CN118019758A - 编码免疫原性降低的因子viii多肽的核酸 - Google Patents

Abstract

本公开文本提供了密码子优化的因子VIII序列、包含密码子优化的因子VIII序列的载体和宿主细胞、由密码子优化的因子VIII序列编码的多肽以及产生此类多肽的方法。

Description

编码免疫原性降低的因子VIII多肽的核酸

相关申请

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背景技术

向患者提供低成本重组FVIII蛋白的主要障碍是商业生产的高成本。FVIII蛋白在异源表达系统中表达较差，比类似大小的蛋白质低二至三个数量级。(Lynch等人,Hum.Gene.Ther.；4:259-72(1993))。FVIII的较差表达部分是由于FVIII编码序列中抑制FVIII表达的顺式作用元件的存在，所述顺式作用元件如转录沉默子元件(Hoeben等人,Blood 85:2447-2454(1995))、基质附着样序列(MAR)(Fallux等人,Mol.Cell.Biol.16:4264-4272(1996))和转录延伸抑制元件(Koeberl等人,Hum.Gene.Ther.；6:469-479(1995))。因此，本领域对在异源系统中高效表达的FVIII序列存在需要。

发明内容

公开了编码具有FVIII活性的多肽的密码子优化的核酸分子。

在某些方面，本文公开了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含与SEQID NO:11具有至少85％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有因子VIII活性的多肽。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:11具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。本文还公开了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有因子VIII活性的多肽。

本文还公开了分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:11的核苷酸58-4815具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，根据权利要求1-5中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:11的核苷酸58-4815。

在某些方面，本文公开了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含与SEQID NO:14具有至少85％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有因子VIII活性的多肽。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:14具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:14具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。本文还公开了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有因子VIII活性的多肽。

在另一个方面，本文公开了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含表达因子VIII多肽的基因盒，其中所述基因盒包含与SEQ ID NO:16具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述基因盒包含与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述基因盒包含与SEQ ID NO:16具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。本文还公开了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含表达因子VIII多肽的基因盒，其中所述基因盒包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。

在另一个方面，本文公开了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含表达因子VIII多肽的基因盒，所述基因盒包含：编码FVIII蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14具有至少85％序列同一性的核酸序列；控制所述核苷酸序列的转录的启动子；和转录终止序列。

在一些实施方案中，所述启动子是肝脏特异性启动子。在一些实施方案中，所述启动子是小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子。在一些实施方案中，所述启动子是mTTR482启动子。在一些实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述分离的核酸分子还包含增强子元件。在一些实施方案中，所述增强子元件是mTTR增强子元件。在一些实施方案中，所述mTTR增强子元件包含SEQ IDNO:8的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述分离的核酸分子还包含合成增强子序列。在一些实施方案中，所述合成增强子序列包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核酸分子还包含多嘌呤区(polypurine tract)(PPT)。在一些实施方案中，所述PPT序列包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核酸分子还包含人CMV启动子区序列。在一些实施方案中，所述CMV启动子区序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核酸分子还包含5’长末端重复(LTR)序列。在一些实施方案中，所述核酸分子还包含3’LTR序列。

在一些实施方案中，所述核酸分子还包含茎环4序列。在一些实施方案中，所述茎环4序列包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核酸分子还包含SL123的引物结合位点。在一些实施方案中，所述SL123的引物结合位点包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核酸分子还包含RU5区的引物结合位点。在一些实施方案中，所述RU5区序列包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

在另一个方面，本文公开了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含表达因子VIII多肽的基因盒，其中所述基因盒从5’至3’包含：5’长末端重复(LTR)序列；包含SEQID NO:9的核苷酸序列的肝脏特异性的经修饰的小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子；包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14具有至少85％序列同一性的核酸序列的编码FVIII蛋白的核苷酸序列；和3’LTR序列。

在另一个方面，本文公开了一种载体，所述载体包含本文公开的核酸分子。

在另一个方面，本文公开了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文公开的核酸分子。本文还公开了由所述宿主细胞产生的多肽。

在另一个方面，本文公开了一种产生具有FVIII活性的多肽的方法，所述方法包括：将本文公开的宿主细胞在产生具有FVIII活性的多肽的条件下培养，以及回收所述具有FVIII活性的多肽。

在另一个方面，本文公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文所公开的核酸分子。在一些实施方案中，所述药物组合物包含含有本文公开的核酸分子的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

在另一个方面，本文公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含本文公开的核酸分子和用于向有需要的受试者施用所述核酸分子的说明书。

在另一个方面，本文公开了一种增加受试者中的具有FVIII活性的多肽的表达的方法，所述方法包括施用包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少80％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。

在另一个方面，本文公开了一种治疗受试者的出血障碍的方法，所述方法包括施用包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，所述治疗受试者的出血障碍的方法包括施用本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述出血障碍是血友病A。

附图说明

图1是coBDDFVIII6-XTEN-3aa表达质粒的图形表示。

图2A-图2B是在大约25周内，如通过FVIII血浆活性(图2A)和FVIII血浆抗原水平(图2B)测量的，在以1.5x 10⁹、3.0x 10⁹、6.0x 10⁹或1.3x 10¹⁰TU/kg剂量经由颞静脉注射施用表达coBDDFVIII6-XTEN-3aa的慢病毒的新生(2日龄)HemA小鼠中的峰值循环FVIII水平的图形表示。

图3是在大约25周内，如通过FVIII血浆活性测量的，在以1.3x 10¹⁰或3.7x10¹⁰TU/kg剂量经由尾静脉注射施用表达coBDDFVIII6-XTEN-3aa的慢病毒的成年(16周龄)HemA小鼠中的峰值循环FVIII水平的图形表示。

图4A-图4B是在施用3x 10⁹TU/kg或6x 10⁹TU/kg的表达coBDDFVIII6-XTEN-3aa的慢病毒的雄性猪尾猕猴中的人FVIII活性(图4A)和人FVIII抗原水平(图4B)的峰值血浆水平的图形表示。将FVIII血浆活性(图4A)和FVIII血浆抗原水平(图4B)表示为跨多个时间点的平均值。

具体实施方式

本公开文本涉及编码具有因子VIII(FVIII)活性的多肽的密码子优化的核酸分子、包含优化的核酸分子的载体和宿主细胞、由优化的核酸分子编码的多肽、和产生此类多肽的方法。本公开文本还涉及治疗出血障碍(如血友病)的方法，所述方法包括向所述受试者施用优化的FVIII核酸序列、包含优化的核酸序列的载体或由此编码的多肽。

本公开文本通过提供优化的FVIII序列满足了本领域中的重要需求，所述优化的FVIII序列显示出在宿主细胞中的表达增加、在产生重组FVIII的方法中的改善的FVIII蛋白产率、以及在用于基因治疗方法时潜在地导致更大的治疗功效。在某些实施方案中，本公开文本描述了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:11的核苷酸序列具有序列同源性的核苷酸序列。在某些实施方案中，本公开文本描述了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:14的核苷酸序列具有序列同源性的核苷酸序列。在某些实施方案中，本公开文本描述了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:16的核苷酸序列具有序列同源性的核苷酸序列。

为了提供对说明书和权利要求书的清晰理解，下文提供了以下定义。

定义

应注意，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”实体是指一个/一种或多个/多种所述实体：例如，“一个核苷酸序列”应理解为代表一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一个/一种(a)”(或“一个/一种(an)”)、“一个/一种或多个/多种”和“至少一个/一种”在本文中可互换使用。

术语“约”在本文中用于意指大约、大致、大约地或在…左右。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展所述数值的上下边界来修改该范围。通常，术语“约”在本文中用于向上或向下(较高或较低)以10％的差异修饰高于和低于所述值的数值。

出于本公开文本的目的的术语“分离的”指定已经从其原始的环境(它天然存在的环境)中移出的生物材料(细胞、多肽、多核苷酸或其片段、变体或衍生物)。例如，在植物或动物中以天然状态存在的多核苷酸是未分离的，然而与它天然存在的邻近核酸分离的相同的多核苷酸被认为是“分离的”。不要求具体纯化水平。为了本公开文本的目的，重组产生的多肽和宿主细胞中表达的蛋白质被视为是分离的，已经通过任何适当的技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组多肽亦是如此。

“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且是指呈单链形式或双链螺旋的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式或其任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯和硫代酸酯。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子、特别是DNA或RNA分子仅仅是指分子的一级和二级结构，并且不将其限制为任何特定三级形式。因此，这个术语包括尤其在线性或环状DNA分子(例如，限制性片段)、质粒、超螺旋化DNA和染色体中发现的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时，在本文中可以根据常规习惯描述序列，仅沿DNA的非转录链(即，具有与mRNA同源的序列的链)以5’至3’方向给出序列。“重组DNA分子”是已经经历分子生物学操纵的DNA分子。DNA包括但不限于cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成DNA和半合成DNA。本公开文本的“核酸组合物”包含如本文所述的一种或多种核酸。

如本文所用，“编码区”或“编码序列”是多核苷酸中由可翻译成氨基酸的密码子组成的部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)通常不翻译成氨基酸，但是可以认为其是编码区的一部分，但是任何侧接序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等)不是编码区的一部分。编码区的边界通常由5’末端的起始密码子(编码所得多肽的氨基末端)和3’末端的翻译终止密码子(编码所得多肽的羧基末端)来决定。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如，在单一载体上)，或者存在于单独的多核苷酸构建体中(例如，在单独的(不同的)载体上)。然后，结果就是单一载体可以仅含有单个编码区，或者包含两个或更多个编码区。

哺乳动物细胞分泌的某些蛋白质与分泌信号肽相关，一旦生长中的蛋白质链跨越糙面内质网的输出已经起始所述分泌信号肽便从成熟蛋白质被切割下来。本领域普通技术人员知道，信号肽通常融合至多肽的N末端，并且从完整或“全长”多肽被切割下来以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中，天然信号肽或该序列的保留指导多肽分泌的能力的功能衍生物与所述多肽可操作地缔合。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽(例如，人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶信号肽)或其功能衍生物。

术语“下游”是指核苷酸序列位于参考核苷酸序列的3’。在某些实施方案中，下游核苷酸序列涉及转录起始点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。

术语“上游”是指核苷酸序列位于参考核苷酸序列的5’。在某些实施方案中，上游核苷酸序列是指位于编码区或转录起点的5’侧的序列。例如，大多数启动子位于转录起始位点的上游。

如本文所用，术语“基因盒”、“表达盒”和“基因表达盒”可互换使用，并且意指能够指导特定多核苷酸序列在适当的宿主细胞中表达的DNA序列，其包含与感兴趣多核苷酸序列可操作地连接的启动子。基因盒可以涵盖位于编码区上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)，且影响相关编码区的转录、RNA加工、稳定性或翻译的核苷酸序列。如果意图在真核细胞中表达编码区，则多聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码序列的3’。在一些实施方案中，基因盒包含编码基因产物的多核苷酸。在一些实施方案中，基因盒包含编码miRNA的多核苷酸。在一些实施方案中，基因盒包含异源多核苷酸序列。编码产物(例如，miRNA或基因产物(例如，多肽，如治疗性蛋白质))的多核苷酸可以包括与一个或多个编码区可操作地缔合的启动子和/或其他表达(例如，转录或翻译)控制序列。在可操作缔合中，以将基因产物的表达置于一个或多个调控区的影响或控制下的方式将基因产物(例如，多肽)的编码区与所述一个或多个调控区缔合。例如，如果启动子功能的诱导引起编码由编码区所编码的基因产物的mRNA的转录，并且如果启动子与编码区之间的连接的性质不干扰启动子指导基因产物表达的能力或者不干扰DNA模板被转录的能力，则编码区和启动子“可操作地缔合”。除了启动子以外的其他表达控制序列(例如，增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号)也可以与编码区可操作地缔合以指导基因产物表达。

“表达控制序列”是指提供编码序列在宿主细胞中的表达的调控核苷酸序列，如启动子、增强子、终止子等。表达控制序列通常涵盖有助于与其可操作地连接的编码核酸的有效转录和翻译的任何调控核苷酸序列。表达控制序列的非限制性例子包括启动子、增强子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点或茎环结构。多种表达控制序列是本领域技术人员已知的。这些包括而不限于在脊椎动物细胞中起作用的表达控制序列，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子片段(即时早期启动子，与内含子A结合)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如劳氏肉瘤病毒)。其他表达控制序列包括衍生自脊椎动物基因的那些，如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β珠蛋白，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。另外的合适的表达控制序列包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如可由干扰素或白细胞介素诱导的启动子)。其他表达控制序列包括内含子序列、转录后调控元件和聚腺苷酸化信号。在本公开文本的其他地方讨论了另外的示例性表达控制序列。

类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES)。

如本文所用的术语“表达”是指多核苷酸产生基因产物(例如，RNA或多肽)的过程。它包括而不限于将多核苷酸转录成信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物以及将mRNA翻译为多肽。表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸，例如通过基因转录产生的信使RNA，或者是从转录物翻译的多肽。本文描述的基因产物还包括经过转录后修饰(例如聚腺苷酸化或剪接)的核酸，或经过翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、脂质的添加、与其他蛋白质亚基缔合或蛋白水解切割)的多肽。如本文所用，术语“产量”是指通过基因表达产生的多肽的量。

“载体”是指用于将核酸克隆和/或转移至宿主细胞中的任何媒介物。载体可以是复制子，另一核酸区段可以与其连接以实现所连接区段的复制。“复制子”是指在体内起自主复制单元的作用(即，能够在其自身控制下复制)的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”包括用于体外、离体或体内将核酸引入细胞的病毒载体和非病毒媒介物。很多载体是本领域已知和使用的，包括例如质粒、经修饰的真核病毒或经修饰的细菌病毒。将多核苷酸插入合适的载体中可以通过将适当多核苷酸片段连接至具有互补粘性末端的所选载体中来完成。

可以对载体进行工程化以编码可选标记或报告物，其提供对已经并入载体的细胞的选择或鉴定。选择性标记或报告物的表达允许鉴定和/或选择并入并表达含于载体上的其他编码区的宿主细胞。本领域中已知并使用的可选标记基因的例子包括：提供针对氨苄西林、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨磷除草剂、磺酰胺等的抗性的基因；和用作表型标记的基因，即花色苷调控基因、异戊烷基转移酶基因等。本领域中已知并使用的报告物的例子包括：荧光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。还可以将可选标记视为报告物。

术语“可选标记”是指能够基于标记基因的效应(即，对抗生素的抗性、对除草剂的抗性、比色标记、酶、荧光标记等)加以选择的鉴定因子(通常是抗生素或化学抗性基因)，其中所述效应用于跟踪所关注核酸的遗传和/或鉴定已经遗传所关注核酸的细胞或生物体。本领域中已知并使用的可选标记基因的例子包括：提供针对氨苄西林、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨磷除草剂、磺酰胺等的抗性的基因；和用作表型标记的基因，即花色苷调控基因、异戊烷基转移酶基因等。

术语“报告基因”是指编码能够基于报告基因的效应加以鉴定的鉴定因子的核酸，其中所述效应用于跟踪所关注核酸的遗传性、鉴定已经遗传所关注核酸的细胞或生物体和/或测量基因表达诱导或转录。本领域中已知并使用的报告基因的例子包括：萤光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。也可以将可选标记基因视为报告基因。

“启动子”与“启动子序列”可互换使用并且是指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以整体衍生自天然基因，或由衍生自见于自然界的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成DNA片段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可指导基因在不同组织或细胞类型中，或在不同发育阶段，或响应不同环境或生理条件而表达。使基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子一般被称为“组成型启动子”。使基因在特定细胞类型中表达的启动子一般被称为“细胞特异性启动子”或“组织特异性启动子”。使基因在发育或细胞分化的特定阶段表达的启动子一般被称为“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”。在用诱导启动子的试剂、生物分子、化学品、配体、光等暴露或处理细胞后被诱导并且使基因表达的启动子一般被称为“诱导型启动子”或“可调型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下，尚未完全界定调节序列的确切边界，所以不同长度的DNA片段可具有相同启动子活性。在本公开文本的其他地方讨论了另外的示例性启动子。

启动子序列通常在其3’末端以转录起始位点为界，并向上游(5’方向)延伸以包括以高于背景的可检测水平起始转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内将发现转录起始位点(例如通过用核酸酶S1标示(mapping)方便地界定)以及负责RNA聚合酶的结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。

术语“质粒”是指通常携带并非细胞的中心代谢的一部分的基因，并且通常呈环状双链DNA分子的形式的染色体外元件。此类元件可以是衍生自任何来源的单链或双链DNA或RNA的线性、环状或超螺旋化的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中多个核苷酸序列已经接合或重组至独特构建中，所述构建能够将用于所选基因产物的启动子片段和DNA序列以及适当的3'非翻译序列引入细胞中。

可以使用的真核病毒载体包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒(例如，痘苗病毒载体)、杆状病毒载体或疱疹病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电脂质(细胞转染素)、DNA-蛋白质复合物和生物聚合物。

