CN117965815A - 基于RPA-CRISPR/Cas13a的猴痘病毒核酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了基于RPA‑CRISPR/Cas13a的猴痘病毒核酸检测方法，属于核酸检测技术领域。本申请要解决的技术问题是：如何快速准确的检测或鉴定猴痘病毒。为此本申请提供一种检测猴痘病毒的方法，所述方法包括待测样本中快速裂解的核酸与RPA‑CRISPR/Cas13a检测组合物混合获得RPA‑CRISPR/Cas13a检测体系，孵育后进行检测，根据检测结果确定待测样本是否含有猴痘病毒。本申请提供的方法无需借助复杂仪器设备，操作简易，可实现在15分钟内检出低至0.5拷贝/微升猴痘病毒样本，为猴痘病毒的现场快速高灵敏检测提供有力技术支撑。
Description
技术领域
本申请涉及核酸检测技术领域，具体涉及基于RPA-CRISPR/Cas13a的猴痘病毒核酸检测方法。
背景技术
MPXV作为一种人畜共患DNA病毒，于1970年首次在人体中发现。其传播途径与天花病毒类似，可通过受感染动物咬伤、呼吸道飞沫、皮肤损伤部位密切或直接接触等方式传播。受感染人群往往会出现发烧、头痛、肌肉酸痛、背痛、淋巴结肿大和皮疹等多种症状。大多数轻症患者会在数周内康复，少数重症患者可导致死亡。当前MPXV的检测方法主要包括qPCR、ELISA等。然而，上述检测方法均需借助复杂昂贵的仪器设备和熟练的技术操作人员，且往往耗时较长，仅适合在实验室环境下开展。因此，亟待开发简易、快速、高灵敏的MPXV检测新方法。
近年来发展的规律间断成簇短回文重复序列 (clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats, CRISPR)技术因其卓越的检测机制、快速的反应效率、优异的检测灵敏度、简易的外部反应条件而被广泛的应用于现场即时检测(point-of-care testing, POCT)。常用的CRISPR检测系统主要包括Cas9、Cas12和Cas13。其中，Cas12和Cas13因具有独特的反式切割特性而被广泛研究与应用。具体地，通过Cas12或Cas13蛋白结合人工体外合成的crRNA，当识别到目标DNA或者RNA序列时，可激活Cas蛋白的反式切割特性，非特异的切割反应体系中的DNA或者RNA分子，通过对这些DNA或者RNA分子做标记修饰，从而实现对于靶标的精准高效检测。因其十分优异的检测特异性和灵敏度，CRISPR技术也被形象地称为“装着瞄准镜的霰弹枪”。然而，仅依赖CRISPR反应的检测灵敏度往往有限，除少数借助复杂外部设备的免扩增CRISPR检测技术外，通常需要引入额外的靶标预扩增以达到高灵敏核酸检测的目的。现有技术中将核酸扩增与CRISPR独立进行的两步法反应包含扩增产物转移，操作复杂，存在气溶胶污染风险。
发明内容
本申请要解决的技术问题是：如何快速准确的检测或鉴定猴痘病毒。
为解决上述技术问题，本申请提供一种检测猴痘病毒的方法，所述方法包括如下步骤：
S1）将待测样本与病毒裂解试剂混合获得裂解样本（含有待测样本的核酸）；
S2）将裂解样本与RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物混合获得RPA-CRISPR/Cas13a检测体系，孵育后进行检测，根据检测结果确定待测样本是否含有猴痘病毒；
所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物是包括核酸组合物的物质，所述核酸组合物由特异扩增猴痘病毒特异DNA片段的引物对和crRNA组成，所述引物对由RPA上游引物和RPA下游引物组成，所述RPA上游引物为核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA分子；所述RPA下游引物为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA分子；所述crRNA包括靶向猴痘病毒基因的靶向区段，所述靶向区段的核苷酸序列是SEQ ID No.3第37-64位。
SEQ ID No.1第1-24位为T7 启动子序列，用于特异性结合RNA聚合酶；第25-54位为扩增猴痘病毒的特异性性F3L基因片段的上游引物序列，用于特异性扩增猴痘病毒特异DNA片段。
进一步地，所述crRNA还包含与Cas13a蛋白结合的结构序列（scaffoldsequence），所述结构序列的核苷酸序列为SEQ ID No.3第1-36位。
本申请中，所述crRNA可由体外转录制备或化学合成。
进一步地，所述crRNA的核苷酸序列为SEQ ID No.3。
进一步地，所述的方法中，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物还包括LwaCas13a蛋白。
