CN116064950A - 一种用于检测猴痘病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统 - Google Patents

一种用于检测猴痘病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测猴痘病毒的crRNA靶点及CRISPR‑Cas13a系统。所述CRISPR‑Cas13a系统包括Cas13a蛋白和crRNA，或二者形成的复合体；所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向猴痘病毒靶点序列的向导序列；所述猴痘病毒靶点序列位于猴痘病毒基因组第46242‑46703位。通过实验证明：本发明的crRNA可通过激活Cas13a实现对猴痘病毒核酸的高灵敏、高特异检测，灵敏度达到十拷贝(10copy/μL)。

Description

一种用于检测猴痘病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，涉及一种用于检测猴痘病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统。
背景技术
猴痘是动物传播的一种以皮肤出疹为特征的热性病毒性疾病，通过直接密切接触，可由动物传染给人，并可在人与人之间传染，属人畜共患传染病。猴痘病毒检测方法有血清学方法，但猴痘病毒与痘病毒之间存在抗原交叉，特异性不够，不能准确检测猴痘病毒，此外还有病原分离方法，但检测周期太长，且猴痘病毒被分类为生物安全Ⅲ级生物因子，对实验室生物安全要求极高。因此，两种方法在实际应用中存在一定的局限性。利用PCR方法对猴痘病毒核酸进行检测，灵敏度高，快速仅需几小时即可得到结果，国外也已有相关报导，但国内就此方面的报道还为数不多。目前主要检测技术为荧光定量PCR法，该方法稳定、可靠、具有一定的灵敏度，但样本处理复杂，且对仪器要求高。
2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)，特异性达到单碱基的核酸检测技术——基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK(Specific HighSensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)，利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白(LwCas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于检测猴痘病毒的CRISPR-Cas13a系统。
本发明提供的用于检测猴痘病毒的CRISPR-Cas13a系统包括Cas13a蛋白和crRNA，或二者形成的复合体；
所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向猴痘病毒靶点序列的向导序列；
所述猴痘病毒的靶点序列位于猴痘病毒基因组(GeneID:9289998)第46456-46483位。
上述CRISPR-Cas13a系统中，所述猴痘病毒靶点序列为序列1。
上述CRISPR-Cas13a系统中，所述crRNA序列为序列2。其中，序列2第1-38位为用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列；序列2第39-66位为靶向猴痘病毒靶点序列的向导序列。
上述CRISPR-Cas13a系统中，所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测猴痘病毒的试剂盒。
本发明提供的用于检测猴痘病毒的试剂盒包括上述用于检测猴痘病毒的CRISPR-Cas13a系统。
进一步的，所述试剂盒还包括用于特异性扩增猴痘病毒靶点序列的引物对；所述引物对由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。
更进一步的，所述试剂盒还包括用于特异性扩增猴痘病毒靶点序列的其他试剂和用于检测扩增产物的其他试剂。所述用于特异性扩增猴痘病毒靶点序列的其他试剂包括缓冲液和/或ddH2O；所述用于检测扩增产物的其他试剂包括如下试剂中的全部或部分：LwCas13a蛋白、NTP(如NTP Mix)、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、报告RNA(具有信号报告功能的荧光报告RNA或用于试纸检测的报告RNA)、RNase free water。
所述试剂盒还可包括记载有如下判定标准甲或判定标准乙的载体：
