.，Li，Q.X.，Planelles，V.和Chen，I.S.(1996).病毒学杂志.70，2581-2585.Barillari，G.，Gendelman，R.，Gallo，R.C.和Ensoli，B.(1993).美国国家科学院学报90，7941-7945.Buchschacher，G.L.，Jr.和Panganiban，A.T.(1992).病毒学杂志66，2731-2739.Bukrinsky，M.I.Haggerty，S.，Dempsey，M.P.，Sharova，N.，Adzhubel，A.，Spitz，L.，Lewis，P.，Goldfarb，D.，Emerman，M.和Stevenson，M.(1993).自然365，666-669.Cannon，P.M.，Kim，N.，Kingsman，S.M.和Kingsman，A.J.(1996).病毒学杂志70，8234-8240.Chen，C.和Okyama，H.(1987).分子细胞生物学7，2745-2752.Echetebu，C.0.，H.Rhim，C.H.Herrmann和A.P.Rice(1994)，获得性免疫缺陷综合症杂志7，655-664.Ensoli，B.，Barillari，G.，Salahuddin，S.Z.，Gallo，R.C.和WongStaal，F.(1990).自然345，84-86.Gallay，P.，Stitt，V.，Mundy，C.，Oettinger，M.和Trono，D.(1996).病毒学杂志70，1027-1032.Heinzinger，N.K.，Bukinsky，M.I.，Haggerty，S.A.，Ragland，A.M.，Kewalramani，V.，Lee，M.A.，Gendelman，H.E.，Ratner，L.，Stevenson，M.和Emerman，M.(1994).美国国家科学院学报91，7311-7315.Joag，S.V.，Stephens，E.B.和Narayan，O.病毒学领域，第2卷，1970-1982(Lippincott-Raven Publishers).Jowett，J.B.，Planelles，V.，Poon，B.，Shah，N.P.，Chen，M.L.和Chen，I.S.(1995).病毒学杂志69，6304-6313.Kim，S.Y.，Byrn，R.，Groopman，J.和Baltimore，D.(1989).病毒学杂志63，3708-3713.Lever，A.，Gottlinger，H.，Haseltine，W.和Sodroski，J.(1989).病毒学杂志63，4085-4087.Levy，D.N.，L.S.Fernandes，W.V.Williams，和D.B.Weiner(1993)，细胞，72，541-50.Levy，D.N.，Y.Refae；；和D.B.Weiner(1995)，病毒学杂志，69，1243-52.Lisziewicz，J.，D.Sun，J.Smythe，P.Lusso，F.Lori，A.Louie，P.Markham，J.Rossi，M.Reitz和R.C.Gallo(1993)，美国国家科学院学报90，8000-4.Mahalingam，S.，Collman，R.G.，Patel，M.，Monken，C.E.和Srinivasan，A.(1995).病毒学212，331-339.Nalnidi，L.，Blomer，U.，Gallay，P.，Ory，D.，Mulligan，R.，Gage，F.H.，Verma，I.M.和Trono，D.(1996).科学272，263-267.Naldini，L.，Blomer，U.，Gage，F.H.，Trono，D.和Verma，I.M.(1996).美国国家科学院学报93，11382-11388.Page，K.A.，Landau，N.R.和Littman，D.R.(1990).病毒学杂志64，5270-5276.Poznansky，M.，Lever，A.，Bergeron，L.，Haseltine，W.和Sodroski，J.(1991).病毒学杂志65，532-536.Richardson，J.H.，Kaye，J.F.，Child，L.A.和Lever，A.M.(1995).普通病毒学杂志76，691-696.Ross，G.，Erickson，R.，Knorr，D.，Motulsky，A.G.，Parkman，R.，Samulski，J.，Straus，S.E.和Smith，B.R.(1996).人类基因治疗7，1781-1790.Shimada，T.，Fujii，H.，Mitsuya，H.和Nienhuis，A.W.(1991).临床研究杂志88，1043-1047.Tomonaga，K.和Mikami，T.(1996).普通病毒学杂志77，1611-1621.表1.附属基因的表达对病毒滴度的影响附属基因                   质粒                       滴度
