KR20120123225A - 피막된 이식세포 분리방법 - Google Patents

피막된 이식세포 분리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피막된 이식세포 분리방법에 관한 것이다. 구체적으로, 이식세포를 생체적합 고분자로 피막하고, 이를 밀도구배형성물질과 혼합한 후, 원심분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 피막된 이식세포 분리방법은 종래 수작업으로 피막화되지 않은 이식세포를 분리하는 방법에 비해 작업성 및 경제성이 뛰어나고, 효율이 현저히 높은 장점이 있다.

Description

피막된 이식세포 분리방법 {Separation Process of Encapsulated Transplantable Cells}
본 발명은 피막된 이식세포 분리방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 피막된 이식세포 분리방법은 이식세포를 생체적합 고분자로 피막하고, 이를 밀도구배형성물질과 혼합한 후, 원심분리하여 층 분리하는 단계를 포함한다.
당뇨 (Diabetes Melitus)는 자가면역반응에 의해 인슐린을 분비하는 췌도 세포가 파괴되거나 기능 저하가 되면서 혈당 조절에 실패하여 다양한 합병증을 유발할 수 있는 질병으로, 유병율이 전 세계적으로 크게 증가하고 있다. 특히 소아당뇨로 불리는 제 1 형 당뇨는 체내의 인슐린 분비 기능이 완전히 상실되어 현재는 인슐린 주사를 이용한 방법으로 혈당을 조절하는 실정이다. 그러나 인슐린 주사로 인해 환자의 삶의 질이 감소하고, 저혈당 발생 위험이 있으며, 인슐린 치료만으로는 합병증을 근본적으로 예방하지 못한다.
이에 기존 방식을 대체할 치료 방법으로 췌장 혹은 췌도의 이식이 대두되고 있다. 특히, 췌장은 그 부피가 크고 실제 인슐린 분비 기능을 하는 췌도는 질량비로 전체 췌장 대비 1 내지 2 % 만을 차지하고 있어 효용성이 크지 않아 췌도 이식에 대한 연구가 진행되고 있으며, Edmonton Protocol과 같은 이식 방식에 제안되어 오고 있다. 그러나 동종 췌장 및 췌도 이식은 생체 공여가 어렵기 때문에 뇌사자의 기증에 의존해야 하므로 실질적인 췌장 및 췌도의 원활한 공급을 기대하기 어렵다. 이에 따라, 성체 돼지 등의 이종 포유류의 췌도를 이용한 이종 이식이 대안으로 떠 오르고 있다.
이러한 췌도 이식을 포함한 이종 장기이식의 가장 큰 문제점은 이식 후의 면역 거부반응이다. 기존 연구에서도 이종 뿐 아니라 동종 장기이식을 한 후에도 면역억제제의 투여가 필수적이다. 면역억제제는 환자의 정상적인 타 기관을 손상시킬 가능성이 있으므로 면역억제제를 최소한으로 투여하거나 투여하지 않아도 장기 이식을 성공시킬 수 있는 기술이 필요하다. 특히, 췌도 이식을 연구하는 부분에서는 췌도의 주변에 방어벽을 만들어 항체 및 면역 세포의 공격을 억제할 수 있는 피막화 기술이 제안되었다. 이 방어벽은 면역반응 억제 기능과 함께 인슐린 및 영양 물질이 자유롭게 출입되어야 하므로, 선택적 투과성을 가지는 생체적합성 고분자가 널리 사용되고 있다.
췌도를 피막화하는 방식은 그 크기에 따라 미세피막화(micro-encapsulation)와 거대피막화(macro-encapsulation)로 나누어진다. 미세피막화는 하나의 피막에 1 내지 4 개의 췌도를 포함하는 구형의 캡슐을 만드는 것으로, 그 지름은 일반적으로 200 내지 1000 ㎛ 사이가 된다. 반면, 거대피막화는 특수하게 제작된 구조체에 수만개 내지 수십만개의 췌도를 삽입하는 방식을 사용한다. 이러한 크기의 차이 때문에 미세피막은 피막화 과정이 간단하고, 거대피막에 비해 확산 속도가 빠르며, 피막의 효율에 영향을 미치는 요소들을 조절하기 쉽고, Edmonton protocol과 같은 이식 방식을 사용하면 이식 수술을 최소화하여 환자의 위험을 최소화할 수 있다는 장점을 가진다.
