CZ419597A3

CZ419597A3 - Zapouzdřené buňky - zdroj modifikovaných virových částic, způsob jejich přípravy a jejich použití v genové terapii pro dodání genů do cílových tkání

Info

Publication number: CZ419597A3
Application number: CZ974195A
Authority: CZ
Inventors: Robert Michael Saller; Walter H. Günzburg; Brian Salmons
Original assignee: Bavarian Nordic Research Institute A/S; GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH
Priority date: 1995-06-27
Filing date: 1996-06-24
Publication date: 1998-03-18
Also published as: JP2008101011A; CN1189104A; UA65525C2; JP4848348B2; ATE309000T1; KR100484883B1; EP0835137A1; WO1997001357A1; HK1010139A1; NZ312671A; SI0835137T1; RU2187301C2; AU708273B2; NO975813L; PL324289A1; PT835137E; NO975813D0; JPH11508768A; IL122119A0; DK0835137T3

Description

Zapouzdřené buňky - zdroj modifikovaných virových částic, způsob jejich přípravy a jejich použití v genové terapii pro dodání genů do cílových tkání

Oblast techniky

Základem genové terapie je dodání terapeuticky výhodného genu do cílových buněk. Má-li se stát genová terapie rutinním postupem je nanejvýše důležité vyvinout systémy, které budou schopny účinně dodávat terapeutické geny in vivo cílovým buňkám.

Dosavadní stav techniky

Virové vektory, zejména retrovirové vektory jsou v genové terapii nejobvyklejším prostředníkem (Morgan a Anderson, 1993) Nejběžnější způsob genové terapie využívá přístup ez vivo, kdy buňky odebrané pacientovi jsou ín vitro geneticky modifikovány a poté vráceny pacientovi. Tento postup je těžkopádný, drahý a jeho použití je limitováno použitím špičkových technologií. Navíc je tento způsob použitelný pouze pro buňky, které je možno lehce izolovat, kultivovat a reimplantovat (Gúnzburg a spol.,1995). Ačkoliv dodání terapeutických genů in vivo by nabízela mnoho výhod, je tento postup v současné době problematický a neefektivní. Hlavním problémem je malá účinnost genomového přenosu a je proto nutno použít opakovaného dodání virového vektoru. Opakovaná

aplikace vektoru je však nejen pracná, ale pravděpodobně i neúspěšná, vzhledem k imunitní odpovědi na virové Částice.

Jeden ze způsobů, kterými by bylo možno tyto potíže překonat je přímá implantace buněk, které produkují virové částice. Implantace buněk, produkujících virové částice obsahující genom virového vektoru in šitu blízko cílového orgánu nebo cílových buněk by také umožnila přímé působení virového vektoru na tyto cílové buňky nebo orgány.

Navíc, je-li použitý virový vektor vektorem retroviru, je tento přístup výhodný proto, že ve srovnání s použitím opakovaných dávek, zvyšuje naději, že vektor bude přítomen v době, kdy cílová buňka prochází stadiem replikace, čímž se zvýší pravděpodobnost infekce. Dále, plynulé uvolňování virových částic v menších množstvích by mohlo příznivě ovlivnit možnost úniku virových částic imunitní odpovědi hostitele.

Má-li být dodáni virového vektoru účinné, buňky produkujíc! virové partikule musí být schopné přežít dlouhou : dobu po implantaci a virové částice musí být po tuto dobu produkovány a uvolňovány z buněk. Nedojde-li k významné imunitní odpovědi, na příklad po implantaci do mozku, jsou tyto buňky schopny přežívat dlouhou dobu, (Culver a spol., 1992; Ram a spol., 1993). K dosažení úspěšné implantace do jiných částí těla je však nutno produkční buňky chránit před reakcí imunitního systému.

Dlouhodobá účinnost tohoto postupu tedy závisí na (1) ochraně buněk před hostitelským immunitním systémem, který za normálních okolností eliminuje buňky produkující virové částice, a to zejména tehdy, pocházeji-li buňky produkující virové částice z jiného živočišného druhu, což je pro tyto buňky obvyklý případ a (2) prodloužené době přežití buněk in sítu, která bývá nutná pro jejich vaskularizaci.

«· ·· · ·

Do jisté míry se ukázalo úspěšné zapouzdření buněk do propustných struktur, průchodných pro některé biologicky aktivních molekul, ale zároveň chránících buňky, produkující tyto látky, před imunitní odpovědí hostitele (přehled viz Chang,1995). Byly již zapouzdřeny buňky, které byly geneticky modifikovány tak, aby produkovaly lidský růstový hormon (hGH) (Tai a Sun,1993) nebo sekretovanou formu lidské adenosin deaminázy (Hughes a spol.,1994). V obou studiích byly buňky zapouzdřeny do poly-L-lyzin-alginátové mikrokapsule a ukázalo se, že v kultuře přežívají dlouhou dobu. Tyto buňky byly po dlouhou dobu schopny vylučovat enzym nebo hormon. Dále (Tai a Sun,1993) prokázali, že po transplantaci těchto mikrokapsulí do myší byly tyto buňky schopny života 1 rok a po tuto dobu pokračovaly v produkci hGH, což dokazuje schopnost mikrokapsule chránit transfekovanou buňku před zničením hostitelským imunitním systémem.

Bylo rovněž publikováno zapouzdření buněk s použitím jiných materiálů. Geneticky byly modifikovány ledvinové buňky mladých křečků tak, aby produkovaly nervový růstový faktor, byly zapouzdřeny do chloridu polyakrylonitrilu nebo polyakrylovinylchloridu a implantovány do krysího mozku. Zapouzdřené buňky přežívaly nejméně 6 měsíců a pokračovaly v produkci NGF (Win a spol.,1994; Deglon a spol., 1995).

Hepatocyty byly úspěšně zapouzdřeny do polyelektrolytického komplexu síranu celulózy a polydimetyl diallylaminia (Stange a spol.,1993). Více než 90 % zapouzdřených hepatocytů si zachovalo životaschopnost a, na rozdíl od hepatocytů rostoucích v monovrstvě, byly metabolicky aktivnější. Tím nechceme tvrdit, že kapsule vytvořené síranem celulózy a polydimetyldiallylamoniem mohou podporovat růst buněk jiných typů, nebo umožňovat průchod virových částic těmito kapsulemi.

• ·	• · ·«	• · ·	• ·	····
• ·	*	• * · ·	«	♦	•
•	•	• ·	•	•	•
	• *	v ·	• ··	•	•
* ··· *	• ♦ • ·	• · • · · ♦···	·«	•	• •

Postup přípravy kapsulí ze síranu síranu celulózy použitých v předkládaném vynálezu byla podrobně popsána v DE 40 21 050 AI. Rovněž syntéza síranu celulózy je popsána v tomto patentu. Postupy k celkové charakterizaci kapsulí se rozsáhle zabývá H.Dautzenberg a spol.,Biomat.,Art.Cells &

Immob.Biotech. ,21(3), 399-405(1993). Jiné kapsule používající síran celulózy jsou popsány v GB 2 135 954. Vlastnosti celulozových kapsulí, t.j. jejich velikost, velikost pórů, síla stěny a mechanické vlastnosti, závisející na několika faktorech jako na příklad na fyzikálních podmínkách, za kterých byly kapsule připraveny, viskozita srážecí lázně, její iontová síla, teplota, rychlost přidávání suspense buněk nebo síranu celulózy, složení síranu celulózy a další parametry jsou popsány Dautzenbergovou skupinou.

Překvapivé bylo zjištění, že nepřetržitou produkci virových částic z implantovaných buněk lze dosáhnout zapouzdřením buněk do polyelektrodového komplexu. Ačkoliv póry těchto kapsulí jsou dostatečně velké, aby umožnily průchod protilátek a komplementu, o kterých je známo, že inaktivujících virus (Welsh a spol.,1975, Cornetta a spol.,1990), nenalezli jsme viditelné důkazy imunitní nebo Zánětlivé odpovědi v okolí implantovaných kapsulí. Překvapivé bylo navíc zjištění, že kapsule připravené podle předloženého vynálezu dobře v hostiteli přirůstají a jsou rychle vaskularizovány. Zapouzdřené buňky připravené podle předloženého vynálezu tedy dovoluji ín vivo dlouhodobé dodávání virového vektoru, nesoucího terapeutické geny.

