CN112553303B - 一种pcr检测样本的前处理液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种PCR检测样本的前处理液。本发明的前处理液通过添加阴离子聚合物，利用一种前处理液实现了常温条件下样本的保存和加热情况下核酸的提取，无需加入磁珠、蛋白酶K或物理破碎、离心等裂解样本，操作简单，提取效果好，对于核酸提取的发展和应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种PCR检测样本的前处理液。
背景技术
磁珠法核酸检测因为其较高的灵敏度，而被广泛应用到医疗诊断中。其检测过程主要包括，磁珠法核酸提取和PCR检测。在磁珠法核酸提取之前需要先处理样本，将样本暂时保存在保存液中；通常的磁珠法核酸提取可分为四个步骤：(1)裂解；(2)结合；(3)洗涤；(4)分离。具体为细胞或组织在裂解液作用下将DNA/RNA释放出来，经过表面修饰的超顺磁性氧化硅纳米磁珠与所释放出的DNA/RNA进行特异性结合，形成核酸-磁珠复合物，后续在核酸-磁珠复合物中加入洗涤液，洗去非特异性吸附的蛋白质等杂质，去除杂质的核酸—磁珠复合物在磁场条件下分离富集磁珠，最后得到欲提取的核酸物质，提取的核酸利用PCR扩增进行检测，分步提取，操作复杂。
目前市面上为了简化操作，开发出全自动核酸提取仪，简化了提取过程，但通常的保存液只能保存样本无法实现样本的裂解，而通常的提取液只能裂解样本无法实现样本的保存，且随着临床检测对时间的要求，对裂解速度的需求越来越高，一旦加入样本，样本会立马开始裂解，在短时间内实现样本核酸的提取。但在实际应用中，通常样本都需要一定时间的存储，特别是利用仪器进行提取，上机前的样本通常需要保持在相同的环境中，而离体的样本很难保持其状态，若是直接添加提取液，又会对后续的结果产生影响，所以急需要提出一种既能够保存样本又能够实现核酸提取的溶液，使样本在提取前可以保持稳定的状态，在需要提取时可以立马被裂解。
此外，磁分离过程需要将磁珠上连接的核酸分离出去，并不能一定保证所有的核酸均与磁珠分离，游离在溶液中，而吸附在磁珠上的核酸会对提取的核酸造成一定的损失，且磁分离之后必须将核酸提取溶液转移出来，才能进行后续的PCR检测，而不能直接在含有磁珠的溶液中进行PCR扩增检测，转移过程可能并不能完全的转移核酸溶液造成损失，且转移之后再放入其他的容器里，容易造成污染，所以若能实现核酸的提取和检测为一体，去除磁分离过程的吸磁、转移等过程，在保证灵敏度的条件下，通过更为简单的操作实现对样本的检测，对于医疗诊断具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种PCR检测样本的前处理液，以解决现有技术操作复杂，实现前处理液同时对样本进行保存和核酸提取的目的，简化操作。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：
一种PCR检测样本的前处理液，包括，缓冲液、还原剂和水溶性阴离子型聚合物。本发明PCR检测样本的前处理液不包含蛋白酶K。
术语“阴离子型聚合物”,按本领域广义的理解,指每个分子包含多个阴离子基团的聚合材料或聚合物；它包括含有至少一个选自硫酸基、硫酸根、磺酸基、磺酸根、磷酸基、磷酸根、膦酸基、膦酸根、硅酸基、硅酸根、羧酸基和羧酸根的可带负电荷和/或带负电荷的部分；所述的阴离子型聚合物可以是均聚物或者共聚物，当阴离子型聚合物是均聚物时，包含单一类型的重复单元；当阴离子型聚合物是共聚物时，包含两个或者更多不同的重复单元；所述的阴离子型聚合物可以是线性聚合物，交联聚合物，或支化共聚物。
具体地，所述阴离子型聚合物可选自多糖，如海藻酸及其盐、透明质酸及其盐或纤维素及其盐(例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素和羧甲基纤维素)；