CRISPR-Cas13a荧光检测体系的判定标准甲：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照(ddH2O)荧光强度值高3倍以上(包括待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍的情况)，或任何时候待测样本检测体系的荧光强度值大于或等于0.2a.u.，则待测样本含有或候选含有猴痘病毒，否则待测样本不含有或候选不含有猴痘病毒。
CRISPR-Cas13a试纸体系判定标准乙：测反应后体系滴在试纸上后2-5分钟进行判读，若试纸没有“T”线显现且有“C”线显现，则待测样本含有或候选含有猴痘病毒；若试纸有“T”线显现且有“C”线显现，则待测样本不含有或候选不含有猴痘病毒；若试纸没有“C”线显现，则试纸失效，需更换试纸重新实验。
本发明的第三个目的是提供如下任一物质：
A1)上述crRNA；
A2)上述Cas13a蛋白和crRNA，或者二者形成的复合体；
A3)上述引物对。
本发明的第三个目的是提供如下任一应用：
B1)上述系统或上述试剂盒或上述物质在检测或辅助检测猴痘病毒中的应用；
B2)上述系统或上述试剂盒或上述物质在制备检测或辅助检测猴痘病毒的产品中的应用；
B3)上述系统或上述试剂盒或上述物质在检测或辅助检测待测样本中是否含有猴痘病毒中的应用；
B4)上述系统或上述试剂盒或上述物质在制备检测或辅助检测待测样本中是否含有猴痘病毒的产品中的应用；
B5)上述系统或上述试剂盒或上述物质在筛选或辅助筛选猴痘病毒防治药物中的应用；
B6)上述系统或上述试剂盒或上述物质在制备筛选或辅助筛选猴痘病毒防治药物的产品中的应用；
B7)上述物质在制备上述试剂盒中的应用。
本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测猴痘病毒的方法。
本发明提供的检测或辅助检测猴痘病毒的方法包括如下步骤：
C1)以待测样本的核酸为模板，采用由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成的引物对进行RAA扩增，得到RAA产物；
C2)配制含有如下组分的CRISPR-Cas13a检测体系：所述RAA产物、Cas13a蛋白、上述crRNA、报告RNA、NTP、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂；同时以水(ddH2O)替代所述PCR产物作为阴性对照；反应；
C3)将所述CRISPR-Cas13a检测体系反应，检测反应产物，从而判断待测样本是否含有猴痘病毒。
上述反应为荧光体系反应C3)-1或试纸条体系反应C3)-2：
C3)-1：所述CRISPR-Cas13a检测体系，且CRISPR-Cas13a检测体系中的RNA为荧光报告RNA，将该CRISPR-Cas13a检测体系放入荧光定量PCR仪中反应，检测荧光强度，根据荧光强度的大小判定所述待测样本中是否含有猴痘病毒：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照(ddH2O)荧光强度值高3倍以上(包括待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍的情况)，或任何时候待测样本检测体系的荧光强度值大于或等于0.2a.u.，则待测样本含有或候选含有猴痘病毒，否则待测样本不含有或候选不含有猴痘病毒；
C3)-2：所述CRISPR-Cas13a检测体系进行反应，且CRISPR-Cas13a检测体系中的RNA为试纸检测的报告RNA，用试纸检测反应产物，根据“T”线是否消失且“C”线显现判定所述待测样本中是否含有猴痘病毒：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的“T”线消失且“C”线显现，则待测样本含有或候选含有猴痘病毒，否则待测样本不含有或候选不含有猴痘病毒。
进一步的，步骤C1)中，所述RAA扩增的反应条件为：39℃反应20-40分钟；
上文中步骤C3)-1中，所述反应的条件为：37℃，每2min读取一次荧光强度值，读取40次。
上文中步骤C3)-2中，所述反应的条件为：37℃，反应30min。
更进一步的，所述待测样本可为血液样本、器官(如肝、脾、肾等)组织样本、细胞等。
本发明所提供的检测或辅助检测猴痘病毒的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在细胞水平筛选猴痘病毒防治药物时检测用药前后细胞内是否含有猴痘病毒。
