DE69838944T2 - Cytomegalovirus nachweis mit nuklein-säuren - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonukleotide, welche verwendet werden können, wie etwa beim Erfassen von mRNA des menschlichen Zytomegalievirus (HCMV) durch Amplifikation. Darüber hinaus wird ein Verfahren für die Diagnose von HCMV-Erkrankung zur Verfügung gestellt.
  • Das menschliche Zytomegalievirus ist ein ubiquitäres Virus vom Herpes-Typ mit einem doppelsträngigen DNA-Genom von etwa 240000 Nukleotiden Länge, das 40–80% der Menschen vor der Pubertät infiziert. Ein hervorstechendes Merkmal, das allen Herpesviren gemeinsam ist, ist ihre Einrichtung einer lebenslangen Persistenz nach der Infektion und ihre Fähigkeit, eine wiederkehrende Infektion nach einer Reaktivierung zu verursachen (Stevens, J. G., Microbiol. Rev. 53, 318–332, 1989). HCMV wird auch nach der primären Infektion latent, welche häufig ohne klinische Symptome stattfindet. Selbst eine wiederkehrende Infektion verläuft in den meisten Fällen asymptomatisch oder führt zu einer nur schwachen Erkrankung im immunkompetenten Wirt. In kongenital infizierten Kleinkindern und immunkompromittierten Patienten, wie Allotransplantat-Empfängern (Meyers, J. D., et al., J. Infect. Dis. 153, 478–488, 1986) oder AIDS-Patienten (Drew, W. L., J. Infect. Dis. 158, 449–456, 1988; Drew, W. L., Clin. Infect. Dis. 14, 608–615, 1992), in welchen das empfindliche Gleichgewicht zwischen dem Immunsystem und dem latent vorliegenden Virus gestört ist, kann HCMV eine schwere und manchmal lebensbedrohliche Krankheit verursachen, einschließlich Retinitis, gastrointestinalen Störungen und Enzephalitis (Drew, 1992). Die frühe Verabreichung von antiviralen Arzneimitteln, wie Ganciclovir und Foscarnet, kann bedeutende nutzbringende Effekte auf die Prognose eines Patienten aufweisen (Jahn, G., et al., Intervirology 35, 60–72, 1993; Schmidt, G. M., et al., N. Engl. J. Med. 324, 1005–1011, 1991). Deshalb ist eine frühe und empfindliche Diagnose, bei Verfügbarkeit einer klinisch wirksamen antiviralen Therapie, von ausschlaggebender Bedeutung.
  • CMV-spezifische Antikörper, insbesondere IgM-Antikörper, können als Marker für eine CMV-Infektion verwendet werden, sind aber von begrenztem Nutzen, wenn es um die Unterscheidung zwischen latenten und aktiven Infektionen geht. Die meisten derzeit angewandten Virus-Nachweisverfahren gestatten keine zweifelsfreie Vorhersage, ob eine gegebene Infektion symptomatisch sein wird. Weiterhin sind serologische Verfahren indirekt, und häufig fehlt es ihnen an Empfindlichkeit. Eine Virenkultur ist ein direkterer diagnostischer Parameter für CMV-Virämie. Obwohl CMV-Kultur aus Blutzellen für eine aktive CMV-Infektion aussagefähig zu sein schien, gestattet das Verfahren nicht eine rasche Diagnose und ist technisch schwierig. Dar über hinaus entspricht die Virenkultur nicht notwendigerweise der HCMV-Krankheit. Eine zuverlässige Beziehung zwischen Virusisolierung aus peripheren Leukozyten und dem Auftreten klinischer Symptome kann in einigen immununterdrückten Patienten nicht vorliegen (Delgado, R., et al., J. Clin. Microbiol. 30, 1876–1878, 1992). Auch die im Urin oder Pharynx erfolgende Absonderung des Virus findet häufig ohne klinische Symptome und Beteiligung eines Organs statt. Die Amplifikation von HCMV-DNA in peripheren Leukozyten durch Polymerasekettenreaktion (PCR) ist, obwohl sie eine sehr empfindliche Technik für CMV-Virämie ist, ebenfalls nicht als ein Marker für eine klinische symptomatische HCMV-Infektion anwendbar. Wegen der hohen Empfindlichkeit der enzymatischen Amplifikation war HCMV-DNA gelegentlich ohne HCMV-verwandte Krankheit in peripheren Leukozyten nachweisbar. Latente virale Genome können durch diese Technik nachgewiesen werden, oder ein Patient kann hinsichtlich HCMV-DNA über einen längeren Zeitraum positiv bleiben, nachdem die Krankheit abgeklungen ist (Jahr, G., et al., 1993; Zipeto, D., et al., J. Clin. Microbiol. 30, 527–530, 1992; Delgado et al., 1992).
  • Gegenwärtig ist das Verfahren der Wahl für die frühe Diagnose von akuter symptomatischer HCMV-Infektion der Antigenämie-Assay, basierend auf dem immunologischen Nachweis des Strukturproteins pp65 unter Verwendung spezifischer Antikörper (Storch, G. A., et al., J. Clin. Microbiol. 32, 997–1003, 1994; Gerna, G., et al., J. Infect. Dis. 164, 488–498, 1991; Gerna, G., et al., J. Clin. Microbiol. 30, 1232–1237.98, 1992). Allerdings ist ein Bedenken bei der Anwendung dieses Verfahrens seine Empfindlichkeit. Die Anzahl von pp65-positiven Zellen im frühen Verlauf der Infektion kann sehr gering sein. Weiterhin schien die Stabilität des pp65-Antigens in exprimierenden Zellen begrenzt zu sein (Chou, S., Curr. Opin. Infect. Dis. 5, 427–432, 1991), und die Empfindlichkeit kann wegen der Anwendung von monoklonalen Antikörpern statt eines Pools von Anti-pp65-Antikörpern, die unterschiedliche Epitope des Proteins erkennen würden, vermindert sein.
  • Da die Virusreplikation die Transkription von mRNA-Spezies erfordert, wurde die Anwendung von HCMV-mRNA-Nachweis als Marker für eine aktive CMV-Infektion untersucht (Bitsch, A., et al., J. Infect. Dis. 167, 740–743, 1993).
  • Kürzlich wurden HCMV-Infektionen auf der Transkript-Ebene unter Anwendung von RNA-Amplifikation untersucht (Bitsch, A., et al., 1993; Meyer, T., et al., Mol. Cell Probes, 8, 261–271, 1994; Gerna, G., et al., J. Clin. Micobiol. 30, 1232–1237.98, 1993; Gerna, G., et al., J. Clin. Micobiol. 30, 1232–1237.98, 1992). Im Prinzip sollte die Analyse von viralen Transkripten, welche in Verbindung mit der Virusreplikation exprimiert werden, wie der Nachweis von viralen Antigenen, eine zuverlässige Diagnose von symptomatischen Infektionen erlauben.