或者，所述阴离子型聚合物为氨基酸聚合物，如聚谷氨酸；
或者，所述阴离子型聚合物选自聚乙烯硫酸盐、聚乙烯磺酸盐、聚苯乙烯硫酸盐、聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯酸及其盐、聚(甲基)丙烯酸及其盐、硫酸葡聚糖及其盐、硫酸软骨素及其盐、聚马来酸及其盐、聚富马酸及其盐、聚马来酸酐、聚硅酸盐。
优选的，所述盐为金属盐，如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锂盐等。
优选地，所述阴离子型聚合物的浓度为0.1-100mM，更优选为1-20mM。
优选地，所述缓冲液选自Tris-HCl、HEPES、MOPS或Tricine，所述缓冲液浓度为1-100mM。
更优选地，所述缓冲液的pH＝7.5-8.5。
优选地，所述还原剂选自DTT、β-巯基乙醇、TCEP、半胱氨酸或谷胱甘肽，所述还原剂的浓度为0.1-100mM。
优选地，所述前处理液还包括尿素，更优选地，所述尿素的浓度为0.01-2M，尿素的添加，可以帮助蛋白更好地溶解。
优选地，所述前处理液还包括0.01-150mM的无机盐，用于调节pH和渗透压，帮助样本裂解。
优选地，所述样本前处理液还包括防腐剂和表面活性剂，作为优选，所述防腐剂选自叠氮钠、Proclin 300、硫柳汞或庆大霉素，所述防腐剂的浓度为：0.01-1％，所述表面活性剂选自：0.01-1％的Triton、吐温、SDS、NP-40或N-月桂酰肌氨酸钠(％为g/100mL)。本发明所述表面活性剂没有特别限制，市面上常用在核酸提取中的表面活性剂均可。
优选地，所述前处理液还包括1-30％甘油(体积比)，加入一定浓度的甘油，可以使前处理液有更好的溶解性，且在低温条件下更好的保存样本的完整性。
前处理液可以加入酚红以便指示溶液酸碱变化。
本发明的PCR样本检测的前处理液，对于样本没有要求，特别适用于非灭活型病毒的保存，可以常温下稳定病毒及内源基因组，加热条件下实现细胞/病毒裂解以及去抑制，加热失活后的样本可直接加入PCR反应液中进行扩增检测，只利用前处理液就可以同时实现样本5天内的短暂保存和核酸提取，操作简单。
本发明的另一方面提供一种样本检测试剂盒，包括上述前处理液。
另一方面，本发明提供了可溶性阴离子型聚合物在PCR检测前处理中的应用，所述阴离子型聚合物含有至少一个选自硫酸基、硫酸根、磺酸基、磺酸根、磷酸基、磷酸根、膦酸基、膦酸根、硅酸基、硅酸根、羧酸基或羧酸根的可带负电荷和/或带负电荷的部分
另一方面，本发明还提供了一种PCR检测样本的前处理方法，所述前处理方法包含使用上述前处理液处理样本的过程。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的前处理液，不受温度的限制，可以在常温下保存和运输，降低了运输成本、储存条件的要求。在加入病毒及内源基因组后，在25℃保存三天，再进行PCR检测，仍可稳定检出。
2、利用本发明的前处理液在加热条件下对样品进行裂解，无需用加入磁珠及蛋白酶K，操作更加便捷，避免吸磁、洗涤、转移过程造成的核酸损失和污染，同时也降低了检测成本。
3、不需要物理的破碎、离心等步骤，最大限度的保证核酸的完整性，降低操作复杂度。
4、一步法核酸提取，操作简单便捷，只需要将样本直接放入前处理液加热即可完成提取。
具体实施例
为了解决现有技术操作复杂等问题，提供了PCR样本检测的前处理液。
具体如下：
A、本实施例前处理液配方为：
表1前处理液配方
上述前处理液1-8体积相同，验证前处理液性能时，添加相同量的乙型肝炎病毒进行比较。
实施例1-8探究温度和时间对不同前处理液的影响，具体方法如下：
(1)将加入乙型肝炎病毒的试剂管插入核酸提取仪，所用提取仪为中元汇吉EXM6000；
(2)95℃，2min加热进行核酸提取；
