ES2253754T3 - Celulas encapsuladas que producen particulas viricas. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A CELULAS ENCAPSULADAS QUE PRODUCEN PARTICULAS VIRALES, ESPECIALMENTE PARTICULAS RETROVIRALES QUE CONTIENEN EL GENOMA DE UN VECTOR VIRAL QUE ES PORTADOR DE GENES TERAPEUTICOS, METODOS PARA LA PREPARACION DE DICHAS CELULAS ENCAPSULADAS, ASI COMO EL USO DE DICHAS CELULAS ENCAPSULADAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES.

Description

Células encapsuladas que producen partículas víricas.

La presente invención se relaciona con células encapsuladas que producen partículas víricas, especialmente partículas retrovíricas que contienen el genoma de un vector retrovírico que porta genes terapéuticos, con métodos para la preparación de tales células encapsuladas, así como al uso de tales células encapsuladas para la transferencia de genes, especialmente genes terapéuticos, a células/ órganos diana.

Antecedentes

La transferencia de genes de beneficio terapéutico a células diana está en el centro del concepto de terapia génica. Si la terapia génica se convierte en un procedimiento de rutina es de mucha importancia que los sistemas que sean desarrollados permitan una transferencia efectiva in vivo de los genes terapéuticos a las células diana.

Los vectores víricos, y especialmente los vectores retrovíricos son los vehículos de transferencia más comúnmente usados para la terapia génica (Morgan y Anderson, 1993). Un método para la producción continua y sostenida de vectores víricos recombinantes para uso en terapia génica es descrito en la patente WO 92/10564. De acuerdo a este método, las células que producen vectores víricos recombinantes son cultivadas en un bioreactor de fibras huecas: Una pluralidad de fibras semipermeables, a través de las cuales el medio es difundido son atraídas a través de un tubo de policarbonato. La membrana semipermeable de las fibras permite el paso de nutrientes dentro del espacio extra fibra (EFS) que es el espacio en el cual las células productoras crecen. De acuerdo a esto, las células cultivadas crecen y llenan los espacios entre las fibras y son alimentadas por el paso de nutrientes a través de las paredes de las fibras desde el medio que es difundido a través de la lumina de las fibras. La difusión es continuada por tiempo suficiente y bajo determinadas condiciones, por medio de las cuales el vector es liberado dentro del EFS, el cual entonces contiene altos títulos del vector recombinante. Adicionalmente la pared de la fibra es impermeable a los vectores víricos con vistas a maximizar la concentración de los mismos en el EFS. Los vectores empacados son recolectados, un medio fresco es adicionado a la EFS y la incubación de las células diana puede ser continuada. La producción del vector empacado continúa a un régimen alto hasta tanto el EFS sea periódicamente recolectado y remplazado por un medio fresco.

Muchos de los protocolos de las terapias génicas actualmente aprobados toman una aproximación ex vivo en que las células son extraídas del paciente, se modifican genéticamente in vitro y luego son introducidas nuevamente en el paciente. Este procedimiento es difícil de manejar, caro y limitado a medios de tecnologías de avanzada. Además este tipo de aproximación está limitado a células que puedan ser fácilmente aisladas, cultivadas y reimplantadas (Günzburg y otros., 1995).

La patente EP 0 243 204 además describe un sistema de transferencia de un fármaco el cual comprende un retrovirus de transferencia. El retrovirus tiene un "genoma" que comprende un RNA que codifica el ingrediente de proteína activo deseado el que se encuentra enlazado operablemente a secuencias de control que fueron derivadas de un retrovirus y a un sitio de empaquetamiento \Psi, y una proteína recubierta que es capaz de efectuar la infección de la célula hospedera diana con el virión, de manera que solamente la célula hospedera diana sea "infectada", pero incapaz de pasar la infección a células adicionales. El ingrediente de la proteína activa deseado es subsecuentemente trascrito desde el "genoma" del vector retrovírico el cual es insertado dentro del genoma celular de la célula "infectada", y es así producido por la célula "infectada".

Aunque una transferencia de genes terapéuticos in vivo ofrecería muchas ventajas, en su forma actual esta tentativa es ineficiente y problemática. Un problema mayor, debido a la baja eficiencia de la transferencia de genes, es la necesidad de aplicaciones múltiples de los vectores víricos. El requerimiento de múltiples rondas de transferencia del vector no es solamente tedioso sino también posiblemente no exitoso debido a las respuestas inmunes dirigidas contra las partículas de los virus.

Una forma posible en la cual estos problemas pudieran ser evitados es a través de la implantación directa de células que producen partículas víricas. La implantación de células que producen partículas víricas que contienen el genoma de un vector vírico in situ cerca de la célula o el órgano diana también permitiría aplicaciones directas del vector vírico a las células/ órganos diana.

Adicionalmente, cuando el virus vector vírico usado es un virus vector retrovírico, tal aproximación tiene una ventaja por encima de aquella basada en múltiples aplicaciones de alta dosificación simple, ya que las oportunidades del virus vector de estar presente en el momento en el que una célula diana es sometida a la replicación, y de este modo la capacidad de infectar a la célula diana aumenta. Además una liberación continua pero más baja de partículas víricas pudiera ser ventajosa para escapar de las respuestas inmunes del hospedero contra las partículas víricas.

Para una transferencia efectiva de vectores víricos, las células que producen partículas víricas deben ser capaces de sobrevivir largos periodos en el hospedero después de la implantación, y las partículas víricas deben ser producidas durante este periodo y liberadas de las células. En ausencia de una respuesta inmune significativa, por ejemplo después de la implantación en el cerebro, estas células pueden sobrevivir por períodos prolongados (Culver y otros., 1992; Ram y otros., 1993). Sin embargo para lograr una implantación exitosa en otros sitios del cuerpo, las células productoras deben ser protegidas del sistema inmune.

El largo período de efectividad de esta aproximación depende entonces de (1) la protección de las células del sistema inmune del hospedero, el cual normalmente eliminará las células que producen las partículas víricas, especialmente si las células que producen las partículas víricas son de diferentes especies como es casi siempre el caso para tales células y (2) la supervivencia de las células in situ por períodos prolongados, lo que puede requerir vascularización.

La encapsulación de células en estructuras permeables que permiten la liberación de ciertas moléculas biológicamente activas y que a su vez protegen las células que producen estas moléculas del sistema inmune del hospedero ha encontrado algunos éxitos (para referencia ver Chang, 1995). Las células que han sido genéticamente modificadas para producir la hormona de crecimiento humano (hGH) (Tai y Sun, 1993) o una forma secretada de la deaminasa adenosina humana (Hughes y otros., 1994) han sido encapsuladas. En ambos estudios, las células fueron encapsuladas en microcápsulas de poli-L-lisina-alginato y las células demostraron sobrevivir por largos períodos de tiempo en el cultivo. Esto fue acompañado por un largo término de producción de la enzima u hormona. Además, fue demostrado (Tai y Sun, 1993) que durante el trasplante de las microcápsulas a los ratones, las células permanecieron viables por 1 año y ellas continuaron produciendo hGH, demostrando que las cápsulas protegen las células transfectadas de la destrucción por el sistema inmune del hospedero.

La encapsulación de células ha sido también reportada usando otros materiales. Las células del riñón del Hámster pequeño genéticamente modificadas para producir factor de crecimiento nervioso han sido encapsuladas en poliacrilonitrilo/ cloruro de vinilo e implantadas en el cerebro de la rata. Las células encapsuladas sobrevivieron por al menos 6 meses y continuaron produciendo factor de crecimiento nervioso (NGF) (Winn y otros., 1994; Deglon y otros., 1995).