  • Noch kürzlicher wurde der Nachweis bestimmter mRNAs von HCMV, d. h. basierend auf IEA ("immediate early" Antigen)- und der Matrixtegumentprotein-pp67-mRNA, in der WO96/06191 beschrieben. Allerdings weisen die Oligonukleotide, bei Verwendung in der Amplifikation und als Sonden im Nachweis der HCMV-pp67-mRNA, wie in der besagten Patentanmeldung offenbart, mehrere Nachteile im Vergleich zu den Oligonukleotiden der vorliegenden Erfindung auf. In Vergleichsuntersuchungen wurde deutlich, dass die neuen Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung mehrere Vorteile gegenüber den Oligonukleotiden, wie offenbart in der WO96/06191 , aufweisen. Diese Untersuchungen werden im experimentellen Abschnitt der Beschreibung dargestellt.
  • Die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit (Robustheit) des CMV-mRNA-Nachweises ist stark abhängig von der Wahl der in der Amplifikation verwendeten Oligonukleotide, da es eine Sequenzvariation unter den Stämmen von CMV potentiell in jeder Region des Genoms gibt. Idealerweise sollte die Primer-Wahl auf der Kenntnis der Variabilität hinsichtlich der Kandidaten-Primersequenzen zwischen Stämmen und der Konsequenzen von Fehlpaarung an Primer-Stellen basieren (Chou, S., J. of Clin. Microbiol., 2307–2310, 1992).
  • Deshalb besteht ein Bedarf nach geeigneten Oligonukleotiden, einschließlich Nukleinsäuresequenzen, die in der Amplifikation und beim anschließenden Nachweis aller Stammvarianten von CMV verwendet werden können.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis einer bestimmten späten HCMV-mRNA und sieht Oligonukleotide vor, die zur Verwendung in der Amplifikation und dem anschließenden Nachweis dieser mRNA geeignet sind. Die Bindungsstellen der Oligonukleotide gemäss der vorliegenden Erfindung sind in der das Matrixtegumentprotein pp67 kodierenden Gensequenz (UL65) lokalisiert, die während der späten Phase der CMV-Infektion exprimiert wird.
  • Oligonukleotide gemäss der vorliegenden Erfindung sind 10–35 Nukleotide lang und umfassen mindestens ein Fragment von 10 Nukleotiden einer Sequenz 5'-CTGGAGATATATGTTGACCA-3' [SEQ. ID. Nr.: 2], oder ihrer komplementären Sequenz.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein Oligonukleotid, das mit einer Promotorsequenz verbunden ist.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung richtet sich auf die folgenden Oligonukleotidsequenzen:
    5'-aattctaatacgactcactatagggagaGGGTCGATTCAGACTGA-3' in Kombination mit 5'-CTGGAGATATATGTTGACCA-3'.
  • Es wird die T7-Promotorsequenz gezeigt, aber sie kann durch eine beliebige andere geeignete Promotorsequenz ersetzt werden.
  • Wie bereits oben angegeben, und wie es im experimentellen Abschnitt der Beschreibung dargestellt ist, wird sowohl die Empfindlichkeit als auch die Zuverlässigkeit des CMV-mRNA-Nachweises unter Verwendung der Oligonukleotide gemäss der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu auf diesem Gebiet verwendeten bekannten Oligonukleotiden stark verbessert, Der Begriff "Oligonukleotid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Molekül, das aus zwei oder mehreren Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden aufgebaut ist, wie Primer und Sonden.
  • Der Begriff "Primer", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein entweder natürlich (z. B. als ein Restriktionsfragment) vorkommendes oder synthetisch hergestelltes Oligonukleotid, das in der Lage ist, als ein Punkt der Initiation der Synthese eines Primerverlängerungsprodukts zu wirken, welches komplementär zu einem Nukleinsäurestrang (Matrize oder Targetsequenz) ist, wenn es unter geeignete Bedingungen (z. B. Puffer, Salz, Temperatur und pH) in Gegenwart von Nukleotiden und einem Mittel zur Nukleinsäure-Polymerisation, wie einer DNA-abhängigen oder RNA-abhängigen Polymerase, gebracht wird. Ein Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in Gegenwart eines Mittels zur Polymerisation zu primen bzw. auszulösen. Ein typischer Primer enthält mindestens etwa 10 Nukleotide Länge einer Sequenz. die im wesentlichen komplementär (P1) oder homolog (P2) zur Targetsequenz ist, aber etwas längere Primer sind bevorzugt. Üblicherweise enthalten Primer etwa 15–26 Nukleotide. aber längere Primer können ebenfalls verwendet werden.
  • Normalerweise wird ein Set von Primer aus mindestens zwei Primer bestehen, einem "Stromaufwärts" und einem "Stromabwärts"-Primer, welche zusammen das Amplifikat (die Sequenz, welche unter Verwendung der besagten Primer amplifiziert werden wird) definieren.
  • Die Oligonukleotide gemäss der Erfindung können auch mit einer Promotorsequenz verbunden sein. Der Begriff "Promotorsequenz" definiert eine Region einer Nukleinsäuresequenz, die von einer RNA-Polymerase spezifisch erkannt wird, welche an eine erkannte Sequenz bindet und den Prozess der Transkription initiiert, durch den ein RNA-Transkript hergestellt wird. Im Prinzip kann eine beliebige Promotorsequenz verwendet werden, für die es eine bekannte und verfügbare Polymerase gibt, die zum Erkennen der Initiationssequenz in der Lage ist. Bekannte und verwendbare Promotoren sind diejenigen, welche von bestimmten Bakteriophagen-RNA-Polymerasen, wie Bakteriophage T3, T7 oder SP6, erkannt werden.
  • Es versteht sich, dass Oligonukleotide, die aus den Sequenzen der vorliegenden Erfindung bestehen, kleinere Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von Nukleinsäurebasen in dem Ausmaß enthalten können, dass solche Änderungen die erhaltene Ausbeute oder das erhaltene Produkt nicht zu irgendeinem bedeutenden Ausmaß negativ beeinflussen.
  • Eine Oligonukleotidsequenz, die als Nachweissonde verwendet wird, kann mit einer erfassbaren Einheit markiert sein. Verschiedene Markierungseinheiten sind im Fachgebiet bekannt. Die besagte Einheit kann zum Beispiel entweder eine radioaktive Verbindung, ein erfassbares Enzym (z. B. Meerrettichperoxidase (HRP)) oder irgendeine andere Einheit sein, die zur Erzeugung eines erfassbaren Signals, wie eines kolorimetrischen, fluoreszenten, chemolumineszenten oder elektrochemolumineszenten Signals, in der Lage ist. Bevorzugte Analysesysteme, in denen die besagten Markierungen verwendet werden, sind die Elektrochemolumineszenz(ECL)-basierte Analyse oder die auf "Enzyme-Linked-Gel-Assay" (ELGA) basierte Analyse.
  • Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren für die Diagnose der symptomatischen CMV-Krankheit, wobei die Gegenwart der pp67-mRNA, kodierend ein spätes Strukturprotein des menschlichen Zytomegalievirus, in einer Blutprobe eines Individuums, von dem angenommen wird, dass es diese Krankheit hat, festgestellt wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • – Amplifizieren einer Targetsequenz innerhalb der besagten mRNA unter Einsatz von Oligonukleotiden gemäss der Erfindung und geeigneter Amplifikationsreagenzien,
    • – Reagieren der Probe, optional enthaltend amplifizierte Nukleinsäure, mit einem Oligonukleotid gemäss der vorliegenden Erfindung als Nachweissonde,
    • – Erfassen von Hybriden, die zwischen der amplifizierten Sequenz und der Probe ausgebildet sind.
  • Verschiedene Techniken zum Amplifizieren von Nukleinsäure sind im Fachgebiet bekannt. Ein Beispiel einer Technik zum Amplifizieren eines DNA-Targetsegments ist die sogenannte "Polymerasekettenreaktion" (PCR). Mit der PCR-Technik wird die Kopienzahl eines besonderen Targetsegments exponentiell mit der Anzahl an Zyklen erhöht. Ein Paar von Primern wird verwendet, und in jedem Zyklus wird ein DNA-Primer an die 3'-Seite von jedem der zwei Stränge der doppelsträngigen DNA-Targetsequenz annealt bzw. angelagert. Die Primer werden mit einer DNA-Polymerase in Gegenwart der verschiedenen Mononukleotide verlängert, um erneut doppelsträngige DNA zu erzeugen. Die Stränge der doppelsträngigen DNA werden durch thermische Denaturierung voneinander getrennt, und jeder Strang dient als Matrize für das Primer-Annealen und die anschließende Verlängerung in einem nachfolgenden Zyklus. Das PCR-Verfahren ist in Saiki et al., Science 230, 135, 1985, und in den europäischen Patenten Nr. EP 200362 und EP 201184 beschrieben worden.
  • Eine andere Technik für die Amplifikation von Nukleinsäure ist das sogenannte Transkriptions-basierte Amplifikationssystem (TAS). Das TAS-Verfahren wird in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 88/10315 beschrieben. Transkriptions-basierte Amplifikationstechniken umfassen üblicherweise das Behandeln der Targetnukleinsäure mit zwei Oligonukleotiden, von denen eines eine Promotorsequenz umfasst, um eine Matrize zu erzeugen, welche einen funktionellen Promotor umfasst. Mehrere Kopien an RNA werden von besagter Matrize transkribiert und können als Basis für weitere Amplifikation dienen.
  • Ein isothermisches kontinuierliches Transkriptions-basiertes Amplifikationsverfahren ist das sogenannte NASBA-Verfahren ("NASBA"), wie beschrieben im europäischen Patent Nr. EP 329822 . NASBA schließt die Verwendung von T7-RNA-Polymerase ein, um mehrere Kopien von RNA von einer Matrize, die einen T7-Promotor einschließt, zu transkribieren.
  • Für RNA-Amplifikation (wie bei dem Verfahren gemäss der Erfindung) ist die NASBA-Technologie, oder eine andere Transkriptions-basierte Amplifikationstechnik, eine bevorzugte Technologie.
  • Wenn RT-PCR für den Nachweis von viralen Transkripten eingesetzt wird, ist eine Differenzierung von mRNA- und DNA-abgeleiteten Produkten notwendig. Für gespleisste Transkripte, wie IEA-mRNA, kann die Exon-Intron-Struktur verwendet werden. Allerdings werden die mRNA-Spezies, welche die späten Strukturproteine kodieren, fast ausschließlich von ungespleissten Transkripten kodiert. DNAse-Behandlung vor RT-PCR kann eingesetzt werden (Bitsch, A., et al., J. Infect. Dis. 167, 740–743, 1993; Meyer, T., et al., Mol. Cell Probes, 8, 261–271, 1994), aber versagt manchmal darin, kontaminierende DNA ausreichend zu entfernen (Bitsch, A., et al., 1993).
  • Im Gegensatz zu RT-PCR benötigt NASBA, welche auf RNA-Transkription durch T7-RNA-Polymerase basiert (Kievits et al., 1991; Compton, 1991), keine Differenzierung zwischen RNA- und DNA-abgeleiteten Amplifikationsprodukten, da sie nur RNA als ihr Hauptziel verwendet. NASBA ermöglicht die spezifische Amplifikation von RNA-Zielen, selbst in einem Hintergrund von DNA. Besonders für ungespleisste Ziele, wie fast allen späten HCMV-Gentranskripten, ist dieses Verfahren nützlich, da es die DNAse-Behandlung umgeht, welche gelegentlich ineffizient sein könnte (Bitsch, A. et al., 1993).
  • Dieses Verfahren wurde für die Analyse von CMV-Transkripten in Vollblutproben aus HIV-infizierten Individuen eingesetzt.
  • Testkits für das Erfassen von CMV in klinischen Proben sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. Ein Testkit gemäss der Erfindung kann ein Paar von Oligonukleotiden gemäss der Erfindung und eine Sonde, umfassend ein Oligonukleotid gemäss der Erfindung, umfassen. Ein solches Testkit kann zusätzlich geeignete Amplifikationsreagenzien, wie DNA- und/oder RNA-Polymerasen, und Mononukleotide umfassen. Testkits, welche mit dem Verfahren gemäss der Erfindung eingesetzt werden können, können die Oligonukleotide gemäss der Erfindung für die Amplifikation und den anschließenden Nachweis von pp67-mRNA umfassen.
  • Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
  • BEISPIELE:
  • Beispiel 1: Analytische Empfindlichkeit von CMV-pp67-Oligonukleotiden bei Amplifikation und Nachweis
  • 1.1. Materialien und Methoden
  • 1.1.1. In-vitro-RNA
  • RNA mit einer Länge von 1125 Nukleotiden, umfassend 338 Nukleotide der CMV-mRNA, kodierend das pp67-Matrixtegumentprotein, wurde in vitro aus einem klonierten Fragment des entsprechenden Gens durch T7-RNA-Polymerase-basierte Transkription synthetisiert. Vor der Transkription wurde Plasmid-DNA durch BamHI-Verdau linearisiert, wobei diese einmalige Restriktionsstelle etwa 800 Basenpaare (bp) stromabwärts des CMV-Inserts gelegen ist. Die verdaute DNA wurde durch Phenolextraktion gereinigt und durch Ethanolfällung konzentriert. Die Transkription von der linearisierten Plasmid-DNA aus wurde durchgeführt in Transkriptionspuffer [40 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 7,5); 6 mM Magnesiumchlorid; 2 mM Spermidin; 10 mM Natriumchlorid], welcher mit 0,5 mM jedes rNTPs, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 1 Unit pro μl "RNA Guard" (Pharmacia) und etwa 500 Units T7-RNA-Polymerase (Pharmacia) ergänzt war. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wurde DNase I (Boehringer) zu einer Endkonzentration von 0,1 Unit pro μl zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde bei 37°C weitere 30 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurde in vitro erzeugte RNA aus der Reaktionsmischung unter Einsatz eines RNeasy-RNA-Reinigungs-Kits (Qiagen) gereinigt. Schließlich wurde die Konzentration der In-vitro-RNAs durch Messung der OD (260 nm) bestimmt, und geeignete serielle Verdünnungen in Wasser wurden bei –70°C aufbewahrt.
  • 1.1.2. Oligonukleotide, welche in der Amplifikation und als Sonden verwendet werden
  • Sequenzen und Polarität der in der Amplifikation eingesetzten Oligonukleotide und der für die spezifische Erfassung eingesetzten Sonden werden in der Tabelle 1 gezeigt.
  • Alle Oligonukleotide wurden auf einem PCR-MATE 391-DNA-Synthesizer (Applied Biosystems) unter Einsatz der Phosphoramidit-Biochemie synthetisiert. Oligonukleotide für die ELGA-Erfassung (siehe nachfolgend) wurden mit einem 5'-Amino-Link (Aminolink 2; Applied Biosystems) für die anschließende Kopplung von Meerrettichperoxidase (HRP) synthetisiert.
  • In der Amplifikation eingesetzte Oligonukleotide wurden durch elektrophoretische Auftrennung der unreinen Oligonukleotidlösungen über ein 20%iges Polyacrylamid/7 M Harnstoff-Flachgel und anschließende Flution des Volllängen-Oligonukleotids aus der entsprechenden Gelbande gereinigt. Nach der Flution aus den Gelstückchen und Konzentrierung durch Ethanolfällung wurden die Oligonukleotide in Milli-Q-Wasser gelöst, und die Konzentrationen wurden durch Messung der OD (260 nm) bestimmt.
  • Für die ELGA-Detektion wurde die Oligonukleotidsonde CMV-pp67-HRP 1 mit HRP (Boehringer) durch Koppeln des Enzyms an den Amino-Link des Oligonukleotids unter Einsatz der Vernetzungsreagenzien SDPD (Pharmacia) und EMCS (Fluka) konjugiert. Nicht-gebundene HRP wurde über eine Qiagen-Tip-100-Säule (Qiagen) entfernt. Das HRP-markierte Oligonukleotid wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließende Flution des HRP-Oligonukleotids aus den Gelstückchen durch Inkubation in Wasser über Nacht gereinigt. Die Menge des HRP-konjugierten Oligonukleotids wurde aus der Messung der OD (260 nm) und OD (400 nm) berechnet. Die Lösungen wurden bei –70°C aufbewahrt.
  • Für die ECL-Erfassung wurde die Oligonukleotidsonde CMV-pp67-ECL (Tabelle 1) mit der ECL-Markierung konjugiert durch Inkubieren des Aminolink-Oligonukleotids mit TAG-NHS-Ester (Igen). Nichtgebundene Markierung wurde durch Hindurchleiten der Reaktionsmischung über eine Qiagen-Tip-100-Säule (Qiagen) entfernt. Die Menge an ECL-markiertem Oligonukleotid wurde aus der Messung der OD (260 nm) und OD (460 nm) bestimmt. Die Lösung wurde bei –70°C aufbewahrt und ohne weitere Reinigung verwendet.
  • 1.1.3. NASBA-Amplifikation
  • RNA-Amplifikationen wurden unter Einsatz der NASBA-Amplifikationstechnologie durchgeführt. Um eine NASBA-Amplifikationsreaktion anzusetzen, wurde ein Prämix erzeugt durch Mischen von 4 μl 5x-Reaktionspuffer [200 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 8,5), 350 mM Kaliumchlorid, 60 mM Magnesiumchlorid, 25 mM DTT, 5 mM jedes dNTPs, 10 mM ATP, CTP und UTP, 7,5 mM GTP und 2,5 mM ITP] mit 2 μl Zuckerlösung [15% (w/v) Saccharose, 5% (w/v) Mannitol, 5% (w/v) Dextran T40] und 4 μl eines Mix mit 1 μΜ jedes in der Amplifikation zu verwendenden Oligonukleotides in 75% DMSO. Von diesem Prämix wurden 10 μl zu 5 μl Nukleinsäurelösung gegeben und während 5 Minuten bei 65°C inkubiert. Anschließend wurden die Reaktionsröhrchen bei 41°C während 5 Minuten inkubiert, bevor 5 μl Enzymmix [32 Units T7-RNA Polymerase; 6,4 Units AMV Reverse Transkriptase; 0,08 μl RNase H; 2,1 μg BSA; 20 mM DTT; 1,5 M Sorbitol] zugegeben wurden. Nach der letzten Zugabe wurden die Röhrchen durch vorsichtiges Klopfen gemischt, zentrifugiert und bei 41°C während 90 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden gestoppt, indem man sie auf –20°C brachte.
  • 1.1.4. Analyse von NASBA-amplifizierten Reaktionsprodukten durch ELGA
  • Für die Analyse von NASBA-Reaktionsprodukten wurde ein auf Flüssighybridisierung basierter, nicht-radioaktiver "Enzym-linked"-Gel-Assay (ELGA) angewandt. Die Hybridisierung von Amplifikationsprodukt an eine spezifische HRP-markierte Oligonukleotidsonde wurde durchgeführt durch Mischen von 3 μl einer NASBA-Amplifikationsreaktion mit 1 μl 6 × SSC, 1 μl konzentriertem Auftragspuffer [25% (v/v) Glycerol; 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0); 0,05% Bromphenolblau, 0,01% Xylencyanol] und 1 μl Stammlösung des HRP-markierten Oligonukleotids CMV-pp67-HRP 1 (Tabelle 1), gefolgt von Inkubation bei 45°C während 15 Minuten. Nach der Hybridisierung wurde die Hälfte der Reaktionsmischung direkt auf ein 7%iges Polyacrylamidgel aufgetragen, welches mit 0,04% (w/v) Dextransulfat ergänzt worden war. Nach der Trennung von gebundenen und ungebundenen HRP-markiertem Oligonukleotid durch Elektrophorese wurde die Sonde im Gel durch direkte Färbung mit 50 ml Substratlösung [125 μg 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin pro ml; 0,003% Wasserstoffperoxid; 100 mM Natriumcitratpuffer (pH 5,2)] während etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur sichtbar gemacht. Schließlich wurde das Gel durch Inkubation über Nacht in einer Lösung von 50% (v/v) Methanol fixiert und luftgetrocknet.
