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Die
vorliegende Erfindung betrifft Oligonukleotide, welche verwendet
werden können,
wie etwa beim Erfassen von mRNA des menschlichen Zytomegalievirus
(HCMV) durch Amplifikation. Darüber
hinaus wird ein Verfahren für
die Diagnose von HCMV-Erkrankung zur Verfügung gestellt.
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Das
menschliche Zytomegalievirus ist ein ubiquitäres Virus vom Herpes-Typ mit
einem doppelsträngigen
DNA-Genom von etwa 240000 Nukleotiden Länge, das 40–80% der Menschen vor der Pubertät infiziert. Ein
hervorstechendes Merkmal, das allen Herpesviren gemeinsam ist, ist
ihre Einrichtung einer lebenslangen Persistenz nach der Infektion
und ihre Fähigkeit,
eine wiederkehrende Infektion nach einer Reaktivierung zu verursachen
(Stevens, J. G., Microbiol. Rev. 53, 318–332, 1989). HCMV wird auch
nach der primären
Infektion latent, welche häufig
ohne klinische Symptome stattfindet. Selbst eine wiederkehrende
Infektion verläuft
in den meisten Fällen
asymptomatisch oder führt
zu einer nur schwachen Erkrankung im immunkompetenten Wirt. In kongenital
infizierten Kleinkindern und immunkompromittierten Patienten, wie
Allotransplantat-Empfängern (Meyers,
J. D., et al., J. Infect. Dis. 153, 478–488, 1986) oder AIDS-Patienten (Drew,
W. L., J. Infect. Dis. 158, 449–456,
1988; Drew, W. L., Clin. Infect. Dis. 14, 608–615, 1992), in welchen das
empfindliche Gleichgewicht zwischen dem Immunsystem und dem latent
vorliegenden Virus gestört
ist, kann HCMV eine schwere und manchmal lebensbedrohliche Krankheit
verursachen, einschließlich
Retinitis, gastrointestinalen Störungen und
Enzephalitis (Drew, 1992). Die frühe Verabreichung von antiviralen
Arzneimitteln, wie Ganciclovir und Foscarnet, kann bedeutende nutzbringende
Effekte auf die Prognose eines Patienten aufweisen (Jahn, G., et
al., Intervirology 35, 60–72,
1993; Schmidt, G. M., et al., N. Engl. J. Med. 324, 1005–1011, 1991).
Deshalb ist eine frühe
und empfindliche Diagnose, bei Verfügbarkeit einer klinisch wirksamen
antiviralen Therapie, von ausschlaggebender Bedeutung.
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CMV-spezifische
Antikörper,
insbesondere IgM-Antikörper,
können
als Marker für
eine CMV-Infektion verwendet
werden, sind aber von begrenztem Nutzen, wenn es um die Unterscheidung
zwischen latenten und aktiven Infektionen geht. Die meisten derzeit
angewandten Virus-Nachweisverfahren
gestatten keine zweifelsfreie Vorhersage, ob eine gegebene Infektion
symptomatisch sein wird. Weiterhin sind serologische Verfahren indirekt,
und häufig
fehlt es ihnen an Empfindlichkeit. Eine Virenkultur ist ein direkterer
diagnostischer Parameter für
CMV-Virämie. Obwohl
CMV-Kultur aus Blutzellen für
eine aktive CMV-Infektion aussagefähig zu sein schien, gestattet
das Verfahren nicht eine rasche Diagnose und ist technisch schwierig.
Dar über
hinaus entspricht die Virenkultur nicht notwendigerweise der HCMV-Krankheit.
Eine zuverlässige
Beziehung zwischen Virusisolierung aus peripheren Leukozyten und
dem Auftreten klinischer Symptome kann in einigen immununterdrückten Patienten
nicht vorliegen (Delgado, R., et al., J. Clin. Microbiol. 30, 1876–1878, 1992).
Auch die im Urin oder Pharynx erfolgende Absonderung des Virus findet
häufig
ohne klinische Symptome und Beteiligung eines Organs statt. Die
Amplifikation von HCMV-DNA in peripheren Leukozyten durch Polymerasekettenreaktion
(PCR) ist, obwohl sie eine sehr empfindliche Technik für CMV-Virämie ist,
ebenfalls nicht als ein Marker für
eine klinische symptomatische HCMV-Infektion anwendbar. Wegen der
hohen Empfindlichkeit der enzymatischen Amplifikation war HCMV-DNA
gelegentlich ohne HCMV-verwandte Krankheit in peripheren Leukozyten nachweisbar.
Latente virale Genome können
durch diese Technik nachgewiesen werden, oder ein Patient kann hinsichtlich
HCMV-DNA über einen
längeren
Zeitraum positiv bleiben, nachdem die Krankheit abgeklungen ist
(Jahr, G., et al., 1993; Zipeto, D., et al., J. Clin. Microbiol.
30, 527–530,
1992; Delgado et al., 1992).
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Gegenwärtig ist
das Verfahren der Wahl für
die frühe
Diagnose von akuter symptomatischer HCMV-Infektion der Antigenämie-Assay,
basierend auf dem immunologischen Nachweis des Strukturproteins
pp65 unter Verwendung spezifischer Antikörper (Storch, G. A., et al.,
J. Clin. Microbiol. 32, 997–1003,
1994; Gerna, G., et al., J. Infect. Dis. 164, 488–498, 1991;
Gerna, G., et al., J. Clin. Microbiol. 30, 1232–1237.98, 1992). Allerdings
ist ein Bedenken bei der Anwendung dieses Verfahrens seine Empfindlichkeit.
Die Anzahl von pp65-positiven Zellen im frühen Verlauf der Infektion kann
sehr gering sein. Weiterhin schien die Stabilität des pp65-Antigens in exprimierenden
Zellen begrenzt zu sein (Chou, S., Curr. Opin. Infect. Dis. 5, 427–432, 1991),
und die Empfindlichkeit kann wegen der Anwendung von monoklonalen
Antikörpern
statt eines Pools von Anti-pp65-Antikörpern, die unterschiedliche
Epitope des Proteins erkennen würden,
vermindert sein.
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Da
die Virusreplikation die Transkription von mRNA-Spezies erfordert,
wurde die Anwendung von HCMV-mRNA-Nachweis als Marker für eine aktive
CMV-Infektion untersucht (Bitsch, A., et al., J. Infect. Dis. 167,
740–743,
1993).