本发明基于CRISPR-Cas13a核酸检测技术，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于猴痘病毒检测的靶点序列及能靶向该靶点序列的特异性crRNA，该crRNA可通过激活Cas13a实现对猴痘病毒核酸的高灵敏、高特异检测，灵敏度达到十拷贝(10copy/μL)。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳筛选候选RAA引物结果图。
图2为优化crRNA用于检测MPXV的时间-荧光曲线。
图3为筛选候选RAA引物时间-荧光曲线。
图4为含有crRNA-4的CRISPR-Cas13a检测MPXV结果(30min)。
图5为含有crRNA-4的CRISPR-Cas13a检测MPXV时间-荧光曲线。
图6为含有crRNA-4的CRISPR-Cas13a检测MPXV结果(10min)。
图7为含有crRNA-4的CRISPR-Cas13a检测MPXV结果(试纸图)。
图8为针对MPXV的CRISPR-Cas13a在检测其他病原时未出现交叉反应(荧光图)。
图9为针对MPXV的CRISPR-Cas13a在检测其他病原时未出现交叉反应(检测开始后30min)。
图10为针对MPXV的CRISPR-Cas13a在检测其他病原时未出现交叉反应(试纸图)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中涉及的试剂及其来源如下：NTP mix(NEB，N0466S)，2*Super pfxMasterMix(康为07984/30425)，LwCas13a蛋白(金斯瑞Z03486-100),琼脂糖凝胶电泳DNA纯化回收试剂盒(天根生化，DP219-03)，T7转录试剂盒(T7 Quick High Yield RNASynthesis kit，NEB，E2050S)，RNA酶抑制剂(Murine RNase inhibitor，NEB，M0314L)，T7RNA聚合酶(NEB，M0251S)，RNA纯化磁珠(Agencourt RNAClean XP，Beckman Coulter，A63987)，ExTaq Mix(TaKaRa，RR001Q)，Tris平衡酚(灏样生物，TBD0001HY)，RAA扩增试剂盒(杭州众测，S001ZC)，荧光报告RNA(RNaseAlertTM QC System v2，赛默飞，4479769)，试纸报告RNA(天一辉远，203130347)，HEPES缓冲液(索莱宝，YZ-B-HEPES250)，MgCl2溶液(天根生化，RP107)，CRISPR检测试纸(杭州众测，211108004)。
猴痘病毒(MPXV，GenBank ID:9289998)、贝纳氏柯克斯氏体(Cb，GenBank ID:NZ-CP040059.1)、埃博拉病毒(EBOV，GenBank ID:AF086833.2)、鸠宁病毒(JV，GenBank ID:2943089)、黄热病毒(YFV，GenBank ID:NC_002031)和乙肝病毒(HBV，GenBank ID:NC-003977.2)分别构建的质粒。
实施例1、基于CRISPR-Cas13a系统的猴痘病毒核酸检测试剂盒及检测方法
(一)基于CRISPR-Cas13a系统的猴痘病毒核酸检测试剂盒
一、crRNA的制备
在猴痘病毒MPXV保守序列(序列3)中共设计8条crRNA：MPXV-crRNA-1、MPXV-crRNA-2、MPXV-crRNA-3、MPXV-crRNA-4、MPXV-crRNA-5、MPXV-crRNA-6、MPXV-crRNA-7、MPXV-crRNA-8。各个MPXV-crRNA序列对应的靶点序列如下：
其中MPXV-crRNA-1靶点序列如下：GTCTTTTGATGATGTTATTCCGGTTAAA，位于MPXV基因组(GeneID:9289998)第46491-46581位；MPXV-crRNA-2靶点序列如下：TTATTTATTGGAAAGGTGTTAACCCTGT，位于MPXV基因组(GeneID:9289998)第46459-46486位；MPXV-crRNA-3靶点序列如下：AAATTATTTATTGGAAAGGTGTTAACCC，位于MPXV基因组(GeneID:928999)第46462-46489位；MPXV-crRNA-4靶点序列如下：TTTATTGGAAAGGTGTTAACCCTGTCAC(序列1)，位于MPXV基因组(GeneID:9289998)第46456-46483位；MPXV-crRNA-5靶点序列如下：GGAAAGGTGTTAACCCTGTCACCGTTAT，位于MPXV基因组(GeneID:9289998)第46450-46477位；MPXV-crRNA-6靶点序列如下：TGTTATTCCGGTTAAAAAAATTATTTAT，位于MPXV基因组(GeneID:9289998)第46479-46506位；MPXV-crRNA-7靶点序列如下：AACTAGGAGAGATTGGTCTTTTCGTATT，位于MPXV基因组(GeneID:9289998)第46404-46431位；MPXV-crRNA-8靶点序列如下：TAGGAGAGATTGGTCTTTTCGTATTGAA，位于MPXV基因组(GeneID:9289998)第46401-46428位。