미세피막화에 사용되는 생체적합 고분자는 알긴산, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 아가로스 등이 많이 사용된다. 특히, 알긴산은 해조류에서 얻을 수 있는 생체적합 고분자로 생체적합성을 가지며 생리학적 조건에서도 고형화가 가능하고 특유의 유연성 때문에 주변의 조직이나 기관에 큰 영향을 미치지 않아 유용하게 사용되고 있다. 국내에서는 알긴산을 이용하여 미세피막화를 시도한 후 피막화 췌도가 초기의 췌도 기능 상실을 방지하는 것으로 확인되었으며 이를 쥐와 돼지에게 이식한 후 일주일이 경과한 시점에서 췌도 생존율이 90% 이상 되는 것으로 나타나, 알긴산을 이용한 미세피막화 기술이 이식 후 면역 억제 기능을 발현함을 알 수 있다.
한국등록특허 제 1096902 호는 당뇨병 치료용 알기네이트-키토산 이중막의 췌도 미세캡슐 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 췌도 미세캡슐은 이종 췌도를 알긴산 나트륨으로 캡슐화한 후 외막을 항염증 작용을 갖는 키토산으로 코팅하여 면역장벽을 형성함으로써, 알긴산 나트륨에 의해 발생되는 염증성 면역세포들의 침착을 억제하여 이종이식에서 나타나는 면역거부 반응으로부터 이종 췌도세포를 보호할 수 있다.
이처럼 알긴산을 이용하여 췌도를 미세피막화하기 위해서는 나트륨 알긴산 용액에 췌도를 섞은 후 방울 형태로 칼슘 이온 농도가 높은 용액에 떨어뜨려 수 초 내지 수 분 내에 고형화하는 방식을 이용한다. 용액 방울의 크기를 조절하기 위하여 공기압축 방식과 정전기 방식이 많이 사용된다. 그러나 위의 방식으로 미세피막화를 실제로 시도를 하면 췌도가 포함되어 있는 피막도 생성이 되지만 피막 내에 췌도가 들어가지 않은, 췌도미포함 알긴산 피막도 함께 생성이 된다. 이 양은 전체 생성된 피막에서 상당한 비율을 차지하며, 췌도미포함 피막을 제거하지 않으면 췌도 이식 시에 이식 부피가 늘어나고 부피가 커질수록 이식 위치에 제한을 받게 된다.
그러나 현재까지 보고된 알긴산을 이용한 췌도의 미세피막화 결과에서는 췌도미포함 피막의 제거에 대해 거의 언급이 없으며, 일부 보고에서 숙련된 인력을 필요로 하는 'Hand-picking' 방식이 언급되었다. 인력을 필요로 하는 이와 같은 방식은 앞으로 췌도 미세피막화 기술을 상업화하는 데에 제약이 될 것이므로, 인력을 들이지 않고 손쉽게 불필요한 피막 생성물들을 제거할 수 있는 기술이 필요하다. 이러한 분리기술은 나아가 다른 이식세포의 피막화 및 그 분리에도 필수적이다.
한국등록특허 제 1096902 호 (2009.01.15 출원)
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 피막화가 이루어지지 않은 피막들로부터 피막이 이루어진 이식세포만 분리하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 피막된 이식세포 분리방법은 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여,
(A) 이식세포를 생체적합 고분자로 피막하는 단계,
(B) 상기 피막된 이식세포를 밀도구배형성물질과 혼합하는 단계,
(C) 상기 혼합물을 원심분리하는 단계, 및
(D) 상기 피막된 이식세포가 분포한 층을 분리하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 이식세포는 췌도세포일 수 있다.