(3)接着降温到37℃，加入R2冻干试剂；
(4)转入PCR仪中(市售的任何仪器均可)进行PCR检测，设置流程具体如下：
a、37℃，2min UNG酶消化；
b、50℃，5min逆转录
c、95℃，2min预变性
d、PCR循环，即95℃、10s变性，60℃、30s退火延伸，并实时监控。
所述步骤(3)中R2试剂为：
实施例1
前处理液1的稳定性研究
温度和时间的影响：用采样试子采集乙型肝炎病毒，加入前处理液1中，在25℃、4℃、-20℃、-70℃，保存12小时、24小时、48小时、72小时，随后进行病毒核酸提取和扩增。
结果如表2
保存效果如表2所示，结果表明随着时间的增加，Ct值逐渐增大，说明病毒完整程度随时间的增加而降低。而在检测的时间范围内，温度对前处理液的效果影响并不大，说明前处理液不受温度的影响，可以在-70℃～25℃范围内稳定保存。
表2温度和时间对前处理液1的影响
实施例2
用采样试子采集乙型肝炎病毒，加入前处理液2中，在25℃、4℃、-20℃、-70℃，保存12小时、24小时、48小时、72小时，随后进行病毒核酸提取和扩增。
结果如表3所示，结果表明随着时间的增加，Ct值逐渐增大，说明病毒完整程度随时间的增加而降低。
而在检测的时间范围内，温度对前处理液的效果影响并不大，随着温度的上升，同一时间内的Ct值相差并不是很大，说明前处理液不受温度的影响，可以在-70℃～25℃范围内稳定保存。
表3温度和时间对前处理液2的影响
实施例3
用采样试子采集乙型肝炎病毒，加入前处理液3中，在25℃、4℃、-20℃、-70℃，保存12小时、24小时、48小时、72小时，随后进行病毒核酸提取和扩增。
结果如表4所示，果表明随着时间的增加，Ct值逐渐增大，说明病毒完整程度随时间的增加而降低。
而在检测的时间范围内，温度对前处理液的效果影响并不大，随着温度的上升，同一时间内的Ct值相差并不是很大，说明前处理液不受温度的影响，可以在-70℃～25℃范围内稳定保存。
表4温度和时间对前处理液3的影响
实施例4
用采样试子采集乙型肝炎病毒，加入前处理液4中，在25℃、4℃、-20℃、-70℃，保存12小时、24小时、48小时、72小时，随后进行病毒核酸提取和扩增。
结果如表5所示，结果表明随着时间的增加，Ct值逐渐增大，说明病毒完整程度随时间的增加而降低。而在检测的时间范围内，温度对前处理液的效果影响并不大，随着温度的上升，同一时间内的Ct值相差并不是很大，说明前处理液不受温度的影响，可以在-70℃～25℃范围内稳定保存。
表5温度和时间对前处理液4的影响
实施例5：
用采样试子采集乙型肝炎病毒，加入前处理液5中，在25℃、4℃、-20℃、-70℃，保存12小时、24小时、48小时、72小时，随后进行病毒核酸提取和扩增。
结果如表6所示，表明随着时间的增加，Ct值逐渐增大，说明病毒完整程度随时间的增加而降低。而在检测的时间范围内，温度对前处理液的效果影响并不大，随着温度的上升，同一时间内的Ct值相差并不是很大，说明前处理液不受温度的影响，可以在-70℃～25℃范围内稳定保存。
表6温度和时间对前处理液5的影响
实施例6
用采样试子采集乙型肝炎病毒，加入前处理液6中，在25℃、4℃、-20℃、-70℃，保存12小时、24小时、48小时、72小时，随后进行病毒核酸提取和扩增。
结果如表7所示，相比于前5个实施例，本实施例保存12小时后，在相同时间内，ΔCt为5左右，说明利用本实施例的前处理液，即未添加阴离子型聚合物，保存之后的病毒核酸，需要更多的扩增循环数，才能达到和前面5种前处理液相同的效果。
同时，对于使用本实施前处理液的病毒，随着时间的增加，Ct值逐渐增大，说明病毒完整程度随时间的增加而降低。而在检测的时间范围内，温度对前处理液的效果影响并不大，随着温度的上升，同一时间内的Ct值相差并不是很大，说明前处理液不受温度的影响，可以在-70℃～25℃范围内稳定保存。