“克隆载体”是指“复制子”，其是单位长度的连续复制的核酸并且其包含复制起点，如质粒、噬菌体或粘粒，另一核酸区段可以与所述复制子连接以实现所连接区段的复制。某些克隆载体能够在一种细胞类型(例如，细菌)中复制，并在另一细胞类型(例如，真核细胞)中表达。克隆载体通常包含一个或多个可以用于选择包含载体的细胞的序列和/或一个或多个用于插入感兴趣核酸序列的多克隆位点。

术语“表达载体”是指设计用于在插入宿主细胞内后能够表达插入的核酸序列的媒介物。如上所述，插入的核酸序列以与调节区处于可操作缔合放置。

通过本领域熟知的方法将载体引入宿主细胞中，所述方法是例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)、使用基因枪或DNA载体转运蛋白。

如本文所用，“培养(culture)”、“培养(to culture)”和“培养(culturing)”意指在允许细胞生长或分裂的体外条件下孵育细胞或使细胞维持存活状态。如本文所用，“培养的细胞”是指体外繁殖的细胞。

如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不涉及产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语包括于“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任一个术语或与其互换使用。术语“多肽”还意图指多肽的表达后修饰的产物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生、蛋白质水解切割或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以从天然生物来源衍生或通过重组技术产生，但不一定是从指定的核酸序列翻译。其能以任何方式产生，包括通过化学合成产生。

术语“氨基酸”包括丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(Ile或I)；亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；和缬氨酸(Val或V)。非传统氨基酸也在本公开文本的范围内，并且包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，如Ellman等人Meth.Enzym.202:301-336(1991)中所述的那些。为了产生此类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等人Science 244:182(1989)和Ellman等人,同上的程序。简单来说，这些程序涉及用非天然存在的氨基酸残基化学激活抑制剂tRNA，之后进行RNA的体外转录和翻译。引入非传统氨基酸也可以使用本领域中已知的肽化学来实现。如本文所用，术语“极性氨基酸”包括具有零个净电荷，但是在其侧链的不同部分具有非零部分电荷的氨基酸(例如，M、F、W、S、Y、N、Q、C)。这些氨基酸可以参与疏水相互作用和静电相互作用。如本文所用，术语“带电氨基酸”包括在其侧链上具有非零净电荷的氨基酸(例如，R、K、H、E、D)。这些氨基酸可以参与疏水相互作用和静电相互作用。

本公开文本中还包括多肽的片段或变体及其任何组合。术语“片段”或“变体”在涉及本公开文本的多肽结合结构域或结合分子时包括保留参考多肽的至少一些特性(例如，对FcRn结合结构域或Fc变体的FcRn结合亲和力、对FVIII变体的凝结活性或对VWF片段的FVIII结合活性)的任何多肽。除了本文其他地方讨论的特异性抗体片段之外，多肽的片段还包括蛋白水解片段以及缺失片段，但不包括天然存在的全长多肽(或成熟多肽)。本公开文本的多肽结合结构域或结合分子的变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的变体可以使用本领域中已知的诱变技术来产生。变体多肽可包含保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。

“保守氨基酸取代”是用具有类似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被来自相同侧链家族的另一种氨基酸替代，则将取代视为保守的。在另一个实施方案中，一串氨基酸可以用结构相似、侧链家族成员的顺序和/或组成不同的串保守地替换。

如本领域中已知的术语“同一性百分比”是两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列所确定。在本领域中，根据具体情况，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列关联性程度，如通过此类序列的串之间的匹配所确定。“同一性”可以通过已知的方法容易地计算，所述方法包括但不限于描述于以文献中的那些：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.编辑)Oxford UniversityPress,New York(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.编辑)Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,第I部分(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press,New Jersey(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology(von Heinje,G.编辑)Academic Press(1987)；和Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press,New York(1991)。确定同一性的优选方法设计为给出所测试序列之间的最佳匹配。确定同一性的方法被编纂于可公开获得的电脑程序中。序列比对和同一性百分比计算可以使用序列分析软件来进行，所述序列分析软件是例如LASERGENE生物信息学计算套件的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison,WI)、GCG程序套件(Wisconsin Package 9.0版，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison,WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403(1990))和DNASTAR(DNASTAR,Inc.1228S.Park St.Madison,WI53715USA)。在本申请的上下文中将理解，如果使用序列分析软件进行分析，除非另外指定，否则分析结果将基于所参考程序的“缺省值”。如本文所用的“缺省值”将意指在首次初始化时最初用软件加载的任一组值或参数。出于确定本公开文本的优化的BDD FVIII序列与参考序列之间的同一性百分比的目的，仅使用参考序列中对应于本公开文本的优化的BDDFVIII序列中的核苷酸的核苷酸来计算同一性百分比。例如，在比较含有B结构域的全长FVIII核苷酸序列与本公开文本的优化的B结构域缺失(BDD)FVIII核苷酸序列时，将使用包括A1、A2、A3、C1和C2结构域的比对部分来计算同一性百分比。全长FVIII序列的编码B结构域的部分(其将在比对中产生大的“空位”)中的核苷酸将不会被计为错配。另外，在确定本公开文本的优化的BDD FVIII序列或其指定部分(例如，SEQ ID NO:16的核苷酸2183-4474和4924-7006)与参考序列之间的同一性百分比时，将通过比对、用匹配核苷酸数除以如本文所述的优化的BDD-FVIII序列或其指定部分的完整序列中的核苷酸总数来计算同一性百分比。

如本文所用，术语“插入位点”是指FVIII多肽或其片段、变体或衍生物中的如下位置，其紧邻可以插入异源部分的位置的上游。“插入位点”被指定为一个编号，所述编号对应于成熟天然FVIII(SEQ ID NO:18)中插入位点对应的氨基酸的编号，其紧邻插入位置的N末端。例如，词组“a3在对应于SEQ ID NO:24的氨基酸1656的插入位点包含异源部分”指示，异源部分位于对应于SEQ ID NO:24的氨基酸1656和氨基酸1657的两个氨基酸之间。

如本文所用，短语“紧邻氨基酸的下游”是指与氨基酸的末端羧基紧紧相邻的位置。类似地，短语“紧邻氨基酸上游”是指紧邻氨基酸的末端胺基的位置。

如本文所用，术语“插入(inserted)”、“插入(is inserted)”、“插入(insertedinto)”或语法上相关的术语是指重组FVIII多肽中相对于天然成熟人FVIII(SEQ ID NO:18)中的类似位置而言的异源部分的位置。

如本文所用，术语“半衰期”是指体内具体多肽的生物半衰期。半衰期可以表示为施用受试者的量的一半被从动物的循环和/或其他组织中清除所需的时间。在将给定多肽的清除曲线构建为时间的函数时，所述曲线通常是双相的，具有快速的α相和较长的β相。α相通常代表所施用的Fc多肽在血管内与血管外空间之间的平衡，并且部分取决于多肽的大小。β相通常代表多肽在血管内空间中的分解代谢。在一些实施方案中，FVIII和包含FVIII的嵌合蛋白是单相的，并且因此不具有α相，而是只具有单一β相。因此，在某些实施方案中，如本文所用，术语半衰期是指多肽在β相中的半衰期。

如本文所用的术语“连接”是指第一氨基酸序列或核苷酸序列分别与第二氨基酸序列或核苷酸序列共价或非共价接合。第一氨基酸或核苷酸序列可以与第二氨基酸或核苷酸序列直接接合或并置，或者可替代地，插入序列可以将第一序列共价接合至第二序列。术语“连接”不仅意指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列在C末端或N末端融合，还包括将完整的第一氨基酸序列(或第二氨基酸序列)插入第二氨基酸序列(或分别地，第一氨基酸序列)中的任两个氨基酸中。在一个实施方案中，第一氨基酸序列可以通过肽键或接头连接至第二氨基酸序列。第一核苷酸序列可以通过磷酸二酯键或接头连接至第二核苷酸序列。接头可以是肽或多肽(对于多肽链)或者核苷酸或核苷酸链(对于核苷酸链)或者任何化学部分(对于多肽和多核苷酸链二者)。术语“连接”还通过连字符(-)指示。

如本文所用，术语“与……缔合”是指在第一氨基酸链与第二氨基酸链之间形成的共价或非共价键。在一个实施方案中，术语“与……缔合”是指共价、非肽键或非共价键。这种缔合可以用冒号表示，即(:)。在另一个实施方案中，它指除肽键外的共价键。例如，氨基酸半胱氨酸包含硫醇基，其可与第二个半胱氨酸残基上的硫醇基形成二硫键或二硫桥。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1区域和CL区域通过二硫键缔合，并且这两条重链通过在对应于使用Kabat编号系统的239和242的位置(位置226或229，EU编号系统)处的两个二硫键缔合。共价键的例子包括但不限于肽键、金属键、氢键、二硫键、σ键、π键、δ键、糖苷键、抓氢键、弯曲键、偶极键、反馈π键、双键、三键、四键、五键、六键、共轭、超共轭、芳香、哈普托数或反键。非共价键的非限制性例子包括离子键(例如阳离子-π键或盐键)、金属键、氢键(例如二氢键、分子氢配合物、低势垒氢键或对称氢键)、范德华力、伦敦分散力、机械键、卤键、亲金作用、嵌入、堆积、熵力或化学极性。

如本文所用，“止血”意指停止或减慢出血(bleeding)或出血症(hemorrhage)；或者停止或减慢血液流经血管或身体部分。

如本文所用，“止血障碍”意指遗传上的遗传性或获得性病症，特征在于由于形成纤维蛋白凝块的能力受损或无能，倾向于自发地或由于创伤而出血。此类障碍的例子包括血友病。三种主要形式是血友病A(因子VIII缺乏)、血友病B(因子IX缺乏或“克雷司马斯病”)和血友病C(因子XI缺乏，轻度出血倾向)。其他止血障碍包括例如血管性血友病、因子XI缺乏(PTA缺乏)、因子XII缺乏、纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII的缺乏或结构异常、GPIb缺陷或缺乏的巨血小板综合征。GPIb(VWF的受体)可能有缺陷并导致缺少初级凝块形成(初级止血)和增加的出血倾向、以及Glanzman和Naegeli的血小板无力症(Glanzmann血小板无力症)。在肝功能衰竭(急性和慢性形式)中，肝脏的凝结因子产生不足；这可能增加出血风险。

可以预防性地使用本公开文本的分离的核酸分子、分离的多肽或包含分离核酸分子的载体。如本文所用，术语“预防性治疗”是指在出血发作之前施用分子。在一个实施方案中，需要通用止血剂的受试者正在进行或即将进行手术。本公开文本的多核苷酸、多肽或载体可以作为预防药在手术之前或之后施用。本公开文本的多核苷酸、多肽或载体可以在手术期间或之后施用以控制急性出血发作。手术可包括但不限于肝移植、肝切除、牙科手术或干细胞移植。

本公开文本的分离的核酸分子、分离的多肽或载体也用于按需治疗。术语“按需治疗”是指响应出血发作的症状或者在可能引起出血的活动之前施用分离的核酸分子、分离的多肽或载体。在一个方面，可以在出血开始时(如在损伤后)或在预期要出血时(如在手术前)，将按需治疗给予受试者。在另一个方面，可以在增加出血风险的活动(如接触运动)之前给予按需治疗。

如本文所用，术语“急性出血”是指无论任何潜在原因的出血发作。例如，受试者可能患有创伤、尿毒症、遗传性出血障碍(例如，因子VII缺乏)、血小板障碍或由于产生针对凝血因子的抗体而产生的抗性。

如本文所用的“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”是指例如疾病或病症严重程度的降低；病程持续时间的缩短；与疾病或病症有关的一种或多种症状的改善；为患有疾病或病症的受试者提供有益的效果而不一定治愈所述疾病或病症或与疾病或病症相关的一种或多种症状的预防。在一个实施方案中，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指通过施用本公开文本的分离的核酸分子、分离的多肽或载体，将受试者中的FVIII谷值水平维持在至少约1IU/dL、2IU/dL、3IU/dL、4IU/dL、5IU/dL、6IU/dL、7IU/dL、8IU/dL、9IU/dL、10IU/dL、11IU/dL、12IU/dL、13IU/dL、14IU/dL、15IU/dL、16IU/dL、17IU/dL、18IU/dL、19IU/dL或20IU/dL。在另一个实施方案中，治疗(treating或treatment)意指将FVIII谷值水平维持在约1IU/dL与约20IU/dL之间、约2IU/dL与约20IU/dL之间、约3IU/dL与约20IU/dL之间、约4IU/dL与约20IU/dL之间、约5IU/dL与约20IU/dL之间、约6IU/dL与约20IU/dL之间、约7IU/dL与约20IU/dL之间、约8IU/dL与约20IU/dL之间、约9IU/dL与约20IU/dL之间、或约10IU/dL与约20IU/dL之间。疾病或病症的治疗(treatment或treating)还可以包括将受试者的FVIII活性维持在相当于非血友病受试者中FVIII活性的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的水平。治疗所需的最低谷水平可以通过一种或多种已知方法来测量，并且可以针对每个个人加以调节(增加或减小)。

如本文所用，“施用”意指经由药学上可接受的途径将药学上可接受的本公开文本的编码因子VIII的核酸分子、因子VIII多肽或包含编码因子VIII的核酸分子的载体施用至受试者。施用途径可以是静脉内的，例如静脉内注射和静脉内输注。另外的施用途径包括例如皮下、神经内、眼内、鞘内、肌内、口服、经鼻和经肺施用。核酸分子、多肽和载体可以作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分来施用。

如本文所用，词组“有需要的受试者”包括将受益于本公开文本的核酸分子、多肽或载体的施用例如以改善止血的受试者(如哺乳动物受试者)。在一个实施方案中，受试者包括但不限于患有血友病的个体。在另一个实施方案中，受试者包括但不限于已经发展出FVIII抑制剂并且因此需要绕路疗法的个体。受试者可以是成年人或未成年人(例如，小于12岁)。

如本文所用，术语“凝血因子”是指天然存在的或重组产生的分子或其类似物，其预防受试者的出血发作或缩短出血发作的持续时间。换句话说，其意指具有促凝血活性(即，负责将纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白的网状物，从而引起血液凝结或凝血)的分子。“可激活的凝血因子”是呈无活性形式(例如，呈其酶原形式)的凝血因子，其能够被转化为活性形式。

如本文所用，“凝血活性”意指参与生化反应级联的能力，所述级联以形成纤维蛋白凝块告终和/或降低出血症或出血发作的严重程度、持续时间或频率。

如本文所用，术语“异源的”或“外源的”是指此类分子通常在给定背景下(例如，在细胞中或在多肽中)未发现。例如，可以将外源或异源分子引入细胞中并且仅在例如通过转染或其他形式的遗传工程化操纵细胞之后存在，或者异源氨基酸序列可以存在于其天然不存在的蛋白质中。

如本文所用，术语“异源核苷酸序列”是指不与给定多核苷酸序列一起天然存在的核苷酸序列。在一个实施方案中，异源核苷酸序列编码能够延长FVIII的半衰期的多肽。在另一个实施方案中，异源核苷酸序列编码增加FVIII的流体力学半径的多肽。在其他实施方案中，异源核苷酸序列编码改善FVIII的一种或多种药代动力学特性但不显著影响其生物学活性或功能(例如，其促凝血活性)的多肽。在一些实施方案中，FVIII通过接头与异源核苷酸序列编码的多肽连接或相连。

“参考核苷酸序列”在本文中用作与本公开文本的核苷酸序列的比较时，是与本公开文本的核苷酸序列基本上相同的多核苷酸序列，但是对应于FVIII序列的部分未经优化。

如本文所用，关于核苷酸序列的术语“优化”是指编码多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列已经突变以增强所述多核苷酸序列的特性。在一些实施方案中，进行优化以增加转录水平、增加翻译水平、增加稳态mRNA水平、增加或减少调控蛋白(如通用转录因子)的结合、增加或减少剪接或增加多核苷酸序列产生的多肽的产量。可以对多核苷酸序列进行以使其优化的变化的例子包括密码子优化、G/C含量优化、去除重复序列、去除富含AT的元件、去除隐蔽剪接位点、去除阻遏转录或翻译的顺式作用元件、添加或去除多聚T或多聚A序列、在转录起始位点周围添加增强转录的序列(如Kozak共有序列)、去除可以形成茎环结构的序列、去除去稳定序列、去除CpG基序及其两个或更多个组合。

多核苷酸序列

本公开文本的某些方面涉及一种核酸分子，所述核酸分子包含基因盒(例如，编码治疗性蛋白质和/或miRNA)。在一些实施方案中，基因盒编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质包含凝血因子。在一些实施方案中，基因盒编码miRNA。在一些实施方案中，核酸分子还包含至少一个非编码区。在某些实施方案中，所述至少一个非编码区包含启动子序列、内含子、表达控制序列或其任何组合。

在一些实施方案中，基因盒包含编码FVIII多肽的核苷酸序列，其中核苷酸序列经密码子优化。在一些实施方案中，基因盒包含由mTTR启动子驱动、编码密码子优化的FVIII的核苷酸序列。在一些实施方案中，基因盒包含国际申请号PCT/US2017/015879中披露的核苷酸序列，将所述申请通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，基因盒是如PCT/US2017/015879中所述的“hFVIIIco6XTEN”基因盒。在一些实施方案中，参考核苷酸序列对应于如披露于PCT/US2017/015879中的hFVIIIco6XTEN序列。