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Kürzlich wurden
HCMV-Infektionen auf der Transkript-Ebene unter Anwendung von RNA-Amplifikation untersucht
(Bitsch, A., et al., 1993; Meyer, T., et al., Mol. Cell Probes,
8, 261–271,
1994; Gerna, G., et al., J. Clin. Micobiol. 30, 1232–1237.98,
1993; Gerna, G., et al., J. Clin. Micobiol. 30, 1232–1237.98,
1992). Im Prinzip sollte die Analyse von viralen Transkripten, welche
in Verbindung mit der Virusreplikation exprimiert werden, wie der
Nachweis von viralen Antigenen, eine zuverlässige Diagnose von symptomatischen
Infektionen erlauben.
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Noch
kürzlicher
wurde der Nachweis bestimmter mRNAs von HCMV, d. h. basierend auf
IEA ("immediate
early" Antigen)-
und der Matrixtegumentprotein-pp67-mRNA, in der
WO96/06191 beschrieben. Allerdings
weisen die Oligonukleotide, bei Verwendung in der Amplifikation
und als Sonden im Nachweis der HCMV-pp67-mRNA, wie in der besagten
Patentanmeldung offenbart, mehrere Nachteile im Vergleich zu den Oligonukleotiden
der vorliegenden Erfindung auf. In Vergleichsuntersuchungen wurde
deutlich, dass die neuen Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung
mehrere Vorteile gegenüber
den Oligonukleotiden, wie offenbart in der
WO96/06191 , aufweisen. Diese Untersuchungen
werden im experimentellen Abschnitt der Beschreibung dargestellt.
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Die
Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit
(Robustheit) des CMV-mRNA-Nachweises ist stark abhängig von
der Wahl der in der Amplifikation verwendeten Oligonukleotide, da
es eine Sequenzvariation unter den Stämmen von CMV potentiell in
jeder Region des Genoms gibt. Idealerweise sollte die Primer-Wahl
auf der Kenntnis der Variabilität
hinsichtlich der Kandidaten-Primersequenzen
zwischen Stämmen
und der Konsequenzen von Fehlpaarung an Primer-Stellen basieren
(Chou, S., J. of Clin. Microbiol., 2307–2310, 1992).
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Deshalb
besteht ein Bedarf nach geeigneten Oligonukleotiden, einschließlich Nukleinsäuresequenzen,
die in der Amplifikation und beim anschließenden Nachweis aller Stammvarianten
von CMV verwendet werden können.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis einer bestimmten späten HCMV-mRNA
und sieht Oligonukleotide vor, die zur Verwendung in der Amplifikation
und dem anschließenden
Nachweis dieser mRNA geeignet sind. Die Bindungsstellen der Oligonukleotide
gemäss
der vorliegenden Erfindung sind in der das Matrixtegumentprotein
pp67 kodierenden Gensequenz (UL65) lokalisiert, die während der
späten
Phase der CMV-Infektion exprimiert wird.
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Oligonukleotide
gemäss
der vorliegenden Erfindung sind 10–35 Nukleotide lang und umfassen
mindestens ein Fragment von 10 Nukleotiden einer Sequenz 5'-CTGGAGATATATGTTGACCA-3' [SEQ. ID. Nr.: 2], oder
ihrer komplementären
Sequenz.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein Oligonukleotid,
das mit einer Promotorsequenz verbunden ist.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung richtet sich auf die folgenden Oligonukleotidsequenzen:
5'-aattctaatacgactcactatagggagaGGGTCGATTCAGACTGA-3' in Kombination mit
5'-CTGGAGATATATGTTGACCA-3'.
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Es
wird die T7-Promotorsequenz gezeigt, aber sie kann durch eine beliebige
andere geeignete Promotorsequenz ersetzt werden.
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Wie
bereits oben angegeben, und wie es im experimentellen Abschnitt
der Beschreibung dargestellt ist, wird sowohl die Empfindlichkeit
als auch die Zuverlässigkeit
des CMV-mRNA-Nachweises
unter Verwendung der Oligonukleotide gemäss der vorliegenden Erfindung
im Vergleich zu auf diesem Gebiet verwendeten bekannten Oligonukleotiden
stark verbessert, Der Begriff "Oligonukleotid", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf ein Molekül,
das aus zwei oder mehreren Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden
aufgebaut ist, wie Primer und Sonden.
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Der
Begriff "Primer", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf ein entweder natürlich (z. B. als ein Restriktionsfragment)
vorkommendes oder synthetisch hergestelltes Oligonukleotid, das
in der Lage ist, als ein Punkt der Initiation der Synthese eines
Primerverlängerungsprodukts
zu wirken, welches komplementär
zu einem Nukleinsäurestrang
(Matrize oder Targetsequenz) ist, wenn es unter geeignete Bedingungen
(z. B. Puffer, Salz, Temperatur und pH) in Gegenwart von Nukleotiden
und einem Mittel zur Nukleinsäure-Polymerisation, wie
einer DNA-abhängigen
oder RNA-abhängigen Polymerase,
gebracht wird. Ein Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese
von Verlängerungsprodukten
in Gegenwart eines Mittels zur Polymerisation zu primen bzw. auszulösen. Ein
typischer Primer enthält
mindestens etwa 10 Nukleotide Länge
einer Sequenz. die im wesentlichen komplementär (P1) oder homolog (P2) zur
Targetsequenz ist, aber etwas längere
Primer sind bevorzugt. Üblicherweise
enthalten Primer etwa 15–26
Nukleotide. aber längere
Primer können
ebenfalls verwendet werden.
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Normalerweise
wird ein Set von Primer aus mindestens zwei Primer bestehen, einem "Stromaufwärts" und einem "Stromabwärts"-Primer, welche zusammen
das Amplifikat (die Sequenz, welche unter Verwendung der besagten
Primer amplifiziert werden wird) definieren.
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Die
Oligonukleotide gemäss
der Erfindung können
auch mit einer Promotorsequenz verbunden sein. Der Begriff "Promotorsequenz" definiert eine Region
einer Nukleinsäuresequenz,
die von einer RNA-Polymerase spezifisch erkannt wird, welche an
eine erkannte Sequenz bindet und den Prozess der Transkription initiiert,
durch den ein RNA-Transkript hergestellt wird. Im Prinzip kann eine
beliebige Promotorsequenz verwendet werden, für die es eine bekannte und
verfügbare
Polymerase gibt, die zum Erkennen der Initiationssequenz in der
Lage ist. Bekannte und verwendbare Promotoren sind diejenigen, welche
von bestimmten Bakteriophagen-RNA-Polymerasen, wie Bakteriophage
T3, T7 oder SP6, erkannt werden.