在本申请的一些实施方式中，所述LwaCas13a蛋白为吐露港公司产品，货号为32117-01。
进一步地，所述的方法中，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物还包括报告RNA。
进一步地，所述报告RNA为具有信号报告功能的RNA分子，当所述RNA分子被降解时，能够报告阳性信号并被检测到。
所述报告RNA为一端连接有荧光基团另一端连接有淬灭基团的单链RNA。所述荧光基团选自FAM、6-FAM、VIC、HEX、TRT、CY3、CY5、ROX、JOE、FITC、TET、NED、TAMRA、LC RED640、LCRED705、Quasar705或Texas Red中的至少一种。所述淬灭基团可选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcy1中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，所述报告RNA的结构如下：
5’-FAM-UUUUU-BHQ1-3’。
其中FAM为荧光基团，BHQ1为荧光淬灭基团，UUUUU为核苷酸序列。
进一步地，所述的方法中，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物还包括用于RPA（Recombinase Polymerase Amplification，重组酶聚合酶扩增）试剂。
本申请，所述RPA试剂为TwistDxTM的产品，货号为TABAS03KIT。所述RPA试剂含RPA冻干粉、RPA重悬液与醋酸镁。
使用时，将DNA模板、对应的扩增引物对和RPA试剂混合即可实现RPA反应。
进一步地，所述的方法中，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物还包括用于DNA体外转录的组分。
进一步地，所述用于DNA体外转录的组分包括T7 RNA聚合酶、核糖核酸酶H、RNA酶抑制剂和 rNTP混合液。
在本申请的一些实施方式中，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物包括：LwaCas13a蛋白，crRNA，T7 RNA聚合酶，核糖核酸酶H，RNA酶抑制剂，rNTP混合液，报告RNA（即荧光淬灭探针），RPA上游引物，RPA下游引物，RPA试剂（包括RPA冻干粉、RPA重悬液和醋酸镁）；
在本申请的一些实施方式中，将RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物中的RPA重悬液与醋酸镁按照混合获得缓冲液，使缓冲液中醋酸镁的浓度为5-50 mM。将裂解样本、缓冲液和RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物中其他组分（除RPA重悬液和醋酸镁以外的其他组分）混合获得RPA-CRISPR/Cas13a检测体系，孵育后进行检测。
本申请所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测体系中，所述LwaCas13a蛋白的使用浓度可为25-200 nM。在本申请一些实施方式中，所述LwaCas13a蛋白的使用浓度为50 nM。
本申请所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测体系中，所述T7 RNA聚合酶的使用浓度可为0.5-4 U/µL。在本申请一些实施方式中，所述T7 RNA聚合酶的使用浓度为1 U/µL。
本申请所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测体系中，所述核糖核酸酶H的使用浓度可为0.01-0.2 U/µL。在本申请一些实施方式中，所述核糖核酸酶H的使用浓度为0.05 U/µL。
本申请所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测体系中，所述T7 RNA聚合酶抑制剂的使用浓度可为0.5-4 U/µL。在本申请一些实施方式中，所述RNA聚合酶抑制剂的使用浓度为1 U/µL。
本申请所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测体系中，所述rNTP混合液的使用浓度可为0.5-4 mM。在本申请一些实施方式中，所述rNTP混合液的使用浓度为1 mM。
本申请所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测体系中，所述crRNA的使用浓度可为10-500nM。