在一些实施方案中，基因盒包含密码子优化的cDNA，所述cDNA编码B结构域缺失(BDD)的密码子优化的人因子VIII分子。在一些实施方案中，所述基因盒包含与SEQ ID NO:14具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述基因盒包含编码coBDDFVIII6-3aa多肽的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述基因盒还包含编码XTEN多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述基因盒包含密码子优化的cDNA，所述密码子优化的cDNA编码与144个氨基酸的XTEN多肽融合的B结构域缺失(BDD)的密码子优化的人因子VIII(BDDcoFVIII)。在一些实施方案中，所述基因盒包含如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述基因盒包含与SEQ ID NO:11具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述基因盒包含编码coBDDFVIII6-XTEN-3aa多肽的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述基因盒包含如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述基因盒包含与SEQ ID NO:16具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本公开文本涉及编码具有FVIII活性的多肽的密码子优化的核酸分子。在一些实施方案中，多核苷酸编码全长FVIII多肽。在其他实施方案中，所述核酸分子编码B结构域缺失的(BDD)FVIII多肽，其中缺失FVIII的B结构域的全部或一部分。在一个特定的实施方案中，所述核酸分子编码包含与SEQ ID NO:12具有至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列的多肽或其片段。

在一些实施方案中，本公开文本的核酸分子编码包含信号肽的FVIII多肽或其片段。在其他实施方案中，所述核酸分子编码缺乏信号肽的FVIII多肽。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

在一个实施方案中，基因盒是单链核酸。在另一个实施方案中，基因盒是双链核酸。在另一个实施方案中，基因盒是封闭端双链核酸(ceDNA)。

除非另外指定，否则如本文所用的“具有FVIII活性的多肽”意指具有正常凝结作用的功能性FVIII多肽。术语具有FVIII活性的多肽包括保留凝结途径中全长野生型因子VIII的功能的其功能性片段、变体、类似物或衍生物。“具有FVIII活性的多肽”可与FVIII蛋白、FVIII多肽或FVIII互换使用。FVIII功能的例子包括但不限于激活凝结的能力、作为因子IX的辅因子作用的能力或在Ca²⁺和磷脂存在下与因子IX形成因子Ⅹ酶(tenase)复合物的能力，所述复合物然后将因子X转化为激活形式Xa。在一个实施方案中，具有FVIII活性的多肽包含两条多肽链，具有FVIII重链的第一链和具有FVIII轻链的第二链。在另一个实施方案中，具有FVIII活性的多肽是单链FVIII。单链FVIII可以含有在对应于成熟人FVIII序列(SEQ ID NO:19)的氨基酸残基1645和/或1648处的一个或多个突变或取代。参见国际申请号PCT/US2012/045784，将其通过引用以其整体并入本文。FVIII蛋白可以是人、猪、犬、大鼠或鼠FVIII蛋白。另外，来自人和其他物种的FVIII之间的比较已经鉴定出可能为功能所需的保守残基。参见例如，Cameron等人(1998)Thromb.Haemost.79:317-22；和美国专利号6,251,632。

多种测试可用于评估多肽的FVIII活性：激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测试、生色测定、测定、凝血酶原时间(PT)测试(也用于确定INR)、纤维蛋白原测试(通常通过克劳斯法进行)、血小板计数、血小板功能测试(通常通过PFA-100进行)、TCT、出血时间、混合测试(如果将患者的血浆与正常血浆混合，是否矫正异常)、凝结因子测定、抗磷脂抗体、D-二聚体、遗传测试(例如，因子V Leiden、凝血酶原突变G20210A)、稀释鲁塞尔蝰蛇毒时间(dRVVT)、杂项血小板功能测试、凝血弹性描记法(TEG或Sonoclot)、凝血弹性测量法(/>例如/>)或优球蛋白溶解时间(ELT)。

aPTT测试是测量“固有”(也称为接触激活途径)和常见凝结途径二者的功效的性能指示物。这个测试一般用于测量市售重组凝血因子(例如，FVIII或FIX)的凝血活性。其与测量外在途径的凝血酶原时间(PT)结合使用。

分析提供关于止血的整体动力学的信息：凝血时间、凝块形成、凝块稳定性和溶解。凝血弹性测量法中的不同参数依赖于血浆凝结系统的活性、血小板功能、纤维蛋白溶解或影响这些相互作用的许多因素。这个分析可以提供次级止血的全面见解。

如本文所用，FVIII的“B结构域”与本领域中已知的B结构域相同，所述B结构域是通过全长人FVIII(SEQ ID NO:20)的内部氨基酸序列同一性和凝血酶的蛋白质水解切割位点(例如，残基Ser741-Arg1648)来定义。其他人FVIII结构域是通过以下氨基酸残基来定义：A1，残基Ala1-Arg372；A2，残基Ser373-Arg740；A3，残基Ser1690-Ile2032；C1，残基Arg2033-Asn2172；C2，残基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括残基Ser1690-Tyr2332。其余序列(残基Glu1649-Arg1689)通常被称为FVIII轻链激活肽。猪、小鼠和犬FVIII的所有结构域(包括B结构域)的边界的位置也是本领域中已知的。BDD FVIII的例子是重组BDD FVIII(Wyeth Pharmaceuticals,Inc.)。“B结构域缺失的FVIII”可以具有披露于以下文献中的完整或部分缺失：美国专利号6,316,226、6,346,513、7,041,635、5,789,203、6,060,447、5,595,886、6,228,620、5,972,885、6,048,720、5,543,502、5,610,278、5,171,844、5,112,950、4,868,112和6,458,563，将其中每一个均通过引用以其整体并入本文。B结构域缺失的FVIII的其他例子披露于Hoeben R.C.等人(1990)J.Biol.Chem.265(13):7318-7323；Meulien等人(1988),Protein Eng.2(4):301-6；Toole等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,5939-5942；Eaton等人(1986)Biochemistry 25:8343-8347；Sarver等人(1987)DNA 6:553-564；欧洲专利号295597；和国际公开号WO 91/09122、WO 88/00831和WO 87/04187，将其中的每一个均通过引用以其整体并入本文。可以在任何FVIII序列中产生前述每一种缺失。

密码子优化

在一个实施方案中，本公开文本提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列，其中已经将所述核酸序列进行密码子优化。在一些实施方案中，将编码具有FVIII活性的多肽的序列针对人表达进行密码子优化。在其他实施方案中，将编码具有FVIII活性的多肽的序列针对鼠表达进行密码子优化。

术语“密码子优化的”，因为它是指用于转化各种宿主的基因或核酸分子的编码区，是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，反映宿主生物体的典型密码子使用的基因或核酸分子编码区中的密码子的改变。这种优化包括将至少一个或多于一个或相当数量的密码子用一个或多个更常用于该生物体的基因中的密码子替代。

包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏差允许基因编码序列中的变化。因为每个密码子由三个核苷酸组成，并且包含DNA的核苷酸局限于四种特定的碱基，因此存在64种可能的核苷酸组合，其中的61种编码氨基酸(剩余的三种密码子编码结束翻译的信号)。作为结果，许多氨基酸由多于一种密码子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种三联体编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在很大的范围内变化而不会改变由DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。

许多生物体展现出在增长的肽链中使用特定的密码子来编码特定的氨基酸的插入的偏倚。密码子偏好性或密码子偏倚、生物体之间密码子使用的差异性是由遗传密码的简并性所提供的，并且在许多生物体中都是详细记录的。密码子偏倚通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，其转而又被认为尤其取决于被翻译的密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中选定的tRNA的优势通常是肽合成中最常使用的密码子的反映。因此，基于密码子优化，可以针对在给定生物体中的最佳基因表达来定制基因。

鉴于可用于多种动物、植物和微生物物种的大量的基因序列，已经计算了密码子使用的相对频率。密码子使用表可以例如在“Codon Usage Database”获得，在www.kazusa.or.jp/codon/(2012年6月18日访问)获得。参见Nakamura,Y.等人Nucl.AcidsRes.28:292(2000)。

以优化的频率随机分配密码子以编码给定的多肽序列可以通过计算每种氨基酸的密码子频率，然后将密码子随机分配到所述多肽序列来手动完成。另外，各种算法和计算机软件程序可以用于计算最佳序列。

密码子优化还可以包括将潜在的免疫原性序列从由核苷酸序列编码的蛋白质序列中去除。在一些实施方案中，经由电脑模拟(in silico)方法可以用于鉴定蛋白质或核苷酸序列中潜在的免疫原性序列。这些方法的非限制性例子包括人白细胞抗原(HLA)等位基因(例如，DR、DP、DQ)的鉴定以及给定蛋白质序列中的主要组织相容性复合物II类(MHCII)结合位点的鉴定。在一些实施方案中，公共数据库(如免疫表位数据库和分析资源(IEDB)(http://www.iedb.org/))可以用于鉴定潜在的免疫原性序列(参见例如，Zhang Q等人Nucleic Acids Res(2008)36:W513-8；Kim Y等人Nucleic Acids Res(2012)40:W525-30；Dhanda等人Nucleic Acids Res(2019)47:W502-W506)。在一些实施方案中，NetMHCIIpan3.0方法可以用于鉴定潜在的免疫原性序列，如描述于Lamberth K等人Sci TranslMed.2017；9(372):eaag1286中。在一些实施方案中，缺失了编码潜在的免疫原性序列的核苷酸序列。

异源核苷酸序列

在一些实施方案中，本公开文本的分离的核酸分子还包含异源核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的分离的核酸分子还包含至少一种异源核苷酸序列。所述异源核苷酸序列可以与本公开文本的优化的BDD-FVIII核苷酸序列在5'端、在3'端处连接，或插入到所述优化的BDD-FVIII核苷酸序列的中间。因此，在一些实施方案中，由异源核苷酸序列编码的异源氨基酸序列与由核苷酸序列编码的FVIII氨基酸序列的N末端或C末端连接，或者插入到所述FVIII氨基酸序列的两个氨基酸之间。在一些实施方案中，所述异源氨基酸序列可以在一个或多个插入位点处插入到两个氨基酸之间。在一些实施方案中，所述异源氨基酸序列可以在以下文献中披露的任何位点处插入由本公开文本的核酸分子编码的FVIII多肽内：国际公开号WO 2013/123457 A1、WO 2015/106052 A1或美国公开号2015/0158929A1，将其中的每一个均通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，将由异源核苷酸序列编码的异源氨基酸序列插入B结构域或其片段内。在一些实施方案中，将异源氨基酸序列插入FVIII内，紧接对应于野生型成熟人FVIII(SEQ ID NO:19)的氨基酸745的氨基酸的下游。在一个特定实施方案中，所述FVIII包含对应于野生型成熟人FVIII(SEQ ID NO:19)的氨基酸746-1637的缺失，并且将由异源核苷酸序列编码的异源氨基酸序列紧接对应于野生型成熟人FVIII(SEQ ID NO:19)的氨基酸745的下游插入。本文引用的FVIII的插入位点指示对应于野生型成熟人FVIII(SEQ ID NO:19)的氨基酸位置的氨基酸位置。

在一些实施方案中，异源部分是具有非结构化或结构化特征的肽或多肽，所述特征与并入本公开文本的蛋白质中时体内半衰期的延长相关。非限制性例子包括白蛋白、白蛋白片段、免疫球蛋白的Fc片段、人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C末端肽(CTP)、HAP序列、XTEN序列、转铁蛋白或其片段、PAS多肽、聚甘氨酸接头、聚丝氨酸接头、白蛋白结合部分或者这些多肽的任何片段、衍生物、变体或组合。

在某些实施方案中，异源部分改善了FVIII蛋白的一种或多种药代动力学特性但不显著影响其生物学活性或功能。在一些实施方案中，异源部分增加了本公开文本的FVIII蛋白的体内和/或体外半衰期。FVIII蛋白的体内半衰期可以通过本领域技术人员已知的任何方法来确定，所述方法例如活性测定(生色测定或一步式凝血aPTT测定)、ELISA、ROTEM^TM等。

在其他实施方案中，异源部分增加了本公开文本的FVIII蛋白或其片段(例如，在FVIII蛋白的蛋白质水解切割后包含异源部分的片段)的稳定性。如本文所用，术语“稳定性”是指本领域公认的响应环境条件(例如，升高或降低的温度)维持FVIII蛋白的一种或多种物理特性的量度。在某些方面，物理特性可以是维持FVIII蛋白的共价结构(例如，不存在蛋白质水解切割、不期望的氧化或脱酰胺作用)。在其他方面，物理特性还可以是处于正确折叠状态的FVIII蛋白的存在(例如，不存在可溶性或不溶性聚集体或沉淀物)。在一个方面，FVIII蛋白的稳定性是通过测定FVIII蛋白的生物物理特性来测量，所述生物物理特性例如热稳定性、pH解折叠谱、糖基化的稳定去除、溶解度、生化功能(例如，结合至蛋白质、受体或配体的能力)等和/或其组合。在另一个方面，生化功能是通过相互作用的结合亲和性来证实。在一个方面，蛋白质稳定性的量度是热稳定性，即对热激发的抗性。稳定性可以使用本领域中已知的方法来测量，如HPLC(高效液相色谱)、SEC(尺寸排阻色谱)、DLS(动态光散射)等。测量热稳定性的方法包括但不限于差式扫描量热法(DSC)、差式扫描荧光测定法(DSF)、圆二色性(CD)和热激发测定。

在一些实施方案中，异源部分包括一个或多个XTEN序列、其片段、变体或衍生物。如本文所用，“XTEN序列”是指延伸长度的多肽，其具有非天然存在的基本上不重复的序列，所述序列主要由小亲水氨基酸构成，并且所述序列在生理条件下具有较低程度的或不具有二级或三级结构。作为异源部分，XTEN可以用作半衰期延长部分。另外，XTEN可以提供所需特性，包括但不限于增强的药代动力学参数和溶解度特征。可以通过引入XTEN序列赋予的其他有利特性包括增强的构象柔性、增强的水溶性、高度的蛋白酶抗性、低免疫原性、与哺乳动物受体的低结合或增加的流体动力学(或Stokes)半径。

XTEN可以有不同的长度用于插入或连接至FVIII。在一些实施方案中，用于本公开文本的XTEN序列是具有大于约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000个氨基酸残基的肽或多肽。在某些实施方案中，XTEN是具有大于约20至约3000个氨基酸残基、大于30至约2500个残基、大于40至约2000个残基、大于50至约1500个残基、大于60至约1000个残基、大于70至约900个残基、大于80至约800个残基、大于90至约700个残基、大于100至约600个残基、大于110至约500个残基、或大于120个至大约400个残基的肽或多肽。在一个具体实施方案中，所述XTEN包含长度长于42个氨基酸且短于144个氨基酸的氨基酸序列。

本公开文本的XTEN序列可包含一个或多个具有5至14个(例如9至14个)氨基酸残基的序列基序或与所述序列基序至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中所述基序包含、基本上由或由选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的4-6种类型的氨基酸(例如5种氨基酸)组成。参见US2010-0239554 A1。

可以用作本公开文本的嵌合蛋白中的异源部分的XTEN序列的例子披露于例如以下文献中：美国专利公开号2010/0239554A1、2010/0323956A1、2011/0046060A1、2011/0046061A1、2011/0077199A1或2011/0172146A1，或者国际专利公开号WO 2010091122A1、WO2010144502 A2、WO 2010144508 A1、WO 2011028228 A1、WO 2011028229A1或WO2011028344 A2，将其中的每一个均通过引用以其整体并入本文。

所述一个或多个XTEN序列可以在由核苷酸序列编码的氨基酸序列的C末端或N末端处插入，或者在由核苷酸序列编码的氨基酸序列中的两个氨基酸之间插入。例如，所述XTEN可以在一个或多个插入位点的两个氨基酸之间插入。允许XTEN插入的FVIII内的位点的例子可以发现于例如国际公开号WO 2013/123457 A1或美国公开号2015/0158929A1中，将其通过引用以其整体并入本文。

在某些实施方案中，异源部分是肽接头。

如本文所用，术语“肽接头”或“接头部分”是指连接多肽链的线性氨基酸序列中的两个结构域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。

在一些实施方案中，编码肽接头的异源核苷酸序列可以在本公开文本的优化的FVIII多核苷酸序列与编码例如上文所述的异源部分之一(如白蛋白)的异源核苷酸序列之间插入。肽接头可以向嵌合多肽分子提供柔性。接头通常不被切割，但是可能需要这种切割。在一个实施方案中，在加工期间不去除这些接头。

可以存在于本公开文本的嵌合蛋白中的一种类型的接头是蛋白酶可切割的接头，其包含切割位点(即，蛋白酶切割位点底物，例如因子XIa、Xa或凝血酶切割位点)并且可以在切割位点的N末端或C末端或两侧上包括其他接头。这些可切割接头在并入本公开文本的构建体中时产生具有异源切割位点的嵌合分子。

在一个实施方案中，由本公开文本的核酸分子编码的FVIII多肽包含两个或更多个Fc结构域或部分，所述两个或更多个Fc结构域或部分经由cscFc接头连接以形成包含于单条多肽链中的Fc区。cscFc接头侧接有至少一个细胞内加工位点，即由细胞内酶切割的位点。多肽在所述至少一个细胞内加工位点的切割产生包含至少两条多肽链的多肽。