上述crRNA的合成方法如下：
1、引物序列的合成
合成表1中的各条序列。
表1、引物序列
Figure BDA0003871006660000051
Figure BDA0003871006660000061
2、PCR扩增
将上述步骤1合成的序列用ddH2O稀释成10μM，配制PCR反应体系。配制PCR反应体系如表2所示。
表2、PCR扩增体系
Figure BDA0003871006660000062
Figure BDA0003871006660000071
PCR反应条件：95℃5min热变性；95℃30s，55℃30s，72℃15s，共38个循环；72℃自动延伸10min；4℃保存PCR产物。得到由表1所示的gRNA-MPXV引物对分别扩增得到的8种PCR产物。
3、PCR产物纯化
使用Tris平衡酚对步骤2获得的8种PCR产物进行纯化，具体步骤如下：Tris平衡酚(灏样生物)取500μL，加入等体积的三氯甲烷，振荡混匀后短暂离心，弃上清；取150μL酚氯仿混合液加入PCR产物中，混匀后12,000rpm离心1min；取上清液到一个新的1.5mL离心管，加入无水乙醇使上清与乙醇比例为3:7，12,000rpm离心10min，弃上清；加入200μL 75％的乙醇，12,000rpm离心10min，弃上清(该步骤共进行三次)。得到的沉淀室温晾干(约10min)，得到8种纯化PCR产物。
将上述8种纯化PCR产物加入50μL无RNA酶的水，Nanodrop检测浓度，-80℃保存。
4、转录
取1μg步骤3获得的8种纯化PCR产物水溶液，分别使用T7转录试剂盒(NEB)转录crRNA。crRNA转录体系如表3所示。
表3、crRNA转录体系
名称 体积
NTP Mix 10μL(每个NTP的终浓度为6.7mM)
纯化的PCR产物(步骤3) 终浓度为1μg
T7 RNA聚合酶 终浓度为2μL
无Nuclease水 XμL(余量为水)
总体积 20μL
上述crRNA转录体系混匀后，37℃转录过夜，使用DNaseⅠ去除多余的DNA：上一步得到的转录产物加入20μL无RNase的水，加入2μL DNaseⅠ，混匀，37℃孵育15min。
将转录获得的crRNA序列命名为MPXV-crRNA-1、MPXV-crRNA-2、MPXV-crRNA-3、MPXV-crRNA-4、MPXV-crRNA-5、MPXV-crRNA-6、MPXV-crRNA-7、MPXV-crRNA-8，其中MPXV-crRNA-4序列具体如下GGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGUGACAGGGUUAACACCUUUCCAAUAAA(序列2)，其中，序列2第1-38位为用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列；序列2第39-66位为靶向MPXV靶点序列的向导序列。
MPXV-crRNA-4靶点序列如下：TTTATTGGAAAGGTGTTAACCCTGTCAC(序列1)，位于MPXV基因组(GeneID:9289998)第46456-46483位。制备出的MPXV-crRNA-4，用于后续CRISPR-Cas13a检测。
5、crRNA纯化
按照Agencourt RNA Clean XP说明书(Beckman Coulter)纯化步骤4转录获得的crRNA，具体步骤如下：磁珠振荡混匀，向转录产物中加入1.8倍体积的磁珠，吹打10次或涡旋30s以混匀磁珠和转录体系，室温静置5min。将反应体系放到磁力架，静置5-10min以分离磁珠。轻轻吸出体系中的液体，避免磁珠被吸出，向磁珠中加入200μL 70％的乙醇(无RNase水配制)，室温孵育30s，吸出乙醇；重复此过程清洗磁珠，共3次。室温晾干体系，去除体系中的乙醇，约10min。加入50μL RNase-free水，涡旋30s或用移液器吹打10次，吸出上清液，放入无RNase的1.5mL离心管中，Nanodrop测定纯化得到的crRNA浓度分别稀释到100ng/μL，-80℃分装备用。
上述crRNA序列用于下面的CRISPR-Cas13a检测猴痘病毒。
二、质粒标准品的制备
1、质粒序列