또한, 상기 밀도구배형성물질은 당과 에피클로로히드린의 중합체, 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드 실리카, 수크로스, 염화세슘, 황산세슘, 브롬화세슘, 염화나트륨, 글리세롤, 브롬화에틸렌, 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것, 특히 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드 실리카 및 수크로스의 혼합물, 또는 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드 실리카 및 염화나트륨의 혼합물인 것이 바람직하다.
또한, 상기 원심분리의 속도는 50 내지 3000 xg인 것이 바람직하다.
또한, 상기 원심분리의 시간은 2 분 내지 3 시간인 것이 바람직하다.
또한, 상기 단계 (A)는,
(A-1) 이식세포를 생체적합 고분자 용액에 첨가하는 단계, 및
(A-2) 상기 이식세포가 첨가된 생체적합 고분자 용액을 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염 수용액에 적가하여 상기 생체적합 고분자를 가교결합시키는 단계
를 포함할 수 있다.
또한, 상기 생체적합 고분자는 알긴산, 아가로스 또는 폴리에틸렌글리콜일 수 있다.
본 발명의 피막된 이식세포 분리방법은 종래 수작업으로 피막화되지 않은 이식세포를 분리하는 방법에 비해 작업성 및 경제성이 뛰어나고, 짧은 시간 내 분리가 완료되어 오염의 위험이 적을 뿐만 아니라, 효율 역시 현저히 높으면서도 세포의 생존능에서는 수작업에 뒤지지 않아 다양한 분야에 응용 가능한 장점이 있다.
도 1은 밀도가 상이한 입자에 대해 원심분리의 진행에 따른 침강정도를 도시한 개념도이다.
도 2는 췌도를 포함한 피막과 포함하지 않은 피막의 분리 현상을 도시한 개념도이다.
도 3은 피막화하지 않은 췌도와 미세피막을 씌운 췌도를 비교 촬영한 사진이다.
도 4는 원심분리 후 원심분리 튜브의 개념도와 실제 크기 별로 분리된 모습을 촬영한 사진이다.
도 5는 수크로스 대신 염화나트륨으로 삼투압을 조절했을 때 밀도 변화에 따른 실제 침강상황을 촬영한 사진이다.
도 6은 본 발명의 분리방법과 종래 수작업에 의해 분리한 방법 사이의 췌도 생존능을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들이 설명되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 피막된 이식세포 분리방법은 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여, 췌도를 포함하지 않은 피막과의 밀도 차이를 이용하였다. 이 아이디어는 췌도세포와 고형 알긴산의 밀도가 다르다는 것을 전제로 한다. 또한, 밀도차이를 이용하여 분리한 후, 우리가 원하는 층을 수거하기 위한 충분한 시간을 얻기 위해 일반적인 수용액이 아닌 밀도 및 농도구배를 제공할 수 있는 용액을 이용하여 층분리를 한다. 본 실험에서 사용할 수 있는 층분리 용액은 피콜(Ficoll®)과 퍼콜(Percoll®)을 포함한 밀도 및 농도구배를 구성하는 모든 용액이 가능하다. 밀도 차이를 이용한 분리는 기본적으로 수학식 1의 Stoke의 법칙을 따른다.
Figure pat00001
위의 법칙에 따르면, 입자의 밀도가 용액보다 작을 경우 속도 값이 음수가 나오면서, 어떠한 경우에도 가라앉지 않는다. 반면, 입자 밀도가 상대적으로 큰 경우에는 밀도차의 크기에 따라 속도가 다양하게 나타날 수 있는데, 만일 액체와 입자의 밀도차가 크지 않다면 입자가 가라앉는 모습을 관찰할 수 있을 것이다.
췌도 포함 및 미포함 피막의 크기가 비슷하므로, 침강속도는 밀도의 차에 의해서만 변화를 받는다. 즉, 췌도의 밀도가 고형알긴산보다 크다면 적절한 조건에서 도 1과 같은 층분리를 발견할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 피막된 이식세포 분리방법은 이식세포를 생체적합 고분자로 피막하는 단계로부터 시작된다. 상기 이식세포는 생체에 이식할 수 있는 세포라면 제한이 없으며, 특히 인슐린 생성을 위한 췌도세포 역시 그 필요성이 큰 이식세포이다.