其他肽接头可以任选地用于本公开文本的构建体中，例如以将FVIII蛋白连接至Fc区。可以结合本公开文本使用的一些示例性接头包括例如更详细地描述于下文中的包含GlySer氨基酸的多肽。

在一个实施方案中，肽接头是合成的，即非天然存在的。在一个实施方案中，肽接头包括包含如下氨基酸序列的肽(或多肽)(其可以是或可以不是天然存在的)，所述氨基酸序列将第一线性氨基酸序列与在自然界中并非与其天然地连接或遗传融合的第二线性氨基酸序列连接或遗传融合。例如，在一个实施方案中，肽接头可以包含非天然存在的多肽，其是天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含突变，如添加、取代或缺失)。在另一个实施方案中，肽接头可以包含非天然存在的氨基酸。在另一个实施方案中，肽接头可以包含存在于在自然界中不存在的线性序列中的天然存在的氨基酸。在仍另一个实施方案中，肽接头可以包含天然存在的多肽序列。

在另一个实施方案中，肽接头包含gly-ser接头或由所述gly-ser接头组成。如本文所用，术语“gly-ser接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。在某些实施方案中，所述gly-ser接头可以插入肽接头的两个其他序列之间。在其他实施方案中，gly-ser接头连接于肽接头的另一序列的一个或两个末端。在又其他实施方案中，两个或更多个gly-ser接头串联并入肽接头中。在一个实施方案中，本公开文本的肽接头包含上铰链区的至少一部分(例如，衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)、中铰链区的至少一部分(例如，衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)和一系列gly/ser氨基酸残基。

本公开文本的肽接头的长度为至少一个氨基酸并且可以具有变化的长度。在一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为约1至约50个氨基酸。如在此上下文中所用，术语“约”指示+/-两个氨基酸残基。由于接头长度必须是正整数，长度为约1至约50个氨基酸的长度意指长度为1-3至48-52个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为约10至约20个氨基酸。在另一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为约15至约50个氨基酸。在另一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为约20至约45个氨基酸。在另一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为约15至约35或约20至约30个氨基酸。在另一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000或2000个氨基酸。在一个实施方案中，本公开文本的肽接头的长度为20或30个氨基酸。

在一些实施方案中，肽接头可以包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸。在其他实施方案中，肽接头可以包含至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1,000个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头可以包含至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个氨基酸。肽接头可以包含1-5个氨基酸、1-10个氨基酸、1-20个氨基酸、10-50个氨基酸、50-100个氨基酸、100-200个氨基酸、200-300个氨基酸、300-400个氨基酸、400-500个氨基酸、500-600个氨基酸、600-700个氨基酸、700-800个氨基酸、800-900个氨基酸或900-1000个氨基酸。

可以使用本领域中已知的技术将肽接头引入多肽序列中。可以通过DNA序列分析来确认修饰。可以使用质粒DNA转化宿主细胞用于稳定产生所产生的多肽。

表达控制序列

在一些实施方案中，本公开文本的核酸分子或载体还包含至少一个表达控制序列。例如，本公开文本的分离的核酸分子可以与至少一个表达控制序列可操作地连接。所述表达控制序列可以是例如启动子序列或启动子-增强子组合。

组成型哺乳动物启动子包括但不限于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β-肌动蛋白启动子和其他组成型启动子。在真核细胞中组成型起作用的示例性病毒启动子包括例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如，SV40)、乳头瘤病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、劳斯肉瘤病毒、巨细胞病毒、莫洛尼白血病病毒的长末端重复序列(LTR)和其他逆转录病毒的启动子，以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。其他组成型启动子是本领域普通技术人员已知的。可用作本公开文本的基因表达序列的启动子还包括诱导型启动子。诱导型启动子是在诱导剂存在下表达。例如，在某些金属离子存在下诱导金属硫蛋白启动子以促进转录和翻译。其他诱导型启动子是本领域普通技术人员已知的。

在一个实施方案中，本公开文本包括在组织特异性启动子和/或增强子控制下的转基因表达。在另一个实施方案中，启动子或其他表达控制序列选择性地增强转基因在肝细胞中的表达。在某些实施方案中，启动子或其他表达控制序列选择性地增强转基因在肝细胞、窦状细胞和/或内皮细胞中的表达。在一个特定实施方案中，启动子或其他表达控制序列选择性地增强转基因在内皮细胞中的表达。在某些实施方案中，启动子或其他表达控制序列选择性地增强转基因在以下中的表达：肌肉细胞、中枢神经系统、眼睛、肝脏、心脏或其任何组合。肝脏特异性启动子的例子包括但不限于小鼠甲状腺素转运蛋白启动子(mTTR)、天然人因子VIII启动子、人α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、人白蛋白最小启动子和小鼠白蛋白启动子。在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含mTTR启动子。mTTR启动子描述于Costa等人(1986)Mol.Cell.Biol.6:4697中。FVIII启动子描述于Figueiredo和Brownlee,1995,J.Biol.Chem.270:11828-11838中。在一些实施方案中，启动子选自肝脏特异性启动子(例如，α1-抗胰蛋白酶(AAT))、肌肉特异性启动子(例如，肌肉肌酸激酶(MCK)、肌球蛋白重链α(αMHC)、肌红蛋白(MB)和结蛋白(DES))、合成启动子(例如，SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK和tMCK)或其任何组合。

在一些实施方案中，转基因表达靶向肝脏。在某些实施方案中，转基因表达靶向肝细胞。在其他实施方案中，转基因表达靶向内皮细胞。在一个特定实施方案中，转基因表达靶向天然表达内源FVIII的任何组织。在一些实施方案中，转基因表达靶向中枢神经系统。在某些实施方案中，转基因表达靶向神经元。在一些实施方案中，转基因表达靶向传入神经元。在一些实施方案中，转基因表达靶向传出神经元。在一些实施方案中，转基因表达靶向中间神经元。在一些实施方案中，转基因表达靶向神经胶质细胞。在一些实施方案中，转基因表达靶向星形胶质细胞。在一些实施方案中，转基因表达靶向少突胶质细胞。在一些实施方案中，转基因表达靶向小神经胶质细胞。在一些实施方案中，转基因表达靶向室管膜细胞。在一些实施方案中，转基因表达靶向许旺细胞。在一些实施方案中，转基因表达靶向卫星细胞。在一些实施方案中，转基因表达靶向肌肉组织。在一些实施方案中，转基因表达靶向平滑肌。在一些实施方案中，转基因表达靶向心肌。在一些实施方案中，转基因表达靶向骨骼肌。在一些实施方案中，转基因表达靶向眼睛。在一些实施方案中，转基因表达靶向感光细胞。在一些实施方案中，转基因表达靶向视网膜神经节细胞。

可以用于本文公开的核酸分子的其他启动子包括小鼠甲状腺素转运蛋白启动子(mTTR)、天然人因子VIII启动子、人α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、人白蛋白最小启动子、小鼠白蛋白启动子、三重四脯氨酸(TTP；也称为ZFP36)启动子、CASI启动子、CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、α1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、肌球蛋白重链α(αMHC)启动子、肌红蛋白(MB)启动子、结蛋白(DES)启动子、SPc5-12启动子、2R5Sc5-12启动子、dMCK启动子和tMCK启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子或其任何组合。

在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含甲状腺素转运蛋白(TTR)启动子。在一些实施方案中，所述启动子是小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子。mTTR启动子的非限制性例子包括如披露于美国公开号US2019/0048362中的mTTR202启动子、mTTR202opt启动子和mTTR482启动子，将所述专利通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，所述启动子是肝脏特异性的经修饰的小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子。在一些实施方案中，所述启动子是肝脏特异性的经修饰的小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子mTTR482。mTTR482启动子的例子描述于Kyostio-Moore等人(2016)Mol Ther Methods Clin Dev.3:16006和Nambiar B.等人(2017)Hum Gene Ther Methods,28(1):23-28中。在一些实施方案中，所述启动子是包含SEQ ID NO:9的核酸序列的肝脏特异性的经修饰的小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子。

可以使用一种或多种增强子元件进一步增强表达水平以实现治疗功效。一种或多种增强子可以单独提供，或与一种或多种启动子元件一起提供。通常，表达控制序列包含多个增强子元件和组织特异性启动子。在一个实施方案中，增强子包含一个或多个拷贝的α-1-微球蛋白/双库尼茨抑制剂(bikunin)增强子(Rouet等人(1992)J.Biol.Chem.267:20765-20773；Rouet等人(1995),Nucleic Acids Res.23:395-404；Rouet等人(1998)Biochem.J.334:577-584；Ill等人(1997)Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30)。在一些实施方案中，增强子衍生自肝脏特异性转录因子结合位点(如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6和Enh1)，所述肝脏特异性转录因子结合位点包含HNF1、(有义)-HNF3、(有义)-HNF4、(反义)-HNF1、(反义)-HNF6、(有义)-EBP、(反义)-HNF4(反义)。在一些实施方案中，增强子是包含SEQ ID NO:8的核酸序列的mTTR482增强子。

在一些实施方案中，增强子包含一个或两个经修饰的凝血酶原增强子(pPrT2)、一个或两个α1-微双库尼茨抑制剂增强子(A1MB2)、经修饰的小鼠白蛋白增强子(mEalb)、乙型肝炎病毒增强子II(HE11)或CRM8增强子。在一些实施方案中，增强子是合成增强子。在一些实施方案中，增强子是包含SEQ ID NO:7的核酸序列的合成增强子。

在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含内含子或内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列是天然存在的内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列是合成序列。在一些实施方案中，内含子序列衍生自天然存在的内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列是杂合的合成内含子或嵌合内含子。在一些实施方案中，内含子序列是嵌合内含子，所述嵌合内含子由鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白内含子组成并且已经修饰以消除现有五个ATG序列，从而减少假翻译起始。在某些实施方案中，内含子序列包含SV40小T内含子。

在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含一个或多个DNA核靶向序列(DTS)。DTS促进含有此类序列的DNA分子易位至核中。在某些实施方案中，DTS包含SV40增强子序列。在某些实施方案中，DTS包含c-Myc增强子序列。在一些实施方案中，核酸分子包含位于第一ITR与第二ITR之间的DTS。在一些实施方案中，核酸分子包含位于第一ITR的3’和转基因(例如FVIII蛋白)的5’的DTS。在一些实施方案中，核酸分子包含位于转基因的3’和所述核酸分子上的第二ITR的5’的DTS。

在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含toll样受体9(TLR9)抑制序列。示例性TLR9抑制序列描述于例如Trieu等人(2006)Crit Rev Immunol.26(6):527-44；Ashman等人Int’l Immunology 23(3):203-14中。

载体系统

本公开文本的一些实施方案涉及包含一种或多种编码本文所述的具有FVIII活性的多肽的密码子优化的核酸分子的载体、包含所述载体的宿主细胞、和使用所述载体治疗出血障碍的方法。本公开文本通过提供包含优化的FVIII序列的载体满足了本领域中的重要需求，所述优化的FVIII序列显示出在受试者中的表达增加以及在用于基因治疗方法时潜在地导致更大的治疗功效。

用于本公开文本的合适的载体包括表达载体、病毒载体和质粒载体。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体。

如本文所用，表达载体是指任何核酸构建体，其含有用于插入的编码序列的转录和翻译的必需元件，或者在RNA病毒载体的情况下，当引入时合适的宿主细胞时用于复制和翻译的必需元件。表达载体可包括质粒、噬菌粒、病毒及其衍生物。

本公开文本的表达载体将包括编码本文所述的BDD FVIII蛋白的优化的多核苷酸。在一个实施方案中，所述BDD FVIII蛋白的优化的编码序列与表达控制序列可操作地连接。如本文所用，当两个核酸序列以这种方式共价连接以允许每个组分核酸序列保留其功能性时，它们是可操作地连接的。当编码序列和基因表达控制序列以这种方式共价连接以便将编码序列的表达或转录和/或翻译置于基因表达控制序列的影响或控制之下时，它们被称为可操作连接的。如果5'基因表达序列中启动子的诱导导致编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接的性质没有(1)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应RNA转录物被翻译成蛋白质的能力，则这两个DNA序列被称为可操作连接的。因此，如果基因表达序列能够影响编码核酸序列的转录使得所得转录物被翻译成所需的蛋白质或多肽，则所述基因表达序列将与该编码核酸序列可操作地连接。

病毒载体包括但不限于来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒(如莫洛尼鼠白血病病毒、哈维鼠肉瘤病毒、鼠乳腺瘤病毒和劳斯氏肉瘤病毒)；慢病毒；腺病毒；腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；乳头瘤病毒；疱疹病毒；痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒(如逆转录病毒)。人们可以便利地采用本领域熟知的其他载体。某些病毒载体是基于非细胞病变的真核病毒，其中非必需基因已经被目的基因替代。在一个实施方案中，病毒是腺相关病毒，双链DNA病毒。腺相关病毒可以被工程化为复制缺陷型并且能够感染大范围的细胞类型和物种。

根据本公开文本，可以使用衍生自几乎任何血清型的一种或多种不同的AAV载体序列。特定的AAV载体序列的选择将由诸如目的趋向性、所需的载体产量等已知参数指导。通常，AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平上具有显著同源性的基因组序列、提供了一组相关的遗传功能、产生相关的病毒体、并且相似地复制和组装。关于不同AAV血清型的基因组序列和基因组相似性的综述参见例如，GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chlorini等人(1997)J.Vir.71:6823-33；Srivastava等人(1983)J.Vir.45:555-64；Chlorini等人(1999)J.Vir.73:1309-1319；Rutledge等人(1998),J.Vir.72:309-319；或Wu等人(2000)J.Vir.74:8635-47。AAV血清型1、2、3、4和5是在本公开文本的背景下用于所述用途的AAV核苷酸序列的说明性来源。AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或通过例如衣壳改组技术和AAV衣壳文库获得的或者从新设计、开发或进化的ITR中获得的最近开发的AVV样颗粒也适合于某些公开申请。参见Dalkara等人(2013),Sci.Transl.Med.5(189):189ra76；Kotterman MA(2014)Nat.Rev.Genet.15(7):455。

其他载体包括质粒载体。质粒载体在本领域中已经被广泛描述，并且是本领域技术人员熟知的。参见例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。在最近的几年里，质粒载体已经被发现对于在体内向细胞递送基因是特别有利的，因为它们不能在宿主基因组内复制并且不能整合到宿主基因组中。然而，这些质粒(具有与宿主细胞相容的启动子)可以表达来自质粒内可操作编码的基因的肽。可以从商业供应商获得的一些常用的质粒包括pBR322、pUC18、pUC19、各种pcDNA质粒、pRC/CMV、各种pCMV质粒、pSV40和pBlueScript。特定质粒的另外的例子包括pcDNA3.1，目录号V79020；pcDNA3.1/hygro，目录号V87020；pcDNA4/myc-His，目录号V86320；和pBudCE4.1，目录号V53220，所有均来自Invitrogen(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。其他质粒是本领域普通技术人员熟知的。另外，可以使用标准分子生物技术去除和/或添加DNA的特定片段来定制设计质粒。

在某些实施方案中，有用的是在载体内包括一个或多个miRNA靶序列，所述miRNA靶序列例如与优化的FVIII转基因可操作地连接。载体中包括的多于一个拷贝的miRNA靶序列可以增加系统的有效性。例如，表达多于一种转基因的载体可以具有在多于一个可以相同或不同的miRNA靶序列控制下的转基因。miRNA靶序列可以是串联的，但是也包括其他排列。含有miRNA靶序列的转基因基因盒也能以反义定向插入载体内。miRNA靶序列的例子描述于以下文献中：WO 2007/000668、WO 2004/094642、WO 2010/055413或WO 2010/125471，所述文献通过引用以其整体并入本文。然而，在某些其他实施方案中，载体将不包括任何miRNA靶序列。是否要包括miRNA靶序列(以及数量)的选择将依据已知参数(如计划的组织靶标、所需的表达水平等)来指导。

慢病毒载体

慢病毒包括牛慢病毒群、马慢病毒群、猫慢病毒群、绵羊山羊慢病毒群和灵长类慢病毒群的成员。用于基因疗法的慢病毒载体的发展综述于以下文献中：Klimatcheva等人(1999)Frontiers in Bioscience 4:481-496。适用于基因疗法的慢病毒载体的设计和使用描述于例如美国专利号6,207,455和6,615,782中。慢病毒的例子包括但不限于HIV-1、HIV-2、HIV-1/HIV-2假型、HIV-1/SIV、FIV、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒和牛免疫缺陷病毒。

在一些实施方案中，本公开文本的慢病毒载体是“第三代”慢病毒载体。如本文所用，术语“第三代”慢病毒载体是指具有第二代载体系统的特征的慢病毒包装系统，并且其进一步缺乏功能性tat基因，例如tat基因已从其缺失或失活的慢病毒包装系统。通常，编码rev的基因在单独的表达构建体上提供。参见例如，Dull等人(1998)J.Virol.72:8463-8471。如本文所用，“第二代”慢病毒载体系统是指缺乏功能性附属基因的慢病毒包装系统，如附属基因vif、vpr、vpu和nef已经从其缺失或失活的慢病毒包装系统。参见例如，Zufferey等人(1997)Nat.Biotechnol.15:871-875。如本文所用，“包装系统”是指一组病毒构建体，其包含编码参与包装重组病毒的病毒蛋白的基因。通常，包装系统的构建体将最终被掺入包装细胞中。