Plasmid-MPXV是将如下来自猴痘病毒基因组的序列：ATGGAGAAGCGAGAAGTTAATAAAGCTCTGTATGATCTTCAACGTAGTACTATGGTGTACAGTTCCGACGATACTCCTCCTCGTTGGTCTACGACAATGGATGCTGATACACGGCCTACAGATTCTGATGCTGATGCTATAATAGATGATGTATCCCGCGAAAAATCAATGAGAGAGGATAATAAGTCTTTTGATGATGTTATTCCGGTTAAAAAAATTATTTATTGGAAAGGTGTTAACCCTGTCACCGTTATTAATGAGTACTGCCAAATAACTAGGAGAGATTGGTCTTTTCGTATTGAATCAGTGGGGCCTAGTAACTCTCCTACATTTTATGCCTGTGTAGACATTGACGGAAGAGTATTCGATAAGGCAGATGGAAAATCTAAACGAGATGCTAAAAATAATGCAGCTAAATTGGCTGTAGATAAACTTCTTAGTTATGTCATCATTAGATTCTGA(序列3)插入至pUC57载体(北京天一辉远公司)中得到的重组质粒。
将Plasmid-MPXV转入大肠杆菌TOP10菌中，得到重组菌，即为下面所用的甘油菌。
2、质粒小提(全式金)
取上述1得到的甘油菌(1：500)加入Amp+LB(取10μL甘油菌+5ml LB)中，37℃、200rpm过夜接菌，取过夜培养的菌液，10000g离心1min，去上清(尽量吸尽)。如菌液量过大，可分多次离心收集。加入无色溶液RB(含RNase A)250μL，震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。加入蓝色溶液LB 250μL，温和的上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过5min)。加入黄色溶液NB 350μL，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min。12000g离心5min，小心吸取上清加入离心柱中。12000g离心1min，弃流出液。如上清体积大于800μL，可以分成多次加入柱中，并同上离心，弃流出液。加入650μL溶液WB，12000g离心1min，弃流出液。12000g离心1-2min，彻底去除残留的WB。将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μL EB或去离子水(PH>7.0)室温静置1min。10000g离心1min，洗脱DNA，测浓度，于-20℃保存。
3、质粒浓度测定
用Thermo的超微量分光光度计测定上述2提取的质粒Plasmid-MPXV的浓度为：40ng/μL。
质粒Plasmid-MPXV长度为3172bp。
公式：copies/μL＝6.02×1023×(ng/μL)×10-9/DNA Length×660。
质粒Plasmid-MPXV的拷贝数为1×1010copies/μL。
4、稀释
取10μL质粒Plasmid-MPXV到90μL水中，得到浓度为1×109copies/μL质粒标准品。
三、RAA扩增引物的设计及RAA扩增产物的获得
1、RAA扩增引物的设计
根据参考文献(PMID:27246147)中的RPA引物设计旨在用于CRISPR检测的MPXVVirus特异性RAA引物，在引物的5’端具有一段T7转录序列，使得RAA扩增得到的双链DNA(dsDNA)可以被T7 RNA聚合酶识别并且进行转录。引物序列如表4所示，由北京天一辉远公司合成。
表4、MPXV-RAA扩增引物
Figure BDA0003871006660000091
Figure BDA0003871006660000101
2、RAA扩增产物的获得
以质粒标准品作为模板，采用步骤1设计的引物进行RAA扩增，得到RAA扩增产物。RAA扩增体系如表5所示。
表5、RAA扩增体系
名称 体积
Plasmid-MPXV 5μL
MPXV-F(10μM) 2μL
MPXV-R(10μM) 2μL
A Buffer(RAA扩增试剂盒中的组件) 25μL
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 13.5μL
总体积 47.5μL
将混合好的47.5μL溶液加入到装有冻干粉的基础反应单元中，使冻干粉充分重溶均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μL乙酸镁水溶液(B Buffer)，合上管盖瞬离收集并混合均匀。将上述反应管放置在39℃条件下反应30分钟，得到RAA扩增产物。
(二)基于CRISPR-Cas13a系统检测猴痘病毒核酸的方法
一、CRISPR-Cas13a荧光检测体系的配制
提取待测样本的核酸，用上述(一)的三的1中的引物MPXV-RAA-F5和MPXV-RAA-R1对待测样品核酸进行RAA扩增，得到RAA扩增产物；