El tejido vivo como, por ejemplo, Islotes viables de Langerhans fueron encapsulados primeramente en cápsulas "temporales" hechas de goma de polisacáridos sintéticos o naturales, solubles en agua para proporcionar un ambiente protectivo temporal para el tejido. Subsecuentemente, una membrana semipermeable permanente fue formada alrededor de las cápsulas temporales por capas de superficie eslabonadas de una goma cuajada en forma de gel del tipo que tiene grupos ácidos libres con polímeros que contienen grupos reactivos ácidos tales como grupos imina o amina. El tejido encapsulado ha sido mantenido en un estado viable por tres meses. También, las células del hígado han sido encapsuladas y demostraron estar en un estado fisiológicamente activo (US 4,391,909).

Adicionalmente, los hepatocitos han sido exitosamente encapsulados en un complejo polielectrolito de sulfato de celulosa y polidimetildialilamonio (Stange y otros., 1993). Más del 90% de los hepatocitos encapsulados retuvieron su viabilidad y en contraste al crecimiento de hepatocitos como monocapas, las células encapsuladas exhibieron una actividad metabólica incrementada. Esto no sugiere que las cápsulas de sulfato de celulosa/ polidimetildialilamonio pudieran soportar el crecimiento de otros tipos de células, tales como células que producen partículas víricas, o permitir la salida de las partículas víricas de las cápsulas.

La preparación de las cápsulas de sulfato de celulosa usadas en la presente invención ha sido detalladamente descrita en la patente DE 40 21 050 A1. También, la síntesis de sulfato de celulosa ha sido descrita en esta solicitud de patente. Los métodos para una caracterización completa de las cápsulas de sulfato de celulosa han sido detalladamente tratados en H. Dautzenberg y otros., Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech., 21(3), 399-405 (1993). Otras cápsulas de sulfato de celulosa han sido descritas en la patente GB 2 135 954. Las propiedades de las cápsulas de sulfato de celulosa, es decir el tamaño, el tamaño del poro, el espesor de la pared y las propiedades mecánicas dependen de varios factores tales como por ejemplo las circunstancias físicas bajo las cuales las cápsulas han sido preparadas, la viscosidad de la solución de precipitación, la fortaleza de sus iones, la temperatura, la rapidez de la adición de la suspensión sulfato de celulosa/ célula, la constitución del sulfato de celulosa, así como otros parámetros descritos por el grupo Dautzenberg.

De manera sorprendente se encontró que la producción continua de partículas víricas de las células implantadas puede ser lograda mediante la encapsulación de las células en un complejo polielectrolito. Aunque los poros de tales cápsulas son lo suficientemente grandes para permitir a los anticuerpos y complementos, conocidos para inactivar los virus (Welsh y otros., 1975, Cornetta y otros., 1990), penetrar en las cápsulas, no se encontraron grandes evidencias de respuestas inflamatorias o inmunes, o de necrosis en las inmediaciones de las cápsulas implantadas. Adicionalmente, fue sorprendentemente encontrado que las cápsulas de acuerdo a la presente invención se injertaron bien en el hospedero, y fueron rápidamente vascularizadas. Las células encapsuladas de acuerdo a la presente invención permiten por tanto la transferencia en gran término de vectores víricos que portan genes terapéuticos in vivo.

Resumen de la presente invención

La invención por lo tanto comprende, entre otras cosas, lo siguiente sola o en combinación:

Células encapsuladas que producen partículas víricas que comprenden un núcleo que contiene células; y una pared de la cápsula porosa que rodea dicho núcleo, dicha pared de la cápsula porosa siendo permeable a dichas partículas víricas;

células encapsuladas como las anteriores donde dicha pared de la cápsula porosa consiste en un complejo polielectrolito formado por polielectrolitos con carga opuesta;

células encapsuladas como las anteriores donde dicha pared de la cápsula porosa consiste en un complejo polielectrolito formado por derivados de polisacáridos o polisacáridos que contienen grupos sulfato o polímeros sintéticos que contienen grupos sulfonato y polímeros con grupos de amonio cuaternario;

células encapsuladas como las anteriores donde los derivados de polisacáridos o polisacáridos que contienen grupos sulfato son el sulfato de celulosa, sulfato de acetato de celulosa, sulfato de carboximetilcelulosa, sulfato de dextrano o sulfato de almidón, y el polímero sintético que contiene grupos sulfonato es un sulfonato de poliestireno;

células encapsuladas como las anteriores donde el polímero con grupos de amonio cuaternario es el polidimetildialilamonio o polivinilbencil-trimetilamonio;

células encapsuladas como las anteriores donde la pared de la cápsula porosa consiste en un complejo formado de sulfato de celulosa y polidimetildialilamonio;

células encapsuladas como las anteriores teniendo la forma de microcápsulas con un diámetro entre 0,01 y 5 mm, preferiblemente entre 0,1 y 1 mm;

células encapsuladas como cualquiera de las anteriores donde dicha cápsula consiste de una matriz de sulfato de celulosa esponjosa que forma el interior de la pared de la cápsula, rodeada por una superficie de la cápsula que contiene poros; dicha matriz esponjosa siendo rellenada con células;

células encapsuladas como las anteriores donde el tamaño del poro de la superficie de la pared de la cápsula porosa está entre 80 y 150 nm, preferiblemente entre 100-120 nm;

células encapsuladas como las anteriores donde la partícula vírica producida por las células encapsuladas es una partícula retrovírica que contiene el genoma de un vector retrovírico;

células encapsuladas como las anteriores donde las células encapsuladas que producen partículas retrovíricas son una línea celular de empaquetamiento transfectada con un vector de expresión, dicho vector de expresión portando una estructura de un vector retrovírico capaz de infectar y dirigir la expresión en células diana de una o más secuencias de codificación portadas por dicha estructura de un vector retrovírico; dicha línea celular de empaquetamiento hospedando al menos un vector de expresión que porta genes que codifican para las proteínas requeridas para la estructura del vector retrovírico a ser empacado;

células encapsuladas como las anteriores donde al menos una de dichas secuencias de codificación codifica para los péptidos heterólogos seleccionados de los genes marcadores, genes terapéuticos, genes antivíricos, genes antitumor y genes de citocina;

células encapsuladas como las anteriores donde dicho gen marcador es seleccionado del grupo que consiste de genes marcadores el cual codifica para las proteínas tal como la \beta-galactosidasa, neomicina, alcohol dehidrogenasa, puromicina, transferasa fosforibosil hipoxantina (HPRT), higromicina y fosfatasa alcalina secretada, y dicho gen terapéutico es seleccionado de los genes el cual codifica para las proteínas tales como la cinasa timidina del Virus del Herpes Simplex, deaminasa citosina, transferasa fosforibosil guanina (gpt), citocroma P450 y genes regulatorios del ciclo de las células tales como SDI, genes supresores de tumores que codifican para las proteínas tales como p53 o genes antiproliferación los que codifican para las proteínas tales como melitina, cecropina o citoquinas tales como IL-2;

células encapsuladas como las anteriores donde la línea celular de empaquetamiento es seleccionada de psi-2, psi-crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317, y GP+envAM-12;

células encapsuladas como las anteriores donde el vector de expresión transfectado en la línea celular de empaquetamiento es pBAG, pLXSN, p125LX, pLX2B1, o pc3/2B1 o derivados de los mismos;

un proceso para la preparación de células encapsuladas como las anteriores que comprende suspender las células que producen partículas víricas en una solución acuosa de un polielectrolito, posteriormente la suspensión en forma de partículas preformadas es introducida en una solución de precipitación que contiene una solución acuosa de un polielectrolito con carga opuesta;