  • 1.2 Ergebnisse
  • 1.2.1 Analytische Empfindlichkeit von CMV-pp67-Oligonukleotiden bei Einsatz in NASBA
  • Um die analytische Empfindlichkeit des verbesserten CMV-pp67-NASBA-Oligonukleotidpaars gemäss der vorliegenden Erfindung (CMV-pp67-5) zu bestimmen und diese Empfindlichkeit mit der analytischen Empfindlichkeit des bekannten ( WO 96/06191 ) CMV-pp67-Paars (CMV-pp67-4) (Tabelle 1) zu vergleichen, wurde eine Verdünnungsreihe von in vitro erzeugter RNA erstellt, welche die Targetsequenz von beiden Paaren beinhaltet. Die einzelnen Proben dieser Verdünnungsreihe enthielten 10000, 1000, 100 bzw. 10 Moleküle von in vitro erzeugter RNA. In mehreren unabhängigen Experimenten wurde die NASBA-Amplifikation dieser Verdünnungsreihe mit diesen zwei CMV-pp67-NASBA-Oligonukleotidpaaren (Tabelle 1) durchgeführt. Ein typisches Beispiel ist in der Tabelle 2 gezeigt.
  • Der direkte Vergleich der Paare zeigte, dass in diesem Beispiel die geringste Menge an In-vitro-RNA-Molekülen, welche mit CMV-pp67-4 erfasst werden konnte, 1000 Moleküle war, wohin gegen mit der verbesserten Kombination CMV-pp67-5 auch 100 Moleküle Eingangs-RNA ein positives NASBA-Ergebnis ergaben.
  • Die Tabelle 3 fasst die Ergebnisse von fünf unabhängigen Experimenten zusammen. Für jedes Paar wird die geringste Menge an In-vitro-RNA, welche noch ein positives NASBA-Ergebnis in einem jeweiligen Experiment ergab, gezeigt.
  • Die Paare, welche analysiert wurden, weisen eine vergleichbare analytische Empfindlichkeit in NASBA auf, da mit beiden Kombinationen das Vorhandensein von 100 Molekülen in vitro erzeugter RNA in einer Probe nach der NASBA-Amplifikation aufgezeigt werden kann. Allerdings schien die CMV-pp67-4-Kombination in drei von fünf Analysen eine geringere Nachweisgrenze von 1000 Molekülen in vitro erzeugter RNA aufzuweisen, wohingegen CMV-pp67-5 konsistent ein positives NASBA-Ergebnis für 100 Moleküle Eingangs-RNA in allen Analysen, welche durchgeführt wurden, zeigte (Tabelle 3).
  • Deshalb wurde die CMV-pp67-5-Kombination als robuster für die NASBA-Amplifikation erachtet. Es wurde vorhergesehen, dass dieser vorteilhafte Aspekt dieses neuen Oligonukleotidpaars nicht nur für den Nachweis von in vitro erzeugter RNA sondern auch für den Nachweis von authentischer CMV-pp67-Protein kodierender mRNA zutrifft, wie sie in klinischen Proben von mit CMV infizierten Individuen vorgefunden wird.
  • Beispiel 2: Erfassen von CMV-pp67-Protein kodierender mRNA in klinischen Proben.
  • 2.1. Materialien und Methoden
  • 2.1.1. Klinische Testproben
  • 495 Proben wurden aus einer Testgruppe von 134 AIDS-Patienten erhalten. Diese mit Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) antikoagulierten Vollblutproben, die aufeinander folgend, wie vom Laboratorium empfangen, aufgenommen wurden, wurden mit neun Volumina Lysepuffer [50 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 6,4); 20 mM EDTA; 1,3% (w/v) Triton X-100; 5,25 M Guanidiniumthiocyanat] gemischt und bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
  • 2.1.2. Oligonukleotide
  • Sequenzen und Polarität der in Amplifikation und Erfassung verwendeten Oligonukleotide sind in der Tabelle 1 gezeigt. Für weitere Details wird auf den Punkt 1.1.2. im Abschnitt über Materialien und Methoden von Beispiel 1 Bezug genommen.
  • 2.1.3. Nukleinsäureisolierung
  • Aus den mit Antikoagulationsmittel behandelten Blutproben wurde Gesamt-Nukleinsäure unter Anwendung von Guanidiniumthiocyanat-vermittelter Zelllyse und Adsorption von Nukleinsäure an Siliciumdioxid-Teilchen isoliert (Boom et al., J. of Clin. Microbiol. 28, 495–503, 1990).
  • Vollblutproben in Lysepuffer wurden aufgetaut, und aus jeder Probe wurde 1 ml (äquivalent zu 100 μl Vollblut) in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Anschließend wurden 50 μl Chlorwasserstoffsäure-aktivierte Siliciumdioxidteilchen [größen-selektierte Suspension von 1 mg/ml in 0,1 M Chlorwasserstoffsäure (Sigma); siehe Bezugsstelle Boom et al., 1990] zugegeben, und die Suspension wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur unter regelmäßigem Vortex-Schütteln inkubiert. An das Siliciumdioxid gebundene Nukleinsäure wurde durch Zentrifugation abzentrifugiert. Peletierte Siliciumdioxidteilchen wurden zweimal mit 1 ml GuSCN-Waschpuffer [50 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 6,4); 5,25 M Guanidiniumthiocyanat] gewaschen, gefolgt von zwei Waschschritten mit 1 ml 70%igem Ethanol und einem einzelnen Waschschritt mit 1 ml Aceton. Nach jedem Waschschritt wurde die Suspension kurz zentrifugiert und das Siliciumdioxidpellet wurde in der nächsten Waschlösung durch gründliches Mischen resuspendiert. Nach Entfernen des Acetons wurden die Siliciumdioxidteilchen durch Inkubation bei 56°C in einem Heizblock 10 Minuten lang getrocknet. Nukleinsäure wurde aus den Siliciumdioxidteilchen durch Inkubation in 50 μl Tris-gepuffertem Elutionsmedium (pH 7,5) bei 56°C 10 Minuten lang eluiert. Schließlich wurden die Siliciumdioxidteilchen erneut abzentrifugiert und der Überstand wurde vorsichtig in frische Reaktionsröhrchen pipettiert, um jeglichen Übertrag von Siliciumdioxid zu vermeiden. Extrahierte Nukleinsäureproben wurden bei –70°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
  • 2.1.4. NASBA-Amplifikation
  • Für die Amplifikation wurde eine sogenannte Accusphäre, die alle für eine NASBA-Reaktion notwendigen Bestandteile (siehe auch "NASBA-Amplifikation"-Kapitel im Abschnitt Materialien und Methoden von Beispiel 1) in einer lyophilisierten Form enthält, in einer mit Tris-HCl (pH 8,5) gepufferten Lösung von 30% (v/v) DMSO rekonstituiert. Anschließend wurden, für jede zu analysierende Probe, 5 μl Nukleinsäure-Lösung und 10 μl der Oligonukleotid-Lösung in ein Teströhrchen gegeben. Die resultierenden Mischungen wurden 5 Minuten lang bei 65°C erwärmt, wonach die Röhrchen auf 41°C gestellt wurden. Nach 5 Minuten Inkubation bei 41°C wurden 5 μl Enzymlösung, welche 32 Units T7-RNA-Polymerase, 6,4 Units AMV Reverse Transkriptase und 0,08 Units RNase H enthielt, zugegeben und der Inhalt des Röhrchens wurde durch vorsichtiges Klopfen gemischt. Die Reaktionen wurden 90 Minuten lang bei 41°C in einem Wasserbad inkubiert. Die Reaktionen wurden gestoppt, indem man sie auf –20°C stellte.