进一步地，本申请所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测体系中，所述crRNA的使用浓度可为10-100 nM。在本申请一些实施方式中，所述crRNA的使用浓度为100 nM。
本申请所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测体系中，所述报告RNA的使用浓度可为0.1-4 µM。在本申请一些实施方式中，所述报告RNA的使用浓度为1 µM。
本申请所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测体系中，所述RPA上游引物的使用浓度可为50-1000 nM。在本申请一些实施方式中，所述RPA上游引物的使用浓度为500 nM。
本申请所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测体系中，所述RPA下游引物的使用浓度可为50-1000 nM。在本申请一些实施方式中，所述RPA下游引物的使用浓度为500 nM。
本申请中，所述RPA重悬液优选但不限于RPA rehydration buffer (TwistDxTM)。
本申请中，所述醋酸镁的使用浓度可为5-50 mM。在本申请一些实施方式中，所述醋酸镁的使用浓度为14 mM。
进一步地，S2）所述孵育的孵育时间为5-15分钟。
进一步地，S2）所述孵育的孵育温度可为25-45℃。
进一步地，S2）所述孵育的孵育温度可为30-40℃。
进一步地，S2）所述孵育的孵育温度可为37℃。
进一步地，所述方法还包括根据阳性信号的有无判定所述待测样本中是否含有猴痘病毒，和/或根据阳性信号的强弱判定所述待测样本中猴痘病毒的浓度。
所述根据阳性信号的有无判定所述待测样本中是否含有猴痘病毒为：如果有阳性信号，则判定所述待测样本中含有或者候选含有猴痘病毒；如果无阳性信号，则判定所述待测样本中不含有或者候选不含有猴痘病毒。
所述根据阳性信号的强弱判定所述待测样本中猴痘病毒的浓度为：阳性信号越强，表示所述待测样本中含有的猴痘病毒含量越高；阳性信号越弱，表示所述待测样本中含有的猴痘病毒含量越低。
本文中，所述阳性信号可为荧光信号。待测样本的荧光强度值高于阴性对照（ddH2O）荧光强度值的均值与三倍标准偏差之和即判定为阳性结果（阳性信号）。
本申请还提供上述方法中的核酸组合物。
本申请还提供用于检测猴痘病毒的组合物，所述组合物为上述任一方法中所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物。
进一步地，所述组合物还包括病毒裂解试剂。
本申请中所述的病毒裂解试剂可为裂解病毒释放DNA的组合物。
在本申请的一些实施方式中，所述病毒裂解试剂包括：chelex-100、TCEP(一种硫醇类还原剂)、Tris（三羟甲基氨基甲烷）和EDTA（乙二胺四乙酸）。
本申请中，所述chelex-100的使用浓度可为2.5 g/100 mL-40 g/100 mL。在本申请一些实施方式中，所述chelex-100得使用浓度为20 g/100 mL。
本申请中，所述Tris的使用浓度可为1-100 mM。在本申请一些实施方式中，所述Tris的使用浓度为10 mM。
本申请中，所述EDTA的使用浓度可为0.1-10 mM。在本申请一些实施方式中，所述EDTA的使用浓度为1 mM。
本申请中，所述TCEP的使用浓度可为10-200 mM。在本申请一些实施方式中，所述TCEP的使用浓度为50 mM。
在本申请的一些实施方式中，所述病毒裂解试剂和水配制获得免提取病毒裂解液，所述免提取病毒裂解液由20 g/100 mL chelex-100，50 mM TCEP，10 mM Tris，1 mMEDTA和水组成。
在本申请的一些实施方式中，所述免提取病毒裂解液的制备方式为：将无酶无菌水与Chelex-100、TCEP、Tris和EDTA混合至溶液中Chelex-100的浓度为20 g/100 mL、TCEP的浓度为50 mM、Tris的浓度为 10 mM、EDTA的浓度为1 mM。
本申请还提供用于检测猴痘病毒的试剂盒，所述试剂盒含有上述的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括记载有本文中所述检测猴痘病毒的方法的可读性载体。所述可读性载体可为关于实践本申请方法的试剂盒说明书（例如印刷形式的说明书）或在其上已记录了信息的计算机可读的介质（例如软盘、CD等）。
所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
本申请还提供应用，所述应用为上述的组合物在下述任一项中的应用和/或上述的试剂盒在B1）、B3）、B5）、B7）B9）和B11）任一项中的应用：
B1）在检测猴痘病毒中的应用；
B2）在制备用于检测猴痘病毒的产品中的应用；