在一些实施方案中，本公开文本的第三代慢病毒载体是自失活慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体是VSV.G假型慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体包含用于转基因表达的肝细胞特异性启动子。在一些实施方案中，肝细胞特异性启动子是增强的甲状腺素转运蛋白启动子。在一些实施方案中，慢病毒载体包含miR-142的一个或多个靶序列以降低针对转基因产物的免疫应答。在一些实施方案中，将miR-142的一个或多个靶序列掺入本公开文本的慢病毒载体中允许所需的转基因表达谱。例如，掺入miR-142的一个或多个靶序列可以在血管内和血管外造血谱系中抑制转基因表达，而在非造血细胞中维持转基因表达。在用本公开文本的慢病毒载体系统处理的肿瘤易发小鼠中未检测到癌发生。参见Brown等人(2007)Blood 110:4144-52；Brown等人(2006)Nat.Ned.12:585-91；和Cantore等人(2015)Sci.Transl.Med.7(277):277ra28。

本公开文本的慢病毒载体包括编码本文所述的BDD FVIII蛋白的密码子优化的多核苷酸。在一个实施方案中，所述BDD FVIII蛋白的优化的编码序列与表达控制序列可操作地连接。如本文所用，当两个核酸序列以这种方式共价连接以允许每个组分核酸序列保留其功能性时，它们是可操作地连接的。当编码序列和基因表达控制序列以这种方式共价连接以便将编码序列的表达或转录和/或翻译置于基因表达控制序列的影响或控制之下时，它们被称为可操作连接的。如果5'基因表达序列中启动子的诱导导致编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接的性质没有(1)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应RNA转录物被翻译成蛋白质的能力，则这两个DNA序列被称为可操作连接的。因此，如果基因表达序列能够影响编码核酸序列的转录使得所得转录物被翻译成所需的蛋白质或多肽，则所述基因表达序列将与该编码核酸序列可操作地连接。

本文公开的示例性慢病毒载体实施方案的示意图呈现如图1。关于示例性慢病毒载体实施方案的产生的另外的信息可以发现于实施例2中。用于基因疗法的逆转录病毒载体设计的进一步讨论提供于Poletti和Mavilio,Viruses.2021(13):1526中。

在某些实施方案中，慢病毒载体是能够感染非分裂细胞的重组慢病毒的载体。在某些实施方案中，慢病毒载体是能够感染肝细胞(例如，肝细胞)的重组慢病毒的载体。慢病毒基因组和原病毒DNA通常具有在逆转录病毒中发现的三个基因：gag、pol和env，它们两侧是两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA引导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5'和3'LTR用于促进病毒体RNA的转录和多腺苷酸化。LTR含有病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。慢病毒具有另外的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-l、HIV-2和/或SIV中)。

与5'LTR相邻的是基因组逆转录所需的序列(tRNA引物结合位点)和将病毒RNA有效衣壳化至颗粒中所需的序列(Psi位点)。如果所述序列对于病毒基因组中缺失衣壳化(或将逆转录病毒RNA包装到传染性病毒体中)是必需的，则顺式缺陷就会阻止基因组RNA的衣壳化。

在一些实施方案中，慢病毒载体包含茎环123(SL123)的引物结合位点(PBS)。在一些实施方案中，PBS包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在一些实施方案中，慢病毒载体包含Psi茎环4(SL4)序列。在一些实施方案中，慢病毒载体包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。Psi和相关序列的进一步讨论可以发现于Kim等人PLoS ONE 2012.7(11):e50148中。

然而，所得突变体仍然能够指导所有病毒体蛋白的合成。本公开文本提供了一种产生能够感染非分裂细胞的重组慢病毒的方法，所述方法包括将合适的宿主细胞用携带包装功能(即gag、pol和env以及rev和tat)的两种或更多种载体转染。如将被下文所公开的，缺乏功能性tat基因的载体对于某些应用是所希望的。因此，例如，第一载体可以提供编码病毒gag和病毒pol的核酸，并且另一种载体可以提供编码病毒env的核酸以产生包装细胞。将提供异源基因的载体(本文中标识为转移载体)引入该包装细胞中，产生释放携带目的外来基因的感染性病毒颗粒的生产细胞。

根据上文指示的载体和外来基因的配置，第二载体可以提供编码病毒包膜(env)基因的核酸。env基因可以源自几乎任何合适的病毒，包括逆转录病毒。在一些实施方案中，env蛋白是允许转导人和其他物种的细胞的双向性包膜蛋白。

逆转录病毒来源的env基因的例子包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV或MMLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV或GALV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。也可以使用其他env基因，如水疱性口炎病毒(VSV)蛋白G(VSV G)、肝炎病毒的env基因和流感病毒的env基因。在一些实施方案中，病毒env核酸序列与本文其他地方所述的调控序列可操作地相关。

在某些实施方案中，慢病毒载体缺失了HIV致病基因env、vif、vpr、vpu和nef，而没有损害所述载体转导非分裂细胞的能力。在一些实施方案中，慢病毒载体包含3'LTR的U3区的缺失。所述U3区的缺失可以是完全缺失的或部分缺失的。

在一些实施方案中，可以将本公开文本的包含本文所述的FVIII核苷酸序列的慢病毒载体转染到具有以下的细胞中：(a)包含gag、pol、或gag和pol基因的第一核苷酸序列，和(b)包含异源env基因的第二核苷酸序列；其中所述慢病毒载体缺乏功能性tat基因。在其他实施方案中，将所述细胞用包含rev基因的第四核苷酸序列进一步转染。在某些实施方案中，慢病毒载体缺乏选自vif、vpr、vpu、vpx和nef或其组合的功能性基因。

在某些实施方案中，本公开文本的慢病毒载体包含编码gag蛋白、Rev响应元件、中心多嘌呤区(cPPT)或其任何组合的一个或多个核苷酸序列。

在一些实施方案中，慢病毒载体在其表面上表达一种或多种多肽，它们改善慢病毒载体或所编码FVIII多肽的靶向和/或活性。所述一种或多种多肽可以由慢病毒载体编码，或者可以在慢病毒载体从宿主细胞出芽期间掺入。在慢病毒产生期间，病毒颗粒从产生宿主细胞出芽。在出芽过程期间，病毒颗粒具有源自宿主细胞的脂质膜的脂质包衣。因此，病毒颗粒的脂质包衣可以包括先前存在于宿主细胞表面上的膜结合多肽。

在一些实施方案中，慢病毒载体在其表面上表达一种或多种多肽，它们在施用至人受试者后抑制针对慢病毒载体的免疫应答。在一些实施方案中，慢病毒载体的表面包含一种或多种CD47分子。CD47是一种“自我标记”蛋白，其在人细胞上普遍表达。CD47的表面表达通过CD47与巨噬细胞表达的SIRPα的相互作用抑制巨噬细胞诱导的对内源性细胞的吞噬作用。表达高水平CD47的细胞不太可能在体内被人巨噬细胞靶向和破坏。

在一些实施方案中，慢病毒载体在其表面上包含高浓度的CD47多肽分子。在一些实施方案中，慢病毒载体是在具有CD47的高表达水平的细胞系中产生。在某些实施方案中，慢病毒载体是在CD47高细胞中产生，其中所述细胞在细胞膜上具有CD47的高表达。在特定实施方案中，慢病毒载体是在CD47高HEK 293T细胞中产生，其中所述HEK 293T在细胞膜上具有CD47的高表达。在一些实施方案中，HEK 293T细胞被修饰以具有相对于未修饰的HEK293T细胞增加的CD47表达。在某些实施方案中，CD47是人CD47。

在一些实施方案中，慢病毒载体具有很少或没有主要组织相容性复合物I类(MHC-I)的表面表达。表面表达的MHC-I展示来自细胞内的“非自身”蛋白的肽片段，如指示感染的蛋白质片段，从而促进针对细胞的免疫应答。在一些实施方案中，慢病毒载体是在MHC-I^低细胞中产生，其中所述细胞在细胞膜上具有降低的MHC-I的表达。在一些实施方案中，慢病毒载体是在MHC-I-(或“MHC-I^无”、“MHC-1^阴性”或“MHC-阴性”)细胞中产生，其中所述细胞缺少MHC-I的表达。

在特定实施方案中，慢病毒载体包含脂质包衣，所述脂质包衣包含高浓度的CD47多肽并且缺少MHC-I多肽。在某些实施方案中，慢病毒载体是在CD47高/MHC-I^低细胞系(例如，CD47高/MHC-I^低HEK 293T细胞系)中产生。在一些实施方案中，慢病毒载体是在CD47高/无MHC-I细胞系(例如，CD47高/MHC-I^无HEK 293T细胞系)中产生。

慢病毒载体的例子披露于美国专利号9,050,269和国际公开号WO 9931251、W09712622、W0 9817815、W0 9817816和WO 9818934中，所述专利通过引用以其整体并入本文。

反向末端重复(ITR)序列

在一些实施方案中，本文公开的核酸序列包含反向末端重复(ITR)序列。如本文所用，“反向末端重复”(或“ITR”)是指位于单链核酸序列的5'端或3'端的核酸子序列，其包含一组核苷酸(初始序列)，之后下游是其反向补体，即回文序列。初始序列与反向补体之间的插入核苷酸序列可以具有任何长度，包括零。在一个实施方案中，可用于本公开文本的ITR包含一个或多个“回文序列”。ITR可以具有任何数目的功能。在一些实施方案中，本文所述的ITR形成发夹结构。在一些实施方案中，ITR形成T形发夹结构。在一些实施方案中，ITR形成非T形发夹结构，例如U形发夹结构。在一些实施方案中，ITR促进核酸分子在细胞的细胞核中的长期存活。在一些实施方案中，ITR促进核酸分子在细胞的细胞核中的永久存活(例如，持续细胞的整个寿命)。在一些实施方案中，ITR促进核酸分子在细胞的细胞核中的稳定性。在一些实施方案中，ITR促进核酸分子在细胞的细胞核中的保留。在一些实施方案中，ITR促进核酸分子在细胞的细胞核中的持久性。在一些实施方案中，ITR抑制或防止核酸分子在细胞的细胞核中的降解。

因此，如本文所用的“ITR”可以折叠回于自身并形成双链区段。例如，在折叠形成双螺旋时，序列GATCXXXXGATC包含GATC的初始序列及其补体(3'CTAG5')。在一些实施方案中，ITR包含初始序列与反向补体之间的连续回文序列(例如，GATCGATC)。在一些实施方案中，ITR包含初始序列与反向补体之间的中断的回文序列(例如，GATCXXXXGATC)。在一些实施方案中，连续或中断的回文序列的互补部分彼此相互作用以形成“发夹环”结构。如本文所用，在单链核苷酸分子上的至少两个互补序列碱基配对形成双链部分时，产生“发夹环”结构。在一些实施方案中，仅ITR的一部分形成发夹环。在其他实施方案中，整个ITR形成发夹环。

在本公开文本中，至少一个ITR是非腺病毒相关病毒(非AAV)的ITR。在某些实施方案中，ITR是病毒科细小病毒科(Parvoviridae)的非AAV成员的ITR。在一些实施方案中，ITR是依赖病毒属(Dependovirus)或红病毒属(Erythrovirus)的非AAV成员的ITR。

在一些实施方案中，本文所述的核酸分子中的ITR可以是转录激活的ITR。转录激活的ITR可以包含已经通过包括至少一个转录活性元件而被转录激活的野生型ITR的全部或一部分。多种类型的转录活性元件适用于这个背景。在一些实施方案中，转录活性元件是组成型转录活性元件。组成型转录活性元件提供持续水平的基因转录，并且在需要持续表达转基因时是优选的。在其他实施方案中，转录活性元件是诱导型转录活性元件。诱导型转录活性元件通常在诱导物(或诱导条件)不存在下展现低活性，并且在诱导物存在下(或切换至诱导条件)上调。当仅在某些时间或在某些位置需要表达时或当需要使用诱导剂逐步增加表达水平时，诱导型转录活性元件可能是优选的。转录活性元件也可以具有组织特异性；也就是说，其仅在某些组织或细胞类型中展现活性。

能以多种方式将转录活性元件并入ITR中。在一些实施方案中，将转录活性元件并入ITR的任何部分的5′或ITR的任何部分的3′。在其他实施方案中，转录激活的ITR的转录活性元件位于两个ITR序列之间。如果转录活性元件包含两个或更多个必须被间隔开的元件，则那些元件可以与ITR的部分交替。在一些实施方案中，ITR的发夹结构缺失并用转录元件的反向重复来替代。这后一种排列将产生模拟结构中的缺失部分的发夹。多个串联转录活性元件也可以存在于转录激活的ITR中，并且这些元件可以相邻或间隔开。另外，可以将蛋白质结合位点(例如，Rep结合位点)引入转录激活的ITR的转录活性元件中。转录活性元件可以包含使得能够通过RNA聚合酶受控转录DNA以形成RNA的任何序列，并且可以包含例如如下文所定义的转录活性元件。

转录激活的ITR向具有相对受限的核苷酸序列长度的核酸分子提供转录激活和ITR功能二者，这有效地使可以携带并从核酸分子表达的转基因的长度最大化。将转录活性元件并入ITR中能以多种方式来完成。对ITR序列和转录活性元件的序列需求的比较可以提供对编码ITR内的元件的方式的了解。例如，可以通过在复制转录活性元件的功能元件的ITR序列中引入特定变化将转录活性添加至ITR。本领域中存在多种技术可有效添加、缺失和/或改变特定位点的具体核苷酸序列(参见例如，Deng和Nickoloff(1992)Anal.Biochem.200:81-88)。产生转录激活的ITR的另一方式涉及在ITR中的所需位置引入限制位点。另外，可以使用本领域中已知的方法将多个转录激活元件并入转录激活的ITR中。

通过说明，可以通过包括一个或多个诸如以下等转录活性元件来产生转录激活的ITR：TATA盒、GC盒、CCAAT盒、Sp1位点、Inr区、CRE(cAMP调控元件)位点、ATF-1/CRE位点、APBβ盒、APBα盒、CArG盒、CCAC盒或如本领域中已知参与转录的任何其他元件。

宿主细胞

本公开文本还提供了包含本公开文本的核酸分子或载体的宿主细胞。如本文所用，术语“转化”应在广义上使用，是指将DNA引入受体宿主细胞中，这改变了基因型并因此导致受体细胞的变化。

“宿主细胞”是指已经用使用重组DNA技术构建并且编码至少一种异源基因的载体转化的细胞。本公开文本的宿主细胞优选地具有哺乳动物来源；最优选地具有人或小鼠来源。相信本领域技术人员有能力优先地确定最适合于其目的的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于CHO、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾系)、COS(具有SV40 T抗原的CVI的衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)、NS0、CAP、BHK21和HEK 293(人肾)。在一个特定实施方案中，所述宿主细胞选自CHO细胞、HEK293细胞、BHK21细胞、细胞、NS0细胞和CAP细胞。宿主细胞系通常可以从商业服务、美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)或从公开文献获得。

将本公开文本的分离的核酸分子或载体引入宿主细胞中可以通过本领域技术人员熟知的多种技术来完成。这些技术包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、与包膜DNA的细胞融合、显微注射和完整病毒感染。参见Ridgway,A.A.G."Mammalian Expression Vectors"第24.2章,第470-472页Vectors,Rodriguez和Denhardt编辑(Butterworths,Boston,Mass.1988)。可以将质粒经由电穿孔引入宿主中。使转化的细胞在适于产生轻链和重链的条件下生长，并且测定重链和/或轻链蛋白质合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、或荧光激活细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学等。

使包含本公开文本的分离的核酸分子或载体的宿主细胞在适当生长培养基中生长。如本文所用，术语“适当生长培养基”是指含有细胞生长所需的营养物的培养基。细胞生长所需的营养素可以包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、矿物质和生长因子。任选地，所述培养基可含有一个或多个选择因子。任选地，所述培养基可含有小牛血清或胎牛血清(FCS)。在一个实施方案中，所述培养基基本上不含IgG。所述生长培养基通常通过例如药物选择或必需营养素缺乏来选择含有DNA构建体的细胞，所述必需营养素由DNA构建体上的选择性标记补充或与DNA构建体共转染。所培养的哺乳动物细胞通常在市售的含血清或无血清培养基(例如，MEM、DMEM、DMEM/F12)中生长。在一个实施方案中，培养基是CDoptiCHO(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。在另一个实施方案中，培养基是CD17(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。适合用于所用具体细胞系的培养基的选择在本领域普通技术人员的水平内。