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Es
versteht sich, dass Oligonukleotide, die aus den Sequenzen der vorliegenden
Erfindung bestehen, kleinere Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen
von Nukleinsäurebasen
in dem Ausmaß enthalten können, dass
solche Änderungen
die erhaltene Ausbeute oder das erhaltene Produkt nicht zu irgendeinem
bedeutenden Ausmaß negativ
beeinflussen.
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Eine
Oligonukleotidsequenz, die als Nachweissonde verwendet wird, kann
mit einer erfassbaren Einheit markiert sein. Verschiedene Markierungseinheiten
sind im Fachgebiet bekannt. Die besagte Einheit kann zum Beispiel
entweder eine radioaktive Verbindung, ein erfassbares Enzym (z.
B. Meerrettichperoxidase (HRP)) oder irgendeine andere Einheit sein,
die zur Erzeugung eines erfassbaren Signals, wie eines kolorimetrischen,
fluoreszenten, chemolumineszenten oder elektrochemolumineszenten
Signals, in der Lage ist. Bevorzugte Analysesysteme, in denen die
besagten Markierungen verwendet werden, sind die Elektrochemolumineszenz(ECL)-basierte
Analyse oder die auf "Enzyme-Linked-Gel-Assay" (ELGA) basierte
Analyse.
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Eine
andere bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren für die Diagnose
der symptomatischen CMV-Krankheit, wobei die Gegenwart der pp67-mRNA,
kodierend ein spätes Strukturprotein
des menschlichen Zytomegalievirus, in einer Blutprobe eines Individuums,
von dem angenommen wird, dass es diese Krankheit hat, festgestellt
wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- – Amplifizieren
einer Targetsequenz innerhalb der besagten mRNA unter Einsatz von
Oligonukleotiden gemäss
der Erfindung und geeigneter Amplifikationsreagenzien,
- – Reagieren
der Probe, optional enthaltend amplifizierte Nukleinsäure, mit
einem Oligonukleotid gemäss der
vorliegenden Erfindung als Nachweissonde,
- – Erfassen
von Hybriden, die zwischen der amplifizierten Sequenz und der Probe
ausgebildet sind.
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Verschiedene
Techniken zum Amplifizieren von Nukleinsäure sind im Fachgebiet bekannt.
Ein Beispiel einer Technik zum Amplifizieren eines DNA-Targetsegments
ist die sogenannte "Polymerasekettenreaktion" (PCR). Mit der PCR-Technik
wird die Kopienzahl eines besonderen Targetsegments exponentiell
mit der Anzahl an Zyklen erhöht.
Ein Paar von Primern wird verwendet, und in jedem Zyklus wird ein
DNA-Primer an die 3'-Seite
von jedem der zwei Stränge
der doppelsträngigen
DNA-Targetsequenz annealt bzw. angelagert. Die Primer werden mit
einer DNA-Polymerase in Gegenwart der verschiedenen Mononukleotide
verlängert,
um erneut doppelsträngige
DNA zu erzeugen. Die Stränge
der doppelsträngigen
DNA werden durch thermische Denaturierung voneinander getrennt,
und jeder Strang dient als Matrize für das Primer-Annealen und die
anschließende
Verlängerung
in einem nachfolgenden Zyklus. Das PCR-Verfahren ist in Saiki et al., Science
230, 135, 1985, und in den europäischen
Patenten Nr.
EP 200362 und
EP 201184 beschrieben worden.
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Eine
andere Technik für
die Amplifikation von Nukleinsäure
ist das sogenannte Transkriptions-basierte Amplifikationssystem (TAS).
Das TAS-Verfahren wird in der internationalen Patentanmeldung Nr.
WO 88/10315 beschrieben.
Transkriptions-basierte Amplifikationstechniken umfassen üblicherweise
das Behandeln der Targetnukleinsäure
mit zwei Oligonukleotiden, von denen eines eine Promotorsequenz
umfasst, um eine Matrize zu erzeugen, welche einen funktionellen
Promotor umfasst. Mehrere Kopien an RNA werden von besagter Matrize
transkribiert und können
als Basis für
weitere Amplifikation dienen.
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Ein
isothermisches kontinuierliches Transkriptions-basiertes Amplifikationsverfahren
ist das sogenannte NASBA-Verfahren ("NASBA"), wie beschrieben im europäischen Patent
Nr.
EP 329822 . NASBA schließt die Verwendung
von T7-RNA-Polymerase ein, um mehrere Kopien von RNA von einer Matrize,
die einen T7-Promotor einschließt,
zu transkribieren.
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Für RNA-Amplifikation
(wie bei dem Verfahren gemäss
der Erfindung) ist die NASBA-Technologie, oder
eine andere Transkriptions-basierte Amplifikationstechnik, eine
bevorzugte Technologie.
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Wenn
RT-PCR für
den Nachweis von viralen Transkripten eingesetzt wird, ist eine
Differenzierung von mRNA- und DNA-abgeleiteten Produkten notwendig.
Für gespleisste
Transkripte, wie IEA-mRNA, kann die Exon-Intron-Struktur verwendet
werden. Allerdings werden die mRNA-Spezies, welche die späten Strukturproteine
kodieren, fast ausschließlich
von ungespleissten Transkripten kodiert. DNAse-Behandlung vor RT-PCR kann
eingesetzt werden (Bitsch, A., et al., J. Infect. Dis. 167, 740–743, 1993;
Meyer, T., et al., Mol. Cell Probes, 8, 261–271, 1994), aber versagt manchmal
darin, kontaminierende DNA ausreichend zu entfernen (Bitsch, A., et
al., 1993).
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Im
Gegensatz zu RT-PCR benötigt
NASBA, welche auf RNA-Transkription durch T7-RNA-Polymerase basiert (Kievits et al.,
1991; Compton, 1991), keine Differenzierung zwischen RNA- und DNA-abgeleiteten
Amplifikationsprodukten, da sie nur RNA als ihr Hauptziel verwendet.
NASBA ermöglicht
die spezifische Amplifikation von RNA-Zielen, selbst in einem Hintergrund
von DNA. Besonders für
ungespleisste Ziele, wie fast allen späten HCMV-Gentranskripten, ist
dieses Verfahren nützlich,
da es die DNAse-Behandlung umgeht, welche gelegentlich ineffizient
sein könnte
(Bitsch, A. et al., 1993).
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Dieses
Verfahren wurde für
die Analyse von CMV-Transkripten in Vollblutproben aus HIV-infizierten Individuen
eingesetzt.
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Testkits
für das
Erfassen von CMV in klinischen Proben sind ebenfalls Teil der vorliegenden
Erfindung. Ein Testkit gemäss
der Erfindung kann ein Paar von Oligonukleotiden gemäss der Erfindung
und eine Sonde, umfassend ein Oligonukleotid gemäss der Erfindung, umfassen.