그리고, 상기 이식세포를 피막하는 생체적합 고분자는 일반적으로 효소나 세포 등을 고정화시킬 수 있는 고분자라면 제한이 없으며, 예컨대 알긴산, 아가로스 또는 폴리에틸렌글리콜, 특히 알긴산이 바람직하다.
상기 알긴산을 예로 들어 이식세포를 피막화하는 구체적인 과정을 설명하면 먼저, 이식세포를 생체적합 고분자 즉 알긴산 용액에 첨가하고, 상기 이식세포가 첨가된 생체적합 고분자 용액을 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염 수용액, 예컨대 염화칼슘 또는 염화바륨 수용액에 적가하여 상기 생체적합 고분자를 가교결합시켜 피막화췌도를 제조한다.
이렇게 피막화된 췌도는 췌도를 포함하지 않은 피막과의 분리를 위해 밀도구배형성물질과 혼합하는 단계를 밟게 된다. 이처럼 일반 수용액이 아닌 밀도구배형성물질을 사용하는 이유는, 전술한 바와 같이 밀도차이를 이용하여 분리한 후 원하는 층을 분리하기 위한 충분한 시간을 얻기 위해서이다.
이러한 목적 달성을 위해 사용할 수 있는 밀도구배형성물질로는 피콜(Ficoll®)과 퍼콜(Percoll®)을 포함한 밀도 및 농도구배를 구성하는 모든 용액이 가능하나, 당과 에피클로로히드린의 중합체, 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드 실리카, 수크로스, 염화세슘, 황산세슘, 브롬화세슘, 염화나트륨, 글리세롤, 브롬화에틸렌, 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것, 특히 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드 실리카 및 수크로스의 혼합물, 또는 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드 실리카 및 염화나트륨의 혼합물인 것이 더욱 바람직하다.
이처럼 밀도구배형성물질과 혼합된 피막화췌도들은 그 다음 원심분리하게 되는데, 이때 원심분리의 속도는 50 내지 3000 xg이고, 원심분리의 시간은 2 분 내지 3 시간인 것이 바람직하다. 상기 속도 및 시간 범위 미만이면 충분한 분리가 이루어지지 않고, 상기 범위를 초과하면 췌도세포에 손상이 가해질 수 있다.
이렇게 원심분리가 정해진 시간만큼 수행되면 상기 원심분리 튜브에서 상기 피막된 이식세포가 분포한 층만 분리해 냄으로써 본 발명의 전 과정이 달성된다.
이하, 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다.
실시예
제조예 : 췌도 배양
1 내지 3 일령의 신생돼지로부터 췌도를 공급받았다. 췌도 분리방법은 기존의 방법을 따랐으며, 간단한 과정은 다음과 같다. 신생돼지의 근육 내부로 1.0 mg/kg의 아자페론 (azaperon. Stresnil, Janssen, Bruxxelles, Belgium)과 125 mg/kg의 틸레트아민 하이드로클로라이드 (tiletamine hydrochloride), 졸라제팜 하이드로클로라이드 (zolazepam hydrochloride. zoletil, Virbac, Carros, France)를 차례대로 주사하였다. 모든 신생돼지는 췌도를 노출시키기 위하여 정중절개법으로 개복하였다. 췌도는 유문, 십이지장, 동맥에서부터 조심스럽게 분리되었다. 박테리아 감염을 방지하기 위해 췌도는 각각 분리되었다. 분리된 췌도는 약 2 mm³의 작은 조각으로 잘렸으며 HBSS (Hank's balanced salt solution) 완충액으로 세척되었다. 그 후 2.5 mg/ml의 콜라게나제(collagenase) V (Roche Diagnostics, S.p.A., Italy)를 이용하여 37 ℃에서 7 내지 10 분간 우유빛이 날 때까지 콜라겐을 분해하였다. 이를 2 분간 20 xg에서 원심분리 후 100 U/ml의 페니실린, 0.1 g의 스트렙토마이신 (streptomycin. Invitrogen, Carsbad, USA), 0.25 %의 BSA (bovine serum albumin), 12.5 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)가 포함된 HBSS로 두 차례 세척하였다. 최종적으로 이 기관은 0.5% BSA, 50 mM IBMX, 10 mM 니코틴아미드, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 0.1 mg/mL 스트렙토마이신이 포함된 Hams F10 배지에 다시 흩어놓았고 100 X 15 mm의 페트리 디쉬에서 배양하였다. 배양액은 48 시간마다 교환되었다.