在一些实施方案中，适用于本发明的宿主细胞是昆虫来源的。在一些实施方案中，合适的昆虫宿主细胞包括例如从草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf)分离的细胞系或从粉纹夜蛾(richoplusia ni)(Tni)分离的细胞系。本领域技术人员将能够容易地确定任何Sf或Tni细胞系的适用性。示例性昆虫宿主细胞包括而不限于Sf9细胞、Sf21细胞和High Five^TM细胞。示例性昆虫宿主细胞还包括而不限于不受外来病毒污染的任何Sf或Tni细胞系，例如Sf-弹状病毒(rhadovirus)阴性(Sf-RVN)和Tn-野田村病毒(nodavirus)阴性(Tn-NVN)细胞。其他合适的宿主昆虫细胞是本领域技术人员已知的。在一个特定实施方案中，昆虫宿主细胞是Sf9细胞。

本公开文本的多个方面提供了克隆本文所述的核酸分子的方法，其包括将能够形成复杂二级结构的核酸分子插入适宜载体中，和将所得载体引入适宜细菌宿主菌株中。如本领域中已知，核酸的复杂二级结构(例如，长回文区)可能不稳定并且难以在细菌宿主菌株中克隆。例如，本公开文本的包含第一ITR和第二ITR(例如，非AAV细小病毒ITR，例如，HBoV1 ITR)的核酸分子可能难以使用常规方法来克隆。长DNA回文序列抑制DNA复制并且在大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Steptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、小鼠和人的基因组中不稳定。这些效应是由于通过链内碱基配对形成发夹或十字形结构所致。在大肠杆菌中，在SbcC或SbcD突变体中可以显著克服对DNA复制的抑制。SbcD是核酸酶亚基，并且SbcC是SbcCD复合物的ATP酶亚基。大肠杆菌SbcCD复合物是负责防止长回文序列复制的外切核酸酶复合物。SbcCD复合物是具有ATP依赖性双链DNA外切核酸酶活性和ATP非依赖性单链DNA内切核酸酶活性的核复合物。SbcCD可以识别DNA回文序列并且通过攻击所产生的发夹结构来瓦解复制叉。

在某些实施方案中，适宜细菌宿主菌株不能拆分十字形DNA结构。在某些实施方案中，适宜细菌宿主菌株包含SbcCD复合物中的破坏。在一些实施方案中，SbcCD复合物中的破坏包含SbcC基因和/或SbcD基因中的基因破坏。在某些实施方案中，SbcCD复合物中的破坏包含SbcC基因中的基因破坏。包含SbcC基因中的基因破坏的各种细菌宿主菌株是本领域中已知的。例如但不限于，细菌宿主菌株PMC103包含基因型sbcC、recD、mcrA、ΔmcrBCF；细菌宿主菌株PMC107包含基因型recBC、recJ、sbcBC、mcrA、ΔmcrBCF；并且细菌宿主菌株SURE包含基因型recB、recJ、sbcC、mcrA、ΔmcrBCF、umuC、uvrC。因此，在一些实施方案中，克隆本文所述的核酸分子的方法包括将能够形成复杂二级结构的核酸分子插入适宜载体中，和将所得载体引入宿主菌株PMC103、PMC107或SURE中。在某些实施方案中，克隆本文所述的核酸分子的方法包括将能够形成复杂二级结构的核酸分子插入适宜载体中，和将所得载体引入宿主菌株PMC103中。

适宜载体是本领域中已知的并且描述于本文中的其他地方。在某些实施方案中，用于本公开文本的克隆方法中的适宜载体是低拷贝载体。在某些实施方案中，用于本公开文本的克隆方法中的适宜载体是pBR322。

多肽的产生

本公开文本还提供了由本公开文本的核酸分子编码的多肽。在其他实施方案中，本公开文本的多肽由包含本公开文本的分离的核酸分子的载体编码。在又其他实施方案中，本公开文本的多肽由包含本公开文本的分离的核酸分子的宿主细胞产生。

多种方法可用于从本公开文本的优化的核酸分子重组产生FVIII蛋白。所需序列的多核苷酸可以通过从头固相DNA合成或通过较早制备的多核苷酸的PCR诱变产生。寡核苷酸介导的诱变是一种用于在核苷酸序列中制备取代、插入、缺失或改变(例如，改变的密码子)的方法。例如，通过使编码所需突变的寡核苷酸与单链DNA模板杂交来改变起始DNA。杂交后，DNA聚合酶用于合成模板的整个第二互补链，所述模板掺入了寡核苷酸引物。在一个实施方案中，基因工程化(例如，基于引物的PCR诱变)足以掺入如本文所定义的改变，以产生本公开文本的多核苷酸。

对于重组蛋白的产生，将本公开文本的编码FVIII蛋白的优化的多核苷酸序列插入适当的表达媒介物中，所述表达媒介物即为含有所插入编码序列的转录和翻译必需元件的载体，或在RNA病毒载体的情况下为含有复制和翻译必需元件的载体。

将本公开文本的多核苷酸序列以正确的阅读框插入载体中。然后将表达载体转染到将表达多肽的合适的靶细胞中。本领域已知的转染技术包括但不限于磷酸钙沉淀(Wigler等人1978,Cell 14:725)和电穿孔(Neumann等人1982,EMBO,J.1:841)。多种宿主表达载体系统可以用于在真核细胞中表达本文所述的FVIII蛋白。在一个实施方案中，真核细胞是动物细胞，包括哺乳动物细胞(例如，HEK293细胞、CHO、BHK、Cos、HeLa细胞)。本公开文本的多核苷酸序列还可以编码允许FVIII蛋白分泌的信号序列。本领域技术人员将理解，FVIII蛋白被翻译的同时，信号序列被细胞切割以形成成熟蛋白。各种信号序列是本领域已知的，例如，天然因子Vll信号序列、天然因子IX信号序列和小鼠IgK轻链信号序列。可替代地，在不包括信号序列的情况下可以通过裂解细胞来恢复FVIII蛋白。

本公开文本的FVIII蛋白可以在转基因动物(如啮齿类动物、山羊、绵羊、猪或牛)中合成。术语“转基因动物”是指已经将外来基因并入基因组中的非人动物。因为这个基因是在种系组织中存在，其从亲代传递给后代。将外源基因引入单细胞胚胎中(Brinster等人1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4438)。产生转基因动物的方法是本领域已知的，包括产生免疫球蛋白分子的转基因学(Wagner等人1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6376；McKnight等人1983,Cell 34:335；Brinster等人1983,Nature 306:332；Ritchie等人1984,Nature 312:517；Baldassarre等人2003,Theriogenology 59:831；Robl等人2003,Theriogenology 59:107；Malassagne等人2003,Xenotransplantation 10(3):267)。

表达载体可以编码允许易于纯化或鉴定重组产生的蛋白质的标签。例子包括但不限于，载体pUR278(Ruther等人1983,EMBO J.2:1791)，在所述载体中本文所述的FVIII蛋白的编码序列可以被连接到在框内具有lac Z编码区的载体中，从而产生杂合蛋白；pGEX载体可以用于表达具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的蛋白质。这些蛋白质通常是可溶的并且可以通过吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠，然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱，容易地从细胞中纯化出来。载体包括切割位点(例如，PreCission蛋白酶(Pharmacia，新泽西州皮帕克))，为了易于在纯化后去除标签。

出于本公开文本的目的，可以使用许多表达载体系统。这些表达载体通常可在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分进行复制。表达载体可包括表达控制序列，包括但不限于启动子(例如天然缔合或异源启动子)、增强子、信号序列、剪接信号、增强子元件和转录终止序列。优选地，所述表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。表达载体还可以利用衍生自动物病毒的DNA元件，如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)、巨细胞病毒(CMV)或SV40病毒。其他涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。

一般来说，表达载体含有选择标记(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以允许检测用所需DNA序列转化的那些细胞(参见例如，Itakura等人,美国专利4,704,362)。可以通过引入一种或多种标记来选择已将DNA整合至其染色体中的细胞，所述一种或多种标记允许选择经转染的宿主细胞。所述标记可以提供对营养缺陷型宿主的原营养、杀生物剂抗性(例如抗生素)或对重金属如铜的抗性。可选择标志基因可以直接与待表达的DNA序列连接，或者通过共转化引入同一细胞中。

可用于表达优化的FVIII序列的载体的例子是NEOSPLA(美国专利号6,159,730)。此载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β珠蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已发现此载体在掺入可变区和恒定区基因、细胞中转染、随后在含有G418的培养基中选择和甲氨蝶呤扩增后，会导致非常高水平的抗体表达。载体系统还在美国专利号5,736,137和5,658,570中教导，将其中的每一个均通过引用以其整体并入本文。此系统提供高表达水平，例如，>30pg/细胞/天。其他示例性载体系统披露于例如美国专利号6,413,777中。

在其他实施方案中，可以使用多顺反子构建体表达本公开文本的多肽。在这些表达系统中，可以从单个多顺反子构建体产生多个目的基因产物，如多聚体结合蛋白的多个多肽。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞中提供相对较高水平的多肽。相容的IRES序列披露于美国专利号6,193,980中，将其也并入本文。

更一般地，一旦制备了编码多肽的载体或DNA序列，就可以将表达载体引入合适的宿主细胞中。也就是说，所述宿主细胞可被转化。如上所述，可以通过本领域技术人员熟知的各种技术来实现将质粒引入宿主细胞中。转化的细胞在适于产生FVIII多肽的条件下生长，并且进行FVIII多肽合成测定。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学等。

在描述用于从重组宿主分离多肽的过程时，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以表示多肽来源，除非另有明确说明。换言之，从“细胞”中回收多肽可以意指从离心沉淀的全细胞，或从含有培养基和悬浮细胞二者的细胞培养物中回收。

用于蛋白质表达的宿主细胞系优选是哺乳动物来源的；最优选是人或小鼠来源的，因为本公开文本的分离的核酸已经针对在人细胞中表达进行了优化。上文已经描述了示例性宿主细胞系。在产生具有FVIII活性的多肽的方法的一个实施方案中，宿主细胞是HEK293细胞。在产生具有FVIII活性的多肽的方法的另一个实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。

编码本公开文本的多肽的基因也可以在非哺乳动物细胞中表达，如细菌或酵母或植物细胞。在这一方面，应当理解，也可以转化多种单细胞非哺乳动物微生物如细菌；即那些能够在培养或发酵中生长的那些微生物。易于转化的细菌包括以下的成员：肠杆菌科，如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌属(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌属(Pneumococcus)；链球菌属(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。还应理解，当在细菌中表达时，多肽典型情况下会成为内含体的一部分。必须分离、纯化多肽，然后将其组装成功能性分子。

可替代地，可以将本公开文本的优化的核苷酸序列掺入转基因中以引入转基因动物的基因组中并且随后在转基因动物的乳汁中表达(参见例如，Deboer等人,US 5,741,957；Rosen,US 5,304,489；和Meade等人,US 5,849,992)。合适的转基因包括与来自乳腺特异性基因的启动子和增强子可操作连接的多肽的编码序列(如酪蛋白或β乳球蛋白)。

体外生产允许按比例放大以给出大量的所需多肽。在组织培养条件下用于哺乳动物细胞培养的技术是本领域已知的并且包括同质悬浮培养(例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中)，或在琼脂糖上微珠或陶瓷盒上的固定化或包埋的细胞培养(例如在中空纤维、微胶囊中)。如果必要和/或需要，可以通过常规色谱方法纯化多肽溶液，例如凝胶过滤，离子交换色谱，DEAE-纤维素色谱或(免疫)亲和色谱，例如，在合成铰链区多肽的优选生物合成后或在本文所述的HIC色谱步骤之前或之后。亲和标签序列(例如His(6)标签)可以任选地附接或包括在多肽序列内以促进下游纯化。

一旦表达，就可以根据本领域的标准程序纯化FVIII蛋白，所述标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱色谱、HPLC纯化、凝胶电泳等(通常参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))。至少约90％至95％同质性的基本上纯的蛋白质优选用于药物用途，其中98％至99％或更高的同质性是最优选的。

药物组合物

含有本公开文本的分离的核酸分子、核酸分子编码的具有FVIII活性的多肽、载体或宿主细胞的组合物可以含有合适的药学上可接受的载体。例如，所述组合物可以含有有助于将活性化合物加工成设计用于递送至作用位点的制剂的赋形剂和/或助剂。

药物组合物可以被配制用于通过推注注射的肠胃外施用(即静脉内、皮下或肌内)。注射用配制品能以单位剂型存在，例如在添加有防腐剂的安瓿中或多剂量容器中。组合物可以采取诸如于油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液等形式，并且含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等配制剂。可替代地，活性成分可以呈粉末形式，用于用适宜媒介物(例如，无热原水)来构造。

适合于肠胃外施用的配制品还包括呈水溶性形式(例如，水溶性盐)的活性化合物的水溶液。另外，可以施用作为适当油性注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。适宜亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油(例如，芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如，油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有稳定剂。脂质体还可以用于包封本公开文本的分子，用于递送至细胞或间质空间中。示例性药学上可接受的载体是生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等。在一些实施方案中，组合物包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。在其他实施方案中，组合物包含增强活性成分的贮存期限或有效性的药学上可接受的物质(如润湿剂)或少量辅助物质(如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液)。

本公开文本的组合物可以呈多种形式，包括例如液体(例如，可注射和可输注的溶液)、分散液、悬浮液、半固体和固体剂型。优选形式取决于施用方式和治疗应用。

组合物可以配制为溶液、微乳液、分散液、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性成分以所需量并入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。通常，分散液是通过以下方式来制备：将活性成分并入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法从预先无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。可以例如通过以下方式维持溶液的适当流动性：通过使用诸如卵磷脂等包衣，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过以下方式来实现：在组合物中包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐和明胶。

活性成分可以用受控释放配制品或装置来配制。此类配制品和装置的例子包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类配制品和装置的方法是本领域已知的。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

可注射长效配制品可以通过以下方式来制备：形成药物于生物可降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中的微囊化基质。根据药物与聚合物的比率以及所采用聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其他示例性生物可降解聚合物是聚原酸酯和聚酐。可注射长效配制品还可以通过将药物捕集于脂质体或微乳液中来制备。

可以将补充性活性化合物并入组合物中。在一个实施方案中，用另一凝血因子或其变体、片段、类似物或其衍生物配制本公开文本的嵌合蛋白。例如，凝血因子包括但不限于因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原、纤维蛋白原、血管性血友病因子或重组可溶性组织因子(rsTF)或前述任一种的激活形式。凝血因子或止血剂还可以包括抗纤维蛋白溶药，例如ε-氨基己酸、氨甲环酸。

可以调节剂量方案以提供最佳所需反应。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用若干次分开剂量，或者可以如治疗情况的紧迫性所示的成比例地减少或增加剂量。有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物，以便于施用和剂量均匀。参见例如，Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,Easton,Pa.1980)。

除了活性化合物以外，液体剂型还可以含有惰性成分，如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯。

合适的药物载体的非限制性例子也描述于E.W.Martin的Remington'sPharmaceutical Sciences中。赋形剂的一些例子包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。组合物还可以含有pH缓冲试剂以及润湿剂或乳化剂。

对于口服施用，药物组合物可以采取通过常规手段制备的片剂或胶囊的形式。还可以将组合物制备为液体，例如糖浆或悬浮液。液体可以包括悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)、乳化剂(卵磷脂或阿拉伯胶)、非水性媒介物(例如，扁桃仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制剂还可以包括矫味剂、着色剂和甜味剂。可替代地，组合物可以作为干产品存在，用于用水或另一种适宜媒介物来构造。

对于经颊施用，组合物可以采取根据常规方案的片剂或锭剂的形式。

对于通过吸入施用，根据本公开文本使用的化合物便捷地以含有或不含赋形剂的雾化气溶胶的形式或以气溶胶喷雾剂的形式从任选地具有推进剂的加压包或雾化器递送，所述推进剂是例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供递送计量量的阀来确定。例如用于吸入器或吹入器中的明胶的胶囊和药筒可以配制含有化合物与诸如乳糖或淀粉等适宜粉末基质的粉末混合物。

药物组合物还可以被配制用于作为例如含有常规栓剂基质(如可可脂或其他甘油酯)的栓剂或保留灌肠剂经直肠施用。

在一个实施方案中，药物组合物包含具有因子VIII活性的多肽、编码具有因子VIII活性的多肽的优化的核酸分子、包含所述核酸分子的载体或包含所述载体的宿主细胞以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物是通过选自以下的途径来施用：局部施用、眼内施用、肠胃外施用、鞘内施用、硬膜下施用和口服施用。肠胃外施用可以是静脉内或皮下施用。

治疗方法

在一些方面，本公开文本涉及治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括施用本文所公开的核酸分子、载体、多肽或药物组合物。

在一些实施方案中，本公开文本涉及用于增加受试者中的具有FVIII活性的多肽的表达的方法。在一些实施方案中，所述方法包括施用包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少80％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。

在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗出血障碍的方法。在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗血友病A的方法。

分离的核酸分子、载体或多肽可以静脉内、皮下、肌内或经由任何粘膜表面施用，例如口服、舌下、经颊、舌下、经鼻、经直肠、经阴道或经由肺途径。分离的核酸分子、载体或多肽还可以神经内、眼内和鞘内施用。可以将凝血因子蛋白植入生物聚合物固相支持体内或与所述固相支持体连接，从而允许将嵌合蛋白缓慢释放至所需位点。