取5μL上述获得的RAA扩增产物作为模板，按如下表6配制CRISPR-Cas13a检测体系。
将表6中的RAA产物替换为ddH2O，且保持其他试剂组分不变，即为阴性对照。
表6、CRISPR-Cas13a荧光检测体系
Figure BDA0003871006660000102
Figure BDA0003871006660000111
含有上述一中表6所示的反应体系的PCR管放入荧光定量PCR仪中，设置通道激发光波长490nm，发射光波长520nm，37℃，每2min读取一次数值，读取40次共计80分钟，检测体系中荧光强度变化。
结果判定：在同一检测时间内，实验组荧光强度值比阴性对照(ddH2O)荧光强度值高3倍以上即判定为阳性结果，或任何时候荧光强度大于或等于0.2a.u.(阴性对照荧光强度能达到的最高值的3倍)即可判定为阳性结果，即待测样本含有或候选含有猴痘病毒或猴痘病毒核酸；反之，则为阴性结果，即待测样本不含有或候选不含有猴痘病毒或猴痘病毒核酸。
二、CRISPR-Cas13a试纸检测体系的配制
提取待测样本的核酸，用上述(一)的三的1中的引物MPXV-RAA-F5和MPXV-RAA-R1对待测样品核酸进行RAA扩增，得到RAA扩增产物；
取5μL上述获得的RAA扩增产物作为模板，按如下表7配制CRISPR-Cas13a检测体系。
将表7中的RAA产物替换为ddH2O，且保持其他试剂组分不变，即为阴性对照。
表7、CRISPR-Cas13a试纸检测体系
Figure BDA0003871006660000112
Figure BDA0003871006660000121
将含有表7所示的反应体系的反应管盖上管盖，上下颠倒5-6次混匀，低速离心10秒钟。将上述反应管放置在37℃条件下反应30分钟。反应完成后，后将整个反应体系(50μL)全部加入CRISPR检测试纸加样孔。
结果判定：检测反应后体系滴在试纸上后2-5分钟进行判读，若试纸没有“T”线显现且有“C”线显现，则待测样本含有或候选含有猴痘病毒；若试纸有“T”线显现且有“C”线显现，则待测样本不含有或候选不含有猴痘病毒；若试纸没有“C”线显现，则试纸失效，需更换试纸重新实验。
(三)基于CRISPR-Cas13a系统检测猴痘病毒核酸的方法的条件优化
一、最优引物的筛选
以(一)中二制备的稀释后的浓度为1×109copies/μL质粒标准品为模板，用上述(一)中三中2的方法进行RAA扩增，引物分别为表4所示各引物的组合(组合形式如图1所示)，得到RAA扩增产物。
设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。
取20μL扩增产物，加入20μL的三氯甲烷：Tris平衡酚＝1：1(体积比)与反应后产物等量混匀，振荡后离心10min，弃去上清的混合液中，振荡混匀，10000rpm离心10min，吸取上清10μL，加入3μL 6*Loading Buffer，混匀后琼脂糖凝胶电泳。
配置1.5％琼脂糖凝胶，电压U＝150V，电流I＝150mA，时间T＝30min，电泳检测，观察电泳条带。
检测如图1所示，相比于其他交叉组合的引物对来说，F4&R1、F5&R1、F6&R1、F6&R2、F6&R3、F6&R5、F6&R6具有较高的扩增效率，其具有明显的条带。
之后对其进行CRISPR荧光筛选:采用实施例1中(二)的1的方法，其中，RAA扩增引物分别为F4&R1、F5&R1、F6&R1、F6&R2、F6&R3、F6&R5、F6&R6，crRNA为MPXV-crRNA-4。
结果如图3所示，F4R1-5表示RAA扩增引物为F4&R1且crRNA为MPXV-crRNA-4，模板为105copies/μL；依次类推，F4R1-0表示RAA扩增引物为F4&R1且crRNA为MPXV-crRNA-4，模板为100copies/μL，F4R1-(-1)表示RAA扩增引物为F4&R1且crRNA为MPXV-crRNA-4，模板为10-1copies/μL，F4R1-(NC)表示RAA扩增引物为F4&R1且crRNA为MPXV-crRNA-4，模板为水；F5&R1引物所对应的荧光值更高，灵敏度更高，于是MPXV-RAA-F5和MPXV-RAA-R1组合作为最佳扩增引物用于针对MPXV病毒的RAA扩增。
二、最优crRNA筛选
1)、crRNA引物序列的合成
实施例1的(一)中一的方法合成并制备8种MPXV-crRNA。
2)、以实施例1的(一)中二的方法获得的稀释后浓度为1×109copies/μL质粒标准品为模板，按照实施例1的(一)中三的2的方法进行RAA扩增，采用的引物为F5R1(最优引物)，得到RAA扩增产物。