B3）在鉴定或辅助鉴定猴痘病毒中的应用；
B4）在制备用于鉴定或辅助鉴定猴痘病毒的产品中的应用；
B5）在鉴定或辅助鉴定待测样本是否为或含有猴痘病毒中的应用；
B6）在制备用于鉴定或辅助鉴定待测样本是否为或含有猴痘病毒的产品中的应用；
B7）在筛选或辅助筛选猴痘病毒防治药物中的应用；
B8）在制备筛选或辅助筛选猴痘病毒防治药物的产品中的应用；
B9）在诊断或辅助诊断猴痘病毒感染引起的疾病中的应用；
B10）在制备用于诊断或辅助诊断猴痘病毒感染引起的疾病的产品中的应用；
B11）在猴痘病毒感染引起的疾病的治疗监测中的应用；
B12）在制备用于猴痘病毒感染引起的疾病的治疗监测的产品中的应用。
上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的。上述应用和方法的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的。上述应用和方法的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息。上述应用和方法的直接目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
进一步地，所述待测样本可为微生物培养物。
进一步地，所述待测样本也可为病变区域组织渗出液拭子、唾液、口腔拭子、尿液、血液样品、组织样品、环境样品（如空气）、衣物或毛巾或作为食品的动物组织和/或器官等。
本申请聚焦MPXV检测应用需求，基于一步法RPA-CRISPR/Cas13a核酸检测技术，设计合成针对MPXV F3L基因的RPA扩增引物与crRNA，所述检测方法可实现10分钟检测出低至0.5拷贝/微升的猴痘病毒DNA，且在特异性验证中与牛痘病毒、痘苗病毒、天花病毒、水痘-带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒均无反应交叉，特异性良好。建立快速免提取病毒裂解方法，可实现2分钟内有效释放痘液、口腔拭子、唾液、尿液等多种样本类型的MPXV DNA。本申请建立的检测方法在对收集的102例MPXV临床样本（包括35例阳性样本、67例阴性样本）的检测验证中，灵敏度与特异性均达到100%。相比于现有猴痘病毒检测试剂与方法，本申请可实现更为简易、快速、高灵敏的MPXV检测。
与现有技术相比，本申请的优势在于：
通过免提取快速裂解可在2 min内释放病毒核酸，并通过集成于单管的一步法RPA-CRISPR/Cas13a反应可实现10 min对猴痘病毒核酸的精准识别。
通过采用一步法RPA-CRISPR/Cas13a检测技术，有效规避了两步法CRISPR反应的转移操作与气溶胶污染风险，且优化后的反应体系可实现恒温条件下对MPXV核酸的高效检测。
此外，本申请中建立了免提取快速样本裂解方法，可实现恒温条件下对痘液拭子、口腔拭子、唾液、尿液等多种MPXV样本类型的快速裂解。建立冻干反应体系，进一步简化操作流程、便于运输与存储。本申请无需借助多种复杂的仪器设备，即可实现在15分钟内得出检测结果，且可检出低至0.5拷贝/µL MPXV样本。兼具操作简易，反应快速，灵敏度优异等多种技术优势，满足现场即时检测应用需求。
附图说明
图1为本申请所述一步法RPA-CRISPR/Cas13a猴痘病毒检测方法RPA扩增引物与crRNA筛选结果。所检测猴痘病毒DNA浓度为10拷贝/µL，反应时间20 min。
图2为本申请所述一步法RPA-CRISPR/Cas13a猴痘病毒检测方法反应体系优化结果。a为rNTP混合液浓度优化结果; b为T7 RNA聚合酶浓度优化结果; c为引物浓度优化结果; d为LwaCas13a浓度优化结果; e为crRNA浓度优化结果；f为核糖核酸酶H浓度优化结果。所检测猴痘病毒DNA浓度为10拷贝/µL，反应时间10 min。每组独立重复三次。
图3为本申请所述一步法RPA-CRISPR/Cas13a猴痘病毒检测方法灵敏度测试的实时荧光检测结果。所检测猴痘病毒DNA浓度梯度为1000、100、10、5、1、0.5、0.2拷贝/µL及阴性对照（猴痘病毒DNA浓度为0拷贝/µL）。每组独立重复三次。
图4为本申请所述一步法RPA-CRISPR/Cas13a猴痘病毒检测方法低浓度样本检测的终点荧光结果。所检测猴痘病毒DNA浓度分别为1、0.5、0.4、0.3、0.2拷贝/µL及阴性对照（猴痘病毒DNA浓度为0拷贝/µL）。每组独立重复20次。
图5为本申请所述一步法RPA-CRISPR/Cas13a猴痘病毒检测方法与牛痘、痘苗、天花、单纯疱疹、水痘-带状疱疹病毒的特异性检测结果。
图6为本申请所述一步法RPA-CRISPR/Cas13a猴痘病毒检测方法临床样本验证的终点荧光结果。所采集的猴痘、单纯疱疹、阴性临床样本包括痘液拭子、咽拭子、唾液、尿液四种样本类型。图中×表示此处无样本。