실시예 1 : 고농도 염화칼슘
In vitro에서 배양된 췌도는 원심분리기를 이용해 수거하였으며 피막화를 위하여 2 % (w/v) 나트륨 알긴산 (Pronova UP LVG, NovaMatrix, Sandvika, Norway)을 녹인 식염수에 흩어 놓았다. 이 용액은 췌도가 균일하게 분포할 수 있도록 조심스럽게 피펫팅을 수 차례 진행하였고, 이 과정에서 발생된 공기를 제거하기 위하여 원심분리기를 이용하였다. 이 용액은 주사기 펌프 (KDS100, KD Scientific Inc., Holliston, USA)를 이용하여 135 ml/hr의 유속을 가지고 피막화장치 (J30 encapsulator, Nisco Engineering AG, Zurich, Switzerland)에 투입되었으며, 공기 압력은 0.09 내지 0.10 psi로 조절되었다. 이 때에 사용한 노즐은 500 um의 구멍이 있는 노즐을 사용하였다. 췌도를 포함한 알긴산 방울은 110 mM의 CaCl2 용액에서 5 분간 고형화 반응을 진행하였으며 이후에 식염수로 두 차례 세척하였다.
밀도구배 용액으로는 Percoll®(Sigma)이 사용되었다. 시약판매 회사에서 제공하는 정보에 따라 수크로스 용액과 적절한 비율로 섞어 원하는 밀도의 Percoll® 용액을 제조하였으며, 삼투압을 적절히 조절한 후에 실제 밀도를 측정하기 위하여 휴대용 밀도계 (DA-130N, KEM, Japan)를 이용해 밀도를 한번 더 확인하였다. 1.03 내지 1.10 사이의 다른 밀도는 미리 제작된 용액들을 일정 비율로 섞어서 사용하였다.
Figure pat00002
Vo [ml] : 요구되는 Percoll®의 부피
V [ml] : 최종 작업용액의 부피
d : 최종 작업용액의 희망 밀도
do : 최종 작업용액의 희망 밀도
d10 : 1.5 M NaCl (1.058) 또는 2.5 M 수크로스 (1.316)의 밀도
(100 ml 제조 기준)
희망 밀도
(g/ml)		 Percoll 원액
(ml)		 2.5 M 수크로스
(ml)		 증류수
(ml)		 삼투압
(mosmol/l)		 측정된 실제 밀도
(g/ml)
1.03 0.0 10.0 90.0 284 1.0274
1.08 37.2 10.0 52.8 290 1.0754
1.10 52.6 10.0 37.4 284 1.0925
실험에 사용한 췌도는 1 내지 3 일령의 신생돼지에서 분리한 후 배양한지 약 12 일된 췌도를 사용하였다. 췌도의 밀도를 측정하기 위하여 다양한 밀도의 Percoll® 용액을 준비하였다. 각 용액은 15 ml의 튜브에 10 ml씩 담겨졌으며, 췌도가 포함된 배지 1 ml를 Percoll® 용액과 섞이지 않도록 조심하여 Percoll® 용액 위층에 투입하였다. 총 11 ml의 부피를 가지는 튜브를 88 xg 에서 30 분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 췌도의 위치 및 Percoll® 용액 내에서의 상태를 아래 표 2에 표시하였다. 아래 표에 따라, 배양한지 12 일된 췌도의 밀도는 약 1.06 내지 1.066임을 알 수 있었다.