在一个实施方案中，分离的核酸分子、载体或多肽的施用途径是肠胃外的。如本文所用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。在一些实施方案中，分离的核酸分子、载体或多肽是静脉内施用的。虽然所有这些施用形式明显被认为是在本公开文本的范围内，但施用形式将是用于注射，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。

用于治疗病症的本公开文本的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用手段、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、所施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法逐步增加，以优化安全性和功效。

本公开文本的核酸分子、载体或多肽可以任选地与在需要治疗(例如，预防性或治疗性)的障碍或病症的治疗中有效的其他药剂组合施用。

如本文所用，与辅助疗法结合或组合的本公开文本的分离的核酸分子、载体或多肽的施用意指依序、同时、同延、并行、伴随或同期施用或应用所述疗法和所公开的多肽。本领域技术人员将了解，组合治疗方案中各种组分的施用或应用可以定时以增强治疗的总体有效性。基于所选辅助疗法和本说明书的传授内容，技术人员(例如，医师)在不进行过度实验的情况下便能够容易地辨别有效的组合治疗方案。

应进一步了解，本公开文本的分离的核酸分子、载体或多肽可以与一种或多种药剂结合或组合使用(例如，以提供组合治疗方案)。本公开文本的多肽或多核苷酸可以组合的示例性药剂包括代表用于所治疗的特定障碍的当前护理标准的药剂。此类药剂的性质可以是化学的或生物的。术语“生物剂(biologic)”或“生物剂(biologic agent)”是指预期用作治疗剂的从活的生物体和/或其产物制备的任何药学活性剂。

要与本公开文本的多核苷酸或多肽组合使用的药剂的量可以随受试者变化，或者可以根据本领域的知识来施用。参见例如，Bruce A Chabner等人,AntineoplasticAgents,Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287(Joel G.Hardman等人编辑,第9版1996)。在另一个实施方案中，施用符合护理标准的量的这种药剂。

在一个实施方案中，本文还公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含本文公开的核酸分子以及向有需要的受试者施用所述核酸分子的说明书。在另一个实施方案中，本文公开了一种用于产生本文所提供的核酸分子的杆状病毒系统。核酸分子是在昆虫细胞中产生的。在另一个实施方案中，提供了一种针对表达构建体的纳米颗粒递送系统。表达构建体包含本文公开的核酸分子。

基因疗法

体细胞基因疗法已经被探索为对出血障碍，并且特别是血友病A的可能的治疗方法。基因疗法是对血友病的特别有吸引力的治疗方法，因为它有通过单次施用编码FVIII的载体后持续内源性产生FVIII来治愈疾病的潜力。血友病A非常适合于基因替代方法，因为其临床表现可完全归因于缺少以微小量(200ng/ml)在血浆中循环的单一基因产物(FVIII)。

由于慢病毒载体的大容量和经由整合维持转基因表达的能力，它们作为基因递送媒介物得到重视。已经在许多离体细胞疗法临床项目中评价了慢病毒载体具有有前途的功效和安全性特征。

本公开文本通过提供包含密码子优化的FVIII序列的慢病毒载体满足了本领域中的重要需求，所述优化的FVIII序列显示出在受试者中的表达增加以及在用于基因治疗方法时潜在地导致更大的治疗功效。本公开文本的实施方案涉及包含一个或多个编码本文所述的具有FVIII活性的多肽的密码子优化的核酸分子的慢病毒载体、包含所述慢病毒载体的宿主细胞(例如，肝细胞)以及使用所公开的慢病毒载体的方法(例如，使用本文公开的慢病毒载体治疗出血障碍)。

总体上，本文公开的治疗方法涉及施用包含核酸分子的慢病毒载体，所述核酸分子包含至少一个编码FVIII凝血因子的密码子优化的核酸序列，其中所述编码FVIII凝血因子的核酸序列与合适的表达控制序列可操作地连接，所述表达控制序列在一些实施方案中被掺入到慢病毒载体(例如，复制缺陷型慢病毒病毒载体)中。

本公开文本提供了治疗有需要的受试者的出血障碍(例如，血友病A)的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少一剂5x 10¹⁰或更少的转导单位/kg(TU/kg)(或者10⁹或更少的TU/kg、或者10⁸或更少的TU/kg)的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含含有编码具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:11具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:14具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。

在一些实施方案中，将慢病毒载体以单一剂量或多个剂量施用。在一些实施方案中，将慢病毒载体剂量一次性施用或分成多个亚剂量，例如，两个亚剂量、三个亚剂量、四个亚剂量、五个亚剂量、六个亚剂量或多于六个亚剂量施用。在一些实施方案中，施用多于一个慢病毒载体。

在一些实施方案中，将慢病毒载体的剂量重复施用至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。在一些实施方案中，将慢病毒载体经由静脉内注射施用。

在一些实施方案中，受试者是儿童受试者，而在其他方面，受试者是成人受试者。

在一些实施方案中，慢病毒载体包含至少一个组织特异性启动子，即，将在特定组织或细胞类型中调节具有FVIII活性的多肽的表达的启动子。在一些实施方案中，慢病毒载体中的组织特异性启动子选择性地增强具有FVIII活性的多肽在靶活细胞中的表达。在一些实施方案中，选择性地增强具有FVIII活性的多肽在靶活细胞中的表达的组织特异性启动子包含mTTR启动子。在一些实施方案中，靶活细胞是肝细胞。

由于慢病毒载体可以转导所有肝细胞类型，转基因(例如，FVIII)在不同细胞类型中的表达可以通过在慢病毒载体中使用不同的启动子来控制。因此，慢病毒载体可以包含特异性启动子，所述启动子将控制FVIII转基因在不同的组织或细胞类型(如不同的肝组织或细胞类型)中的表达。因此，在一些实施方案中，慢病毒载体可以包含内皮特异性启动子，所述启动子将控制FVIII转基因在肝内皮组织中的表达；或肝细胞特异性启动子，所述启动子将控制FVIII转基因在肝细胞中的表达；或二者。

在一些实施方案中，慢病毒载体包含一种或多种组织特异性启动子，所述启动子控制FVIII转基因在除肝以外的组织中的表达。在一些实施方案中，将分离的核酸分子稳定整合到靶细胞或靶组织的基因组中，例如肝细胞的基因组中或肝内皮细胞的基因组中。

在一些实施方案中，在本公开文本的慢病毒载体中编码具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列包含coBDDFVIII-3aa(SEQ ID NO:14)、由其组成或基本上由其组成。

在其他实施方案中，在本公开文本的慢病毒载体中编码具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列包含coBDDFVIII6-XTEN-3aa(SEQ ID NO:11)、由其组成或基本上由其组成。

在其他实施方案中，在本公开文本的慢病毒载体中编码具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:16、由其组成或基本上由其组成。

本文公开的慢病毒载体可以在哺乳动物(例如，人患者)体内以低剂量(例如，10¹⁰TU/kg或更低、10⁹TU/kg或更低、或10⁸TU/kg或更低)使用，使用基因治疗方法对于选自以下的出血疾病或障碍的治疗将是治疗上有益的：出血凝结障碍、关节积血、肌肉出血、口腔出血、出血症、出血至肌肉中、口腔出血症、创伤、头部创伤、胃肠出血、颅内出血、腹内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血和髂腰肌鞘出血。在一个实施方案中，出血疾病或障碍是血友病。在另一个实施方案中，出血疾病或障碍是血友病A。

在一些实施方案中，将靶细胞(例如，肝细胞)在体外用低剂量(例如，10¹⁰TU/kg或更低、10⁹TU/kg或更低、或10⁸TU/kg或更低)的本文公开的慢病毒载体处理，然后施用至患者。在某些实施方案中，将靶细胞(例如，肝细胞)在体外用约3.0x10⁹TU/kg的本文公开的慢病毒载体处理，然后施用至患者。在又另一个实施方案中，将来自患者的细胞(例如，肝细胞)用低剂量(例如，10¹⁰TU/kg或更低、10⁹TU/kg或更低、或10⁸TU/kg或更低)的本文公开的慢病毒载体离体处理，然后施用至患者。

在一些实施方案中，相对于生理正常循环FVIII水平，施用本文公开的慢病毒载体(例如，以10¹⁰TU/kg或更低、10⁹TU/kg或更低、或10⁸TU/kg或更低施用)后的血浆FVIII活性增加至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少约220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％或至少约300％。

本公开文本还提供了治疗、预防、改善有需要的受试者的止血障碍(例如，出血障碍，如血友病A)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含含有编码具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中将所述慢病毒载体以5x10¹⁰或更少TU/kg、10⁹或更少TU/kg、或10⁸或更少TU/kg的至少一个剂量施用。

通过本公开文本的慢病毒载体的治疗/改善和预防可以是绕路疗法。接受绕路疗法的受试者可能已经产生针对凝血因子(例如，FVIII)的抑制剂，或者正在产生凝血因子抑制剂。

本公开文本的慢病毒载体通过促进纤维蛋白凝块的形成治疗或预防止血障碍。由本公开文本的核酸分子编码的具有FVIII活性的多肽可以激活凝结级联的成员。凝血因子可以是外在途径、固有途径或二者的参与者。

本公开文本的慢病毒载体可以用于治疗已知可用FVIII治疗的止血障碍。可以使用本公开文本的方法治疗的止血障碍包括但不限于血友病A、血友病B、血管性血友病、因子XI缺乏(PTA缺乏)、因子XII缺乏、以及纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII的缺乏或结构异常、关节积血、肌肉出血、口腔出血、出血症、出血至肌肉中、口腔出血症、创伤、头部创伤、胃肠出血、颅内出血、腹内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙出血、腹膜后间隙出血和髂腰肌鞘出血。

用于向受试者施用的组合物包括包含核酸分子的慢病毒载体，所述核酸分子包含本公开文本的编码FVIII凝血因子(用于基因疗法应用)以及FVIII多肽分子的优化的核苷酸序列。在一些实施方案中，用于施用的组合物是在体内、在体外或离体与本公开文本的慢病毒载体接触的细胞。

在一些实施方案中，止血障碍是遗传性障碍。在一个实施方案中，受试者患有血友病A。在其他实施方案中，止血障碍是缺乏FVIII的结果。在其他实施方案中，止血障碍可能是缺陷性FVIII凝血因子的结果。

在另一个实施方案中，止血障碍可以是获得性障碍。获得性障碍可能源自潜在的继发性疾病或病症。无关病症可以是(作为例子但不限制)癌症、自身免疫疾病或妊娠。获得性障碍可能源自衰老或源自治疗潜在继发性障碍的药物疗法(例如，癌症化学疗法)。

本公开文本还涉及治疗未患止血障碍或导致获得止血障碍的继发性疾病或病症的受试者的方法。本公开文本因此涉及治疗需要通用止血剂的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本公开文本的慢病毒载体。例如，在一个实施方案中，需要通用止血剂的受试者正在进行或即将进行手术。本公开文本的慢病毒载体可以在手术之前或之后作为预防剂施用。

本公开文本的慢病毒载体可以在手术期间或之后施用以控制急性出血事件。手术可以包括但不限于肝移植、肝切除或干细胞移植。

在另一个实施方案中，本公开文本的慢病毒载体可以用于治疗患有急性出血发作但未患止血障碍的受试者。急性出血发作可能源自严重创伤(例如，手术)、车祸、伤口、枪击撕裂(laceration gun shot)或导致不受控制的出血的任何其他创伤性事件。

慢病毒载体可以用于预防性治疗患有止血障碍的受试者。慢病毒载体也可以用于治疗患有止血障碍的受试者的急性出血发作。

在另一个实施方案中，本文公开的慢病毒载体的施用和/或随后FVIII蛋白转基因的表达不诱导受试者的免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答包含产生针对FVIII的抗体。在一些实施方案中，免疫应答包含细胞因子分泌。在一些实施方案中，免疫应答包含激活B细胞、T细胞或B细胞和T细胞二者。在一些实施方案中，免疫应答是抑制性免疫应答，其中相对于未产生免疫应答的受试者的FVIII的活性，受试者的免疫应答降低FVIII蛋白的活性。在某些实施方案中，通过施用本公开文本的慢病毒载体表达FVIII蛋白预防针对FVIII蛋白或从分离的核酸分子或慢病毒载体表达的FVIII蛋白的抑制性免疫应答。

在一些实施方案中，将本公开文本的慢病毒载体与至少一种促进止血的其他药剂组合施用。促进止血的所述其他药剂是具有已证实的凝血活性的治疗剂。作为例子但不限制，止血剂可以包括因子V、因子VII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原或纤维蛋白原或前述任一种的激活形式。凝血因子或止血剂还可以包括抗纤维蛋白溶解药，例如ε-氨基己酸、氨甲环酸。

在本公开文本的一个实施方案中，组合物(例如，慢病毒载体)是在将FVIII施用至受试者时以可激活的形式存在的组合物。这种可激活的分子可以在施用至受试者后在体内在凝血位点处被激活。

本公开文本的慢病毒载体可以静脉内、皮下、肌内或通过任何粘膜表面施用，例如，口服、舌下、经颊、舌下、经鼻、直肠、阴道或经由肺途径。可以将慢病毒载体植入生物聚合物固体支持物内或连接至生物聚合物固体支持物，从而允许将载体缓慢释放到所需的位点。

在一个实施方案中，慢病毒载体的施用途径是肠胃外。如本文所用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。肠胃外施用的静脉内形式是优选的。虽然所有这些施用形式明显被认为是在本公开文本的范围内，但施用形式将是用于注射，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，适于注射的药物组合物可以包含缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、任选地稳定剂(例如人白蛋白)等。然而，在与本文的传授内容相容的其他方法中，可以将慢病毒载体直接递送至不良细胞群的位点，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)以及可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在本公开文本中，药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M且优选地0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其他常见的肠胃外媒介物包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

更具体地，适于注射使用的药物组合物包括无菌的水性溶液(在水溶性的情况下)或分散液、以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在此类情况下，组合物必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。其应在制造和储存条件下稳定，并且将优选地抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，将优选地在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。

在任何情况下，无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物(例如，多肽自身或与其他活性剂组合)以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。将用于注射的制剂加工，填充至容器(如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶)中，并且根据本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，制剂可以以试剂盒的形式包装和出售。此类制品将优选地具有标签或包装说明书，所述标签或包装说明书表明相关组合物可用于治疗患有或易患凝血障碍的受试者。

药物组合物还可以被配制用于作为例如含有常规栓剂基质(如可可脂或其他甘油酯)的栓剂或保留灌肠剂经直肠施用。

用于治疗病症的本公开文本的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用手段、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、所施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法逐步增加，以优化安全性和功效。

慢病毒载体可以作为单一剂量或作为多个剂量来施用，其中多个剂量可以连续施用或以指定时间间隔施用。可以采用体外测定来确定用于施用的最佳剂量范围和/或时间表。测量凝血因子活性的体外测定是本领域已知的。另外，有效剂量可以根据从动物模型(例如，血友病犬)获得的剂量-反应曲线来推知(Mount等人2002,Blood 99(8):2670)。

在上述范围中间的剂量也意图在本公开文本的范围内。可以每天、隔日、每周或根据按经验分析确定的任何其他时间表向受试者施用此类剂量。示例性治疗使得需要在例如至少六个月的延长时期中以多个剂量施用。

可以多次施用本公开文本的慢病毒载体。单一剂量之间的间隔可以是每天、每周、每个月或每年。如通过测量修饰的多肽或抗原在患者体内的血液水平所指示，间隔也可以是不规律的。本公开文本的慢病毒载体的剂量和频率根据由转基因编码的FVIII多肽在患者体内的半衰期而变化。

本公开文本的慢病毒载体的施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，将含有本公开文本的慢病毒载体的组合物施用至尚未处于疾病状态的患者，以增强所述患者的抵抗力或最小化疾病的影响。这种剂量被定义为“预防有效剂量”。在很长一段时间内以相对较不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。

本公开文本的慢病毒载体可以任选地与在需要治疗(例如，预防性或治疗性)的障碍或病症的治疗中有效的其他药剂组合施用。

如本文所用，与辅助疗法结合或组合的本公开文本的慢病毒载体的施用意指依序、同时、同延、并行、伴随或同期施用或应用所述疗法和所公开的多肽。本领域技术人员将了解，组合治疗方案中各种组分的施用或应用可以定时以增强治疗的总体有效性。基于所选辅助疗法和本说明书的传授内容，技术人员(例如，医师)在不进行过度实验的情况下便能够容易地辨别有效的组合治疗方案。

应进一步了解，本公开文本的慢病毒载体可以与一种或多种药剂结合或组合使用(例如，以提供组合治疗方案)。可以与本公开文本的慢病毒载体组合的示例性药剂包括代表用于所治疗的特定障碍的当前护理标准的药剂。此类药剂的性质可以是化学的或生物的。术语“生物剂(biologic)”或“生物剂(biologic agent)”是指预期用作治疗剂的从活的生物体和/或其产物制备的任何药学活性剂。

要与本公开文本的慢病毒载体组合使用的药剂的量可以随受试者变化，或者可以根据本领域的知识来施用。参见例如，Chabner等人,Pharmacological Basis ofTherapeutics 1233-1287(Joel G.Hardman等人编辑,第9版1996)。在另一个实施方案中，施用符合护理标准的量的这种药剂。