图7为本申请所述一步法RPA-CRISPR/Cas13a猴痘病毒检测方法与qPCR检测结果的对比。其中，横坐标为qPCR检测结果的Ct值，纵坐标为本申请所述方法的终点荧光信号强度。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本申请进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本申请，而不是为了限制本申请的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本申请的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的单纯疱疹病毒1型、水痘-带状疱疹病毒、痘苗病毒、含牛痘病毒F3L-F4L 基因的质粒、含天花病毒 E3L-E4L 基因的质粒为中国食品药品检定研究院的猴痘病毒核酸检测试剂国家参考品（编号为370114）中的阴性参考品。
下述实施例中的猴痘病毒来源为中国食品药品检定研究院的猴痘病毒核酸检测试剂国家参考品（编号为370114）中阳性参考品P1。
下述实施例中的LwaCas13a为吐露港公司产品，货号为32117-01。
下述实施例中的T7 RNA聚合酶为New England Biolabs公司产品，货号为M0251。
下述实施例中的核糖核酸酶H为New England Biolabs公司产品，货号为M0297。
下述实施例中的RNA酶抑制剂为索莱宝公司产品，货号为R8061。
下述实施例中的RPA冻干粉、RPA重悬液与280 mM醋酸镁为TwistDxTM产品，货号为：TABAS03KIT。
下述实施例中的chelex-100为索莱宝公司产品，货号为C8230。
下述实施例中的TCEP为碧云天公司产品，货号为ST049。
下述实施例中的Tris为Thermo Fisher公司产品，货号为15568025。
下述实施例中的EDTA为Thermo Fisher公司产品，货号为AM9260G。
下述实施例中的报告RNA（即荧光淬灭探针）委托上海生工公司合成。
下述实施例中的引物和crRNA制备模板委托上海生工公司合成。
（注：本发明中所述crRNA由体外转录制备。具体地，crRNA体外转录主要包括三个步骤：退火杂交反应、转录、RNA纯化。（1）退火杂交反应：用于生产待转录双链DNA模板。具体地，10 µL退火反应体系包含1 µL化学合成的crRNA制备模板（100 µM），1 µL T7启动子引物（序列：GAAATTAATACGACTCACTATAGGG）（100 µM），1 µL Standard Taq buffer（10×）（购自New England Biolabs公司，货号为B9014），以及7 µL无酶无菌水（购自索莱宝公司，货号为R1600）。反应体系于Biorad t200 PCR仪上，95 ℃下变性5 min，然后以0.1 ℃/s降温速率梯度退火至4 ℃。（2）转录：使用HiScribe™ T7快速高效RNA合成试剂盒（购自New EnglandBiolabs公司，货号为E2040），依据生产商说明，对退火反应产物进行转录。并于金属浴中37℃条件下孵育8-12 h。（3）RNA纯化：使用脱氧核糖核酸酶（购自Promega公司，货号为M6101）降解转录产物中多余的DNA。随后根据生产厂商说明，使用RNA Clean&Concentrator-5 Kit（购自ZYMO公司，货号为R1013）对转录所得RNA进行纯化，即可完成crRNA制备。上述制备的crRNA经Qubit™ Flex荧光分光光度计定量后，于-80 ℃长期保存以备后续使用。
下述实施例中的102例临床样本为地坛医院提供，患者已签署知情同意书。
下述实施例中的定量试验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。
下述实施例采用GraphPad Prism统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Two-tailed Student t检验，P＜0.0001（****），ns表示P＞0.05无显著性差异。
实施例1：基于一步法RPA-CRISPR/Cas13a的猴痘病毒恒温检测组合物
1.1、一步法RPA-CRISPR/Cas13a的猴痘病毒恒温检测组合物
本实例中所述一步法RPA-CRISPR/Cas13a的猴痘病毒恒温检测组合物包括：RPA反应试剂、转录试剂、CRISPR/Cas13a检测试剂、病毒裂解试剂。
（1）RPA反应试剂为用于DNA扩增的组分，包括RPA试剂和扩增引物对。将模板DNA、对应的扩增引物对和RPA试剂混合即可实现DNA恒温扩增。