un proceso como el anterior donde la formación de las partículas tiene lugar por atomización;

un proceso como el anterior donde las células son suspendidas en una solución acuosa de un derivado de polisacárido o polisacárido que contiene grupos sulfato, o un polímero sintético que contiene grupos sulfonato;

un proceso como el anterior donde el derivado polisacárido o polisacárido que contiene grupos sulfato es seleccionado de sulfato de celulosa, sulfato de acetato de celulosa, sulfato de carboximetilcelulosa, sulfato de dextrano o sulfato de almidón, y el polímero sintético que contiene grupos sulfonato es un sulfonato de poliestireno;

un proceso como el anterior donde la solución de precipitación contiene una solución acuosa de un polímero con grupos de amonio cuaternario;

un proceso como el anterior donde el polímero con grupos de amonio cuaternario es polidimetildialilamonio o polivinilbencil-trimetilamonio;

un proceso como el anterior donde las células son suspendidas en una solución acuosa de sulfato de celulosa de sodio, e introducidas en una solución de precipitación que contiene una solución acuosa de cloruro de polidimetildialilamonio;

un método como el anterior donde la solución acuosa de sulfato de celulosa está compuesta de 0,5-50% preferiblemente de 2-5% de sulfato de celulosa de sodio y 2-10%, preferiblemente 5% de suero fetal de ternero en una solución buffer salina;

un método como el anterior donde la solución acuosa en la solución de precipitación está compuesta de 0,5-50%, preferiblemente 2-10%, o más preferiblemente 3% de cloruro de polidimetildialilamonio en solución buffer salina;

células encapsuladas como cualquiera de las anteriores producidas por un proceso como el anterior;

células encapsuladas como las anteriores para uso en terapia génica y/o en el tratamiento del cáncer o cualquier otra enfermedad o desorden relevante;

células encapsuladas como las anteriores para la transferencia de genes a células/ órganos diana, donde las células encapsuladas son inyectadas y/o implantadas en dichas células/ órganos diana y/o cerca de dichas células/ órganos diana;

células encapsuladas como las anteriores, donde dichas células/ órganos diana son tejidos cancerosos;

células encapsuladas como las anteriores donde las células/ órganos diana son la glándula mamaria, el páncreas, o las células del músculo liso que rodea las arterias;

uso de las células encapsuladas como las anteriores para la preparación de una composición farmacéutica;

una composición farmacéutica que comprende las células encapsuladas como las anteriores;

la composición farmacéutica como la anterior en una forma apropiada para una inyección y/o un implante en las células/ órganos diana y/o cerca de dichas células/ órganos diana;

la composición farmacéutica como la anterior, donde dichas células/ órganos diana son los tejidos cancerosos;

la composición farmacéutica como la anterior, donde las células/ órganos diana son la glándula mamaria, el páncreas, o las células del músculo liso que rodea las arterias.

Objetos de la presente invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar células encapsuladas que producen partículas víricas, las cuales permiten la liberación de las partículas víricas producidas por las células desde las cápsulas, y al mismo tiempo permiten que no se produzca una respuesta significativa inflamatoria o inmune del hospedero después de la implantación en un hospedero.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para la producción de tales células encapsuladas que producen partículas víricas.

Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para la transferencia de genes, especialmente genes terapéuticos, a células/ órganos diana mediante la implantación de tales células encapsuladas que producen partículas víricas en un hospedero, y de esta manera proporcionar un método para la producción continua y la liberación de partículas víricas en órganos diana o células diana cercanas.

La invención

De acuerdo a la presente invención, son provistas células encapsuladas que producen partículas víricas, las cuales permiten la liberación de las partículas víricas producidas por las células desde las cápsulas, y al mismo tiempo permiten que no se produzca una respuesta significativa inflamatoria o inmune del hospedero después de la implantación en un hospedero.

Las células encapsuladas de acuerdo a la presente invención pueden ser preparadas suspendiendo las células que producen las partículas víricas en una solución acuosa de un polielectrolito (por ejemplo seleccionado de derivados de polisacáridos o polisacáridos que contienen grupos sulfato o de polímeros sintéticos que contienen grupos sulfonato), donde la suspensión en forma de partículas preformadas es introducida en una solución de precipitación que contiene una solución acuosa de un polielectrolito con carga opuesta (tal como por ejemplo un polímero con grupos de amonio cuaternario).

Los derivados de polisacáridos o polisacáridos que contienen grupos sulfato incluyen sulfato de celulosa, sulfato de acetato de celulosa, sulfato de carboximetilcelulosa, sulfato de dextrano o sulfato de almidón en forma de una sal, especialmente una sal de sodio. El polímero sintético que contiene grupos sulfonato puede ser una sal de sulfonato de poliestireno, preferiblemente una sal de sodio.

Los polímeros con grupos de amonio cuaternario incluyen polidimetildialilamonio o polivinilbencil-trimetilamonio, en forma de una sal de los mismos, preferiblemente una sal de cloruro.

En una realización preferida de la invención las células que producen partículas víricas son encapsuladas en un complejo que consiste de un complejo formado por sulfato de celulosa y polidimetildialil-amonio.

Tales cápsulas son preferiblemente preparadas suspendiendo las células que producen partículas víricas en una solución que contiene 0,5-50%, preferiblemente 2-5%, de sulfato de celulosa sodio y 5% de suero fetal de ternero opcionalmente en buffer. Esta suspensión es entonces goteada por un sistema dispensador (ej. sistema de chorro de aire o sistema piezoeléctrico) mientras se agita en una solución de precipitación que contiene 0,5%-50%, preferiblemente 2-10%, o más preferido alrededor de 3% de cloruro de polidimetil-dialilamonio opcionalmente en buffer. La formación de la cápsula tiene lugar en milisegundos y las cápsulas que contienen las células son mantenidas en la solución de precipitación por un período de 30 segundos a 5 minutos y posteriormente lavadas. La rapidez de este método asegura que las células no sean estresadas indebidamente durante el procedimiento completo (Stange y otros., 1993).

De acuerdo a la invención las cápsulas tienen un diámetro variable entre 0,01 y 5 mm, pero preferiblemente entre 0,1 y 1 mm. En consecuencia, las cápsulas pueden ser hechas para contener un número variable de células. Usando el proceso de encapsulación de acuerdo a la invención, hasta el 10^{10}, pero preferiblemente 10^{5} - 10^{7} células que producen partículas víricas pueden ser encapsuladas en el complejo polielectrolito.

Las cápsulas compuestas de sulfato de celulosa y polidimetildialilamonio tienen excelentes propiedades mecánicas y pueden ser manufacturadas a un tamaño de poro y tamaño consistente.

El tamaño de poro de las cápsulas está entre 80 y 150 nm, preferiblemente entre 100 y 120 nm.

Las células encapsuladas pueden ser cultivadas en un medio de cultivo de células normal (cuya naturaleza depende de las células encapsuladas) y bajo condiciones estándares de humedad, temperatura y concentración de CO_{2}. Durante este período de cultivo la producción de partículas víricas desde las cápsulas hacia del medio de cultivo de la célula puede ser demostrada usando tanto la tecnología de la Reacción en cadena de la polimerasa- transcriptasa inversa (RT-PCR) o por transferencia del sobrenadante libre de células (0,45 \mum filtrado) a las células diana seguido por la demostración de la infección viral por ensayo de la actividad de las proteínas de marcaje codificadas por los genes portados por la estructura del vector vírico contenido dentro de la partícula vírica. Si el gen marcador portado por el vector vírico es un gen que ofrece resistencia a un compuesto específico sobre la célula diana, el título del virus producido por el sistema puede ser asegurado.