Podstata vynálezu

Vynález se týká následujících bodů nebo jejich kombinací:

ti ΦΦΦφ Φ ·· ·· ΦΦΦΦ

5·· φ φ φ ♦ · φ · · φ φ φ ΦΦΦφ » · · φ φ * · φ φ · φ φ φ φ · · ♦

ΦΦΦΦ φφ φφφ ΦΦΦΦ φ* ·

Zapouzdřených buněk produkujících virové částice sestávájících z vnitřku, obsahujícího buňky; a porézní stěny kapsule, která obklopuje buňky a umožňuje průchod příslušným virovým částicím;

zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, kdy porézní stěna této kapsule je tvořena polyelektrolytovým komplexem, obsahujícím opačně nabité polyelektrolyty;

zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno a porézní stěna této kapsule je tvořena polyelektrodovým komplexem z polysacharidů nebo polysacharidových derivátů, obsahujících síranovou skupiny nebo, nebo syntetických polymerů obsahujících sulfonové skupiny a polymerů, obsahujících kvarterní amoniové skupiny;

zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, kdy polysacharid nebo derivát polysacharidů obsahující síranovou skupinu je síran celulóza, síran acetylcelulozy, síran karboxymetylcelulozy, síran dextranu nebo síran škrobu, a syntetický polymer obsahující sulfonovou skupinu je sulfopolystyren;

zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno a polymer obsahující kvarterní amoniovou skupinu je polydimetyldiallylamonium nebo polyvinylbenzentrimetylamonium;

zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, kdy stěna porézní kapsule se skládá z komplexu tvořeného síranem celulózy a polydimetyldiallylamonia;

zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, mající 'tvar mikrokapsule o průměru mezi 0,01 a 1 mm;

zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, kdy vnitřní stěna kapsule sestává z houbovitého skeletu tvořeného síranem celulózy a je obklopena vnějším porézním povrchem; uvedený houbovitý skelet je naplněn buňkami;

Μ ··· · zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno s velikosti pórů ve

Stěně porézní kapsule mezi 80 a 150 nm, lépe mezi 100-120nm; zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno kdy virové částice produkované zapouzdřenými buňkami jsou částice retrovirů, obsahující genom retrovirového vektoru;

zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno a zapouzdřenými buňkami produkujícími retrovirové částice je buněčná linie obsahující pomocný virus (termín „buňka (nebo buněčná linie), obsahující pomocný virus je použit na tomto místě a v celé přihlášce místo anglckého „packaging cell, („packaging cell line); výstižný krátký český termín nebyl dosud vytvořen; význam termínu ke vysvětlen v přihlášce na str.12 řádek 1) transfekovaná expresním vektorem, tento expresní vektor obsahující konstrukt retrovirového vektoru schopný infekce a řízení exprese jedné nebo více kódovaných sekvencí, obsažených v tomto konstruktu vektoru v cílových buňkách; zmíněná buněčná linie obsahující pomocný virus nese alespoň jeden expresní vektor obsahující geny kódující bílkoviny nutné ke sbalení retrovirového konstruktu;

zapouzdřené buňky, jak shora uvedeno ve kterých jedna ze zmíněných sekvencí kóduje heterologní peptidv vybrané ze značkovaných genů, terapeutických genů, protinádorových genů nebo cytokininových genů;

zapouzdřené buňky, jak shora uvedeno v nichž je uvedený značkový gen vybrán ze skupiny značkových genů kódujících bílkoviny jako β-galaktosidázu, neomycin, alkohol dehydrogenázu, puromycin, hypoxantin fosforibosyltransferázu (HPRT). hygromycin, vylučované alkalické fosfatázy, a zmíněný terapeutický gen je vybrán z genů, které kódují bílkoviny jako jsou Herpes simplex virus tymidin kináza, cytosin deamináza, guanin fosforibosyltransferáza (gpt), cytochrom P 450 a cyklické regulační geny jako SDI, nádory

**	···«	• «		• · · ·
• ·		«· · ·	« «	•
	•	• ·	• « «
•	• ♦	• · ·	• * * ·
•	• ·	• «	• ·
• · · »	··	• » · · · 9 ·	«· ·

potlačující geny, které kódují bílkoviny jako p53 nebo antiproliferační geny, které kódují bílkoviny jako melittin, cecropin nebo cytokininy jako IL-2;

zapouzdřené buňky, jak shora uvedeno, kdy buněčná linie obsahující pomocný virus je vybrána z psi-2, psi-crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 a GP+envAM-12;

zapouzdřené buňky, jak shora uvedeno u nichž je expresní vektor transfekovaný do buněčné linie, obsahující pomocný virus je pBAG, pLXSN, pl25LX, pLX2Bl nebo pc3/2Bl nebo jejich deriváty postup přípravy zapouzdřených buněk se sestává v suspendování buněk produkujících virové částice ve vodném roztoku polyelektrolytu, poté je nově vzniklá suspense ve formě částic vnesena do srážecí lázně, obsahující vodný roztok opačně nabitého polyelektrolytu;

postup uvedený shora, při kterém se částice tvoří rozprášením;

postup uvedený shora, při kterém se buňky suspendují ve vodném roztoku polysacharidu, nebo derivátu polysacharidu, obsahujícího síranové skupiny, nebo roztoku syntetického polymeru, obsahujícího suifonové skupiny;

postup uvedený shora, kdy použité polysacharidy, nebo polysacharidové deriváty, obsahující síranové skupiny jsou vybrány ze síranu celulózy, síranu acetylcelulozy, síranu . karboxymetylcelulozy, síranu dextran nebo síranu škrobu a syntetický polymer, obsahující sulfoskupinu je sulfopolystyren postup uvedený shora, kdy srážecí lázeň obsahuje vodný roztok polymeru majícího kvartem! amoniové skupiny;

postup uvedený shora, kdy polymerem obsahujícím kvartérní amoniové skupiny je polydimetyldiallylamonium nebo polyvinylbenzyltrimetylamonium;

8«· «·«* * ·· ·· ··»« • · · · · * · · · · • · « · · · · «·«**····· • · * * · · · ···· ·· ··· ·♦·· ·· · postup uvedený shora, a buňky jsou suspendovány ve vodném roztoku sodné soli síranu celulózy a jsou vnášeny do srážecí lázně, obsahující vodný roztok chloridu polydimetyldiallylamonia;

metoda uvedená shora, kdy vodný roztok síranu celulózy obsahuje 0,5-50 % sodné soli síranu celulózy a 2-10 %, přednostně 5 % fetálního telecího sera v pufrovaném fyziologickém roztoku;

metoda uvedená shora, kdy vodný roztok srážecí lázně obsahuje 0,5-50 %, lépe 2-5 %, ještě lépe 3 % chloridu polydimetyldiallylamonia v pufrovaném fyziologickém roztoku;

jakékoliv zapouzdřené buňky připravené kterýmkoli ze shora uvedených postupů;

použití zapouzdřených buněk, jak je shora uvedeno pro dodání genů do cílových orgánů nebo buněk sestávající z:

a) růstu zapouzdřených buněk ve vhodném mediu a

b) implantace zapouzdřených buněk do živého zvířecího těla, včetně těla lidského;

použití jak je shora uvedeno, do cílových orgánů nebo buněk ssavčích žláz nebo pankreatu; a použití jak je shora uvedeno, do cílových orgánů nebo buněk hladkého svalstva a jiných typů buněk obklopujících arterie.

Předmětem předkládaného vynálezu je získání zapouzdřených buněk, umožňujících uvolnění virových částice produkovaných těmito buňkami z kapsulí, a které po implantaci kapsulí nevzbudí významnou imunitní nebo zánětlivou reakci hostitelského organismu.

Dalším předmětem vynálezu je uvedení postupu přípravy těchto zapouzdřených buněk, produkujících virové částice.

Předmětem tohoto vynálezu je také metoda pro dodání genů, zvláště genů terapeutických, cílovým orgánům nebo buňkám; implantací zapouzdřených buněk, produkujících virové částice do hostitelského organismu a tedy zajištění stálé produkce a uvolňování virových částic v cílových orgánech nebo v blízkosti cílových buněk.