RPA试剂为TwistDx产品，货号为TABAS03KIT。RPA试剂包括RPA冻干粉、RPA重悬液与280 mM醋酸镁。
（2）转录试剂包括T7 RNA聚合酶、rNTP混合液、核糖核酸酶H和RNA酶抑制剂，用于DNA的体外转录。
（3）CRISPR/Cas13a检测试剂包括LwaCas13a、crRNA和报告RNA（即荧光淬灭探针）组成，用于目的基因的检测。
（4）病毒裂解试剂为裂解病毒释放DNA的组合物，包括：chelex-100、TCEP、Tris和EDTA。病毒裂解试剂和水制备获得免提取病毒裂解液，免提取病毒裂解液由20 g/100 mLchelex-100，50 mM TCEP，10 mM Tris，1 mM EDTA和水组成。
所述免提取病毒裂解液的制备方式为：将无酶无菌水与Chelex-100、TCEP、Tris和EDTA混合至溶液中Chelex-100的浓度为20 g/100 mL、TCEP的浓度为50 mM、Tris的浓度为10 mM、EDTA的浓度为1 mM。
其中，针对MPXV F3L基因设计的RPA上游引物和RPA下游引物的引物序列如下：
RPA上游引物: 5’-cctctaatacgactcactatagggTCCTCTCTCATTGATTTTTCGCGGGATACA-3’（SEQ ID No.1）；其中，SEQ ID No.1第1-24位为T7 启动子序列，第25-54位为扩增猴痘病毒的特异性性F3L基因片段的上游引物序列。
RPA下游引物: 5’-AACGATACTCCTCCTCGTTGGTCTACGACA-3’（SEQ ID No.2）
针对MPXV F3L基因设计的crRNA序列如下：
5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUGGAUGCUGAUACACGGCCUACAGAUUC-3’（SEQ ID No.3）其中，SEQ ID No.3第1-36位为crRNA的结构序列（scaffold sequence），第37-64位为靶向猴痘病毒特异DNA片段的向导序列。
报告RNA（即荧光淬灭探针）的结构如下：
5’-FAM-UUUUU-BHQ1-3’。
其中FAM为荧光基团，BHQ1为荧光淬灭基团，UUUUU为核苷酸序列。
使用时将待测样本与免提取病毒裂解液混合孵育获得裂解样本。RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物中的RPA重悬液与280 mM醋酸镁按照12:1（v/v）配制获得缓冲液。将裂解样本、缓冲液和RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物的其他组分中（除RPA重悬液和280 mM醋酸镁之外的组分）混合获得一步法RPA-CRISPR/Cas13a检测体系并于37 ℃孵育10分钟进行一步法RPA-CRISPR/Cas13a反应后进行结果检测。结果检测可借助实时荧光检测设备实时监测，或借助荧光读取设备进行终点荧光判读。
一步法RPA-CRISPR/Cas13a检测体系中包括：50 nM LwaCas13a，100 nM crRNA，1U/µL T7 RNA聚合酶，0.05 U/µL 核糖核酸酶H，1 U/µL RNA酶抑制剂，1 mM rNTP混合液，1µM报告RNA，500 nM RPA上游引物，500 nM RPA下游引物，RPA试剂（冻干粉一管（TwistDxTM/TABAS03KIT）、RPA重悬液和醋酸镁）。
检测原理为：待测样本与病毒裂解液混合后，待测样本中的DNA释放出来。如果待测样本为或含有猴痘病毒，作为扩增模板的DNA加入体系后，在RPA上游引物、RPA下游引物和RPA试剂（TwistDxTM/TABAS03KIT）作用下实现DNA扩增获得猴痘病毒特异性F3L基因的目的片段，该目的片段在T7 RNA聚合酶作用下发生体外转录获得转录产物。转录产物与crRNA特异性结合之后激活了的LwaCas13a蛋白的非特异性切割活性，LwaCas13a蛋白切割报告RNA，使报告RNA上的荧光基团发出荧光信号。
如果待测样本不为或不含含有猴痘病毒，则模板扩增和体外转录不能实现，LwaCas13a蛋白的非特异性切割活性不会激活，报告RNA未被切割从而不发出荧光信号。
1.2、扩增引物与向导RNA筛选
本文具体针对MPXV F3L基因，使用Primer Premier 5设计了3条crRNA，上下游各4条RPA扩增引物(如表1所示)。使用NCBI BLAST进行相似性序列比对验证所设计引物与crRNA的特异性。并由上海生工生物合成。本发明中将上述扩增引物与crRNA进行组合筛选，共计48组。将不同引物与crRNA组合加入一步法RPA-CRISPR/Cas13a反应体系中，如图1所示，荧光检测结果表明MPV-RPA-F3（即1.1中的RPA上游引物），MPV-RPA-R1（即1.1中的RPA下游引物），MPV-crRNA3（即1.1中的crRNA）组合效果最佳。