说明温度和时间对于本实施例前处理液和实施例1-5中前处理液的影响趋势一致。
表7温度和时间对前处理液6的影响
实施例7
用采样试子采集乙型肝炎病毒，加入前处理液7中，在25℃、4℃、-20℃、-70℃，保存12小时、24小时、48小时、72小时，随后进行病毒核酸提取和扩增。
结果如表8所示，结果如表8所示，相比于实施例1-5中的前处理液，本实施例中乙型肝炎病毒在前处理液7中保存12小时后，在相同时间内，ΔCt为6左右，说明利用本实施例的前处理液，即，未添加阴离子型聚合物，保存之后的病毒核酸，需要更多的扩增循环数，才能达到和前面5种前处理液相同的效果。
同时，对于使用本实施前处理液的病毒，随着时间的增加，Ct值逐渐增大，说明病毒完整程度随时间的增加而降低。而在检测的时间范围内，温度对前处理液的效果影响并不大，随着温度的上升，同一时间内的Ct值相差并不是很大，说明前处理液不受温度的影响，可以在-70℃～25℃范围内稳定保存。
说明温度和时间对于本实施例前处理液和实施例1-5中前处理液的影响趋势一致。
表8温度和时间对前处理液7的影响
实施例8
用采样试子采集乙型肝炎病毒，加入前处理液8中，在25℃、4℃、-20℃、-70℃，保存12小时、24小时、48小时、72小时，随后进行病毒核酸提取和扩增。
结果如表8所示，结果如表9所示，结果表明随着时间的增加，Ct值逐渐增大，说明病毒完整程度随时间的增加而降低。而在检测的时间范围内，温度对前处理液的效果影响并不大，随着温度的上升，同一时间内的Ct值相差并不是很大，说明前处理液不受温度的影响，可以在-70℃～25℃范围内稳定保存。
但保存时间48h时，Ct值已经增加了2左右，说明保存48小时，病毒核酸稳定性已经开始降低，相比于实施例1-5中的前处理液，保存的时间更短。且保存12h的Ct值约为25，与实施例1-5中相比，ΔCt约为1.5，说明前处理8核酸提取的完整性不如前处理1-5，这可能是未添加尿素、无机盐等成分，使样本在高温裂解时，受到损害。但相比于前处理液6和7来说，核酸提取效果是更好的，相比与前处理液6，保存12h，ΔCt为3左右；相比与前处理液6，保存12h，ΔCt为4左右，说明只含有缓冲液、还原剂和阴离子型聚合物的前处理液就能够实现对核酸的提取和PCR的准确检测，但保存时间稍短，可能是未添加甘油、叠氮钠等可以延长保存的物质。
表9温度和时间对前处理液8的影响
结合实施例1-8，分析温度和时间对前处理液的影响
探究保存12小时，温度25℃、4℃、-20℃、-70℃对前处理液1-7的影响，以及在室温(25℃)下，保存12小时、24小时、48小时、72小时对前处理液的影响。
结果显示，前处理液1-7可以保存在-70℃～25℃温度条件下，温度对其性能影响不大，相同时间内温度从-70℃～25℃，ΔCt值小于1。
但保存时间对前处理液的性质有明显的影响，前处理液1-5保存3天以内，Ct值变化不大，保存5天会有所增加，说明在前处理液中放置5天的病毒会开始丢失完整性，为了保持核酸信息完整性，最好保存时间在5天以内。
而前处理液6相比于前处理液1-5，保存12小时后ΔCt约5；前处理液7相比于前处理液1-5，保存12小时后ΔCt约6。
说明在同一批、取同等体积的乙型肝炎病毒，添加了阴离子型聚合物的前处理液，相对于添加普通聚合物和未添加阴离子型聚合物的前处理液，病毒核酸的完整性更高，能够用更少的循环，达到相同的扩增效果。
而前处理8验证了，只需要缓冲液、还原剂和阴离子型聚合物，就能够实现良好的PCR检测结果。
实施例9
为了更加清楚完整的表明前处理液中阴离子聚合物的可替换性，扩展前处理液的配方，前处理液9-25与前处理液1-5的配方相似，只更换了其中阴离子聚合物的种类。
表10前处理液配方
各前处理液对样本的处理效果，通过将前处理液用于提取三种不同的病毒中进行比较，病毒样本加入提取液后，立即放入中元EXM6000核酸提取仪中，95℃高温提取，冷却至室温后，放入PCR仪中进行荧光检测。