Después de un período apropiado en cultivo (normalmente no más de 1 hora y no excediendo los 30 días), las cápsulas que contienen las células pueden ser implantadas quirúrgicamente de manera directa, o por inyección usando una jeringuilla en varias áreas del cuerpo.

Las partículas víricas producidas por las células encapsuladas de acuerdo a la invención pueden estar basadas en cualquier virus usado para terapia génica, incluyendo pero no limitado a adenovirus, virus asociados a adenovirus, virus o retrovirus del herpes; para referencia ver Günzburg y Salmons, 1995.

En una realización preferida de la invención, las células encapsuladas son una línea celular de empaquetamiento que produce partículas retrovíricas que contienen el genoma de una estructura del vector retrovírico que porta los genes terapéuticos y/o marcadores.

Los sistemas del vector retrovírico constan de dos componentes:

1) un vector de expresión (plásmido vector) que porta una estructura de un vector retrovírico el cual es un retrovirus modificado en el cual los genes que codifican las proteínas víricas han sido reemplazados por genes terapéuticos que incluyen opcionalmente genes marcadores para ser transferidos a la célula diana. Ya que el reemplazo de los genes que codifican para las proteínas víricas incapacita efectivamente el virus, este debe ser rescatado por un segundo componente en el sistema el cual proporciona las proteínas víricas perdidas al retrovirus modificado.

El segundo componente es:

2) una línea celular que produce grandes cantidades de proteínas víricas, sin embargo carece de capacidad para producir virus de replicación competentes. Esta línea celular es conocida como la línea celular de empaquetamiento y consiste de una línea celular transfectada con plásmidos que portan los genes capacitando el genoma retrovírico modificado para ser empacado. Estos plásmidos dirigen la síntesis de las proteínas víricas necesarias requeridas para la producción del virión.

Para generar el vector retrovírico empacado, el plásmido vector es transfectado a la línea celular de empaquetamiento. Bajo estas condiciones el genoma retrovírico modificado incluyendo los genes marcadores opcionales y terapéuticos insertados es transcrito del plásmido vector y el genoma retrovírico modificado resultante es empacado en las partículas retrovíricas. Una célula infectada con una partícula vírica tal no puede producir partículas víricas ya que no están presente las proteínas víricas en estas células. Sin embargo la estructura del vector retrovírico que porta los genes marcadores y terapéuticos está presente y estos ahora pueden ser expresados en la célula infectada.

Las patentes WO 94/29437, WO 89/11539 y WO 96/07748 describen diferentes tipos de sistemas de vectores retrovíricos útiles para el propósito de la presente invención.

Las partículas víricas producidas por las células encapsuladas de acuerdo a la presente invención pueden ser construidas para contener el genoma de un vector vírico que porta genes que codifican los genes terapéuticos y/o marcadores.

Los genes terapéuticos o marcadores portados por el vector vírico pueden ser, por ejemplo, genes los cuales codifican para las proteínas tales como la \beta-galactosidasa, neomicina, alcohol dehidrogenasa, puromicina, hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT), higromicina, y fosfatasa alcalina secretada o genes terapéuticos que codifican para las proteínas tales como la cinasa timidina del Virus del Herpes Simplex, citosina deaminasa, guanina fosforibosil transferasa (gtp), citocroma P450, genes regulatorios del ciclo de las células tales como SDI, genes supresores de tumores que codifican para las proteínas tales como p53, genes antiproliferación que codifican para las proteínas tales como melitina, cecropina o citoquinas tales como IL-2.

En una realización especial, la invención se refiere a células encapsuladas de acuerdo a la invención para uso en el tratamiento de tumores.

Muchos tumores malignos no responden bien a la quimioterapia. Los fármacos contra el cáncer usados para tratar tumores son en muchos casos aplicados sistemáticamente y por lo tanto diseminados por todo el cuerpo del paciente. La alta dosis sistémica de tales fármacos requerida para el tratamiento del cáncer a menudo está combinada con efectos colaterales desagradables para el paciente. Una estrategia mediante la cual estos problemas de alta concentración sistémica de fármacos contra el cáncer pudieran ser evitados es mediante la aplicación directa o por la activación del medicamento directamente en el tumor o cercano al mismo. Esto pudiera ser logrado mediante la implantación de las células encapsuladas de acuerdo a la invención que producen partículas víricas que contienen el genoma de un virus diseñado, especialmente un vector retrovírico, que porta un gen que codifica un medicamento contra el cáncer, por ejemplo una enzima de activación capaz de convertir un profármaco en un agente citotóxico, tanto en las células de tumores como en las células cercanas.

En una realización de la invención son provistas las células encapsuladas que producen partículas retrovíricas que contienen el genoma de un vector retrovírico que porta enzimas relevantes del tumor tales como citocroma P450 o genes suicidas tales como pero no limitado a timidina cinasa que convierte los fármacos no tóxicos en uno o más metabolitos tóxicos. Tales células encapsuladas de la invención pueden ser usadas para el tratamiento de cánceres por la implantación de las cápsulas en o cerca de los tumores, por ejemplo tumores en el páncreas o la glándula
mamaria.

Un objetivo adicional puede ser obtenido mediante el uso de promotores y elementos regulatorios específicos de la célula diana para la dirección de la expresión de los genes terapéuticos enlazados a tipos de células específicas.

Tales promotores y elementos regulatorios específicos de la célula diana incluyen, por ejemplo, promotores y elementos regulatorios específicos del páncreas incluyendo promotores y elementos regulatorios de la anhidrasa carbónica II y la \beta-glucocinasa; promotores y elementos regulatorios específicos de los linfocitos incluyendo inmunoglobulina y promotores y elementos regulatorios específicos linfáticos del Virus del Tumor Mamario de Ratón (MMTV); promotores y elementos regulatorios específicos mamarios incluyendo la Proteína Acida del Suero de la Leche (WAP), Virus del Tumor Mamario de Ratón (MMTV), promotores y elementos regulatorios específicos de la caseína y la \beta-lactoglobulina y promotores y elementos regulatorios específicos del MMTV confiriendo sensibilidad a las hormonas glucocorticoides o dirigiendo la expresión a la glándula mamaria. Otros promotores incluyen por ejemplo los promotores CD4, CD34, y IL2. Dichos promotores y elementos regulatorios específicos regulan preferiblemente la expresión de dicho vector retrovírico.

Promotores inducibles tales como promotores inducibles de radiación, por ejemplo, el promotor de la molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1), el promotor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y el promotor del factor de la necrosis del tumor (TNF) pueden también ser usados.

Los siguientes ejemplos ilustrarán la invención adicionalmente, sin embargo ellos no son interpretados como limitantes:

Ejemplo 1 Lipofección de PA317 con pBAG y aislamiento de células resistentes G418

Las células de empaquetamiento PA317 basadas en NIH3T3 anfotrópico (Miller y Buttimore, 1986) fueron cultivadas en un medio de Eagle con modificación Dulbecco (DMEM) conteniendo 10% de suero fetal de ternero. Las células fueron sembradas en una placa de cultivo de tejido de 10 cm a una densidad de células de 3x10^{5} un día antes de la lipofección y entonces lipofectadas con 2 mg del vector pBAG (Price y otros., 1987) portando un vector retrovírico basado en MLV (Virus de la Leucemia de Ratón) usando el estuche de lipofectamina de GIBCO/BRL de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes. Las células fueron posteriormente diluidas una en diez y cultivadas en un medio usual que contiene adicionalmente 400 \mug/ml de G418 (GIBCO/BRL). Después de 14 días las colonias de células resistentes G418 fueron agrupadas.