  • 2.1.5. Analyse von NASBA-amplifizierten Reaktionsprodukten durch ECL-Erfassung
  • Für die auf Elektrochemolumineszenz (ECL) basierte Analyse wurden die Nachweisreagenzien durch Vortexen einer Einfangsonden-Lösung, enthaltend biotinylierte Einfangsonde CMV-pp67-CAP (Tabelle 1), immobilisiert auf Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Kügelchen (Dynal), bis eine opake Lösung gebildet wurde, und anschließendes Mischen von 10 μl dieser Suspension (enthaltend 3,4 × 105 mit Einfangsonde beladene Kügelchen) und 10 μl einer Lösung von CMV-pp67-ECL-Sonde (Tabelle 1) (enthaltend 3,4 × 1011 Moleküle ECL-markierte Sonde) in frischen Reaktionsröhrchen hergestellt. Zu diesen Mischungen wurden 5 μl einer zweifach verdünnten NASBA-Reaktion zugegeben und 30 Minuten lang bei 41°C inkubiert. Während der Hybridisierung wurden die Röhrchen alle 10 Minuten vermischt. Anschließend wurden 300 μl NASBA-QR-System Assay-Puffer (Organon Teknika) in jedes Hybridisierungsröhrchen zugegeben, und die Röhrchen wurden in einem NASBA-QR-System für die automatisierte Ablesung von ECL-Signalen positioniert.
  • 2.2. Ergebnisse
  • 2.2.1. Nachweis von CMV-pp67-mRNA in klinischen Proben mit zwei verschiedenen Oligonukleotid-Paaren.
  • Vollblutproben aus Patienten, die klinisch gefährdet für Infektion mit CMV waren, wurden hinsichtlich Gegenwart von das Matrixtegumentprotein pp67 kodierender CMV-mRNA (CMV-pp67-mRNA) mit den zwei verschiedenen Oligonukleotidpaaren (Tabelle 1) analysiert, die für NASBA-Amplifikation geeignet sind.
  • Insgesamt 495 Proben aus AIDS-Patienten, welche zuvor durch NASBA-Amplifikation mit der Kombination CMV-pp67-4 (Tabelle 1) analysiert worden waren, wurden nun erneut unter ähnlichen NASBA-Bedingungen mit dem verbesserten Paar CMV-pp67-5 analysiert, welches der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. In der Tabelle 4 werden die mit jedem der Paare erhaltenen Ergebnisse gezeigt und miteinander verglichen.
  • Obwohl aus früheren Experimenten kein (statistisch) signifikanter Unterschied in der analytischen Empfindlichkeit dieser Sätze von Oligonukleotiden festgestellt werden konnte (wegen der Tatsache, dass nur einige wenige Proben getestet wurden; siehe Beispiel 1), schien das verbesserte Set CMV-pp67-5 für den Nachweis von CMV-pp67-mRNA durch NASBA in aus Vollblutproben extrahierten Nukleinsäurelösungen viel besser geeignet zu sein. Auf Grund der Menge an Proben (n = 495) ist dieser Unterschied auch statistisch signifikant.
  • In 65 Proben enthüllte das verbesserte Paar CMV-pp67-5 ein positives NASBA-Ergebnis, wohingegen mit dem Paar CMV-pp67-4 durchgeführte NASBA-Reaktionen negativ waren. In nur 9 Fällen (von denen 5 schwierig zu interpretieren waren) war es genau umgekehrt.
  • Als Schlussfolgerung scheint das neue und verbesserte Oligonukleotid-Paar gemäss der vorliegenden Erfindung (CMV-pp67-5), außer dass es robuster als das Set CMV-pp67-4 ist (Beispiel 1), auch beim Nachweis von CMV-pp67-mRNA in klinischen Proben überlegen zu sein.
  • Beispiel 3: Nachweis von CMV-pp67-Protein kodierender mRNA in klinischen Proben
  • 3.1. Materialien und Methoden
  • 3.1.1. Klinische Proben
  • Achtzehn mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) antikoagulierte Vollblutproben wurden aus einer Testgruppe von AIDS-Patienten erhalten. Innerhalb einiger Stunden nach der Blutentnahme wurden die Proben mit neun Volumina Lysepuffer (siehe Abschnitt 2.1.1) gemischt und bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
  • Zehn mit Heparin antikoagulierte Vollblutproben wurden aus Nierentransplantat-Empfängern an Zeitpunkten erhalten, an welchen von den Patienten angenommen wurde, an einer CMV-Infektion zu leiden. Wie für die Proben aus AIDS-Patienten wurden auch diese Proben am Tag der Blutentnahme zu Lysepuffer zugesetzt und bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
  • 3.1.2. Primer und Sonden
  • Sequenzen und Polarität der für das spezifische Erfassen verwendeten Primer und Sonden sind in der Tabelle 1 gezeigt. Für weitere Details wird auf Punkt 1.1.2 im Abschnitt Materialien und Methoden von Beispiel 1 Bezug genommen.
  • 3.1.3. Nukleinsäureisolierung
  • Gesamt-Nukleinsäure wurde aus den mit Antikoagulationsmittel behandelten Blutproben in Lysepuffer isoliert, wie beschrieben im Punkt "Nukleinsäureisolierung" im Abschnitt über Materialien und Methoden von Beispiel 2. Extrahierte Nukleinsäureproben wurden durch NASBA-Amplifikation ohne vorherige Aufbewahrung bei –70°C analysiert.
  • 3.1.4. NASBA-Amplifikation
  • RNA-Amplifikationen wurden im Wesentlichen durchgeführt, wie beschrieben im Punkt "NASBA-Amplifikation" im Abschnitt über Materialien und Methoden von Beispiel 1. Jeder Nukleinsäureextrakt wurde in zweifacher Ausfertigung sowohl mit dem Primerpaar CMV-pp67-4 als auch CMV-pp67-5 analysiert (siehe Tabelle 1).