PCR检测
检测不同病毒，R2中的引物探针换为病毒特异性引物探针。
检测方法：用采样拭子分别采集乙型肝炎病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒，其中乙型肝炎病毒的引物探针序列(上游引物：5'-CGCACCTCTCTTTACG-3’，下游引物：5'-GGTGAAGCGAAGTGC-3’，荧光探针：5'-FAM-CCGTCTGTGCCTTCTCATCT-TAMRA-3’),甲型流感病毒(上游引物5’-GGTACGGTTATCACCATCAAAA-3’，下游引物：下游引物：5’-GTTAGTAATCTCGTCAATGGCATT-3’，荧光探针：5’-FAM-ATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACA-TAMRA-3’)，把每个样本分别加入到配方1-7的病毒前处理液中，然后用0.9％的生理盐水将样本按10倍、100倍、1000倍、10000倍稀释，临床样本加入纯生理盐水的组别作为对照组。样本加入病毒前处理液后，取200微升病毒前处理液使用病毒提取试剂进行核酸提取，核酸提取洗脱液取10μL与10μL相应检测反应液混合之后上机做PCR核酸敏感度实验，测定Ct值。
表10乙型肝炎病毒
表11甲型流感病毒
表12乙型流感病毒
结果表明：
前处理液1-5对于同一种病毒的影响不大，前处理液6和7相比于前处理液1-5对于病毒核酸的完整性保藏，效果较差，1-5效果说明阴离子型聚合物的添加，对于病毒前处理液性能的提升具有决定性作用。而前处理液8相对于前处理液1-5效果稍差，但是比前处理液6和7效果好，说明只有缓冲液、还原剂和阴离子聚合物就能实现核酸的提取，但是因为没有一些辅助的物质存在，效果稍弱。
而前处理液9-25的结果与前处理液1-5类似，进一步说明了，前处理液中阴离子聚合物是可以在不同种类之间替换的，不会影响提取效果。
但是在不同的病毒中间，实验过程中不好控制前处理液中病毒核酸量的一致性，所以不同的病毒间Ct值本身存在一定的差异，但是通过将三种不同病毒添加到前处理液1-25中，可以得到相同的变化趋势。
实施例10
磁珠法PCR检测效果
所用核酸提取试剂盒(磁珠法)为来自重庆中元汇吉生物技术公司。
表13磁珠法核酸提取的组分
检测具体方法如下：
A:核酸提取
(1)取出包装盒中的各组分，平衡至室温后，混匀备用。
(2)混合500μL提取试剂I、4μL磁珠溶液和15μL蛋白酶成工作液。
(3)在离心管中，按照工作溶液：样本＝5:2，添加样本，震荡并上下混匀5s，置于55℃干浴器上加热裂解4min。
(4)瞬时离心5s后，将离心管置于磁分离器上吸磁1min，然后将上清液吸除。
(5)加入600μL提取试剂II，震荡混匀5s，瞬时离心后将离心管置于磁分离器上吸磁1min，上后将上清液吸除。
(6)静置1min后，将管底残留的液体吸除。
(7)加入50～100μL洗脱液，震旦混匀，瞬时离心。
(8)将离心管置于80℃干浴器上加热洗脱2min。
(9)将离心管置于磁分离器上，取上清。
B：PCR检测
(10)将步骤(9)中的上清液加入PCR溶液：
(11)37℃，2min UNG酶消化；
(12)50℃，5min逆转录
(13)95℃，2min预变性
(14)PCR循环，即95℃、10s变性，60℃、30s退火延伸，并实时监控。
上述PCR液的成分如下：
检测不同病毒，加入特异性的引物探针，其中乙型肝炎病毒的引物探针序列为(5'-FAM-CCGTCTGTGCCTTCTCATCT-TAMRA-3’),甲型流感病毒的引物探针序列为(5’-FAM-ATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACA-TAMRA-3’)，乙型流感病毒的引物探针序列为(5’-FAM-CCCGGAACCCATCCCCGGA-TANRA-3’)