혼합비 실제 밀도 (g/ml) 침강정도
Percoll 1.10 (ml) 수크로스 (ml)
0 10 1.027 침전
1 9 1.034 침전
2 8 1.040 침전
3 7 1.047 침전
4 6 1.053 산포, 아래쪽에 위치
5 5 1.060 산포, 위쪽에 위치
6 4 1.066 부유
7 3 1.073 부유
8 2 1.079 부유
9 1 1.086 부유
10 0 1.093 부유
평균 200 ㎛의 지름을 가지는 알긴산 피막을 제작한 후, 3.3 mM의 CaCl2가 섞인 식염수에 약 4 시간 동안 배양하여 캡슐의 안정화시간을 가졌다. 총 12 ml의 다양한 농도의 Percoll® 용액을 제작하고, 캡슐이 포함된 식염수를 1.2 ml 씩 섞이지 않도록 조심하여 Percoll® 용액 위층에 투입하였다. 원심분리 방법은 췌도 실험과 동일하게 진행하였다. 실험 결과, 캡슐의 밀도는 1.04 내지 1.045로 예측되었다.
혼합비 실제 밀도 (g/ml)
 침강정도
Percoll 1.08 (ml) 수크로스 (ml)
0 12 1.029 침전
1 11 1.033 침전
2 10 1.037 산포
3 9 1.041 산포
4 8 1.045 부유
6 6 1.052 부유
9 3 1.064 부유
12 0 1.075 부유
위의 실험 결과, 알긴산 피막과 췌도는 크기는 비슷한 반면, 그 밀도는 차이가 있음을 발견하였다. 즉, Stoke의 법칙에 따라, 같은 용액에서 같은 크기의 중력을 가한다면 침강 속도에 차이를 보여, 이 방식에 따라 췌도미포함 피막과 췌도는 분리됨을 확인할 수 있다. 특히, 췌도포함피막은 전체 부피에서 알긴산피막이 차지하는 부피가 매우 작아 밀도는 췌도보다 작으나 췌도와 비슷한 밀도를 가진다.
실시예 2 : 저농도 염화칼슘
분리를 수월하게 하기 위해서는 밀도의 차가 클수록 좋으므로, 피막을 제작한 후 피막의 안정화를 위해 3.3 mM의 CaCl2가 포함된 식염수를 사용한 실시예 1 대신, 칼슘이온의 농도가 낮은 용액을 사용함으로써 알긴산 피막의 밀도를 추가적으로 감소시키고, 피막화 췌도와의 밀도차이를 크게 하여 췌도미포함 피막의 분리가 용이해지는지 확인하였다. 배양액은 식염수를 사용하였으며, 식염수에 추가하는 염화칼슘의 농도를 0에서부터 3.3 mM까지 변화시키면서 배양 24 시간 후의 밀도를 측정하였다. 측정 방법은 실시예 1과 동일한 방법으로, 다양한 밀도의 Percoll® 용액을 준비하고 가라앉을 때와 가라앉지 않을 때의 조건을 찾아, 가라앉기 시작할 때의 밀도를 캡슐의 기준으로 잡았다. 24 시간 배양 후, 알긴산피막을 500 xg에서 60 분간 원심분리하여 각 밀도에서의 피막의 위치를 확인하였다. 그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 배양할 때의 염화칼슘의 농도가 낮아질수록 알긴산피막의 밀도가 감소하였다. 이 결과를 토대로 이후의 실험에서는 피막화 췌도를 낮은 농도의 칼슘 이온을 포함한 배양용액에서 배양한 후에 밀도분리를 하였다.
Percoll®의 밀도
(g/ml)		 염수에 첨가된 염화칼슘의 농도 (mM)
0 0.55 1.1 2.2 3.3
1.052 부유 부유 부유 부유 부유
1.049 부유 부유 부유 부유 부유
1.047 부유 부유 부유 부유 부유
1.044 부유 부유 부유 부유 산포
1.040 부유 부유 부유 산포 산포
1.037 부유 부유 산포 산포 산포
1.034 부유 산포 산포 산포 침전
캡슐의 밀도 (g/ml) < 1.034 1.034 1.037 1.040 1.044
미세피막화된 신생췌도와 췌도미포함 피막을 분리하기 위하여 피막화 결과물을 24 시간 배양하였다. 배양용액 내의 칼슘 농도가 1.8 mM이므로, Percoll® 용액의 밀도를 1.035 내지 1.040 g/ml로 변화시켰다. 결과적으로 Percoll®의 밀도가 1.0387 g/ml이고, 원심분리 속도가 2500 xg, 90 분일 때에 도 4와 같이 췌도미포함 피막과 피막화췌도가 분리가 되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 각 층 별로 회수를 하였을 때에 췌도의 크기에 따라서도 분리가 되는 것을 확인하였다.