Ejemplo 2 Microencapsulación

10^{7} células fueron suspendidas en 1 ml de una solución salina buffer conteniendo de 2-5% de sulfato de celulosa de sodio y 5% de suero fetal de ternero y la suspensión fue goteada usando un sistema dispensador (sistema de chorro de aire) en una solución de precipitación que contiene entre 2-3% de polidimetil-dialilamonio en buffer salino. La formación de la cápsula tuvo lugar en milisegundos seguido por la constitución adicional de una capa, de más poros, interior para soporte mecánico esencialmente consistiendo de sulfato de celulosa. Las cápsulas que contienen las células son mantenidas en la solución de precipitación por un período de 30 segundos a 5 minutos y posteriormente lavadas en DMEM (Stange y otros., 1993). Las soluciones obtenidas para diferentes parámetros como las descritas anteriormente, por ejemplo, la concentración del sulfato de celulosa de sodio, el flujo del sistema de chorro de aire y el tiempo en la solución de precipitación fueron usadas para estudios biológicos. Ejemplos representativos de las condiciones son por ejemplo: 2,5% de sulfato de celulosa de sodio, 2% de polidimetil-dialilamonio, y 1 minuto en la solución de precipitación, o 1,5% de sulfato de celulosa de sodio, 2% de polidimetil-dialilamonio, y 0,5 minutos en la solución de precipitación, o 3% de sulfato de celulosa de sodio, 3% de polidimetil-dialilamonio, y 2 minutos en la solución de precipitación. Los parámetros exactos son seleccionados también tomando en cuenta el tamaño exacto deseado de las cápsulas, el espesor de la pared de la cápsula así como otras propiedades.

Ejemplo 3 Implantación de las microcápsulas en la glándula mamaria de ratones

Las microcápsulas fueron insertadas en las glándulas mamarias de ratones hembras BALB/c de 2 meses de edad por intervención quirúrgica "de mínimo acceso" y el sitio de entrada cerrado mediante 1 sutura. Hasta 6 cápsulas de 0,5 - 2 mm de diámetro fueron insertadas en cada sitio de operación.

Estudios in vitro de los virus liberados de las microcápsulas, la estructura de las microcápsulas y el efecto de la implantación de la cápsula en los ratones inmunocompetentes fueron estudiados usando los siguientes métodos de prueba:

A) Actividad de la \beta-galactosidasa

La detección de las células infectadas por teñido histoquímico fue realizada como se esbozó anteriormente (Cepko, 1989). Las células, cápsulas o secciones de tejidos fueron lavadas con PBS enfriado y luego fijadas con un 2% de solución de paraformaldehído por 20 minutos - 24 horas de acuerdo al espesor de la muestra. Después de un lavado prolongado con PBS, las células, cápsulas o secciones de tejidos fueron incubadas en una solución que contiene el sustrato X-gal (20 mM K_{3}FeCN_{6}, 20m M K_{4}FeCN_{6}.3H_{2}O, 2 mM MgCl_{2} y 1 mg/ml de X-gal) por al menos 2 horas a 37°C.

B) Infección

4x10^{4} células diana fueron sembradas en placas de cultivo de tejido de 6 cavidades 6 horas antes de la infección. Las cápsulas que contienen las células que producen los virus fueron ubicadas en la parte de arriba de las células y fue adicionado polibreno (8 \mug/ml) al medio. Cuatro horas después el medio fue cambiado para remover el polibreno residual. Cinco días después algunas cavidades fueron teñidas por la actividad de la \beta-galactosidasa como se describió anteriormente, las otras fueron tripsinizadas en grandes placas de cultivo de tejido y cultivadas en un medio que contiene 400 \mug/ml de G418. 16 días después, las colonias resistentes a G418 fueron detectadas.

C) Análisis RT-PCR

Las partículas de virus de 5 ml del sobrenadante del medio de cultivo de la cápsula fueron proyectadas en forma de pelotas por ultra centrifugación (240,000xg, 1 hora, 4°C). Las pelotas fueron resuspendidas en buffer lisis (1% Triton 100, 0,5% de desoxicolato de sodio, 0,1% de sulfato de dodecil sodio, PBS) y el RNA extraído por extracción fenólica seguido de la precipitación de etanol, como previamente descrito (Salmons y otros., 1986). El RNA fue entonces transcrito de manera inversa a DNA usando un estuche Ready-To-Go T-primed first-strand (Pharmacia). Una amplificación PCR fue llevada a cabo usando cebadores localizados dentro del env y el R del MLV derivado del LTR vector BAG (Fig. 2A). La amplificación PCR fue llevada a cabo en 100 \mul de mezclas de reacción que consisten de 500 mM KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH8,3) 1,5 mM de MgCl_{2}, 0,01% (peso/volumen) de gelatina y 100 \muM de cada dNTP, 40 pM de cada cebador y 2,5 unidades de polimerasa Taq (Perkin Elmer). Las reacciones fueron llevadas a cabo en un ciclador Perkin Elmer Cetus Therma 9600 bajo las siguientes condiciones: 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 53°C y 3 minutos a 72°C por 35 ciclos. Los productos PCR fueron separados en un gel de agarosa al 0,8% y entonces transferidos a las membranas de prueba Zeta (BIORAD) e hidridizadas, como se describió previamente (Indraccolo y otros., 1995), a un fragmento PCR 612bp marcado ^{32}P del genoma MLV generado usando los mismos cebadores y pBAG como un patrón. Las secuencias específicas MLV fueron visualizadas usando un sistema de fotoimagen Fuji (BAS 1000).

D) Análisis PCR

El DNA genómico (1 \mug) fue amplificado por PCR usando un primer cebador localizado dentro de las secuencias env residuales del vector BAG y un segundo cebador en la región polioma del plásmido fuera de las secuencias del vector retrovírico (Fig.3B). Las reacciones PCR fueron llevadas a cabo como se describió anteriormente usando las siguientes condiciones de reacción: 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 50°C y 3 minutos a 68°C por 35 ciclos. El producto PCR fue hibridizado con fragmento de DNA XbaI de 1,5kB marcado ^{32}P del pBAG que es específico para las secuencias del polioma.

F) Microscopía Electrónica

Las muestras para el examen por microscopía electrónica de exploración (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) fueron enjuagadas en PBS (pH 7,35) y prefijadas en 1% de glutaraldehido en PBS por 15 minutos antes de agregarlas en 2% de OsO_{4} por 15 minutos. Las muestras fueron deshidratadas en una serie escalonada de etanol y luego divididas en dos grupos. a) Las muestras SEM fueron secadas en punto crítico usando CO_{2} y recubiertas con 1-3nM de platino (Emscope SC 500; Ashford, Inglaterra). Las muestras recubiertas fueron examinadas en un microscopio electrónico de exploración de emisión de campo de 10kV (Jeol JSM-6300F; Tokio, Japón), con voltajes de aceleración de 5-10kV en un modo secundario. b) Las muestras TEM fueron embebidas en Epon. Secciones ultra delgadas fueron dos veces teñidas con uranil acetato y citrato de plomo, e inspeccionadas en un microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM-10C (Oberkochen, Alemania).

Resultados

Estudios in vitro de virus liberados de las microcápsulas:

El teñido de las células en las microcápsulas obtenidas en el Ejemplo 2 con el sustrato X-gal como fue descrito en la prueba anterior para la actividad de la \beta-galactosidasa reveló que ellas expresan el gen de la \beta-galactosidasa codificada por pBAG (Fig. 1), como hacen las células no encapsuladas que producen el vector (no mostrado).