3)、取5μLRAA扩增产物按照实施例1的(二)中的方法检测不同crRNA猴痘病毒核酸，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。上述(二)中的方法中crRNA分别为上述8种MPXV-crRNA。
检测结果如图2所示，可以看出，在用同一浓度的MPXV作模板时，MPXV-crRNA-4检测的荧光值较其他7条crRNA检测的荧光值要高，因此，MPXV-crRNA-4为最优crRNA。
实施例2、基于CRISPR-Cas13a系统检测猴痘病毒核酸的灵敏度检测
以梯度稀释后的质粒标准品作为模板，按照实施例1中的方法检测不同浓度含有MPXV基因片段的质粒，以检测本发明方法的灵敏度。具体步骤如下：
1、将实施例1步骤(一)的二获得的质粒标准品用水进行梯度稀释，得到含有不同浓度MPXV基因片段的质粒溶液：105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL、10-1copies/μL。
2、按照实施例1步骤(一)的三中的方法进行RAA扩增，引物为MPXV-RAA-F5和MPXV-RAA-R1(最佳引物)，得到RAA扩增产物。
3、CRISPR荧光检测：
取5μLRAA扩增产物按照实施例1步骤(二)中的一的方法基于CRISPR-Cas13a荧光系统检测猴痘病毒核酸，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。crRNA为MPXV-crRNA-4。
CRISPR-Cas13a检测结果如图4和图5所示，10-1-105copies/μL的质粒扩增产物的荧光信号在反应开始后开始升高，而阴性对照组(ddH2O)中的荧光强度不随时间推移而升高，含有猴痘病毒核酸的实验组荧光值要显著高于阴性对照(图4)。
从检测开始的第10分钟，105copies/μL到10-1copies/μL模板对应荧光信号分别为0.56±0.17a.u.、0.59±0.16a.u.、0.57±0.05a.u.、0.66±0.39a.u.、0.22±0.09a.u.、0.04±0.05a.u.、0.05±0.05a.u.，阴性对照荧光信号为0.02±0.002a.u.(图6)。与阴性对照相比，荧光强度均具有统计学差异(T检验，P<0.001)，结果表明本发明涉及的CRISPR-Cas13a检测系统可在最短2分钟内检出MPXV核酸，灵敏度达到十拷贝(10copy/μL)。
4、CRISPR试纸检测
完成上述步骤2后，取5μL RAA扩增产物按照实施例1中步骤(二)中的二的方法基于RAA-CRISPR/Cas13a系统检测MPXV核酸，同时设置ddH2O为模板的扩增产物作为阴性对照。crRNA为MPXV-crRNA4，引物MPXV-RAA-F5和MPXV-RAA-R1。
RAA-CRISPR试纸检测结果如图7所示，利用MPXV-crRNA4检测MPXV模板时，在105-101copies/μL组“T”线消失且“C”线显现，100copies/μL、10-1copies/μL、阴性对照组“T”线和“C”线均显现，因此利用MPXV-crRNA4可以检测MPXV位点，灵敏度达到十拷贝(10copy/μL)，判定105-101copy/μL组为阳性，100copy/μL组、10-1copy/μL组和阴性对照组为阴性，说明本方法的灵敏度为10copy/μL(图7)。
实施例3、基于CRISPR-Cas13a系统检测猴痘病毒核酸的特异性检测
分别以贝纳氏柯克斯氏体(Cb)、埃博拉病毒(EBOV)、鸠宁病毒(JV)、猴痘病毒(YFV)和乙肝病毒(HBV)病原核酸为模板，按照实施例1(二)中的方法检测不同病毒核酸，以验证本发明方法的特异性。具体步骤如下：
1、分别以贝纳氏柯克斯氏体(Cb)、埃博拉病毒(EBOV)、鸠宁病毒(JV)、猴痘病毒(YFV)和乙肝病毒(HBV)病原核酸作为检测模板，按照实施例1步骤(一)的三中的方法进行RAA扩增，得到RAA扩增产物。引物MPXV-RAA-F5和MPXV-RAA-R1。
2、取5μLRAA扩增产物按照实施例1步骤(二)中一的方法基于CRISPR-Cas13a荧光系统检测各病毒核酸，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。crRNA为MPXV-crRNA4。
CRISPR-Cas13a检测结果如图8和图9显示，含有MPXV实验组的荧光信号在反应开始后开始升高，而阴性对照组(ddH2O)以及含有其他病毒核酸的实验组中的荧光强度不随时间推移而升高，含有MPXV基因的实验组荧光强度要显著高于阴性对照以及其他病毒组(图8)。检测开始后第30分钟，含有MPXV基因的实验组荧光强度为阴性对照以及其他病毒组150倍(图9)。说明本发明的基于CRISPR-Cas13a系统检测猴痘病毒核酸的方法具有很高的特异性，检测过程中不存在交叉反应。