실시예 3 : 염화나트륨으로 삼투압 조절
실시예 2의 원심분리 조건은 속도가 매우 빠르고 시간이 길기 때문에 췌도의 생존능을 감소시킬 가능성이 있다. 이 때문에 좀 더 낮은 밀도에서 분리시간을 줄이는 방법을 선택하였다. 앞의 용액들보다 낮은 밀도의 용액을 만들기 위하여 삼투압 조절 용액을 수크로스 대신 염화나트륨 용액을 사용하였으며, 여기에 칼슘 이온의 농도가 1.8 mM이 되도록 염화칼슘을 추가하였다. 밀도는 1.005 내지 1.035 g/ml로 조절하며 췌도미포함 피막 분리를 수행하였다. 원심분리의 속도는 200 xg로 고정하였는데, 이 속도는 피막화하지 않은 췌도를 수거할 때에도 사용되는 속도로, 세포에 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있기 때문이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 밀도가 1.011 g/ml일 때에는 5 분간 원심분리하였을 때 피막화췌도와 알긴산 캡슐이 모두 가라앉았다. 그러나 피막화췌도 층과 알긴산 층은 완벽히 분리되어 있었다. 밀도가 1.017, 1.022, 1.034 g/ml로 높아질수록 가라앉는 피막화췌도의 양이 줄어들고 용액에 남아있는 췌도의 양이 늘어났다. 결과적으로, 밀도가 1.017 g/ml이고, 200 xg에서 5 분간 원심분리하였을 때 피막화췌도는 용액에 남아있지 않고 완벽히 분리되었으며, 현미경으로 확인한 결과 췌도미포함 피막의 비율이 전체 피막의 10% 이하로 나타났다.
시험예 : 생존능 평가
Percoll®을 이용하여 밀도 분리한 피막화췌도와 마이크로피펫을 이용하여 현미경으로 관찰하며 췌도를 고르는 Hand-picking 방식으로 수거한 피막화췌도의 생존능을 비교하였다. 생존능 측정을 위하여 CCK-8 kit을 이용하였다. 각 그룹 당 100 개씩의 피막화췌도를 고른 후에 CCK 평가를 하였다. 도 6에 도시한 바와 같이, Hand-picking을 하였을 때와 Percoll®을 이용하여 췌도미포함 피막을 제거하였을 때에 생존능에 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 특허청구범위 뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims (7)

  1. (A) 이식세포를 생체적합 고분자로 피막하는 단계,
    (B) 상기 피막된 이식세포를 밀도구배형성물질과 혼합하는 단계,
    (C) 상기 혼합물을 원심분리하는 단계, 및
    (D) 상기 피막된 이식세포가 분포한 층을 분리하는 단계
    를 포함하는 피막된 이식세포 분리방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 이식세포는 췌도세포인 것을 특징으로 하는 피막된 이식세포 분리방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 밀도구배형성물질은 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드 실리카와 수크로스 또는 염화나트륨의 혼합물인 것을 특징으로 하는 피막된 이식세포 분리방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 원심분리의 속도는 50 내지 3000 xg인 것을 특징으로 하는 피막된 이식세포 분리방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 원심분리의 시간은 2 분 내지 3 시간인 것을 특징으로 하는 피막된 이식세포 분리방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 (A)는,
    (A-1) 이식세포를 생체적합 고분자 용액에 첨가하는 단계, 및
    (A-2) 상기 이식세포가 첨가된 생체적합 고분자 용액을 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염 수용액에 적가하여 상기 생체적합 고분자를 가교결합시키는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 피막된 이식세포 분리방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 생체적합 고분자는 알긴산, 아가로스 또는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 피막된 이식세포 분리방법.

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