Para demostrar que las partículas del virus son liberadas desde las células en las microcápsulas hacia el medio de cultivo, fue preparado RNA de los viriones en forma de pelotas recogidos de los sobrenadantes de la cápsula después de varios períodos de tiempo en cultivo. Este RNA fue analizado por RT-PCR usando cebadores complementarios al env viral y las regiones R como se describió anteriormente bajo el análisis RT-PCR. En el medio de cultivo de la microcápsula fue observado un MLV específico, un PCR generado, un fragmento del tamaño esperado (612bp) por al menos 6 semanas (Fig. 2B, bandas 1-4), en cuyo punto los análisis fueron descontinuados. Este fragmento no es debido al DNA contaminante ya que el pretratamiento del RNA viral con RNasa antes del RT-PCR no dio como resultado ninguna señal (Fig.2C; 1-4).

La producción y liberación de virus infecciosos de las cápsulas podría ser verificado mediante su co-cultivación como se describió bajo la prueba infección anteriormente mencionada con células diana, es decir, células NIH3T3 (Jainchill y otros., 1969) o CRFK (Crandell y otros., 1973). Después de 4 días de co-cultivación, una alícuota de células diana así como células de empaquetamiento encapsuladas fueron teñidas por la actividad de la \beta-galactosidasa como se describió anteriormente. Las células diana remanentes fueron seleccionadas por la resistencia de G418. Muchas de las células NIH3T3 y CRFK co-cultivadas pudieron ser mostradas para expresar el gen \beta-gal
(Fig.3A).

Para confirmar que las células diana han adquirido el gen \beta-gal por infección, las células diana fueron probadas por PCR. La línea celular de empaquetamiento que produce el BAG está basada en la línea celular PA317 (Miller y Buttimore, 1986) y porta el gen cinasa timidina del Virus del Herpes Simplex (HSV-TK), cuyo producto convierte el profármaco ganciclovir en un fármaco citotóxico. Las células diana NIH3T3 o CFRK normalmente no portan este gen. En un experimento donde pudiera ser demostrado que las células diana NIH3T3 y CFRK co-cultivadas que expresan el gen \beta-gal fueron resistentes al GCV indicando que no tuvo lugar el escape de células que producen BAG, el DNA genómico fue extraído de las células diana y analizado para determinar la presencia de secuencias de plásmidos fuera del vector por PCR (Análisis de PCR anterior). Estas secuencias están presentes en las células de empaquetamiento ya que el vector BAG fue lipofectado en estas células en forma del plásmido pBAG. Sin embargo el virus producido a partir de las células de empaquetamiento no porta estas secuencias de plásmidos y por tanto ellas no pueden estar presentes en las células diana infectadas. La Fig. 3B muestra que tales secuencias de plásmidos no fueron detectables, lo que es compatible con la infección de estas células con el vector BAG.

Estructura de las microcápsulas

Fueron preparadas secciones de las microcápsulas y su estructura fue analizada mediante microscopía electrónica. El interior de las cápsulas consiste de una matriz de tipo esponjoso la cual es rellenada con células (Fig. 4). La microscopía electrónica de exploración de la superficie de las microcápsulas revela la presencia de poros que son lo suficientemente grandes para permitir el paso de las partículas del vector retrovírico fuera de las cápsulas ya que la banda blanca representa el diámetro promedio de una partícula del retrovirus (Fig. 4).

Estabilidad in vivo en ratones inmunocompetentes

Para determinar la estabilidad in vivo de las microcápsulas y si las microcápsulas o el virus que ellas producen deduce una respuesta inmune de consideración, las mismas fueron implantadas en la glándula mamaria de dos ratones hembras BALB/c de 2 meses de edad. Los ratones fueron sacrificados un tiempo después de la implantación para valorar tanto el destino de las microcápsulas y si la infección viral fue producida. Las microcápsulas implantadas pueden ser vistas claramente embebidas dentro del cojín de grasa mamario por al menos 6 semanas después de la implantación (Fig. 5A). Intrínsecamente, la vascularización ocurrió en las inmediaciones de las microcápsulas en todos los animales analizados (Fig. 5A), presumiblemente como resultado de la producción de factores de crecimiento o angiogénicos por las células empacadas.

Secciones hechas a través de la microcápsula y alrededor del tejido mamario confirmaron que pueden ser encontrados vasos de sangre en los alrededores inmediatos de las cápsulas (Fig. 5B). Estas secciones también revelaron una capa de tejido conectivo localizado entre la microcápsula y el tejido mamario. No hubo evidencia de una respuesta inmune o inflamatoria de consideración contra las microcápsulas o las células que producen el virus que las mismas contienen.

Con vistas a demostrar que las partículas del vector retrovírico infeccioso han sido liberadas de la cápsula y han infectado los alrededores del tejido mamario, algunas de las secciones fueron analizadas para la expresión de la \beta-gal por el teñido de X-gal. Las células que expresan el gen \beta-gal fueron claramente visibles fuera de la microcápsula (Fig. 5C).

Ejemplo 4

Este ejemplo describe la estructura de un vector de expresión retrovírico para la infección intratumoral el cual contiene el gen para el citocroma de la rata P450 2B1.

El vector de expresión pLX2B1, mostrado en la Figura 6, fue construido ligando los fragmentos obtenidos del plásmido pLX125 y pSW1 (Kedzie y otros., 1991). El plásmido pLX125 fue linealizado con HpaI y los extremos despuntados resultantes fueron defosforilatados usando fosfatasa de intestino de ternero. El DNA fue purificado por separación en un gel de agarosa al 1%, la escisión y preparación se realizó usando el protocolo Qiaquick (Qiagen). Después de la precipitación del etanol el DNA fue resuspendido en agua.

El vector de clonación pSW1 fue digerido con SmaI y HincII para producir dos fragmentos con extremos despuntados. La mezcla de la digestión fue separada en un gel de agarosa al 1%. El fragmento más corto (1,5 kb) que contiene el citrocroma de la rata P450 2B1 cDNA (Fuji-Kuriyama y otros., 1982) fue extirpado y extraído usando el protocolo de extracción DNA Qiaquick, precipitado en etanol y resuspendido en agua.

7,6 fMoles de pLX125 y 24 fMoles de fragmentos de SmaI/HindII de pSW1 fueron mezclados juntos y ligados por 3 días a 12°C usando ligasa-T4 (Boehringer). La ligasa fue inactivada a 65°C por 10 minutos y el DNA precipitado con un volumen de 10 partes de butanol. El DNA precipitado fue resuspendido en agua y electroporado dentro de la bacteria-DH10B (Gibco). Las colonias resistentes a la ampicilina fueron seleccionadas, el DNA fue preparado y la prueba digerida con SspBI/SaII, BamHI/SspBI, PvuI y BamHI. El plásmido correcto final fue designado pLX2B1.