Ein solches Testkit kann zusätzlich
geeignete Amplifikationsreagenzien, wie DNA- und/oder RNA-Polymerasen, und
Mononukleotide umfassen. Testkits, welche mit dem Verfahren gemäss der Erfindung
eingesetzt werden können,
können
die Oligonukleotide gemäss
der Erfindung für
die Amplifikation und den anschließenden Nachweis von pp67-mRNA
umfassen.
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Die
Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
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BEISPIELE:
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Beispiel 1: Analytische Empfindlichkeit
von CMV-pp67-Oligonukleotiden bei Amplifikation und Nachweis
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1.1. Materialien und Methoden
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1.1.1. In-vitro-RNA
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RNA
mit einer Länge
von 1125 Nukleotiden, umfassend 338 Nukleotide der CMV-mRNA, kodierend das
pp67-Matrixtegumentprotein, wurde in vitro aus einem klonierten
Fragment des entsprechenden Gens durch T7-RNA-Polymerase-basierte
Transkription synthetisiert. Vor der Transkription wurde Plasmid-DNA durch
BamHI-Verdau linearisiert, wobei diese einmalige Restriktionsstelle
etwa 800 Basenpaare (bp) stromabwärts des CMV-Inserts gelegen
ist. Die verdaute DNA wurde durch Phenolextraktion gereinigt und
durch Ethanolfällung
konzentriert. Die Transkription von der linearisierten Plasmid-DNA
aus wurde durchgeführt
in Transkriptionspuffer [40 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH
7,5); 6 mM Magnesiumchlorid; 2 mM Spermidin; 10 mM Natriumchlorid],
welcher mit 0,5 mM jedes rNTPs, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 1 Unit
pro μl "RNA Guard" (Pharmacia) und
etwa 500 Units T7-RNA-Polymerase (Pharmacia) ergänzt war. Nach 4 Stunden Inkubation bei
37°C wurde
DNase I (Boehringer) zu einer Endkonzentration von 0,1 Unit pro μl zugegeben,
und die Reaktionsmischung wurde bei 37°C weitere 30 Minuten lang inkubiert.
Anschließend
wurde in vitro erzeugte RNA aus der Reaktionsmischung unter Einsatz
eines RNeasy-RNA-Reinigungs-Kits (Qiagen) gereinigt. Schließlich wurde
die Konzentration der In-vitro-RNAs durch Messung der OD (260 nm)
bestimmt, und geeignete serielle Verdünnungen in Wasser wurden bei –70°C aufbewahrt.
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1.1.2. Oligonukleotide, welche in der
Amplifikation und als Sonden verwendet werden
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Sequenzen
und Polarität
der in der Amplifikation eingesetzten Oligonukleotide und der für die spezifische
Erfassung eingesetzten Sonden werden in der Tabelle 1 gezeigt.
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Alle
Oligonukleotide wurden auf einem PCR-MATE 391-DNA-Synthesizer (Applied
Biosystems) unter Einsatz der Phosphoramidit-Biochemie synthetisiert.
Oligonukleotide für
die ELGA-Erfassung
(siehe nachfolgend) wurden mit einem 5'-Amino-Link (Aminolink 2; Applied Biosystems)
für die
anschließende
Kopplung von Meerrettichperoxidase (HRP) synthetisiert.
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In
der Amplifikation eingesetzte Oligonukleotide wurden durch elektrophoretische
Auftrennung der unreinen Oligonukleotidlösungen über ein 20%iges Polyacrylamid/7
M Harnstoff-Flachgel und anschließende Flution des Volllängen-Oligonukleotids
aus der entsprechenden Gelbande gereinigt. Nach der Flution aus
den Gelstückchen
und Konzentrierung durch Ethanolfällung wurden die Oligonukleotide
in Milli-Q-Wasser gelöst, und
die Konzentrationen wurden durch Messung der OD (260 nm) bestimmt.
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Für die ELGA-Detektion
wurde die Oligonukleotidsonde CMV-pp67-HRP 1 mit HRP (Boehringer) durch
Koppeln des Enzyms an den Amino-Link des Oligonukleotids unter Einsatz
der Vernetzungsreagenzien SDPD (Pharmacia) und EMCS (Fluka) konjugiert.
Nicht-gebundene HRP wurde über
eine Qiagen-Tip-100-Säule
(Qiagen) entfernt. Das HRP-markierte Oligonukleotid wurde durch
Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließende Flution des HRP-Oligonukleotids
aus den Gelstückchen
durch Inkubation in Wasser über
Nacht gereinigt. Die Menge des HRP-konjugierten Oligonukleotids
wurde aus der Messung der OD (260 nm) und OD (400 nm) berechnet.
Die Lösungen
wurden bei –70°C aufbewahrt.
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Für die ECL-Erfassung
wurde die Oligonukleotidsonde CMV-pp67-ECL (Tabelle 1) mit der ECL-Markierung
konjugiert durch Inkubieren des Aminolink-Oligonukleotids mit TAG-NHS-Ester (Igen). Nichtgebundene
Markierung wurde durch Hindurchleiten der Reaktionsmischung über eine
Qiagen-Tip-100-Säule
(Qiagen) entfernt. Die Menge an ECL-markiertem Oligonukleotid wurde
aus der Messung der OD (260 nm) und OD (460 nm) bestimmt. Die Lösung wurde
bei –70°C aufbewahrt
und ohne weitere Reinigung verwendet.
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1.1.3. NASBA-Amplifikation
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RNA-Amplifikationen
wurden unter Einsatz der NASBA-Amplifikationstechnologie durchgeführt. Um eine
NASBA-Amplifikationsreaktion anzusetzen, wurde ein Prämix erzeugt
durch Mischen von 4 μl
5x-Reaktionspuffer [200 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH
8,5), 350 mM Kaliumchlorid, 60 mM Magnesiumchlorid, 25 mM DTT, 5
mM jedes dNTPs, 10 mM ATP, CTP und UTP, 7,5 mM GTP und 2,5 mM ITP]
mit 2 μl
Zuckerlösung [15%
(w/v) Saccharose, 5% (w/v) Mannitol, 5% (w/v) Dextran T40] und 4 μl eines Mix
mit 1 μΜ jedes in
der Amplifikation zu verwendenden Oligonukleotides in 75% DMSO.