Podle předloženého vynálezu zapouzdřené buňky produkují a umožňují uvolnit virové částice, které byly buňkami produkovány, z kapsulí, a současně nevyvolají významnou imunitní reakci, nebo zánět v hostitelském organismu.

zapouzdřené buňky podle tohoto vynálezu mohou být připraveny suspendováním buněk produkujícím virové částice ve vodném roztoku polyelektrolytu { na př. podle výběru polysacharidy, nebo deriváty polysacharidů, obsahující síranové skupiny nebo syntetické polymery, obsahující sulfonové skupiny) a dále vnesením suspense obsahující vzniklé částice do srážecí lázně, obsahující vodný roztok opačně nabitého polyelektrolytu (jakým je na př. polymer obsahující kvarterní amoniové skupiny).

polysacharidy, nebo deriváty polysacharidů, obsahující síranové skupiny, včetně síranu celulózy, síranu acetylcelulozy, síranu karboxymetylcelulozy, síran dextranu nebo síran škrobu ve formě solí, zejména sodných. Syntetickým polymerem obsahující sulfo-skupiny může být sůl sulfopolystyrenu, lépe jeho sodná sůl.

polymery, obsahující kvarterní amoniové skupiny mohou být polydimetvldiallylamonium nebo polyvinylbenzyltrimetylamonium ve formě solí, lépe jako chloridy.

V přednostním provedení vynálezu jsou buňky produkující virové částice zapouzdřeny v komplexu, sestávajícím z komplexu tvořeného síranem celulózy a polydimetyldiallylamonia.

Tyto kapsule jsou přednostně připraveny suspendováním buněk, produkujících virové částice v roztoku obsahujícím 0, 5-50 %, lépe 2-5 %, síranu celulózy a 5 % fetálního hovězího séra ve zvoleném pufru. Suspense je potom vnášena po kapkách dávkovacím zařízením ( na př. rozstřikováním vzduchem pomocí trysky nebo piezoelektrickým systémem) za stálého míchání do srážecí lázně, obsahující 0,5-50 %, lépe 2-10 %, nebo nejlépe 3 % chloridu polydimetyldiallylamonia ve zvoleném pufru. Tvorba kapsulí trvá milisekundy a kapsule obsahující buňky jsou ponechány ve srážecí lázni 30 sekund až 5 minut a poté jsou promyty. Rychlost metody zaručuje, že buňky nejsou vystaveny během postupu škodlivému stresu. (Stange a spol., 1993).

Kapsule připravené podle- vynálezu mají průměry v rozmezí mezi 0,01 a 5 mm, lépe mezi 0,1 a 1 mm. V závislosti na velikosti mohou být kapsule připraveny tak, aby obsahovaly různé množstvím buněk. S použitím postupu podle vynálezu je možno zapouzdřením do polyelektrodového komplexu připravit kapsule obsahující až 10¹⁰, lépe 10⁵-10⁷ buněk, produkujících virové částice.

Kapsule vytvořené síranem celulózy a polydimetyldiallylamoniem mají výborné mechanické vlastnosti a mohou být připraveny v jednotné velikosti a s jednotnou velikostí pórů.

Velikost pórů kapsulí je mezi 80 a 150 nm, lépe mezi

100 a 120 nm.

Zapouzdřené buňky mohou být kultivovány v normálním buněčném mediu (jehož složení závisí na druhu zapouzdřených buněk) za standardních podmínek vlhkosti, teploty a koncentrace CO₂. Po dobu kultivace je možno dokázat, že dochází k uvolňováni virových částic z kapsulí do «· ♦ · · · ♦ · • · « « 9 « · • · · ··· ·*·♦ kultivačního media použitím buď RT-PCR technologií, nebo přenosem bezbuněčného (0,45 pm filtrace) supernatantu do cílových buněk a následným důkazem virové infekce stanovením aktivity značkových bílkovin, kódovaných geny konstruktu virového vektoru, obsaženého ve virových částicích. Je-li značkový gen, obsažený ve virovém vektoru, genem nesoucím specifickou rezistenci k nějaké látce v cílových buňkách, je možno titr viru, produkovaného systémem, stanovit také tímto způsobem.

Po vhodné době kultivace (normálně ňe kratší než 1 hodina a delší než 30 dní) mohou být kapsule, obsahující buňky, chirurgicky implantovány a to buď přímo, nebo injekčně s použitím injekční stříkačky do různých částí těla.

Podle tohoto vynálezu mohou být virové částice produkované zapouzdřenými buňkami jakéhokoli druhu vhodného pro genovou terapii, zahrnujíce v to, ale neomezujíce se pouze na, adenoviry, viry sdružené s adenoviry, herpetické viry nebo retroviry; přehled viz Gunzburg a Salmons,1995.

V přednostním provedení vynálezu jsou zapouzdřené buňky buněčná linie obsahující pomocný virus, produkující retrovirové částice, které obsahují ve svém genomu konstrukt retrovirového vektoru, nesoucí markerový a terapeutický gen.

Systémy retrovirového vektoru se skládají ze dvou částí:

1) expresní vektor (plazmidový vektor) nesoucí retrovirový vektor konstruktu, který je modifikovaným retrovirem u něhož byly geny kódující virové bílkoviny nahrazeny terapeutickými geny a podle rozhodnutí i zvoleným značkovým genem za účelem jejich přenosu do cílové buňky. Protože záměna genů kódujících virové bílkoviny virus značně poškozuje, je nutno jej ochránit druhou složkou systému, která zajistí syntézu chybějících virových bílkovin.

«· · ··«·«· 9

I/ « »9« ······ ^Xt* · · · · · ♦· ···· ·« ··· ···· ·· ·

Druhá složka je:

2) buněčná linie, produkující velké množství virových bílkovin, která ale neprodukuje replikace schopný virus. Tato buněčná linie se nazývá buněčná linie obsahující pomocný virus a je to buněčná linie, která byla transfekována plazmidy nesoucími geny umožňující sbalení modifikovaného retrovirového genomu do virové částice. Tyto plazmidy řídí syntézu, virových bílkovin nutných pro produkci virionů.

K získání sbaleného retrovirálního vektoru je vektorový plazmid transfekován do buněčné- linie obsahující pomocný virus. Za těchto podmínek je modifikovaný retrovirový genom, obsahující vložený terapeutický gen a zvolený značkový gen přepsán z vektorového plazmidu a výsledný modifikovaný retrovirový genom je sbalen do retrovirové částice. Buňka infikovaná takovou virovou částicí není schopna vytvářet virové částice, protože žádné virové bílkoviny nejsou v těchto buňkách obsaženy. Avšak, retrovirový konstrukt, nesoucí terapeutický a značkový gen, je přítomen a muže být v infikovaných buňkách exprimován.

TO 94/29437, WO89/11539 a WO96/07748 popisují různé typy systémů retrovirových vektorů, použitelných k účelům tohoto předloženého vynálezu

Virové částice produkované zapouzdřenými buňkami podle tohoto vynálezu, mohou být navrženy tak, aby obsahovaly genom virového vektoru nesoucího geny kódující značku a/nebo terapeutické geny.

Značkové nebo terapeutické geny nesené virovým vektorem mohou být, na př. geny kódující bílkoviny jako β-galaktosidázu, neomycin, alkoholdehydrogenázu, puromycin, hypoxantin fosforibosyl transferázu (HPRT),hygromýcin a vylučovanou alkalickou fosfatázu nebo terapeutické geny kódující bílkoviny jako virová Herpes Simplex tymidin kináza, cytosin deamináza, guaniň fosforibosyltransferáza (get), cytochrom P 450, regulační geny buněčného cyklu jako je SDI, geny potlačující nádory kódující bílkoviny jako p53, antiproliferační geny, které kódují bílkoviny jako melitin, cecropin nebo cytokininy jako IL-2.

Ve zvláštním spojení se použití vynálezu týká užití zapouzdřených buněk, připravených podle vynálezu, k léčení nádorů.

Mnoho maligních nádorů nereaguje dobře na chemoterapii. Protirakovinná léčiva, používaná v léčení nádorů, jsou v mnoha případech používána systematicky a jsou tedy rozšiřována do celého organismu pacienta. Soustavná podávání vysokých dávek takových léčiv, vyžadovaná k léčení rakoviny, jsou často doprovázeny pro pacienta nepříjemnými vedlejšími efekty. Jedna ze strategií, které by mohly obejít tyto problémy vysokých systematických koncentrací je přímá aplikace nebo aktivace léčiva v blízkém okolí nádoru. Toho může být dosaženo, podle tohoto vynálezu, implantací zapouzdřených buněk, produkujících virové částice, obsahující genom plánovitě pozměněného viru, zvláště retroviru, nesoucího gen, kódující léčivo proti rakovině, na př. aktivační enzym schopný převést prekursor léčiva na cytotoxickou látku, buď přímo v nádorových buňkách, nebo v buňkách v jejich blízkém okolí.