Lipofección

Un día antes de la lipofección 3x10^{5} células de empaquetamiento retrovíricas PA317 (Miller y Buttimore, 1986) fueron sembradas en placas de cultivo o petri de 6 cm. El día de la infección 2 \mug de pLX2B1 fueron mezclados con 100 \mul de un medio libre de suero. Paralelamente 15 \mul de Lipofectamina (Gibco BRL) fue mezclada con 100 \mul de un medio libre de suero. La solución que contiene el plásmido fue adicionada a la mezcla de Lipofectamina e incubada por 45 minutos. Después de 35 minutos las células fueron lavadas una vez con 2 ml de un medio libre de suero. 800 \mul de un medio libre de suero fueron adicionados a la mezcla de la lipofección y el 1 ml resultante fue añadido a las células preparadas. Después de 6 horas 1 ml de un medio Eagle con modificación Dulbecco conteniendo 10% de FCS fue adicionado. Al día siguiente las células fueron tripsinizadas y diluidas 1:10 y sembradas en una placa de 100 mm. Después de 24 horas el medio fue remplazado con un medio que contiene el análogo a la neomicina G418. Los clones de las células simples o poblaciones de células fueron aislados y analizados para la expresión del citocroma P450.

Encapsulación

Las células de empaquetamiento que producen el vector retrovírico obtenidas son encapsuladas como se describió en el ejemplo 2 anterior.

Implantación

Las cápsulas obtenidas son introducidas mediante intervención quirúrgica de "mínimo acceso" cerca o en el propio tumor espontáneo o transplantado de los ratones GR o BALB/c. Alrededor de seis cápsulas de 1 mm de diámetro son insertadas en cada sitio de operación. El sitio de la intervención quirúrgica es cerrado con 1 sutura. Los ratones son luego tratados con ciclofosfamida o ifosfamida localmente, por inyección intratumoral directa de 100 \mul de 20 mg/ml o concentraciones sistémicas de 130 mg de CPA/kg de peso del cuerpo i.p. y 40-60 mg de IFO/kg peso del cuerpo i.p. hasta un máximo de 10 semanas. Durante este período el tamaño del tumor y la apariencia macroscópica es monitoreada diariamente. Los ratones son entonces sacrificados, el tejido que contiene las cápsulas insertadas y el tumor removido, y preparadas las secciones histológicas para la microscopía electrónica y luminosa. Estas secciones muestran claramente buen injerto de las cápsulas, vascularización, y ninguna evidencia de la presencia de linfocitos indicativos de una respuesta inmune celular. Estas secciones tampoco mostraron signos de muerte de las células o necrosis dentro de la cápsula. En contraste el tumor mostró necrosis y macroscópicamente hubo una clara reducción en el tamaño al terminar el período de prueba.

Ejemplo 5

Este ejemplo describe la estructura de una línea celular estable la cual expresa esencialmente el citocroma de la rata P450 2B1.

La expresión del vector pc3/2B1 fue construida ligando los fragmentos obtenidos del plásmido pcDNA3 (Invitrogen) y pSW1 (Kedzie y otros., 1991).

El plásmido pcDNA3 fue digerido con XhoI/XbaI y los fragmentos terminales puntiagudos resultantes fueron defosforilatados usando fosfatasa del intestino del ternero. El DNA de la columna del vector fue purificado mediante separación en un gel de agarosa al 1%, la excisión y preparación se hizo usando el protocolo Qiaquick (Qiagen). Después de la precipitación del etanol el DNA fue resuspendido en agua.

El vector de clonación pSW1 fue digerido con XhoI y XbaI para producir dos fragmentos. La mezcla de la digestión fue separada en un gel de agarosa al 1%. Los fragmentos más cortos (1,5kb) que contienen el citocroma de la rata P450 2B1 cDNA (Fuji-Kuriyama y otros., 1982) fue extirpado y extraído usando el protocolo de extracción del DNA Qiaquick, el etanol precipitado y resuspendido en agua.

8,3 fMoles de la columna del pcDNA3 y 24,8 fMoles del fragmento XhoI/XbaI del pSW1 fueron mezclados juntos y ligados por 1 día a 12°C usando ligasa-T4 (Boehringer). La ligasa fue inactivada a 65°C por 10 minutos y el DNA precipitado con un volumen de 10 partes de butanol. El DNA precipitado fue resuspendido en agua y electroporado dentro de la bacteria-DH10B (Gibco). Las colonias de ampicilina resistentes fueron seleccionadas, el DNA fue preparado y la prueba digerida con EcoRI, BamHI, EcoRV y XhoI. El plásmido correcto final fue designado pc3/2B1.

Lipofección

Antes del día de la infección 3x10^{5} células de NIH3T3 fueron sembradas en placas de 35 mm. El día de la infección 2 \mug de pc3/2B1 fue mezclado con 100 \mul de un medio libre de suero. De manera paralela 15 \mul de Lipofectamina fue mezclada con 100 \mul de un medio libre de suero. El plásmido que contiene la solución fue adicionado a la mezcla de Lipofectamina e incubado por 45 minutos. Después de 35 minutos las células fueron lavadas una vez con 2 ml de un medio libre de suero. 800 \mul de un medio libre de suero fueron adicionados a la mezcla de lipofección y el 1 ml resultante fue añadido a las células preparadas. Después de 6 horas 1 ml de DMEM (Glutamax) con 10% de FCS fueron adicionados. Al día siguiente las células fueron tripsinisadas y diluidas a factor diez y sembradas sobre una placa de 100 mm. Después de 24 horas el medio fue remplazado por un medio de neomicina. Después de 14 días los clones resistentes a la neomicina fueron aislados y probados para determinar la presencia y actividad del vector.

Las cápsulas que contienen estas células fueron producidas como se describió en el Ejemplo 2 e implantadas en los ratones cerca del sitio del tumor. Después del tratamiento con ciclofosfamida o ifosfamida fue evaluada la eficacia del tratamiento como se describió anteriormente.

Las Figuras

La Fig. 1: El teñido histológico de las células PA317 encapsuladas transfectadas de manera estable con pBAG para demostrar expresión \beta-galactosidasa.

La Fig. 2: Análisis RT-PCR de las partículas de los virus liberadas por las cápsulas. (2B; bandas 1-4: medio tomado después de 2, 3, 5 y 6 semanas de cultivo de las cápsulas). El medio de cultivo de las células a partir de las células que producen el virus BAG no encapsulado fue usado como control positivo (banda 5) y el medio de las no transfectadas PA317 fue usado como control negativo (banda 6). No se observaron señales cuando las muestras víricas fueron digeridas con RNasa antes de llevar a cabo el análisis RT-PCR para asegurar que la banda amplificada fuera derivada del RNA viral (2C; bandas 1-4). El RNA viral preparado a partir de las células que producen el virus BAG no encapsuladas, sin el tratamiento con RNasa, fue usado como un control positivo en la reacción RT-PCR (banda 7).

La Fig. 3: La co-cultivación de las células encapsuladas que producen virus con células NIH3T3.

(A) Fueron sembradas células diana a una baja densidad un día antes que las cápsulas que contienen las células empacadas que producen el vector retrovírico fueran adicionadas. Tanto las células como las cápsulas fueron teñidas histológicamente para la actividad de la \beta-galatosidasa varios días después.

(B) Con vistas a verificar que las células diana que expresan a la \beta-galatosidasa en A fueron derivadas de un evento de infección y no debido al escape de las células que producen el virus, el DNA genómico fue extraído de las células y se llevó a cabo el análisis PCR.

La Fig. 4: Microscopía electrónica de exploración mostrando la superficie de la cápsula en la cual las estructuras semejantes a un poro se hacen detectables a una magnificación de alta potencia (x 75000). La banda blanca representa 100 nm (el diámetro de una partícula retrovírica) indicando que estas estructuras pueden representar los poros a través de los cuales el virus es liberado de la cápsula.

La Fig. 5: Análisis histológico de las cápsulas implantadas en la glándula mamaria de un ratón. (A)

(B) Microscopía luminosa de una sección a través de una cápsula después de la implantación en la glándula mamaria del ratón para cuatro semanas (magnificación de 133 partes).