1.3、反应体系优化
为了进一步提升一步法RPA-CRISPR/Cas13a反应体系的检测效率，本发明中对rNTP混合液、T7 RNA聚合酶、引物、LwaCas13a蛋白、crRNA和RNase H浓度这些关键组分进行逐步优化。结果如图2中a-f所示，结果表明1 mM rNTP混合液、1 U/μL T7 RNA聚合酶、500nM引物、50 nM LwaCas13a、100 nM crRNA、0.05 U/μL 核糖核酸酶H条件下所述一步法RPA-CRISPR/Cas13a反应体系检测性能最佳。
实施例2：基于一步法RPA-CRISPR/Cas13a的猴痘病毒检测方法
本实例以猴痘样本为例，说明一步法RPA-CRISPR/Cas13a的猴痘病毒检测的方法，具体包括以下步骤：
（S1）采集的猴痘样本与实施例1中的免提取病毒裂解液按照1:9（病变区域组织渗出液拭子），1:3（口腔拭子），3:1（唾液），1:9（尿液）的体积比混合，并于80 ℃反应2分钟获得裂解样本（含有待测样本的核酸）。
（S2）将7 µL裂解样本、13 µL缓冲液和RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物充分混匀并于37 ℃孵育10分钟进行一步法RPA-CRISPR/Cas13a反应后使用实时荧光PCR系统ABI-7500进行荧光强度检测。
本申请中根据阳性信号的有无判定待测样本是否为或含有猴痘病毒。或根据阳性信号的强弱判定待测样本中猴痘病毒的浓度。
阳性信号即荧光信号。实验组荧光强度值高于阴性对照（ddH2O）荧光强度值的均值与三倍标准偏差之和即判定为阳性结果（即认为有阳性信号）。
根据阳性信号的有无判定待测样本中是否含有猴痘病毒为：如果有阳性信号，则判定待测样本中含有或者候选含有猴痘病毒；如果无阳性信号，则判定待测样本中不含有或者候选不含有猴痘病毒。
根据阳性信号的强弱判定待测样本中猴痘病毒的浓度为：阳性信号越强，表示待测样本中含有的猴痘病毒含量越高；阳性信号越弱，表示待测样本中含有的猴痘病毒含量越低。
实施例3：基于一步法RPA-CRISPR/Cas13a的猴痘病毒检测方法性能评价
本实例中所述一步法RPA-CRISPR/Cas13a的猴痘病毒检测方法性能评价主要包括检测的灵敏度测试与特异性测试。
3.1：灵敏度测试
病毒感染初期患者体内病毒载量往往处于较低水平，因此检测试剂的灵敏度对早期筛查至关重要。本申请对所建立的针对MPXV F3L基因的一步法CRISPR反应的灵敏度进行测试。使用数字PCR绝对定量的MPXV F3L基因参考品（猴痘病毒核酸检测试剂国家参考品编号P1）作为参照标准，选取1000、100、10、5、1、0.5、0.2和0拷贝/µL的MPXV F3L基因参考品进行检测。结果如图3所示，结果表明本申请所述一步法RPA-CRISPR/Cas13a的检出限为0.5拷贝/µL。
为进一步探索该方法的实际检出限，分别选取浓度为1、0.5、0.4、0.3、0.2和0拷贝/µL的MPXV DNA检测验证，每组独立重复20次，以不低于19/20的检出率视为可检出浓度。如图4所示，结果显示上述浓度的检出率分别为20/20、20/20、16/20、9/20、3/20、0/20。因此本申请所述方法的最终检出限为0.5拷贝/µL。
3.2：特异性测试
验证了所述MPXV检测方法与单纯疱疹病毒1型、水痘-带状疱疹病毒、痘苗病毒、牛痘病毒（含牛痘病毒 F3L-F4L 基因的质粒）、天花病毒（含天花病毒 E3L-E4L 基因的质粒）的反应特异性。结果如图5所示，结果表明本申请所述方法与上述病毒均无交叉反应，特异性良好。
实施例4：基于一步法RPA-CRISPR/Cas13a的猴痘病毒检测方法临床样本验证
为探究本方法的临床适用性，本申请中收集了102例临床样本，包括病变区域组织渗出液拭子、唾液、口腔拭子、尿液四种样本类型在内的共计35例MPXV阳性临床样本，19例单纯疱疹病毒样本，48例阴性样本。将获得的102例临床样本参照实施例2中的方法分别进行检测，结果如图6所示，结果表明所有样本均被准确检出。
此外，如图7所示，本申请所述方法对临床样本的检测结果与核酸检测“金标准”的qPCR方法完全一致。