V jednom z použití tohoto vynálezu zapouzdřené buňky skýtají možnost produkce retrovirových částic, obsahujících genom retrovirového vektoru nesoucí enzymy, významné pro nádorovou tkáň, jako jsou cytochrom P 450, nebo sevevražedné geny jako jsou, ale ne pouze, tymidin kináza, která přeměňuje netoxické léčiva na jeden nebo několik toxických metabolitů . Takové zapouzdřené buňky, podle tohoto vynálezu, mohou býti využity k léčbě rakovin implantací těchto kapsulí do / nebo blízko nádorů, na př. nádorů pankreatu nebo mléčných žláz.

··	»*»·	V		• li v
« a	•	a ♦ a a	a ·	a
a	a		• ·	•
•	• a	• ·	• ·»·	a
•	• ·	» a	*	a
·«·♦	··	*aa a··	a-a	a

Dalšího cíleného působení může být dosaženo použitím specifických regulačních prvků a promotorů v cílových buňkách, jimiž lze dosáhnout řízení exprese připojených terapeutických genů ve specifických typech buněk.

Tyto specifické regulační prvky a promotory cílových buněk zahrnují na př. specifické pankreatické regulační prvky a promotory počítajíce do nich regulační elementy a promotory anhydrázy kys. uhličité II a β-glukokínázy; lymfocytární specifické regulační prvky a promotory zahrnující lymfocytární specifické regulační prvky a promotory imunoglobulinu a MMTV; specifické'regulační prvky a promotory mléčných žláz počítajíce do nich Whey Acidic Protein (WAP) a virus myších mléčných žláz (MMTV) Mouše Mammary Tumor Virus, specifické regulační prvky a promotory β-laktoglobulinu a kaseinu a specifické regulační prvky a promotory MMTV udělující citlivost na glukokortikoidní hormony nebo řídící expresi v mléčných žlázách. Jiné promotory zahrnujíce na příklad promotory CD4, CD34 a IL2. Uvedené regulační prvky a promotory regulují přednostní expresi zmíněných retrovirových vektorů.

Mohou být rovněž použity radiačně induktivní promotory na příklad promotor intracelulární adhesivní molekuly-1 (ICAM-1), promotor epidermálního růstového faktoru (EGFR) nebo promotor nádorového nekrozního faktoru (TNF).

Následující příklady dále ilustrují tento vynález, avšak není je možno chápat jako příklady vynález omezující.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 ··· •a·* ··

Lipofekce PA317 pomoci pBAG a izolace rezistentních buněk G418:

Amfotropické buňky NIH3T3 založené na buňkách P317, obsahujících pomocný virus (Miller a Bultimore,1986) byly kultivovány na Dubesccem modifikovaném mediu podle Eagle (DMEM), obsahující 10 % fetálního telecího sera. Buňky byly naočkovány do 10 cm misek na tkáňové kultury v hustotě 3xl0⁵jeden den před lipofekcí a byly lipofekovány 2 pg vektoru pBAG (Příče a spol.,1987), nesoucím retrovirální vektor MLV (virus myší leukemie) s použitím komerční lipofektaminové sady činidel od GIBCO/BRL podle návodu výrobce. Buňky byly poté zředěny jedna ku deseti a kultivovány v obvyklém mediu, obsahujícím navíc 400 pg/ml G418 (GIBCO/BRL). Po 14 dnech byly kolonie, obsahující G418 rezistentní buňky, spojeny.

Příklad 2

Mikrozapouzdřeni:

buněk bylo suspendováno v 1 ml pufrovaného fyziologického roztoku, obsahujícího 2-5 % sodné soli síranu celulózy a 5 % fetálního telecího séra a vzniklá suspenze byla po kapkách pomocí dávkovacího systému (rozstřikováním vzduchem pomocí trysky) vnášena do srážecí lázně, obsahující

2-3 % polydimetyldiallylamonia v pufrovaném fyziologickém • roztoku. Tvorba mikrokapsulí probíhající v milisekundách byla následována tvorbou porézní, pro mechanickou odolnost důležité vnitřní vrstvy, v zásadě složené ze síranu celulózy. Kapsule, obsahující buňky byly ponechány ve srážecí lázni 30 sekund až 5 minut a potom promyty DMEM (Stange a spol.,1993). Jednotlivé preparáty, získané za různých podmínek, t.j.různé koncentrace síranu celulózy, různého průtoku tryskou dávkovacího systému a časem po který byly kapsule ponechány ve srážecí lázni byly použity k biologickým studiím. Reprezentativní příklady podmínek jsou na přiklad: 2,5 % sodné soli síranu celulózy, 2 % polydimetyldiallylamonia a 1 minuta ve srážecí lázni, nebo 1,5 % sodné soli síranu celulózy, 2 % polydimetyldiallylamonia a 0.5 minuty ve srážecí lázni, nebo 3 % sodné soli síranu celulózy a 3 % polydimetyldiállylamonia a 2 minuty ve srážecí lázni. Přesné podmínky byly voleny s ohledem na přesnou velikost žádaných kapsulí, sílu stěny kapsule a jiné vlastnosti.

Příklad 3

Implantace mikrokapsulí do mléčných žláz myší:

Mikrokapsule byly chirurgicky vloženy do mléčných žláz 2 měsíce starých samic BALB/c myší metodou „klíčové dírky a otvor byl uzavřen jedním stehem. Až 6 kapsulí o průměru 0,5-2 mm bylo umístěno do každého operačního místa.

Uvolnění virových částic ve studiích in. vitro, struktura mikrokapsulí a vliv implantace kapsulí do imunokompetentních myší byly studovány následujícími metodami:

A) β-galaktosidázová aktivita

Provedení histochemického barvení použitého pro detekci v infekóvaných buňkách bylo uvedeno již dříve (Čepko,1989). Buňky, kapsule nebo tkáňové řezy byly promyty chladným PBS a fixovány 2 % paraformaldehydem 20 minut-24 hodin, podle tlouštky vzorku. Po extensivním promytí PBS byly buňky, kapsule nebo tkáňové řezy inkubovány v roztoku obsahujícím substrát X-gal ( 20 mM K^FeCNj, 20 mM K₄FeCN₆.3H₂0, 2 mM MgCl₂ a 1 mg/ml X-gal) nejméně 2 hodiny při 37°C.

*9 ♦ <

B) Infekce

4xl0⁴ cílových buněk vylo vyseto do 6-ti jamkových misek na tkáňové kultury 6 hodin před infekcí. Kapsule obsahující virus produkující buňky byly umístěny na buňky a k mediu byl přidán polybren (8 μς/ml). Čtyři hodiny později bylo medium vyměněno, aby se odstranil zbývající polybren. Po pěti dnech byly některé jamky obarveny testem na β-galaktosidázovou aktivitu, jak shora uvedeno, jiné byly trypsinizovány do větších tkáňových misek a kultivovány v mediu, obsahujícím 400 pg/ml G418. Po 16 dnech byly detekovány G418 rezistentní kolonie.

C) RT-PCR analýza

Virové částice z 5 ml supernatantu kultivačního media byly pelétovány na ultracentrifuze (240 OOOxg, 1 hodinu, 4°C). Pelety byly suspendovány v lyžujícím pufru (1% Triton 100, 0,5% desoxycholátu, 0,1% dodecylsíranu sodného, PBS) a RNK byly extrahována fenolem s následným srážením etanolem, jak bylo dříve popsáno(Salmons a spol.,1986). RNK byly reverzně přepsána do DNK s použitím soupravy: Read-To-Go T-primed first strand kit (Pharmacia). PCR amplifikace byla provedena s použitím primerů, umístěných uvnitř env a R ML V pozměněného BAG vektorem LTR (Obr.2A). PCR amplifikace byla provedena v 100 μΐ reakční směsi sestávající z 500 mM Kel, 10 mM Tris-HCl (pH=8,3) 1,5 mM MgCl₂, 0,01 %(w/v) želatiny a 100 μΐ každého dNTB, 40 pM každého primeru a 2,5 jednotek Taq polymerázy (Perkin Elmer). Reakce byla prováděna v cykleru Perkin Elmer Cetus Therma Cycler 9600 za těchto podmínek: 1 min. při 94°C, 2 min. při 53°C, 3 min. při 72°C, celkový počet cyklů byl 35. Produkty PCR byly » · ···« ·· rozděleny na 0,8 % agarozovém gelu a potom přeneseny Zeta probe membrány (BIORAD) a hybridizovány jak popsáno (Indaccolo a spol.,1995) s ³²P-značeným 612 PCR fragmentem genomu MLV, získaného se stejnými primery a pBAG jako templářem. MLV specifická sekvence byla zviditelněna s použitím Fuji phosphoimaging systém (BAS 1000).