在某些实施方案中，将本公开文本的慢病毒载体与免疫抑制剂、抗过敏剂或抗炎剂结合施用。这些药剂通常是指起到抑制或屏蔽本文所治疗的受试者的免疫系统的作用的物质。这些药剂包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或屏蔽MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶；硫唑嘌呤；环磷酰胺；溴麦角环肽；达那唑；氨苯砜；戊二醛；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇，如糖皮质激素，例如，泼尼松、甲泼尼龙和地塞米松；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；全T抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶性肽；链激酶；TGF-β；链道酶；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素和雷帕霉素。在某些实施方案中，药剂是抗组胺药。如本文所用的“抗组胺药”是拮抗组胺的生理作用的药剂。抗组胺药的例子是氯苯那敏、苯海拉明、普鲁米近、色甘酸钠、阿司咪唑、马来酸阿扎他定、马来酸溴苯那敏、马来酸卡比沙明、盐酸西替利嗪、富马酸氯马斯汀、盐酸赛庚啶、马来酸右溴苯那敏、马来酸右氯苯那敏、茶苯海明、盐酸苯海拉明、琥珀酸多西拉敏、盐酸非索非那定、盐酸特非那定、盐酸羟嗪、氯雷他定、盐酸美克洛嗪、柠檬酸曲吡那敏、盐酸曲吡那敏和盐酸曲普利啶。

可以将免疫抑制剂、抗过敏剂或抗炎剂掺入慢病毒载体施用方案中。例如，免疫抑制剂或抗炎剂的施用可以在施用所公开的慢病毒载体之前开始，并且可以在此后以一个或多个剂量继续。在某些实施方案中，将免疫抑制剂或抗炎剂作为慢病毒载体的预先用药来施用。

如前所述，本公开文本的慢病毒载体可以以药学有效量施用，以用于凝血障碍的体内治疗。在这一方面，应当理解，本公开文本的慢病毒载体可以被配制成促进施用且促进活性剂的稳定性。优选地，根据本公开文本的药物组合物包含药学上可接受的、无毒的、无菌的载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。当然，本公开文本的药物组合物可以以单一剂量或多个剂量施用，以提供药学有效量的多肽。

多种测试可用于评估凝结系统的功能：激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测试、生色测定、测定、凝血酶原时间(PT)测试(也用于确定INR)、纤维蛋白原测试(通常通过克劳斯法进行)、血小板计数、血小板功能测试(通常通过PFA-100进行)、TCT、出血时间、混合测试(如果将患者的血浆与正常血浆混合，是否矫正异常)、凝结因子测定、抗磷脂抗体、D-二聚体、遗传测试(例如，因子V Leiden、凝血酶原突变G20210A)、稀释鲁塞尔蝰蛇毒时间(dRVVT)、杂项血小板功能测试、凝血弹性描记法(TEG或Sonoclot)、凝血弹性测量法(/>例如/>)或优球蛋白溶解时间(ELT)。

aPTT测试是测量“固有”(也称为接触激活途径)和常见凝结途径二者的功效的性能指示物。这个测试一般用于测量市售重组凝血因子(例如，FVIII或FIX)的凝血活性。其与测量外在途径的凝血酶原时间(PT)结合使用。

分析提供关于止血的整体动力学的信息：凝血时间、凝块形成、凝块稳定性和溶解。凝血弹性测量法中的不同参数依赖于血浆凝结系统的活性、血小板功能、纤维蛋白溶解或影响这些相互作用的许多因素。这个分析可以提供次级止血的全面见解。

本文所述的所有各个方面、实施方案和选择都能以任何和所有变化组合。

本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同指示每个单独出版物、专利或专利申请明确且单独地通过引用并入一般。

已经一般性地描述了本公开文本，通过参考本文所提供的实施例可以获得进一步的理解。这些实施例仅用于说明的目的，而不具有限制性。

实施例

实施例1：优化的coBDDFVIII6-XTEN-3aa转基因的产生

假设可以通过针对靶向宿主对编码序列进行密码子优化来提高转基因表达水平。在先前的研究中已经使用密码子优化的FVIIIco6XTEN基因盒证明了更高水平的FVIII表达。此基因盒包含编码B结构域缺失的人因子VIII(BDDcoFVIII)的密码子优化的cDNA，所述BDDcoFVIII与FVIII的B结构域中的XTEN 144肽融合。

为了进一步改善靶标特异性并且降低免疫原性，将经由计算机模拟抗原性分析用于评价将新表位引入FVIIIco6XTEN蛋白中的风险并且使所述风险最小化。使用开放资源免疫表位数据库和分析资源(Immune Epitope Database and Analysis Resource，IEDB)和用于确定主要组织相容性复合物II类(MHCII)与嵌合蛋白的结合的推荐的预测方法评价了多种代表性人白细胞抗原(HLA)等位基因(DR、DP、DQ)。对于另外的分析，还使用了用HLA-DR等位基因(代表北美或日本群体)的NetMHCIIpan 3.0方法(参见Lamberth K等人SciTransl Med.2017；9(372):eaag1286)。

半数最大抑制浓度(IC₅₀)值<50nM、<500nM、<5000nM的肽被认为对MHCII分别具有高亲和力(高免疫原性风险)、中亲和力和低亲和力。将500nM的IC₅₀截止值用于评价HLA-DR等位基因。IC₅₀值>500nM被认为不具有显著的免疫原性潜力。

位于嵌合蛋白的FVIII-XTEN连接处的GAP残基被鉴定为具有免疫原性潜力。申请人将这些GAP残基鉴定为由对应于XhoI限制性酶切位点(最初为了促进克隆而引入)的核苷酸序列编码。将编码GAP残基的9个核苷酸从FVIII蛋白的编码序列中缺失。这些核苷酸和翻译的蛋白质中的相应的GAP残基的缺失被确认为消除了FVIII-XTEN连接处的免疫原性潜力。

这得到了编码本文测试的嵌合FVIII蛋白(被称为“coBDDFVIII6-XTEN-3aa”)的最终FVIII核苷酸序列。编码coBDDFVIII6-XTEN-3aa的核苷酸序列被公开为SEQ ID NO:11。coBDDFVIII6-XTEN-3aa的氨基酸序列被公开为SEQ ID NO:12(对于另外的序列信息，参见表1)。

实施例2：编码coBDDFVIII-XTEN-3aa的基因表达盒的产生

设计携带在肝细胞特异性启动子的控制下以用于体内表达的coBDDFVIII-XTEN-3aa转基因的基因表达盒。基因表达盒侧接5’和3’长末端重复(LTR)序列，所述序列促进转移质粒序列整合到宿主基因组中。

LTR编码元件包括与异源人巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子区融合的嵌合5’LTR(SEQ ID NO:1)、3’LTR的U3区中的增强子/启动子序列的自失活(SIN)缺失体(SEQ ID NO:X_标注为“dU3RU5”)以及允许Tat结合的R区和U5区(SEQ ID NO:2_RU5区)。

转移质粒维持衣壳化、逆转录和整合到宿主细胞基因组中所必需的顺式作用病毒序列。顺式作用病毒序列是包装信号(Psi，Ψ)、SL123的引物结合位点(PBS)(SEQ ID NO:3)、茎环4(SL4)(SEQ ID NO:4)、逆转录所必需的多嘌呤区(PPT)(SEQ ID NO:6)、具有供体和受体剪接位点的内含子以及未剪接的全基因组转录物的Rev介导的核输出所必需的Rev响应元件(RRE)(SEQ ID NO:5)。另外，质粒还编码在3’UTR处掺入的造血特异性微小RNAmiR-142-3pT(SEQ ID NO:10)的互补序列的四个串联拷贝，以防止转基因在造血谱系抗原呈递细胞中表达而维持转基因在非造血细胞中表达(Brown等人Nature 12:585-591(2006))。

基因盒包含编码与XTEN 144肽融合的B结构域缺失的人因子VIII(BDDcoFVIII)的密码子优化的cDNA，其中将FVIII/XTEN连接处的三个氨基酸残基(Gly-Ala-Pro)去除以避免潜在的MHCII结合位点(XTEN-3aa)(参见实施例1)。此转基因(称为coBDDFVIII6-XTEN-3aa)通过肝脏特异性的经修饰的小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子(SEQ ID NO:9)与两个上游增强子序列(mTTR增强子元件(SEQ ID NO:8)和合成增强子(SEQ ID NO:7))调控。

包含编码coBDDFVIII6-XTEN-3aa的基因表达盒的质粒的图形表示示于图1中。

以下实施例测试了在多个动物模型中coBDDFVIII-XTEN-3aa转基因的体内功能性。

实施例3：LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa处理在HemA新生小鼠中的长期剂量反应

为了评估使用慢病毒系统在儿科HemA模型中表达coBDDFVIII6-XTEN-3aa以及产生FVIII活性的功效，向新生(2日龄)HemA小鼠通过颞静脉注射施用约1.5x10⁹、3.0x 10⁹、6x10⁹或1.3x 10¹⁰TU/kg LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa。通过FVIII显色测定测量循环FVIII活性。通过人FVIII特异性ELISA测定测量循环FVIII蛋白。

对于施用LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa的所有小鼠，均观察到呈剂量依赖性方式的持续长期FVIII表达。慢病毒载体处理后，接受LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa的小鼠的FVIII活性水平保持相对稳定直到第25周研究结束(图2A)。在接受1.3x 10¹⁰TU/kg LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa剂量的小鼠中观察到约50％的最高FVIII活性。与FVIII活性数据一致，对于所有慢病毒剂量，循环FVIII蛋白的水平均保持相对稳定直到研究结束(图2B)。

这些数据证明使用慢病毒系统递送的coBDDFVIII6-XTEN-3aa可以在新生HemA小鼠中产生治疗性FVIII水平。

这些数据支持使用LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa治疗儿科HemA患者的潜在的治疗益处。

实施例4：LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa处理在HemA成年小鼠中的长期剂量反应

为了评估使用慢病毒系统在成年HemA模型中表达coBDDFVIII6-XTEN-3aa以及产生FVIII活性的功效，向成年(16周龄)HemA小鼠通过颞静脉注射施用约1.3x10¹⁰或3.7x10¹⁰TU/kg LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa。通过FVIII显色测定测量循环FVIII活性。通过人FVIII特异性ELISA测定测量循环FVIII蛋白。

对于两个给药组，均观察到呈剂量依赖性方式的持续长期FVIII表达。慢病毒载体处理后，接受LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa的所有小鼠的FVIII活性水平均保持相对稳定直到至少第20周研究结束(图3)。接受3.7x 10¹⁰TU/kg LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa的小鼠在研究持续时间内的FVIII活性为正常值的大约50％。接受较低剂量1.3x 10¹⁰TU/kg LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa的小鼠的FVIII活性为正常值的≥5％-7％。

这些数据证明使用慢病毒系统递送的coBDDFVIII6-XTEN-3aa可以在成年HemA小鼠中产生治疗性FVIII水平。

这些数据支持使用LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa治疗成年HemA患者的潜在的治疗益处。这些数据还表明使用LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa的治疗益处可以以相对较低剂量的LV实现。

实施例5：LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa处理在非人灵长类动物中的长期剂量反应

为了评估使用慢病毒系统在非人灵长类动物中表达coBDDFVIII6-XTEN-3aa以及产生FVIII活性的功效，将十只雄性猪尾猕猴(3.5-4.3kg体重)经由以1.5mL/分钟的输注速率的静脉内(IV)输注用LV-coFVIII-6或LV-coFVIII-6-XTEN(由CD47高/MHC-I^无293T细胞产生)处理。LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa的剂量是1x 10⁹或3x 10⁹TU/kg。为了控制抗人FVIII抗体形成，从LV处理的第-1天至第7天，将动物用每天肌内注射SOLU-(甲基泼尼松龙)以10mg/kg的剂量处理。LV处理前三十(30)分钟，还将动物用IV注射右扑尔敏(右氯苯那敏)以4mg/kg的剂量处理以控制潜在的过敏反应。

在LV处理后第0天、第1天、第3天、第7天、第14天、第21天、第28天、第45天和第60天收集血浆样品，并且分析所述血浆样品的人FVIII活性和FVIII抗原水平。通过FVIII显色测定测量循环FVIII活性。通过人FVIII特异性ELISA测定测量循环FVIII蛋白。将每个LV给药组的FVIII活性水平和FVIII抗原水平跨处理后时间点取平均值。

1x 10⁹和3x 10⁹TU/kg处理组的平均FVIII活性水平分别是正常值的约20％和约75％(图4A)。1x 10⁹或3x 10⁹TU/kg处理组的平均FVIII抗原水平分别为约31ng/mL或约140ng/mL(图4B)。

这些数据证明LV-coBDDFVIII6-XTEN-3aa可以在非人灵长类动物中产生治疗性人FVIII水平。

序列

表1.核苷酸和氨基酸序列

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Claims (48)

1.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有因子VIII(FVIII)活性的多肽。

2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性。

3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:11具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。

4.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有因子VIII活性的多肽。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与SEQID NO:11的核苷酸58-4815具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含SEQID NO:11的核苷酸58-4815。

7.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:14具有至少85％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有因子VIII(FVIII)活性的多肽。

8.根据权利要求7所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:14具有至少90％序列同一性。

9.根据权利要求7所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:14具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。

10.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有因子VIII活性的多肽。

11.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含表达因子VIII多肽的基因盒，其中所述基因盒包含与SEQ ID NO:16具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。

12.根据权利要求11所述的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

13.根据权利要求11所述的分离的核酸分子，其中所述基因盒包含与SEQ ID NO:16具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

14.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含表达因子VIII多肽的基因盒，其中所述基因盒包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。

15.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含表达因子VIII(FVIII)多肽的基因盒，所述基因盒包含：

i)编码FVIII蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14具有至少85％序列同一性的核酸序列；

ii)控制所述核苷酸序列的转录的启动子；和

iii)转录终止序列。

16.根据权利要求15所述的分离的核酸分子，其中所述启动子是肝脏特异性启动子。

17.根据权利要求15所述的分离的核酸分子，其中所述启动子是小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子。

18.根据权利要求15所述的分离的核酸分子，其中所述启动子是mTTR482启动子。

19.根据权利要求18所述的分离的核酸分子，其中所述启动子包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列。

20.根据权利要求15-19中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子还包含增强子元件。

21.根据权利要求20所述的分离的核酸分子，其中所述增强子元件是mTTR增强子元件。

22.根据权利要求20或21所述的分离的核酸分子，其中所述mTTR增强子元件包含SEQID NO:8的核苷酸序列。

23.根据权利要求15-22中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子还包含合成增强子序列。

24.根据权利要求23所述的分离的核酸分子，其中所述合成增强子序列包含SEQ IDNO:7的核苷酸序列。

25.根据权利要求15-24中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子还包含多嘌呤区(PPT)。

26.根据权利要求25所述的分离的核酸分子，其中所述PPT序列包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。

27.根据权利要求15-26中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子还包含人CMV启动子区序列。

28.根据权利要求27所述的分离的核酸分子，其中所述CMV启动子区序列包含SEQ IDNO:1的核苷酸序列。

29.根据权利要求15-28中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子还包含5’长末端重复(LTR)序列。

30.根据权利要求15-29中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子还包含3’LTR序列。

31.根据权利要求15-30中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子还包含茎环4序列。

32.根据权利要求31所述的分离的核酸分子，其中所述茎环4序列包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

33.根据权利要求15-32中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子还包含SL123的引物结合位点。

34.根据权利要求33所述的分离的核酸分子，其中所述SL123的引物结合位点包含SEQID NO:3的核苷酸序列。

35.根据权利要求15-34中任一项所述的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子还包含RU5区的引物结合位点。

36.根据权利要求35所述的分离的核酸分子，其中所述RU5区序列包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

37.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含表达因子VIII(FVIII)多肽的基因盒，其中所述基因盒从5’至3’包含：

(a)5’长末端重复(LTR)序列；

(b)包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列的肝脏特异性的经修饰的小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子；

(c)编码FVIII蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14具有至少85％序列同一性的核酸序列；和

(d)3’LTR序列。

38.一种载体，所述载体包含根据权利要求1-37中任一项所述的核酸分子。

39.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1-37中任一项所述的核酸分子或根据权利要求38所述的载体。

40.一种多肽，所述多肽由根据权利要求39所述的宿主细胞产生。

41.一种产生具有FVIII活性的多肽的方法，所述方法包括：将根据权利要求39所述的宿主细胞在产生具有FVIII活性的多肽的条件下培养，以及回收所述具有FVIII活性的多肽。

42.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-37中任一项所述的核酸分子。

43.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求38所述的载体和药学上可接受的赋形剂。

44.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-37中任一项所述的核酸分子和用于向有需要的受试者施用所述核酸分子的说明书。

45.一种增加受试者中的具有FVIII活性的多肽的表达的方法，所述方法包括施用包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少80％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。

46.一种治疗受试者的出血障碍的方法，所述方法包括施用包含与SEQ ID NO:11、SEQID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。

47.一种治疗受试者的出血障碍的方法，所述方法包括施用根据权利要求42或43所述的药物组合物。

48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述出血障碍是血友病A。