Von diesem Prämix
wurden 10 μl
zu 5 μl
Nukleinsäurelösung gegeben
und während
5 Minuten bei 65°C
inkubiert. Anschließend
wurden die Reaktionsröhrchen
bei 41°C
während
5 Minuten inkubiert, bevor 5 μl
Enzymmix [32 Units T7-RNA Polymerase; 6,4 Units AMV Reverse Transkriptase;
0,08 μl
RNase H; 2,1 μg
BSA; 20 mM DTT; 1,5 M Sorbitol] zugegeben wurden. Nach der letzten
Zugabe wurden die Röhrchen
durch vorsichtiges Klopfen gemischt, zentrifugiert und bei 41°C während 90
Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden gestoppt, indem man sie
auf –20°C brachte.
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1.1.4. Analyse von NASBA-amplifizierten
Reaktionsprodukten durch ELGA
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Für die Analyse
von NASBA-Reaktionsprodukten wurde ein auf Flüssighybridisierung basierter, nicht-radioaktiver "Enzym-linked"-Gel-Assay (ELGA)
angewandt. Die Hybridisierung von Amplifikationsprodukt an eine
spezifische HRP-markierte Oligonukleotidsonde wurde durchgeführt durch
Mischen von 3 μl
einer NASBA-Amplifikationsreaktion mit 1 μl 6 × SSC, 1 μl konzentriertem Auftragspuffer
[25% (v/v) Glycerol; 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0); 0,05%
Bromphenolblau, 0,01% Xylencyanol] und 1 μl Stammlösung des HRP-markierten Oligonukleotids
CMV-pp67-HRP 1 (Tabelle 1), gefolgt von Inkubation bei 45°C während 15 Minuten.
Nach der Hybridisierung wurde die Hälfte der Reaktionsmischung
direkt auf ein 7%iges Polyacrylamidgel aufgetragen, welches mit
0,04% (w/v) Dextransulfat ergänzt
worden war. Nach der Trennung von gebundenen und ungebundenen HRP-markiertem
Oligonukleotid durch Elektrophorese wurde die Sonde im Gel durch
direkte Färbung
mit 50 ml Substratlösung
[125 μg
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
pro ml; 0,003% Wasserstoffperoxid; 100 mM Natriumcitratpuffer (pH
5,2)] während
etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur sichtbar gemacht. Schließlich wurde
das Gel durch Inkubation über
Nacht in einer Lösung
von 50% (v/v) Methanol fixiert und luftgetrocknet.
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1.2 Ergebnisse
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1.2.1 Analytische Empfindlichkeit von
CMV-pp67-Oligonukleotiden bei Einsatz in NASBA
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Um
die analytische Empfindlichkeit des verbesserten CMV-pp67-NASBA-Oligonukleotidpaars
gemäss der
vorliegenden Erfindung (CMV-pp67-5) zu bestimmen und diese Empfindlichkeit
mit der analytischen Empfindlichkeit des bekannten (
WO 96/06191 ) CMV-pp67-Paars (CMV-pp67-4) (Tabelle 1) zu
vergleichen, wurde eine Verdünnungsreihe
von in vitro erzeugter RNA erstellt, welche die Targetsequenz von
beiden Paaren beinhaltet. Die einzelnen Proben dieser Verdünnungsreihe
enthielten 10000, 1000, 100 bzw. 10 Moleküle von in vitro erzeugter RNA.
In mehreren unabhängigen
Experimenten wurde die NASBA-Amplifikation dieser Verdünnungsreihe
mit diesen zwei CMV-pp67-NASBA-Oligonukleotidpaaren (Tabelle 1)
durchgeführt.
Ein typisches Beispiel ist in der Tabelle 2 gezeigt.
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Der
direkte Vergleich der Paare zeigte, dass in diesem Beispiel die
geringste Menge an In-vitro-RNA-Molekülen, welche
mit CMV-pp67-4 erfasst werden konnte, 1000 Moleküle war, wohin gegen mit der verbesserten
Kombination CMV-pp67-5 auch 100 Moleküle Eingangs-RNA ein positives
NASBA-Ergebnis ergaben.
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Die
Tabelle 3 fasst die Ergebnisse von fünf unabhängigen Experimenten zusammen.
Für jedes
Paar wird die geringste Menge an In-vitro-RNA, welche noch ein positives
NASBA-Ergebnis in einem jeweiligen Experiment ergab, gezeigt.
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Die
Paare, welche analysiert wurden, weisen eine vergleichbare analytische
Empfindlichkeit in NASBA auf, da mit beiden Kombinationen das Vorhandensein
von 100 Molekülen
in vitro erzeugter RNA in einer Probe nach der NASBA-Amplifikation
aufgezeigt werden kann. Allerdings schien die CMV-pp67-4-Kombination
in drei von fünf
Analysen eine geringere Nachweisgrenze von 1000 Molekülen in vitro
erzeugter RNA aufzuweisen, wohingegen CMV-pp67-5 konsistent ein
positives NASBA-Ergebnis für
100 Moleküle
Eingangs-RNA in allen Analysen, welche durchgeführt wurden, zeigte (Tabelle
3).
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Deshalb
wurde die CMV-pp67-5-Kombination als robuster für die NASBA-Amplifikation erachtet.
Es wurde vorhergesehen, dass dieser vorteilhafte Aspekt dieses neuen
Oligonukleotidpaars nicht nur für
den Nachweis von in vitro erzeugter RNA sondern auch für den Nachweis
von authentischer CMV-pp67-Protein kodierender mRNA zutrifft, wie
sie in klinischen Proben von mit CMV infizierten Individuen vorgefunden
wird.
-
Beispiel 2: Erfassen von CMV-pp67-Protein
kodierender mRNA in klinischen Proben.
-
2.1. Materialien und Methoden
-
2.1.1. Klinische Testproben
-
495
Proben wurden aus einer Testgruppe von 134 AIDS-Patienten erhalten.
Diese mit Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) antikoagulierten
Vollblutproben, die aufeinander folgend, wie vom Laboratorium empfangen,
aufgenommen wurden, wurden mit neun Volumina Lysepuffer [50 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH
6,4); 20 mM EDTA; 1,3% (w/v) Triton X-100; 5,25 M Guanidiniumthiocyanat]
gemischt und bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
-
2.1.2. Oligonukleotide
-
Sequenzen
und Polarität
der in Amplifikation und Erfassung verwendeten Oligonukleotide sind
in der Tabelle 1 gezeigt. Für
weitere Details wird auf den Punkt 1.1.2. im Abschnitt über Materialien
und Methoden von Beispiel 1 Bezug genommen.