研究中使用核酸检测“金标准”的qPCR法检测MPXV F3L基因作为一步法RPA-CRISPR/Cas13a检测方法的对照。反应体系具体包括：4 µL Taq buffer（5×），0.8 µL TaqMaster PCR Mix，0.8 µL上游引物MPXV-PCR-F（10 µM），0.8 µL下游引物MPXV-PCR-R（10 µM），0.8 µL Taqman探针MPXV-PCR-P（10 µM），补水至20 µL。qPCR反应条件如下：①UNG酶激活：50 ℃反应2 min；②热启动DNA聚合酶激活：95 ℃反应2 min；③扩增循环：包含45个温度控制循环，其中94 ℃变性反应30 s，55 ℃退火延伸30 s。上述qPCR反应于台式实时荧光PCR仪ABI-7500上进行。其中，上游引物MPXV-PCR-F为核苷酸序列是SEQ ID No.13的单链DNA分子，下游引物MPXV-PCR-R为核苷酸序列是SEQ ID No.14的单链DNA分子。Taqman探针MPXV-PCR-P的核苷酸序列是SEQ ID No.15，其5’端连接荧光基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。
以上对本申请进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本申请的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本申请。虽然本申请给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本申请作进一步的改进。总之，按本申请的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本申请的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.一种检测猴痘病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
S1）将待测样本与病毒裂解试剂混合，获得裂解样本；
S2）将裂解样本与RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物混合获得RPA-CRISPR/Cas13a检测体系，孵育后进行检测，根据检测结果确定待测样本是否含有猴痘病毒；
所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物是包括核酸组合物的物质，所述核酸组合物由特异扩增猴痘病毒特异DNA片段的引物对和crRNA组成，所述引物对由RPA上游引物和RPA下游引物组成，所述RPA上游引物为核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA分子；所述RPA下游引物为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA分子；所述crRNA包括靶向猴痘病毒基因的靶向区段，所述靶向区段的核苷酸序列是SEQ ID No.3第37-64位。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物还包括LwaCas13a蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物还包括报告RNA。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物还包括用于RPA反应的组分。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物还包括用于DNA体外转录的组分。
6.权利要求1-5中任一项所述的核酸组合物。
7.用于检测猴痘病毒的组合物，其特征在于，所述组合物为权利要求1-5中任一项所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括权利要求1中所述的病毒裂解试剂。
9.用于检测猴痘病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求8或9所述的组合物。
10.应用，其特征在于，所述应用为权利要求7或8所述的组合物在下述任一项中的应用和/或权利要求9所述的试剂盒在B1）、B3）、B5）、B7）B9）和B11）任一项中的应用：
B1）在检测猴痘病毒中的应用；
B2）在制备用于检测猴痘病毒的产品中的应用；
B3）在鉴定或辅助鉴定猴痘病毒中的应用；
B4）在制备用于鉴定或辅助鉴定猴痘病毒的产品中的应用；
B5）在鉴定或辅助鉴定待测样本是否为或含有猴痘病毒中的应用；
B6）在制备用于鉴定或辅助鉴定待测样本是否为或含有猴痘病毒的产品中的应用；
B7）在筛选或辅助筛选猴痘病毒防治药物中的应用；
B8）在制备筛选或辅助筛选猴痘病毒防治药物的产品中的应用；
B9）在诊断或辅助诊断猴痘病毒感染引起的疾病中的应用；
B10）在制备用于诊断或辅助诊断猴痘病毒感染引起的疾病的产品中的应用；
B11）在猴痘病毒感染引起的疾病的治疗监测中的应用；
B12）在制备用于猴痘病毒感染引起的疾病的治疗监测的产品中的应用。
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