3、完成步骤1后，取5μL RAA扩增产物按照实施例1中(二)中二的方法基于CRISPR-Cas13a系统试纸检测各病毒核酸，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。crRNA为MPXV-crRNA4。
结果显示，含有MPXV基因的实验组的“T”线消失且“C”线显现，而阴性对照组(ddH2O)以及其核酸的实验组中的“T”线和“C”线均显现(图10)。
说明本发明的基于CRISPR-Cas13a系统检测猴痘病毒位点的方法具有很高的特异性，检测过程中不存在交叉反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于检测猴痘病毒的CRISPR-Cas13a系统，包括Cas13a蛋白和crRNA，或二者形成的复合体；
所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向猴痘病毒靶点序列的向导序列；
所述猴痘病毒靶点序列为序列1。
2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas13a系统，其特征在于：所述crRNA序列为序列2。
3.根据权利要求1或2所述的CRISPR-Cas13a系统，其特征在于：所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。
4.一种用于检测猴痘病毒的试剂盒，其包括权利要求1-3任一所述的用于检测猴痘病毒的CRISPR-Cas13a系统。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于特异性扩增猴痘病毒靶点序列的RAA扩增引物；所述RAA扩增引物由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。
6.如下任一物质：
A1)权利要求1-3任一中所述的crRNA；
A2)权利要求1-3任一中所述的Cas13a蛋白和crRNA，或者二者形成的复合体；
A3)权利要求5中所述的引物对。
7.如下任一应用：
B1)权利要求1-3任一所述的系统或权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的物质在检测或辅助检测猴痘病毒或其核酸中的应用；
B2)权利要求1-3任一所述的系统或权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的物质在制备检测或辅助检测猴痘病毒或其核酸的产品中的应用；
B3)权利要求1-3任一所述的系统或权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的物质在检测或辅助检测待测样本中是否含有猴痘病毒或其核酸中的应用；
B4)权利要求1-3任一所述的系统或权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的物质在制备检测或辅助检测待测样本中是否含有猴痘病毒或其核酸的产品中的应用；
B5)权利要求1-3任一所述的系统或权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的物质在筛选或辅助筛选猴痘病毒防治药物中的应用；
B6)权利要求1-3任一所述的系统或权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的物质在制备筛选或辅助筛选猴痘病毒防治药物的产品中的应用；
B7)权利要求6所述的物质在制备权利要求4或5所述试剂盒中的应用。
8.一种检测或辅助检测猴痘病毒的方法，包括如下步骤：
C1)以待测样本的核酸为模板，采用由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成的引物对进行RAA扩增，得到RAA产物；
C2)配制含有如下组分的CRISPR-Cas13a检测体系：所述RAA产物、权利要求1-3任一中所述的Cas13a蛋白、权利要求1-3任一中所述的crRNA、报告RNA、NTP、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂；同时以水替代所述PCR产物作为阴性对照；
C3)将所述CRISPR-Cas13a检测体系反应，检测反应产物，从而判断待测样本是否含有猴痘病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤C1)中，所述RAA扩增的反应条件为：39℃反应30分钟。
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