-
2.1.3. Nukleinsäureisolierung
-
Aus
den mit Antikoagulationsmittel behandelten Blutproben wurde Gesamt-Nukleinsäure unter
Anwendung von Guanidiniumthiocyanat-vermittelter Zelllyse und Adsorption
von Nukleinsäure
an Siliciumdioxid-Teilchen isoliert (Boom et al., J. of Clin. Microbiol.
28, 495–503,
1990).
-
Vollblutproben
in Lysepuffer wurden aufgetaut, und aus jeder Probe wurde 1 ml (äquivalent
zu 100 μl Vollblut)
in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Anschließend wurden
50 μl Chlorwasserstoffsäure-aktivierte
Siliciumdioxidteilchen [größen-selektierte
Suspension von 1 mg/ml in 0,1 M Chlorwasserstoffsäure (Sigma);
siehe Bezugsstelle Boom et al., 1990] zugegeben, und die Suspension
wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur unter regelmäßigem Vortex-Schütteln inkubiert.
An das Siliciumdioxid gebundene Nukleinsäure wurde durch Zentrifugation
abzentrifugiert. Peletierte Siliciumdioxidteilchen wurden zweimal
mit 1 ml GuSCN-Waschpuffer [50 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH
6,4); 5,25 M Guanidiniumthiocyanat] gewaschen, gefolgt von zwei
Waschschritten mit 1 ml 70%igem Ethanol und einem einzelnen Waschschritt
mit 1 ml Aceton. Nach jedem Waschschritt wurde die Suspension kurz
zentrifugiert und das Siliciumdioxidpellet wurde in der nächsten Waschlösung durch
gründliches
Mischen resuspendiert. Nach Entfernen des Acetons wurden die Siliciumdioxidteilchen
durch Inkubation bei 56°C
in einem Heizblock 10 Minuten lang getrocknet. Nukleinsäure wurde
aus den Siliciumdioxidteilchen durch Inkubation in 50 μl Tris-gepuffertem
Elutionsmedium (pH 7,5) bei 56°C
10 Minuten lang eluiert. Schließlich
wurden die Siliciumdioxidteilchen erneut abzentrifugiert und der Überstand
wurde vorsichtig in frische Reaktionsröhrchen pipettiert, um jeglichen Übertrag
von Siliciumdioxid zu vermeiden. Extrahierte Nukleinsäureproben
wurden bei –70°C bis zur
Verwendung aufbewahrt.
-
2.1.4. NASBA-Amplifikation
-
Für die Amplifikation
wurde eine sogenannte Accusphäre,
die alle für
eine NASBA-Reaktion notwendigen Bestandteile (siehe auch "NASBA-Amplifikation"-Kapitel im Abschnitt
Materialien und Methoden von Beispiel 1) in einer lyophilisierten
Form enthält,
in einer mit Tris-HCl (pH 8,5) gepufferten Lösung von 30% (v/v) DMSO rekonstituiert.
Anschließend
wurden, für
jede zu analysierende Probe, 5 μl
Nukleinsäure-Lösung und 10 μl der Oligonukleotid-Lösung in
ein Teströhrchen
gegeben. Die resultierenden Mischungen wurden 5 Minuten lang bei
65°C erwärmt, wonach
die Röhrchen
auf 41°C
gestellt wurden. Nach 5 Minuten Inkubation bei 41°C wurden
5 μl Enzymlösung, welche
32 Units T7-RNA-Polymerase, 6,4 Units AMV Reverse Transkriptase und
0,08 Units RNase H enthielt, zugegeben und der Inhalt des Röhrchens
wurde durch vorsichtiges Klopfen gemischt. Die Reaktionen wurden
90 Minuten lang bei 41°C
in einem Wasserbad inkubiert. Die Reaktionen wurden gestoppt, indem
man sie auf –20°C stellte.
-
2.1.5. Analyse von NASBA-amplifizierten
Reaktionsprodukten durch ECL-Erfassung
-
Für die auf
Elektrochemolumineszenz (ECL) basierte Analyse wurden die Nachweisreagenzien
durch Vortexen einer Einfangsonden-Lösung, enthaltend biotinylierte
Einfangsonde CMV-pp67-CAP
(Tabelle 1), immobilisiert auf Streptavidin-beschichteten paramagnetischen
Kügelchen
(Dynal), bis eine opake Lösung
gebildet wurde, und anschließendes
Mischen von 10 μl
dieser Suspension (enthaltend 3,4 × 105 mit
Einfangsonde beladene Kügelchen)
und 10 μl
einer Lösung
von CMV-pp67-ECL-Sonde (Tabelle 1) (enthaltend 3,4 × 1011 Moleküle
ECL-markierte Sonde) in frischen Reaktionsröhrchen hergestellt. Zu diesen
Mischungen wurden 5 μl
einer zweifach verdünnten
NASBA-Reaktion zugegeben und 30 Minuten lang bei 41°C inkubiert.
Während
der Hybridisierung wurden die Röhrchen
alle 10 Minuten vermischt. Anschließend wurden 300 μl NASBA-QR-System
Assay-Puffer (Organon Teknika) in jedes Hybridisierungsröhrchen zugegeben,
und die Röhrchen
wurden in einem NASBA-QR-System für die automatisierte Ablesung
von ECL-Signalen positioniert.
-
2.2. Ergebnisse
-
2.2.1. Nachweis von CMV-pp67-mRNA in klinischen
Proben mit zwei verschiedenen Oligonukleotid-Paaren.
-
Vollblutproben
aus Patienten, die klinisch gefährdet
für Infektion
mit CMV waren, wurden hinsichtlich Gegenwart von das Matrixtegumentprotein
pp67 kodierender CMV-mRNA (CMV-pp67-mRNA)
mit den zwei verschiedenen Oligonukleotidpaaren (Tabelle 1) analysiert,
die für
NASBA-Amplifikation geeignet sind.
-
Insgesamt
495 Proben aus AIDS-Patienten, welche zuvor durch NASBA-Amplifikation
mit der Kombination CMV-pp67-4 (Tabelle 1) analysiert worden waren,
wurden nun erneut unter ähnlichen
NASBA-Bedingungen mit dem verbesserten Paar CMV-pp67-5 analysiert,
welches der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. In der Tabelle
4 werden die mit jedem der Paare erhaltenen Ergebnisse gezeigt und
miteinander verglichen.
-
Obwohl
aus früheren
Experimenten kein (statistisch) signifikanter Unterschied in der
analytischen Empfindlichkeit dieser Sätze von Oligonukleotiden festgestellt
werden konnte (wegen der Tatsache, dass nur einige wenige Proben
getestet wurden; siehe Beispiel 1), schien das verbesserte Set CMV-pp67-5
für den Nachweis
von CMV-pp67-mRNA durch NASBA in aus Vollblutproben extrahierten
Nukleinsäurelösungen viel besser
geeignet zu sein. Auf Grund der Menge an Proben (n = 495) ist dieser
Unterschied auch statistisch signifikant.