C) PCR analýza

Genomová DNK (1 pg) byla amplifikována metodou PCR s použitím jednoho primeru umístěného ve zbytkové části env sekvence vektoru BAG a druhého primeru v polyomové části plazmidu mimo sekvenci retrovirového vektoru (Obr.3B). PCR reakce byly provedeny, jak shora popsáno, za použití těchto reakčních podmínek:1-min.při 94°C, 2.min.při 50°C, 3.min.při 68°C celkový počet cyklů byl 35. Produkt PCR byl hybridizován s ³²P-značeným fragmentem 1,5 kb Xbal DNK ze pBAG, specifickým pro sekvence polyomu.

E) Elektronová mikroskopie

Vzorky pro skenovací elektronovou mikroskopii (SEM) a transmizní elektronovou mikroskopii (TEM) byly promyty PBS (pH 7,3) a předfixovány 1 % glutaraldehydem po dobu 15 minut a potom 15 minut fixovány 2 % 0s0₄ . Vzorky byly odvodněny roztoky etanolu se stoupající koncentrací a rozděleny do dvou skupin, a)vzorky pro SEM byly sušeny metodou kritického bodu C0₂ a pokoveny 3 nm platiny (Emscope SC 500Ashford,England). Pokovené vzorky byly hodnoceny v lOkV. emisním skenujícím mikroskopu (Jeol JSM-6300F; Tokyo,Japan), s urychlujícím napětím 5-10 kV v sekundárním modu b) Vzorky pro TEM byly zality do Eponu. Ultratenké řezy byly dvojitě barveny octanem ·# ♦ · • * • ·

uranylu a citrátem olovnatým, a hodnoceny na transmisním elektronovém mikroskopu Zeis EM-10C (Oberkochem, Germany).

Výsledky

Uvolňování viru z mikrokapsulí - studie in vitro:

Barveni mikrokapsulí, získaných podle postupu uvedeného v přikladu 2 se substrátem X-gal, jak je popsáno v testu na β-galaktosidázovou aktivitu ukázalo, že tyto kapsule exprimuji β-galaktosidázu kočovanou pBAG (Obr.l), stejně jako nezapouzdřené vektor produkující buňky (není ukázáno).

Uvolňování virových částic do kultivačního media z buněk v mikrokapsulích bylo prokázáno tak, že z peletovaných virionů získaných ze supernatantu kapsulí byla v různých časových intervalech kultivace připravena RNK. Tato RNK byla analyzována RT-PCR technikou s použitím doplňkových primerů k. env a R oblastem virového genomu, jak je popsáno v odstavci RT-PCR analýza. Vznik fragmentu o předpokládané délce (612bp), specifického pro MLV, generovaného PCR metodou z kultivačního media mikrokapsulí byl pozorován nejméně 6 týdnů (0br.2B, řádky 1-4), kdy bylo stanovení přerušeno. Tento .fragment nevznikl vlivem znečistění DNK, protože po působení ribonukleázy na virovou RNK před RT-PCR nedalo positivní výsledky. (Obr.2C;1-4).

Produkce a uvolnění infekčního viru z kapsulí mohlo být ověřeno společnou kultivací s cílovými buňkami, jak je shora popsáno, v testech na infekčnost, na př. s buňkami NIH3T3 (Janchill a spol.,1969) nebo CRFK (Crandell a spol.,1973) Po 4 dnech společné kultivace alikvoty cílových buněk stejně jako zapouzdřené buňky, obsahující pomocný virus, byly barveny na β-galaktosidázovou aktivitu, způsobem shora • · ·· · • · » ♦ · · « ···« to· ··· ···· ·· · uvedeným. Zbylé cílové buňky byly selektovány na rezistenci proti G418. Mnoho buněk NIH3T3 a CRfK společně kultivovaných NIH3T3 a CRFK prokázalo expresi genu β-gal (0br.3A).

Aby bylo možno potvrdit, že cílové buňky získaly β-gal infekcí, byly cílové buňky testovány metodou PCR. BAG produkující buněčné linie, obsahující pomocný virus jsou založeny na buněčné linii PA317 (Miller a Buttimore,1986) a nesou gen tymidin kinázy viru Herpes simplex (HSV-TK), působením které je převáděn prekursor ganclovir na cytotoxický prostředek. Cílové buňky NIH3T3 nebo CRTK běžně tento gen nemají. V pokusně může být demonstrováno, že společně kultivované cílové buňky NIH3T3 nebo CRTK, které jsou schopny exprimovat β-gal jsou rezistentní k GCV, což znamená, že nedošlo k úniku buněk produkujících BAG, genomová DNK byla extrahována z cílových buněk, analyzována na přítomnost plazmidové sekvence mimo vektor metodou PCR (viz PCR analýz). Tyto sekvence jsou přítomny v buněčných liniích, obsahujících pomocný virus, poněvadž vektor BAG byl lipofektován do těchto buněk ve formě plazmidu pBAG. Virus produkovaný buňkami, obsahujícími pomocný virus nemá tyto plazmidové sekvence, takže by neměly být přítomny ani v cílových infikovaných buňkách. Obr.3B ukazuje, že takové plazmidové sekvence nebyly detekovatelné, v souhlase s infekcí těchto buněk vektorem BAG.

Struktura mikrokapsuli:

Byly připraveny řezy mikrokapsuli a jejich struktura byla analyzována elektronovou mikroskopií. Vnitřek mikrokapsuli tvoří houbovitá matrice, naplněná buňkami (Obr.4). Skenující elektronová mikroskopie ukázala, že na povrchu mikrokapsuli jsou otvory dostatečně velké, aby umožnily průchod vektorům retrovirových částic z mikrokapsuli, bílá úsečka na obr.4 ·· ····

9 · · ♦ · · · ·* • · · · · ··

2ί ♦♦♦··· ··· · ··*·· · · • Φ·· ·· ··· ··*·♦ · · odpovídá svou velikostí průměrnému průměru retrovirových částic (Obr.4).

Stabilita in vivo u imunokompetentnich myší:

Ke stanovení stability mikrokapsulí a zjištění zda-li mirokapsule nebo virus, který je jimi produkován způsobuje pozorovatelnou imunitní odpověď, byly mikrokapsule implantovány do mléčných žláz 2 měsíce starých myších samic BALB/c. Myši byly po různých dobách implantace utraceny a byl sledován byl vzhled mikrokapsulí a produkce infekčního viru. Implantované mikrokapsule byly jasně viditelné, obalené polštářky tuku mléčných žláz nejméně 6 týdnů po implantaci (Obr.SB). K vaskularizaci došlo v okolí mikrokapsulí u všech analyzovaných zvířat (Obr.SA), pravděpodobně jako výsledek produkce angiogenického nebo růstového faktoru buňkami, obsahujícími pomocný virus.

Řezy mikrokapsulí a je obklopující tkáně mléčných žláz potvrdily, že je možno nalézt cévy v bezprostřední blízkosti kapsulí (Obr.SB). Tyto řezy také ukázaly vrstvu spojovací tkáně mezi mikrokapsulemi a tkání mléčných žláz. Nebyla pozorována viditelná známka větší zánětlivé nebo imunitní reakce na mikrokapsule, nebo virus produkující buňky, v nich obsažené.

Na důkaz toho, že infekční retrovirové vektory byly uvolněny z kapsulí a infikovaly je obklopující tkáň mléčných žláz byly některé řezy analyzovány na expresi β-gal barvením X-gal. Buňky, exprimující β-gal, byly jasně viditelné mimo mikrokapsule (Obr.SC).