(C) Infección de las células mamarias de ratón después de la implantación de las cápsulas que contienen las células PA317 que producen el vector BAG.

La Fig. 6: Estructura del vector de expresión pLX2B1 que contiene el gen para el citocroma P450 2B1 de la rata el cual será controlado por el promotor U3-MMTV después de la conversión del promotor.

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Claims (31)

1. Una cápsula que encapsula una célula de empaquetamiento retrovírico que produce partículas retrovíricas, dicha cápsula comprendiendo un núcleo que contiene dichas células y una pared de la cápsula porosa que rodea dicho núcleo, dicha pared de la cápsula porosa siendo permeable a dichas partículas retrovíricas producidas por dichas células.

2. La cápsula de acuerdo a la reivindicación 1, donde dicha pared de la cápsula porosa comprende un complejo polielectrolito formado por polieletrolitos con carga opuesta.

3. La cápsula de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 2, donde dicha pared de la cápsula porosa comprende un complejo polielectrolito formado por derivados de polisacáridos o polisacáridos que contienen grupos sulfato o polímeros sintéticos que contienen grupos sulfonato y polímeros con grupos de amonio cuaternario.

4. La cápsula de acuerdo a la reivindicación 3, donde los derivados de polisacáridos o polisacáridos que contienen grupos sulfato son seleccionados del grupo que comprende sulfato de celulosa, sulfato de acetato de celulosa, sulfato de carboximetilcelulosa, sulfato de dextrano o sulfato de almidón, y donde el polímero sintético que contiene grupos sulfonatos es un sulfonato de poliestireno.

5. La cápsula de acuerdo a las reivindicaciones 3 o 4 donde el polímero con grupos de amonio cuaternario es el polidimetildialilamonio o el polivinilbenciltrimetilamonio.

6. La cápsula de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 5, donde la pared de la cápsula porosa comprende un complejo formado por sulfato de celulosa y polidimetildialilamonio.

7. La cápsula de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 6 teniendo la forma de microcápsulas con un diámetro entre 0,01 y 5 mm, preferiblemente entre 0,1 y 1 mm.

8. La cápsula de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 7, donde dicha cápsula comprende una matriz esponjosa que forma el interior de la cápsula rodeada por la pared de la cápsula conteniendo dichos poros, dicha matriz esponjosa siendo rellenada con dichas células.

9. La cápsula de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 8, donde el tamaño de poro de la superficie de la pared de la cápsula porosa está entre 80 y 150 nm, preferiblemente entre 100-120nm.

10. La cápsula de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 9 donde la línea celular de empaquetamiento es transfectada con un vector de expresión, dicho vector de expresión portando una estructura de vector retrovírico capaz de infectar y dirigir la expresión en células diana de una o más secuencias de codificación portadas por dicha estructura del vector retrovírico, dicha línea celular de empaquetamiento hospedando al menos un vector de expresión que porta genes que codifican para las proteínas requeridas para la estructura del vector retrovírico a ser empacado.

11. La cápsula de acuerdo a la reivindicación 10 donde al menos una de dichas secuencias de codificación codifica para los péptidos heterólogos seleccionados de los genes marcadores, genes terapéuticos, genes antivíricos, genes anti-tumor, y genes de citocina.

12. La cápsula de acuerdo a la reivindicación 11 donde dicho gen marcador es seleccionado del grupo que comprende genes marcadores los cuales codifican para las proteínas tales como la \beta-galactosidasa, neomicina, alcohol dehidrogenasa, puromicina, hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT), higromicina y fosfatasa alcalina secretada, y dicho gen terapéutico es seleccionado de los genes los cuales codifican para las proteínas tales como la cinasa timidina del Virus del Herpes Simplex, citosina deaminasa, guanina fosforibosil transferasa (gpt), citocroma P450, genes regulatorios del ciclo de la célula tal como el inhibidor derivado de célula senescente (SDI), genes supresores de tumor los cuales codifican para las proteínas tales como p53, genes antiproliferación los cuales codifican para las proteínas tales como melitina, cecropina, o citoquinas tales como interleucina 2 (IL-2).

13. Un proceso para la preparación de la cápsula de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 12 que comprende suspender las células que producen partículas víricas en una solución acuosa de un polielectrolito, donde la suspensión en forma de partículas preformadas es introducida en una solución de precipitación que contiene una solución acuosa de un polielectrolito de carga opuesta.

14. El proceso de acuerdo a la reivindicación 13 donde la formación de partículas tiene lugar por atomización.

15. El proceso de acuerdo a las reivindicaciones 13 o 14, donde las células son suspendidas en una solución acuosa de un derivado de polisacárido o polisacárido que contiene grupos sulfato, o un polímero sintético que contiene grupos sulfonato.

16. El proceso de acuerdo a la reivindicación 15, donde el derivado de polisacárido o polisacárido que contiene grupos sulfato es seleccionado de sulfato de celulosa, sulfato de acetato de celulosa, sulfato de carboximetilcelulosa, sulfato de dextrano o sulfato de almidón, y el polímero sintético que contiene grupos sulfonato es el sulfonato de poliestireno.

17. El proceso de acuerdo a las reivindicaciones 13 a 16, donde la solución de precipitación contiene una solución acuosa de un polímero con grupos de amonio cuaternario.

18. El proceso de acuerdo a la reivindicación 17 donde el polímero con grupos de amonio cuaternario es el polidimetildialilamonio o el polivinilbencil-trimetilamonio.

19. El proceso de acuerdo a las reivindicaciones 13 o 14, donde las células son suspendidas en una solución acuosa de sulfato de celulosa de sodio, e introducidas en una solución de precipitación que contiene una solución acuosa de cloruro de polidimetildialilamonio.

20. El proceso de acuerdo a la reivindicación 19 donde la solución de sulfato de celulosa acuosa está compuesta de 0,5-50%, preferiblemente de 2-5% de sulfato de celulosa de sodio y de 2-10%, preferiblemente 5% de suero fetal de ternero en un buffer fosfato salino.

21. El proceso de acuerdo a las reivindicaciones 19 o 20, donde la solución acuosa en la solución de precipitación está compuesta de 0,5-50%, preferiblemente de 2-10%, o más preferido 3% de cloruro de polidimetildialilamonio en un buffer fosfato salino.

22. La cápsula de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 12 producida por un proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21.

23. La cápsula de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 12 o 22 para uso en terapia génica y/o en el tratamiento del cáncer o cualquier otro desorden o enfermedad relevante.

24. La cápsula de acuerdo a la reivindicación 23 para la transferencia de genes a órganos/ células diana, donde las células encapsuladas son inyectadas y/o implantadas en dichas células/ órganos diana y/o cercanas a dichas células/ órganos diana.

25. La cápsula de acuerdo a la reivindicación 24 donde dichas células/ órganos diana son tejidos cancerosos.

26. La cápsula de acuerdo a las reivindicaciones 24 o 25, donde las células/ órganos diana son la glándula mamaria, el páncreas, o células del músculo liso que rodea las arterias.

27. Uso de la cápsula de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes de la 1 a 12 o 22 para la preparación de una composición farmacéutica.

28. Una composición farmacéutica que comprende la cápsula de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes de la 1 a 12 o 22.

29. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 28 en una forma adecuada para una inyección y/o una implante en las células/ órganos diana y/o cercano a dichas células/ órganos diana.

30. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 29, donde dichas células/ órganos diana son el tejido canceroso.

31. La composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 29 o 30, donde las células/ órganos diana son la glándula mamaria, el páncreas, o las células del músculo liso que rodea las arterias.