PCR检测
检测方法：用采样拭子分别采集乙型肝炎病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒，把每个样本分别加入上述工作液中，然后用0.9％的生理盐水将样本按10倍、100倍、1000倍、10000倍稀释，临床样本加入纯生理盐水的组别作为对照组。样本加入病毒前处理液后，取200微升病毒前处理液使用病毒提取试剂进行核酸提取，核酸提取洗脱液取10μL与10μL相应检测反应液混合之后上机做PCR核酸敏感度实验，测定Ct值。
表14磁珠法对不同病毒的PCR检测
从结果可以看出，同样的样本，磁珠法提取再利用PCR检测的效果略差于本发明，ΔCt约为1，说明本发明的前处理液能够更好的保证提取核酸的完整性。
此外，磁珠法提取过程必须涉及吸磁、转移核酸的过程，才能将提取的核酸进行PCR扩增检测，操作复杂且容易造成核酸的损失，且吸磁还需要用到磁棒等仪器结构对溶液中的磁珠进行吸附，操作复杂且易被污染。
本发明的PCR样本前处理液，不需要蛋白酶K，可以降低试剂的成本，也不会有酶失活对提取效果产生影响的问题，同时不含有磁珠，不需要多余的吸磁结构，可以降低仪器的复杂程度，同时降低由磁棒吸磁带来的污染问题。
所以相对于目前使用较多的磁珠法核酸提取再进行PCR扩增检测，本发明的方法简单易操作、实现了一步法核酸检测，且提取效果较好，适合用于临床试验。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (11)
1.可溶性阴离子型聚合物在PCR检测前处理中的应用，所述阴离子型聚合物选自聚丙烯酸钠、聚4-苯乙烯磺酸钠盐、硫酸软骨素钠、透明质酸钠、硫酸葡聚糖钠盐、聚乙烯基硫酸钾、聚苯乙烯磺酸钙、聚茴香醚磺酸钠、聚乙烯基膦酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸钠、羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟甲基纤维素、聚谷氨酸、聚-L-赖氨酸、聚马来酸酐、月桂醇聚醚磷酸钾、聚磷酸钾、聚硅酸锂或硫酸软骨素钙，所述阴离子型聚合物的浓度为0.1-100mM。
2.一种PCR检测样本的前处理方法，其特征在于，所述前处理方法包含使用前处理液处理样本的过程，所述前处理液包括缓冲液、还原剂和如权利要求1所述的0.1-100mM的可溶性阴离子型聚合物。
3.如权利要求2所述的前处理方法，其特征在于，所述阴离子型聚合物的浓度为1-20mM。
4.如权利要求2或3所述的前处理方法，其特征在于，所述缓冲液选自Tris-HCl、HEPES、MOPS或Tricine，所述缓冲液的pH＝7.5-8.5。
5.如权利要求2所述的前处理方法，其特征在于，所述还原剂选自DTT、β-巯基乙醇、TCEP、半胱氨酸或谷胱甘肽。
6.如权利要求5所述的前处理方法，其特征在于，所述还原剂的浓度为0.1-100mM。
7.如权利要求5所述的前处理方法，其特征在于，所述样本前处理液还包括尿素。
8.如权利要求7所述的前处理方法，其特征在于，所述尿素的浓度为0.01-2M。
9.如权利要求5-8任意一项所述的前处理方法，其特征在于，所述样本前处理液还包括防腐剂和表面活性剂。
10.如权利要求9所述的前处理方法，其特征在于，所述防腐剂选自叠氮钠、Proclin300、硫柳汞或庆大霉素，所述防腐剂的浓度为：0.01-1％，所述表面活性剂选自：0.01-1％的Triton、吐温、SDS、NP-40或N-月桂酰肌氨酸钠。
11.如权利要求9所述的前处理方法，其特征在于，所述样本前处理液还包括1-30％甘油。
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