Příklad 4

♦ ·	• · v ·
•	•	• ·	•	•	•
•	• ·	• · ·	• ·	•	•
•	• ♦	• ♦		•
• · · ·	·*	·· · ·*·«			•

Tento přiklad popisuje konstrukci retrovirového expresního vektoru, obsahujícího gen krysího cytochromu P450 2B1, pro intratumorální infekci.

Expresní vektor pLX2Bl, viz Obr.6, byl konstruován ligací fragmentů získaných z plazmidu pLX125 a pSWl (Kedzie a spol.1991). Plazmid pLX125 byl linearizován Hpal a výsledné zarovnané konce byly defosforylovány telecí střevní fosfatázou. DNK byla separována na 1 % agarozovém gelu, vyříznuta a získána podle komerčního postupu QiaQuick (Qiagen). Po srážení etanolem byla DNK resuspendována ve vodě.

Klonovaci vektor pSWl po štěpení Smál a HincII poskytl dva zarovnané konce. Štěpená směs byla rozdělena na 1% agarozovém gelu. Kratší fragment (1,5kb) obsahující krysí cytochrom P4 50 2B1 cDNK (Fuji-Kuriyama a spol.,1982) byl vyříznut a eluován podle Qiaquick DNK extrakčního protokolu, sražen etanolem a resuspendován ve vodě.

7,6 fMolů pLX125 a 24 fMolů Smal/HundlI-fragmentu ze pSWl bylo smícháno a ligováno po 3 dny při 12°C pomocí T-4 ligázy (Boehringer). Ligáza byla inaktivována při teplotě 65°C 10 min. a DNK sražena 10 objemy butanolu. Sražená DNK byla resuspendována ve vodě a metodou elektroporace zavedena do DHlOB-bakterií (Gibco). Kolonie, které byly rezistentní vůči ampicilinu byly vybrány, byla z nich připravena DNK, která byla štěpena SspBI/SalI, BamHI/SspBI, Pvul'a BamHI. Výsledný správný plazmid byl označen pLX2Bl.

Lipofekce ·* ··** ·· · · · · · ♦ · • · v · · · · • * · · ····*· • · · ♦ · · · ···· ·» ··· ··*· ·· ·

Jeden den před lipofekcí bylo 3xl0⁵ retrovirových buněk obsahujících pomocný virus PA317 (Miller a Buttimore,1986) vyseto na 6 cm petriho nebo tkáňové kultivační misky. V den infekce byla smícháno 1 μς pLX2Bl se 100 μΐ media prostého sera. Paralelně 15 μΐ Lipofectaminu (Gibco BRL) bylo smícháno s 100 μΐ media prostého sera. Roztok obsahující plazmid byl přidán k Lipofektaminové směsi a inkubován 45 min. Po 35 minutách byly buňky promyty jednou 2 ml media neobsahujícího sérum. 800 μΐ media neobsahujícího sérum bylo přidáno k Lipofectaminové směsi a výsledný 1 ml reakční směsi byl přidán k připraveným buňkám. Po 6 hodinách byl přidán 1 ml Dulbeccem modifikované Eaglovo medium, obsahující 10 % FCS. Příštího dne byly buňky trypsinizovány , zředěny 1:10 a vysety na 100 mm misku. Po 24 hodinách bylo medium vyměněno za medium obsahující analog neomycinu G418. Jednotlivé populace buněčných klonů byly izolovány a analyzovány na expresi cytochromu P450.

Zapouzdření

Buňky produkující retrovirový vektor a obsahující pomocný virus byly získány a zapouzdřeny postupem popsaným shora v příkladu 2.

Implantace

Získané kapsule byly chirurgicky implantovány postupem „klíčové dírky blízko nebo přímo do transplantovaných nebo spontánních nádorů myší BALB/c nebo GR. Asi 6 kapsulí o průměru 1 mm bylo vloženo do každého z operačních míst. Operační pole bylo uzavřeno jedním stehem. Myši byl potom mistně vystaveny působení cyklofosfamidu nebo ifosfámidu •Λ ··«* přímou intratumorální injekční aplikací 100 μΐ 20 mg/ml nebo systémové koncentraci 130 mg CPA/kg váhy, aplikované i.p. a 40-60 mg IFO/kg váhy rovněž i.p. aplikované, a to maximálně po dobu 10 týdnů. Po tuto dobu byl denně monitorován makroskopický vzhled nádoru. Potom byly myši utraceny, tkáň obsahující vložené kapsule a nádor byla vyňata a byly připraveny histologické řezy pro světelný a elektronový mikroskop. Tyto řezy jasně ukázaly, dobré vhojení kapsulí a vaskularizaci, nebyla pozorována přítomnost lymfocytů, která by indikovala buněčnou imunitní reakci. V těchto řezech nebyla pozorována přítomnost odumřelých buněk nebo nekrozy uvnitř kapsulí. Nádor naopak nekrotické změny vykazoval a makroskopicky byla jasně patrné zmenšení jeho velikosti během pokusu.

Přiklad 5

Tento přiklad popisuje konstrukci stálé buněčné linie, přirozeně exprimující cytochrom P450 2B1.

Expresní vektor pc3/2Bl byl konstruován ligací fragmentů získaných z plazmidu pcDNA3 (invitrogen) a pSWl (Kedzie a spol.,1991).

Plazmid pcDNA3 byl štěpen Xhol/Xbal a vzniklé kohézní konce fragmentů defofosforylovány telecí střevní fosfatázou. Řetězec vektorové DNK byl izolován a čištěn na 1 % agarozovém gelu, DNK byla vyříznuta a extrahována podle Qiaquick postupu (Qiagen). Po srážení etanolem byla DNK resuspendována ve vodě.

v * ·· ···♦ «* · «··*·♦ ♦ Λ £- ·♦ ··»··

ZD · · · · · · ·*· ♦ • · · · · * · »·«* ·♦ ·** ♦··· ·· ·

Klonovaci vektor pSWl byl štěpen Xhola Xbal na dva fragmenty. Štěpená směs byla rozdělena na 1 % agarozovém gelu. Nejkratší fragment (l,5kb) obsahující krysí cytochrom P 450 2B1 cDNK (Fuji~Kuriyamaa spol.,1982) byl vyříznut, eluován extrakcním postupem Qiaquick DNK, sražen etanolem a resuspendován ve vodě.

8,3 fMolů hlavního řetězce pcDNA3 a 24,8 fMolů Xhol/Xbalfragmentu pSWl bylo smícháno,a ligováno 1 den při 12°C T4ligázou (Boehringer). Ligáza byla inaktívována při 65°C 10 min. a DNK byla srážena 10 násobným nadbytkem butanolu. Sražená DNK byla resuspendována ve vodě a metodou elektroevaporace zavedena do bakterií DHlOb (Gibco). Vybrány byly kolonie rezistentní k ampicilinu, z nich byla připravena DNK a zkušebně štěpena EcoRI, BamHI, EcoRV a Xhol. Výsledný správný plazmid byl označen pc3/2Bl.

Lipofekce den před infekci bylo vyseto 3xl0⁵ buněk na 35 mm misky. V den infekce bylo smiseno 2 pg pc3/2Bl se 100 μΐ media neobsahujícího sérum. Roztok obsahující plazmid byl přidán k Lipofectaminové směsi a inkubován 45 minut. Po 35 minutách byly buňky jedenou promyty 2 ml media neobsahujícího sérum. 800 μΐ media neobsahujícího sérum bylo přidáno k lipofekční směsi a výsledný 1 ml směsi byl přidán nalit na připravené buňky. Po 6 hodinách byl přidán 1 ml DMEM (Glutamax) s 10 % FCS. Příští den byly buňky trypsinizovány, desetkrát zředěny a vysety na 100 mm misku. Po 24 hodinách bylo medium vyměněno za neomycinové medium. Po 14 dnech neomycin rezistentní klony byly izolovány a testovány na přítomnost a aktivitu vektoru.

·«««·* · • · · · · » * * «·« » • · · · ·ν· «*·· »· ’

Kapsule, obsahující tyto buňky, byly připraveny podle příkladu 2 a implantovány do myší blízko nádorů. Po působení cyclofosfamidem nebo ifosfamidem byla účinnost působení hodnocena shora popsaným způsobem.