  • 3.1.5. Analyse von NASBA-amplifizierten Reaktionsprodukten durch ELGA
  • Für die Analyse NASBA-Reaktionsprodukten durch "Enzym-linked" Gel-Assay (ELGA) wird auf Abschnitt 1.1.4 im Abschnitt über Materialien und Methoden von Beispiel 1 Bezug genommen. Allerdings betrug die hier verwendete Hybridisierungstemperatur 41°C anstatt 45°C wie in Beispiel 1.
  • 3.1.6. Analyse von NASBA-amplifizierten Reaktionsprodukten durch ECL-Nachweis
  • Die Elektrochemolumineszenz(ECL)-basierte Analyse wurden im Wesentlichen durchgeführt, wie in Punkt 2.1.5 im Abschnitt über Materialien und Methoden von Beispiel 2 beschrieben. Wie beim ELGA-Nachweis (Punkt 3.1.5) wurde eine Hybridisierungstemperatur von 41°C verwendet.
  • 3.2. Ergebnisse
  • 3.2.1 Nachweis von CMV-pp67-mRNA-Amplikons, die mit zwei verschiedenen Primerpaaren erzeugt wurden
  • Im vorangehenden Beispiel (Beispiel 2) wurden RNA-Amplikons, welche durch NASBA-Amplifikation unter Verwendung des Primerpaars CMV-pp67-4 (Tabelle 1) erzeugt worden waren, durch ELGA-Nachweis analysiert, wohingegen CMV-pp67-RNA, welche aus den gleichen klinischen Proben mit dem Primerpaar CMV-pp67-5 amplifiziert wurde, durch ECL-basierte Analyse nachgewiesen wurde. Für einen direkteren Vergleich dieser NASBA-Primer für CMV-pp67-RNA wurden in diesem Beispiel Nukleinsäureextrakte mit jedem Primerpaar amplifiziert und anschließend durch das selbe Nachweisverfahren analysiert. Für jede Amplifikationsreaktion wurden sowohl ELGA-Ergebnisse als auch ECL-Ergebnisse erstellt.
  • Gesamtnukleinsäure wurde aus 18 Vollblutproben von AIDS-Patienten, bei denen ein klinisches Risiko einer Infektion mit CMV bestand, extrahiert. Anschließend wurde CMV-pp67-RNA in zweifacher Ausfertigung aus diesen Extrakten durch NASBA-Amplifikation amplifiziert, wobei entweder das Primerpaar CMV-pp67-4 oder CMV-pp67-5 verwendet wurde. Schließlich wurden die in jeder der einzelnen Amplifikationsreaktionen erzeugten Amplikons mittels ELGA unter Verwendung der mit Meerrettichperoxidase (HRP) markierten Sonde CMV-pp67-HRP-1 (Tabelle 1) und mittels ECL-basiertem Nachweis mit der Sonde CMV-pp67-ECL (Tabelle 1) in Kombination mit CMV-pp67-CAP, welche eine biotinylierte Version des ELGA-Sondenoligonukleotids ist, analysiert. Auf eine ähnliche Weise wurden zehn klinische Proben von Nierentransplantat-Patienten analysiert, und die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 zusammengefasst. Beim Vergleich der mit jedem Primerpaar erhaltenen ELGA-Ergebnisse zeigte das Primerpaar CMV-pp67-5, für 10 individuelle Amplifikationsreaktionsprimer, ein positives Ergebnis, wohingegen die entsprechende Amplifikation des gleichen Nukleinsäureextrakts mit dem Primerpaar CMV-pp67-4 negativ war (Tabelle 5, Proben 4, 6, 10, 12, 13, 17, 18, 26 (2 Reaktionen) und 27). In nur 4 Fällen (Proben 9 (2 Reaktionen), 10, 28) war es umgekehrt.
  • Der Vergleich der ECL-Daten ergab ein ähnliches Ergebnis: 16 sich widersprechende Ergebnisse, von denen 11 ein positives Ergebnis mit dem Primerpaar CMV-pp67-5 betrafen, gegenüber einem negativen Ergebnis mit dem Primerpaar CMV-pp67-4 (Proben 4, 6, 7, 12 (2 Reaktionen), 13, 15, 18, 26 und 27 (2 Reaktionen)). Für 5 Reaktionen war es umgekehrt (Proben 5, 7, 9, 10 und 18).
  • Der Vergleich auf Ebene der Probe und das Annehmen einer Testprobe als positiv hinsichtlich CMV-pp67-mRNA, wenn eine oder beide Amplifikationsreaktionen positiv sind, würde acht Testproben als positiv für diese CMV-mRNA mit dem Primerpaar CMV-pp67-5 aufgezeigt haben, welche mit dem Primerpaar CMV-pp67-4 unter Anwendung des ELGA-Nachweises negativ gewesen wären (Proben 4, 6, 12, 13, 17, 18, 26 und 27), und eine Testprobe als negativ mit dem Primerpaar CMV-pp67-5, welche mit dem Primerpaar CMV-pp67-4 positiv ist (Probe 9). Unter Anwendung der ECL-Erfassung wären fünf Proben durch das Primerpaar CMV-pp67-4 nicht als hinsichtlich CMV-pp67-mRNA positiv erkannt worden, und dem Primerpaar CMV-pp67-5 wäre erneut nur eine einzige Probe entgangen.
  • Als Schlussfolgerung ist CMV-pp67-5 ein empfindlicheres Primerpaar für die NASBA-Amplifikation von CMV-pp67-mRNA als CMV-pp67-4, ungeachtet des Nachweisverfahrens (sei es ELGA- oder ECL-basierte Erfassung), welches für das Analysieren der mit jedem Primerpaar erzeugten Amplikons angewandt wird. Tabelle 1: Oligonukleotide, die bei der NASBA-Amplifikation und dem Nachweis von CMV-pp67 mRNA verwendet werden
    Figure 00150001
  • Die T7 Promotorsequenz wird in kleinen Buchstaben angegeben. Tabelle 2: Analytische Empfindlichkeit von zwei CMV-pp67-Paaren von Oligonukleotiden, wenn sie in NASBA verwendet werden.
    ELGA Ergebnis
    Input-RNA CMV-pp67-4 CMV-pp67-5
    104 + +
    103 + +
    102 +
    101
    Tabelle 3: Vergleich von zwei CMV-pp67-Paaren von Oligonucleotiden, die in NASBA verwendet werden.
    niedrigere Nachweisgrenze*
    Experiment CMV-pp67-4 CMV-pp67-5
    1 103 102
    2 102 102
    3 102 102
    4 102 102
    5 103 102
    • * niedrigere Nachweisgrenze: niedrigste Menge an Input-RNA, welche immer noch ein positives NASBA-Ergebnis zeigt.