-
In
65 Proben enthüllte
das verbesserte Paar CMV-pp67-5 ein positives NASBA-Ergebnis, wohingegen mit
dem Paar CMV-pp67-4 durchgeführte
NASBA-Reaktionen negativ waren. In nur 9 Fällen (von denen 5 schwierig
zu interpretieren waren) war es genau umgekehrt.
-
Als
Schlussfolgerung scheint das neue und verbesserte Oligonukleotid-Paar
gemäss
der vorliegenden Erfindung (CMV-pp67-5), außer dass es robuster als das
Set CMV-pp67-4 ist (Beispiel 1), auch beim Nachweis von CMV-pp67-mRNA
in klinischen Proben überlegen
zu sein.
-
Beispiel 3: Nachweis von CMV-pp67-Protein
kodierender mRNA in klinischen Proben
-
3.1. Materialien und Methoden
-
3.1.1. Klinische Proben
-
Achtzehn
mit Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA) antikoagulierte Vollblutproben wurden aus einer Testgruppe
von AIDS-Patienten erhalten. Innerhalb einiger Stunden nach der
Blutentnahme wurden die Proben mit neun Volumina Lysepuffer (siehe
Abschnitt 2.1.1) gemischt und bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
-
Zehn
mit Heparin antikoagulierte Vollblutproben wurden aus Nierentransplantat-Empfängern an
Zeitpunkten erhalten, an welchen von den Patienten angenommen wurde,
an einer CMV-Infektion
zu leiden. Wie für
die Proben aus AIDS-Patienten wurden auch diese Proben am Tag der
Blutentnahme zu Lysepuffer zugesetzt und bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
-
3.1.2. Primer und Sonden
-
Sequenzen
und Polarität
der für
das spezifische Erfassen verwendeten Primer und Sonden sind in der Tabelle
1 gezeigt. Für
weitere Details wird auf Punkt 1.1.2 im Abschnitt Materialien und
Methoden von Beispiel 1 Bezug genommen.
-
3.1.3. Nukleinsäureisolierung
-
Gesamt-Nukleinsäure wurde
aus den mit Antikoagulationsmittel behandelten Blutproben in Lysepuffer isoliert,
wie beschrieben im Punkt "Nukleinsäureisolierung" im Abschnitt über Materialien
und Methoden von Beispiel 2. Extrahierte Nukleinsäureproben
wurden durch NASBA-Amplifikation
ohne vorherige Aufbewahrung bei –70°C analysiert.
-
3.1.4. NASBA-Amplifikation
-
RNA-Amplifikationen
wurden im Wesentlichen durchgeführt,
wie beschrieben im Punkt "NASBA-Amplifikation" im Abschnitt über Materialien
und Methoden von Beispiel 1. Jeder Nukleinsäureextrakt wurde in zweifacher
Ausfertigung sowohl mit dem Primerpaar CMV-pp67-4 als auch CMV-pp67-5
analysiert (siehe Tabelle 1).
-
3.1.5. Analyse von NASBA-amplifizierten
Reaktionsprodukten durch ELGA
-
Für die Analyse
NASBA-Reaktionsprodukten durch "Enzym-linked" Gel-Assay (ELGA)
wird auf Abschnitt 1.1.4 im Abschnitt über Materialien und Methoden
von Beispiel 1 Bezug genommen. Allerdings betrug die hier verwendete
Hybridisierungstemperatur 41°C
anstatt 45°C
wie in Beispiel 1.
-
3.1.6. Analyse von NASBA-amplifizierten
Reaktionsprodukten durch ECL-Nachweis
-
Die
Elektrochemolumineszenz(ECL)-basierte Analyse wurden im Wesentlichen
durchgeführt,
wie in Punkt 2.1.5 im Abschnitt über
Materialien und Methoden von Beispiel 2 beschrieben. Wie beim ELGA-Nachweis
(Punkt 3.1.5) wurde eine Hybridisierungstemperatur von 41°C verwendet.
-
3.2. Ergebnisse
-
3.2.1 Nachweis von CMV-pp67-mRNA-Amplikons,
die mit zwei verschiedenen Primerpaaren erzeugt wurden
-
Im
vorangehenden Beispiel (Beispiel 2) wurden RNA-Amplikons, welche
durch NASBA-Amplifikation unter
Verwendung des Primerpaars CMV-pp67-4 (Tabelle 1) erzeugt worden
waren, durch ELGA-Nachweis analysiert, wohingegen CMV-pp67-RNA,
welche aus den gleichen klinischen Proben mit dem Primerpaar CMV-pp67-5
amplifiziert wurde, durch ECL-basierte Analyse nachgewiesen wurde.
Für einen
direkteren Vergleich dieser NASBA-Primer für CMV-pp67-RNA wurden in diesem Beispiel Nukleinsäureextrakte
mit jedem Primerpaar amplifiziert und anschließend durch das selbe Nachweisverfahren
analysiert. Für
jede Amplifikationsreaktion wurden sowohl ELGA-Ergebnisse als auch
ECL-Ergebnisse erstellt.
-
Gesamtnukleinsäure wurde
aus 18 Vollblutproben von AIDS-Patienten, bei denen ein klinisches
Risiko einer Infektion mit CMV bestand, extrahiert. Anschließend wurde
CMV-pp67-RNA in zweifacher Ausfertigung aus diesen Extrakten durch
NASBA-Amplifikation amplifiziert, wobei entweder das Primerpaar
CMV-pp67-4 oder CMV-pp67-5 verwendet wurde. Schließlich wurden
die in jeder der einzelnen Amplifikationsreaktionen erzeugten Amplikons
mittels ELGA unter Verwendung der mit Meerrettichperoxidase (HRP)
markierten Sonde CMV-pp67-HRP-1 (Tabelle 1) und mittels ECL-basiertem
Nachweis mit der Sonde CMV-pp67-ECL (Tabelle 1) in Kombination mit
CMV-pp67-CAP, welche eine biotinylierte Version des ELGA-Sondenoligonukleotids
ist, analysiert. Auf eine ähnliche
Weise wurden zehn klinische Proben von Nierentransplantat-Patienten
analysiert, und die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 zusammengefasst.