Obrázky

Obr.l: Histologické barvení zapouzdřených PA317 buněk stabilně transfekovaných pBAG jako důkaz exprese β-galaktosidázy.

Obr.2! Analýza RT-PCR virových částic uvolněných z kapsulí. (2B; vzorky 1-4: medium odebráno po 2,3,5 a 6 týdnech kultivace kapsulí). Kultivační medium buněk z nezapouzdřených produkujících virus BAG bylo použito jako positivní kontrola (vzorek 5) a medium z netransfekovaných PA317 jako negativní kontrola (vzorek 6). Negativní odpovědi byly získány u vzorků štěpených Rnázou před provedením RT-PCR analyzy,' což je důkazem, že amplifikované pásy pocházejí z virové RNK (2C;vzorky 1-4). Virová RNK, připravená z nezapouzdřených buněk produkujících virus BAG, bez štěpení ribonukleázou byla použita při reakci RT-PCR jako positivní kontrola (vzorek 7).

Obr.3: Společná kultivace zapouzdřených buněk, produkujících virus a buněk NIH3T3.

(A) Cílové buňky byly vysety s nízkou hustotou jeden den před přidáním kapsulí s buňkami, obsahujícími pomocný virus a produkujícími retrovirový vektor. Buňky a kapsule byly několik dní později histologicky barveny na průkaz β-galaktosidázbvé aktivity.

(B) Za účelem ověření, že cílové buňky exprimující β-galaktosidázu, vznikly infekci spíše než únikem viru z produkčních cel, byla z buněk extrahována genomová DNK a byla analyzována metodou PCR.

·· ♦··· • * · · · · • · * · «····· • « t · · « · ···· ·· ··· ···♦ ·♦ ♦

Obr.4: Snímek skenovacího elektronového mikroskopu, ukazující povrch částice (mikrokapsule), na kterém jsou při vysokém zvětšení (x 75 000)patrné porézní struktury. Bílá úsečka reprezentující 100 nm (průměr částice retroviru) je důkazem, že tyto struktury mohou býti póry, kterými je virus z kapsule uvolňován. '·

Obr.5: Histologická analýza kapsule implantované do mléčné žlázy myši.(A) (B) řez kapsulí implantované do myší mléčné žlázy po čtyřech týdnech na světelném mikroskopu (133 x zvětšeno).

(C) Infekce buněk myší mléčné žlázy po implantaci kapsulí, obsahujících buňky PA317, produkující vektor BAG.

Obr. 6 Struktura expresního vektoru pLX2Bl, obsahující gen pro krysí cytochrom P450 2B1, který je kontrolován po konverzi promotoru promotorem U3-MMTV.

• · ·· ·

Literární odkazy:

Čepko,C.(1989). Liniová analýza nervového systému obratlovců genovým transferem, zprostředkovaným retrovirem.

Meth. Neurosci.1,367-392.

Chang,P.L.(1995). Neautologní somatická genová terapie.

Somatická genová terapie.P.L.Chang,ed(CRC press,Boca Raton) pp. 203-223.

Cornetta,K.,Moen,RiC.,Culver, K. ,Morgan,R.A.,McIachlin,J. R., Sturm,S.,Selegue,J.,London,W., Blaese,R.M., and Anderson,W.F. (1990). Amfotropický retrovirus myší leukemie není akutním patogenem primátů. Hum.Gene Ther.1,15-30.

Crandelll,R.A.,Fabricant,C.G.,a Nelson-Rees,W.A. (1973).Vývoj, charakterisace a virová citlivost liščích (Felis catus) ledvinových buněčných linií (CRFK) In vitro 9,176-185.

Culver,K.W.,Ram,Z.,Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfield, E.H., a

Baese,R.M.(1992) Genový transfer in vivo pomocí buněk produkujících retrovirový vektor k léčení experimentálních mozkových nádorů. Science 256,1550-1552.

Deglon,N.,Zurn,A.,Baetge,E.,a Aebischer,P.(1995) Vývoj genové terapie pro léčeni neurodegenerativních chorob; Parkinsonovy nemoci, Alzheimerovy choroby a terapie amyotropické laterální sklerózy; intratekální transplantace neurotropinsekretujících buněk zapouzdřených v polymeru.

Gene Ther.2,563.

·· > »»W* « V « * · » « ··· τη · · · · · ·*

JU · ♦ ♦ · · ···♦ · • · · ♦ · · · «··* ·» ··· ♦··· ·· ·

Fuji-Kuryama, Y.,Mizukami, Y., Kawajiri, K., Sogawa, K., a

Muramutsu,M.: Primární struktura cytochromu P-450: Kódující nukleotidová sekvence cDNK cytochromu P-450 z krysích jater, indukovatelného fenobarbitálem, Proč.Nati.Acad.Sci.USA,1982 May; 79:2793-97.

Gťínzburg, W. H., Saller, R., a Salmons,B. (1995). Retrovirové vektory řízené k předdefinovaným buněčným typům pro genovou terapii. Biologicals 23,5-12.

Gťínzburg, W. H., a Salmons, B. (1995) Návrh virového vektoru pro genovou terapii. Molecular Mědíčine Today,1,410-417.

Hughes,M.,Vassilakos,A.,Andrews,D.W.,Hortelano,G.,

Belmont,J.W.,a Chang,P.L.(1994)Dodání sekretované adenozin deaminázy mikrokapsulemi - nový přístup k somatické genové terapii. Hum.Gene Ther.5,1445-1455.

Indraccolo,S.,Gunzburg,W.H., Leib-Mošch,C.,Erfle,V.,a

Salmons,B.(1995) Identifikace tří lidských sekvencí s virovými specifickými primery superantigenů. Mammalian Genome 6,339-344.

Jainchill,J.L.,Andeson,S.A._za Torado,G.J.(1969) Myší sarkomové a leukemické viry: stanovení s použitím klonových' linií stykem-inhibovaných myších buněk. J.Virol.4,549-553.

Kedzie,J.L.,Balfour,C.A., Wscobar, G.Y.,Grimm,S.W.,He,Y.A., Pepperl,D.J, Reagan, J.W., Stevens, J.C.,Halpert,J.H.: Molekulární základ unikátní varianty cytochromu P450IIB1. J.Biol.Chem.1991 Nov 25 263,(33)22515-21.

·· ♦#·· „ _Λ · ··· · 31 ♦ ♦♦♦·· ··· · **^χ · · * · · · « ···· ♦· ··· ···* ·· ·

Miller,A.D.a Buttimore,C.(1986). Změna buněčné linie obsahující virus znemožňující rekombinaci vedoucí k produkci pomocného viru. Mol.Cell.Biol.6,2895-2902·

Morgan,R.A.a Anderson,W.F.(1993). Lidská genová terapie. Ann.Rev.Biochem.62,191-217.

Price,J.,Turner, D.a Čepko,C.(1987)Liniová analýza nervového systému obratlovců pomocí retrovirem zprostředkovaného genového, transferu. Proč.Nati.Acad.Sci.USA 84, 156-160.

Ram,Z.,Culver,K.W.,Walbridge, S., Blaese,R.M. a Oldfield,E.H. (1993). Retrovirem zprostředkovaný transfer in šitu při léčení mozkových nádorů krys. Cancer Res.53,83-88.

Salmons,B.,Knedlitschek,G.,Kennedy,N.,Groner,B. a Ponta,H. (1986).Endogenní lokus Mtv-8 viru nádorů myších mléčných žláz obsahuje obálkový (env) gen.Virus Res.4,377-389.

Stange,J.,Mitzner,S.,Dautzenberg,H.,Ramlow,W.,Knippel,M., Steiner,M.,Ernst,B.,Schmidt,R. a Klinkmann,H.(1993) Prodloužená biochemická a morfologická stabilita zapouzdřených jaterních buněk - nová metoda. Art.Cells & Immob.Biotech. 21,343-352.

Tai,I.T. a Sun,A.M.(1993) Mikrozapouzdření rekombinantních buněk: nový dodávající systém pro genovou terapii.

FASEB J. 7,1061-1069.

Welsh,R.M.,Cooper,N.R.,Jensen, F.C. a 01dstone,M.B,A.(1975). Lidské sérum lyžuje nádorové RNK viry. Nátuře 257,612-614.