                                                 (l.f.u./ml)aTat  Vif  Nef  Vpr  载体   Gagpol    Nef     Vpr+     +    -    +   pH3Z  pGP-RRE1          pCI-Vpr    2.2×105+     +    +    -   pH3Z  pGP-RRE1  pC-Nef             2.5×105+     +    -    -   pH3Z  pGP-RRE1                     4.0×105+     -    -    -   pH3Z  pGP-RRE2                     3.7×105-     -    -    -   pH4Z  pGP-RRE2                     4.6×105a：在293细胞中测定转导效率：在转导后进行X-gal染色48小时，然后计数蓝色集落的数目；转导效率用lacZ集落形成单位每毫升病毒原液(l.f.u./ml)的单位表示。表2.最小化H4Z载体在不同的细胞系中的转导效率细胞系                                    滴度(l.f.u./ml)a
                              不用polybrene处理使用polybrene处
                                             理293T  人类肾细胞          9.1×104             3.2×105HeLa  人类上皮细胞        9.6×103             N.D.208f  大鼠成纤维细胞      8.3×103             N.D.a：转导效率的测定：在转导后进行X-gal染色48小时，然后计数蓝色集落的数目；转导效率用lacZ集落形成单位每毫升病毒原液(l.f.u./ml)的单位表示。

Claims (19)

1.一个逆转录病毒载体生产系统，生产用于基因治疗、基于慢病毒的复制缺陷型载体颗粒；所述载体颗粒能感染并转导非分裂的哺乳类靶细胞，所述系统包含一组编码该载体组份的核酸序列，其中选自以下的一个或多个有功能的基因从所述系统中缺失：HIV-1辅助基因vpr、vif、tat和nef或其它慢病毒上相似的辅助基因(这些辅助基因通常出现在载体颗粒所基于的慢病毒上)。
2.依照权利要求1的逆转录病毒载体生产系统，用于生产基于HIV-1的载体颗粒，其中还缺失了有功能的辅助基因vpu，条件是当有功能的vpu和vpr基因都缺失时，从vif、tat和nef中选出的一个或多个辅助基因也缺失。
3.依照权利要求1或2的逆转录病毒载体生产系统，其中有功能的vpr和tat基因或通常出现在载体颗粒所基于的慢病毒上的相似基因都从所述系统中缺失。
4.依照权利要求1到3中任一项的逆转录病毒载体生产系统，用于生产基于HIV的载体颗粒，其中有功能的辅助基因vpr、vif、tat、nef和vpu中的三个或四个或所有五个从所述系统中缺失。
5.依照权利要求1至4中任一项的逆转录病毒载体生产系统，其中一个编码载体RNA基因组的核酸序列包含一个或多个有治疗活性的基因。
6.依照权利要求1到5中任一项的逆转录病毒载体生产系统，其中编码载体组份的一组核酸序列包含3个DNA构成物，这3个DNA构成物分别编码载体的RNA基因组、gag蛋白和pol蛋白以及env蛋白或一个env蛋白的取代物。
7.依照权利要求1到6中任一项的逆转录病毒载体生产系统，其中编码载体RNA基因组的核酸序列包含rev和RRE序列或有功能的等同物，以使得基因组的转录物能从核输出到胞质。
8.在宿主细胞中的依照权利要求1到7中任一项的逆转录病毒载体生产系统。
9.依照权利要求1至8中任一项的逆转录病毒载体生产系统，其中通常出现在载体颗粒所基于的慢病毒上的所有有功能的辅助基因(除rev外)都从所述系统中缺失，而rev可任选的出现在所述系统中。
10.用在依照权利要求9的系统中的DNA构成物，所述DNA构成物编码一个可包装的RNA载体基因组，并可操作地连接于一个启动子。
11.一种如权利要求10所要求保护的DNA构成物，其中所述启动子是一个非逆转录病毒的高效启动子。
12.用于依照权利要求9的系统中的一组DNA构成物，包括依照权利要求10或11的DNA构成物和一个编码gag蛋白和pol蛋白的构成物。
13.一组如权利要求12所要求保护的DNA构成物，还包括一个编码env蛋白或env蛋白的替代物的DNA构成物。
14.使用在依照权利要求9的系统中的DNA构成物，包括位于一个或多个表达载体上的依照权利要求10到14中任何一项的DNA构成物。
15.由依照权利要求1到9中任何一项的系统产生的逆转录病毒载体颗粒。
16.依照权利要求15的逆转录病毒载体颗粒的应用，用于基因治疗以感染并转导靶细胞。
17.依照权利要求15的逆转录病毒载体颗粒的应用，用于制备在基因治疗中使用的药物。
18.用于对靶细胞进行基因治疗的方法，该方法包括用依照权利要求15的逆转录病毒载体颗粒感染并转导所述靶细胞。
19.由依照权利要求16到18中任何一项的应用或方法产生的靶细胞。
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