    Tabelle 4: Analyse von CMV-pp67-mRNA-Oligonucleotiden bei Amplifikationen, die bezüglich klinischen Proben durchgeführt werden (n = 495)
    neue CMV-pp67-5 Oligo's
    positiv negativ
    (bekannte) CMV-pp67-4-Oligo's positiv 53 (10)* 4 (5)*
    negativ 65 358
    • * zwischen den Klammern wird die Zahl von schwach positiven Proben, die mit den CMV-pp67-4-Paaren erhalten werden, angegeben.
    Tabelle 5: Analyse von klinischen Vollblutproben mittels NASBA mit zwei unterschiedlichen CMV-pp67-mRNA-Primerpaaren.
    Probe Nr. Probenidentifikation Probenquelle CMV-pp67-5 CMV-pp67-4
    ELGA ECL ELGA ECL
    1 93,1 Aids-Patient +/+ +/+ +/+ +/+
    2 93,2 '' +/+ +/+ +/+ +/+
    3 93,3 '' +/+ +/+ +/+ +/+
    4 93,4 '' +/– +/– –/– –/–
    5 94,5 '' –/– –/– –/– +/–
    6 94,6 '' +/– +/+ –/– +/–
    7 94,7 '' –/– +/– –/– –/+
    8 95,18 '' (+)/+ +/+ +/(+) +/+
    9 95,19 '' –/– –/+ (+)/+ +/+
    10 95,20 '' +/– +/– –/(+) +/+
    11 94,9 '' +/+ +/+ (+)/(+) +/+
    12 94,10 '' +/– +/+ –/– –/–
    13 94,11 '' +/– +/– –/– –/–
    14 94,12 '' +/+ +/+ +/+ +/+
    15 94,13 '' –/(+) –/+ –/(+) –/–
    16 94,14 '' +/+ +/+ +/+ +/+
    17 94,16 '' –/(+) –/+ –/– –/+
    18 95,17 '' (+)/– +/– –/– –/+
    19 M2896062-1 Nierentransplantat +/+ +/+ +/+ +/+
    20 M2896062-2 '' +/+ +/+ +/+ +/+
    21 M2896062-3 '' +/+ +/+ +/+ +/+
    22 M2896062-4 '' +/+ +/+ (+)/(+) +/+
    23 M2896062-5 '' +/+ +/+ +/+ +/+
    24 M2896062-6 '' +/– +/+ +/– +/+
    25 M2896062-7 '' +/+ +/+ +/+ +/+
    26 M2896062-8 '' +/(+) +/+ –/– –/+
    27 M2896062-19 '' +/– +/+ –/– –/–
    28 M2896062-20 '' +/– +/+ +/+ +/+
    • + positiv
    • (+) schwach positiv
    • – negativ
    SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00180001
    Figure 00190001
    Figure 00200001

Claims (10)

  1. Oligonukleotid, entsprechend einem Teil einer Nukleinsäuresequenz kodierend HCMV pp67, wobei das besagte Oligonukleotid eine Länge von 10–35 Nukleotiden aufweist und umfassend mindestens ein Fragment von 10 Nukleotiden einer Sequenz bestehend aus: 5'-CTG GAG ATA TAT GTT GAC CA-3' [SEQ.ID.Nr.: 2], oder ihrer komplementären Sequenz.
  2. Oligonukleotid gemäss Anspruch 1 verbunden mit einer Promotersequenz.
  3. Paar von Oligonukleotiden für die Verstärkung einer Targetsequenz angeordnet innerhalb einer HCMV pp67 Sequenz, zur Verwendung als ein Set, umfassend ein Oligonukleotid mit einer Länge von 10–35 Nukleotiden und umfassend mindestens ein Fragment von 10 Nukleotiden einer Sequenz bestehend aus 5'-GGG TCG ATT CAG ACT GA-3' (SEQ.ID.Nr. 1] und ein zweites Oligonukleotid mit einer Länge von 10–35 Nukleotiden und umfassend mindestens ein Fragment von 10 Nukleotiden einer Sequenz bestehend aus 5'-CTG GAG ATA TAT GTT GAC CA-3' [SEQ.ID.Nr. 2].
  4. Verfahren für die Diagnose der symptomatischen ZMV-Krankheit (Zytomegalievirus), dadurch gekennzeichnet, dass die Gegenwart der pp67 mRNS, kodierend ein spätes Strukturprotein des menschlichen Zytomegalievirus in einer Blutprobe eines Individuums, von dem angenommen wird, dass es diese Krankheit hat, festgestellt wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Verstärken einer Targetsequenz innerhalb der besagten mRNS unter Einsatz eines Paars von Oligonukleotiden gemäss Anspruch 3 und geeigneter Verstärkungsreagenzien, – Reagieren der Probe, optional enthaltend verstärkte Nuklein säure, mit einem Oligonukleotid im wesentlichen umfassend die Sequenz 5'-GGA TTC GGA CTT TCC GTT CGA-3' (SEQ.ID.Nr.: 3] oder 5'-CCA AAA AGC TAG CCG TCA CG-3' (SEQ.ID.Nr.: 4], versehen mit einer erfassbaren Markierung, – Erfassen von Hybriden, die zwischen der verstärkten Sequenz und der Probe ausgebildet sind.
  5. Verfahren gemäss Anspruch 4, bei dem die mRNS verstärkt wird unter Einsatz einer Transkriptions-basierten Verstärkungstechnik.
  6. Verfahren gemäss Anspruch 5, bei dem die Sequenz 5'-GGG TCG ATT CAG ACT GA-3' [SEQ.ID.Nr. 1] mit einer Promotersequenz verbunden wird.
  7. Verfahren gemäss Anspruch 5, bei dem die besagte Verstärkungstechnik NASBA (Nukleinsäuresequenz basierte Verstärkung) ist.
  8. Verwendung eines Paares von Oligonukleotiden gemäss Anspruch 3 in einer Nukleinsäure-Verstärkungsreaktion.
  9. Testkit für die Diagnose der HCMV Krankheit (Humane Cytomegalievirus Krankheit) umfassend: – das Paar von Oligonukleotiden gemäss Anspruch 3, – ein Oligonukleotid umfassend eine Nukleinsäuresequenz im wesentlichen komplementär zu mindestens einem Teil der verstärkten Nukleinsäuresequenz, versehen mit einer erfassbaren Markierung, – geeignete Verstärkungreagenzien.
  10. Testkit gemäss Anspruch 9, bei dem das Oligonukleotid, das mit einer Markierung versehen ist, ein Oligonukleotid ist, bestehend im wesentlichen aus der Sequenz
    Figure 00230001
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