99	• «9«	9 · *
• 9	•	*9 9 9	• 9
•	9	• ·	9 9
•	9 *	• 9 9	»•9	9
•	• 9	• 9	9	♦
··« ·	♦ 9	·♦··	• 9	•

Winn,S.R.,Hammang, J.P.,Emerich, D., F.,Lee,A.,Palmiter,R. D. and Baetge,E.E.(1994). V polymeru zapouzdřené buňky, geneticky modifikované tak, aby produkovaly lidský, nervový růst, podporují přežívání axotomizovaných septálních cholinergických neuronů. Proč.Nati.Acad.Sci.USA 91,2324-2328.

Claims

1. Zapouzdřené buňky produkující virové částice, vyznačující se tím, že sestávají z jádra, obsahujícího buňky, a porézní stěny kapsule, obklopující uvedené jádro, přičemž tato porézní stěna kapsule je průchodná pro uvedené virové částice.

2. Zapouzdřené buňky podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená porézní stěna kapsule je tvořena polyelektrolytovým komplexem, tvořeným opačně nabitými pólyelektrolyty.

3. Zapouzdřené buňky podle nároků 1-2, vyznačující se tím, že uvedená porézní stěna kapsule je tvořena polyelektrolytovým komplexem vzniklým z polysacharidu nebo derivátů polysacharidu obsahujících sulfátové skupiny nebo syntetických polymerů obsahujících sulfonátové skupiny a polymerů s kvarterními amoniovými skupinami.

4. Zapouzdřené buňky podle nároku 3, vyznačující se tím, že polysačharidy nebo deriváty polysacharidu obsahujícími sulfátové skupiny jsou sulfát celulózy, acetátsulfát celulózy, sulfát karboxymethylcelulosy, sulfát dextranu nebo sulfát škrobu a syntetickým polymerem, obsahujícím sulfonátové skupiny, je polystyren-sulfonát.

5. Zapouzdřené buňky podle nároku 3, vyznačující se tím, že polymerem s kvarterními amoniovými skupinami je polydimetyldiallylamonium nebo polyvinylbenzyltrÍmetylamoníum.

·· • · • ·· ♦ · · * * • • · · · • • · • · · ··· • • • · • · · * ·· ·♦·· ··

6. Zapouzdřené buňky podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že porézní stěna kapsule sestává z komplexu tvořeného ze sulfátu celulózy a polydimetyldiallylamonia.

7. Zapouzdřené buňky podle nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že jsou ve formě mikrokapsulí o průměru mezi 0,01 a 5 mm, výhodně mezi .

0,1 a 1 mm.

8. Zapouzdřené buňky podle nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že uvedená kapsule sestává z houbovité sítě sulfátu celulózy, tvořící vnitřek steny kapsule, obklopené povrchem kapsule, ve kterém jsou póry, přičemž uvedená houbovitá síť je naplněná buňkami.

9. Zapouzdřené buňky podle nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že velikost pórů na povrchu porézní stěny kapsule je mezi 80 a 150 nm, výhodně mezi 100 - 120 nm.

10. Zapouzdřené buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že virovou částicí produkovanou zapouzdřenými buňkami je retrovirová částice, obsahující genom retrovirového vektoru.

11. Zapouzdřené buňky podle nároku 10, vyznačující se tím, že zapouzdřenými buňkami, produkujícími retrovirové částice je buněčná linie, obsahující pomocný virus, transfekovaná expresním vektorem, kterýžto .expresní vektor nese retrovirový vektorový konstrukt t · «·· schopný infikovat a řídit expresi, jedné nebo několika kódujících sekvencí, které obsahuje, v cílových buňkách, přičemž uvedená buněčná linie, obsahující pomocný virus, obsahuje alespoň jeden expresní vektor, nesoucí geny, kódující bílkoviny, nutné pro sbaleni genomu uvedeného retrovirového vektorového konstruktu.

12. Zapouzdřené buňky podle nároku 11, vyznačující se tím, že nejméně jedna z uvedených kódujících sekvencí kóduje heterologní peptidy, vybrané ze značkových genů, terapeutických genů, antivirových genů, protinádorových genů, a cytokinových genů.

13. Zapouzdřené buňky podle nároku 12, vyznačující se t i m, že uvedený značkový gen je vybrán ze skupiny, skládající se ze značkových genů kódujících bílkoviny jako β-galaktosidázu, neomycin, alkohol dehydrogenázu, puromycin, hypoxantin.fosforibosyltransferázu (HPRT), hygromycin a sekretovanou alkalickou fosfatázu, a uvedený terapeutický gen je vybrán z genů, kódujících bílkoviny jako Herpes simplex tymidinkinázu, cytozin deaminázu, guaninfosforibosyltransferázu (gpt), cytochrom P 450, geny regulující buněčný cyklus jako je SDI, nádory potlačující geny kódující bílkoviny jako p53, antiproliferační geny kódující bílkoviny jako melittin, cecropin nebo cytokiny jako je IL-2.

14. Zapouzdřené buňky podle nároku 11, vyznačuj ící se tím, že buněčná linie obsahující pomocný virus je vybrána z psi-2, psi-crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 a GP+envAM-12.

Φ Φ Φ •999 99 φ φ φ φ φ φ * ···♦ • · φ ·

15. Zapouzdřené buňky podle nároku 11, vyznačující se tím, že expresním vektorem je pBAG, pLXSN, pl25LX, pLX2Bl nebo pc3/2Bl nebo jejich deriváty.

16. Způsob přípravy zapouzdřených buněk podlé nároků 1-15, vyznačující se tím, že se bunňky produkující virové částice suspendují ve vodném roztoku polyelektrolytu a suspense ve formě částic se vnese do srážecí lázně, obsahující vodný roztok opačně nabitého polyelektrolytu.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se t i m, že částice se vytvářejí rozprášením.

18. Způsob podle nároků 16 až 17, vyznačující se tím, že se buňky suspendují ve vodném roztoku polysacharidu nebo derivátu polysacharidu, obsahujícího sulfátové skupiny, nebo syntetického polymeru, obsahujícího sulfonátové skupiny.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že se použije polysacharid nebo derivát polysacharidu obsahující sulfátové skupiny vybraný ze skupiny zahrnující sulfát celulózy, acetátsulfát celulózy, sulfát karboxymetylcelulozy, sulfát dextranu a sulfát škrobu, a jako syntetický polymer obsahující sulfonátové skupiny se použije polystyren-sulfonát.

20. Způsob podle nároků 16 - 17, vyznačující se tím, že srážecí lázeň obsahuje vodný roztok polymeru s kvarterními amoniovými skupinami.

• · • 9 · • · • 9 · • » ·· · « • • · ♦ • · • • • »· · ·* ·<· · · · *· 9

21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se jako polymer s kvarterními amoniovými skupinami použije polydimetyldiallylamonium nebo polyvinylbenzyltrimethylamonium.

22. Způsob podle nároků 16 - 17, vyznačující se tím, že buňky se suspendují ve vodném roztoku sodné soli sulfátu celulózy, a vnesou se do srážecí lázně obsahující vodný roztok chloridu polydimetyldiallylamonia.

23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že se použije vodný roztok sulfátu celulózy obsahující 0,5 - 50 %, výhodně 2-5 %, sodné soli sulfátu celulózy a 2 -10 %, výhodně 5 %, fetálního telecího sera v pufrovaném fyziologickém roztoku

24. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že se ve srážecí lázni použije vodný roztok obsahující 0,5-50 %, výhodně 2-10 %, a ještě výhodněji 3 %, chloridu polydimetyldiallylamonia v pufrovaném fyziologickém roztoku.

25. Zapouzdřené buňky podle nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že byly připraveny pomocí způsobu podle kteréhokoli z nároků 16 - 24.

26. Použití zapouzdřených buněk podle nároků 1 až 15 pro dodávání genů cílovým orgánům nebo buňkám, při kterém se

a) zapouzdřené buňky kultivují ve vhodném mediu a

b) zapouzdřené buňky se implantují do živých zvířecích těl, zahrnujíce v to i těla lidská.

»·· v ·· ·· • « • ·· · « * • • • t a a • • • « • · « • • • • a · • · a ·· ··· ·· •

27. Použiti podle nároku 26, při kterém jsou cílovými orgány nebo buňkami mléčné .žlázy nebo slinivka břišní.

28. Použití podle nároku 26, při kterém jsou cílovými orgány nebo buňkami buňky hladkého svalstva obklopujícího arterie.