Beim Vergleich der mit jedem Primerpaar erhaltenen ELGA-Ergebnisse
zeigte das Primerpaar CMV-pp67-5, für 10 individuelle Amplifikationsreaktionsprimer, ein
positives Ergebnis, wohingegen die entsprechende Amplifikation des
gleichen Nukleinsäureextrakts
mit dem Primerpaar CMV-pp67-4 negativ war (Tabelle 5, Proben 4,
6, 10, 12, 13, 17, 18, 26 (2 Reaktionen) und 27). In nur 4 Fällen (Proben
9 (2 Reaktionen), 10, 28) war es umgekehrt.
-
Der
Vergleich der ECL-Daten ergab ein ähnliches Ergebnis: 16 sich
widersprechende Ergebnisse, von denen 11 ein positives Ergebnis
mit dem Primerpaar CMV-pp67-5 betrafen, gegenüber einem negativen Ergebnis
mit dem Primerpaar CMV-pp67-4 (Proben 4, 6, 7, 12 (2 Reaktionen),
13, 15, 18, 26 und 27 (2 Reaktionen)). Für 5 Reaktionen war es umgekehrt
(Proben 5, 7, 9, 10 und 18).
-
Der
Vergleich auf Ebene der Probe und das Annehmen einer Testprobe als
positiv hinsichtlich CMV-pp67-mRNA, wenn eine oder beide Amplifikationsreaktionen
positiv sind, würde
acht Testproben als positiv für
diese CMV-mRNA mit dem Primerpaar CMV-pp67-5 aufgezeigt haben, welche
mit dem Primerpaar CMV-pp67-4 unter Anwendung des ELGA-Nachweises
negativ gewesen wären
(Proben 4, 6, 12, 13, 17, 18, 26 und 27), und eine Testprobe als
negativ mit dem Primerpaar CMV-pp67-5, welche mit dem Primerpaar CMV-pp67-4
positiv ist (Probe 9). Unter Anwendung der ECL-Erfassung wären fünf Proben
durch das Primerpaar CMV-pp67-4 nicht als hinsichtlich CMV-pp67-mRNA
positiv erkannt worden, und dem Primerpaar CMV-pp67-5 wäre erneut
nur eine einzige Probe entgangen.
-
Als
Schlussfolgerung ist CMV-pp67-5 ein empfindlicheres Primerpaar für die NASBA-Amplifikation von CMV-pp67-mRNA
als CMV-pp67-4, ungeachtet des Nachweisverfahrens (sei es ELGA-
oder ECL-basierte Erfassung), welches für das Analysieren der mit jedem
Primerpaar erzeugten Amplikons angewandt wird. Tabelle
1: Oligonukleotide, die bei der NASBA-Amplifikation und dem Nachweis
von CMV-pp67 mRNA
verwendet werden
-
Die
T7 Promotorsequenz wird in kleinen Buchstaben angegeben. Tabelle 2: Analytische Empfindlichkeit
von zwei CMV-pp67-Paaren von Oligonukleotiden, wenn sie in NASBA verwendet
werden.
| | ELGA Ergebnis |
| Input-RNA | CMV-pp67-4 | CMV-pp67-5 |
| 104 | + | + |
| 103 | + | + |
| 102 | – | + |
| 101 | – | – |
Tabelle 3: Vergleich von zwei CMV-pp67-Paaren
von Oligonucleotiden, die in NASBA verwendet werden.
| | niedrigere
Nachweisgrenze* |
| Experiment | CMV-pp67-4 | CMV-pp67-5 |
| 1 | 103 | 102 |
| 2 | 102 | 102 |
| 3 | 102 | 102 |
| 4 | 102 | 102 |
| 5 | 103 | 102 |
- * niedrigere Nachweisgrenze: niedrigste
Menge an Input-RNA, welche immer noch ein positives NASBA-Ergebnis
zeigt.
Tabelle 4: Analyse von CMV-pp67-mRNA-Oligonucleotiden
bei Amplifikationen, die bezüglich
klinischen Proben durchgeführt
werden (n = 495) | | neue CMV-pp67-5
Oligo's |
| positiv | negativ |
| (bekannte) CMV-pp67-4-Oligo's | positiv | 53
(10)* | 4
(5)* |
| negativ | 65 | 358 |
- * zwischen den Klammern wird die Zahl von
schwach positiven Proben, die mit den CMV-pp67-4-Paaren erhalten werden, angegeben.
Tabelle 5: Analyse von klinischen Vollblutproben
mittels NASBA mit zwei unterschiedlichen CMV-pp67-mRNA-Primerpaaren. | Probe Nr. | Probenidentifikation | Probenquelle | CMV-pp67-5 | CMV-pp67-4 |
| ELGA | ECL | ELGA | ECL |
| 1 | 93,1 | Aids-Patient | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 2 | 93,2 | '' | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 3 | 93,3 | '' | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 4 | 93,4 | '' | +/– | +/– | –/– | –/– |
| 5 | 94,5 | '' | –/– | –/– | –/– | +/– |
| 6 | 94,6 | '' | +/– | +/+ | –/– | +/– |
| 7 | 94,7 | '' | –/– | +/– | –/– | –/+ |
| 8 | 95,18 | '' | (+)/+ | +/+ | +/(+) | +/+ |
| 9 | 95,19 | '' | –/– | –/+ | (+)/+ | +/+ |
| 10 | 95,20 | '' | +/– | +/– | –/(+) | +/+ |
| 11 | 94,9 | '' | +/+ | +/+ | (+)/(+) | +/+ |
| 12 | 94,10 | '' | +/– | +/+ | –/– | –/– |
| 13 | 94,11 | '' | +/– | +/– | –/– | –/– |
| 14 | 94,12 | '' | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 15 | 94,13 | '' | –/(+) | –/+ | –/(+) | –/– |
| 16 | 94,14 | '' | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 17 | 94,16 | '' | –/(+) | –/+ | –/– | –/+ |
| 18 | 95,17 | '' | (+)/– | +/– | –/– | –/+ |
| 19 | M2896062-1 | Nierentransplantat | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 20 | M2896062-2 | '' | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 21 | M2896062-3 | '' | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 22 | M2896062-4 | '' | +/+ | +/+ | (+)/(+) | +/+ |
| 23 | M2896062-5 | '' | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 24 | M2896062-6 | '' | +/– | +/+ | +/– | +/+ |
| 25 | M2896062-7 | '' | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| 26 | M2896062-8 | '' | +/(+) | +/+ | –/– | –/+ |
| 27 | M2896062-19 | '' | +/– | +/+ | –/– | –/– |
| 28 | M2896062-20 | '' | +/– | +/+ | +/+ | +/+ |
- + positiv
- (+) schwach positiv
- – negativ
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