DE69333649T2 - Verbessertes Verfahren für Nukleinsäure-Amplifikation durch NASBA - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Verstärkung von einer Nukleinsäure durch NASBA.
  • Die Verstärkung von spezifischen Nukleinsäuren-Segmenten ist insbesondere nützlich für die Erzeugung von erfassbaren Mengen von gewissen Arten von Nukleinsäuren. Beispielsweise, wenn das Auftreten von Nukleinsäuren-Charakteristika auf einen spezifischen Krankheitszustand hinweist, liegen diese Nukleinsäuren im allgemeinen in biologischen Proben in kleinen Mengen vor.
  • Um fähig zu sein, diese kleinen Mengen von Nukleinsäuren zu erfassen, sind entweder sehr empfindliche Erfassungsverfahren einzusetzen oder es sind sehr grosse Mengen von Probenmaterial aufzukonzentrieren. Mit den vorliegenden Verstärkungstechniken können die kleinen Mengen von einem spezifischen Segment von einer Nukleinsäure, die in einer biologischen Probe vorliegt, amplifiziert werden. Diese amplifizierte Nukleinsäure kann einfach erfasst werden durch, beispielsweise, Hybridisieren von dieser in ein markiertes komplementäres Oligonukleotid. Natürlich ist die Verstärkung von Nukleinsäuren auch nützlich für die Erzeugung von grösseren Mengen von Nukleinsäuren, die in rekombinanten DNS-Techniken und zum Klonen und für Sequenzierungszwecke eingesetzt werden.
  • Bekannte Techniken für die Verstärkung von spezifischen Nukleinsäure-Segmenten sind, beispielsweise, die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), wie sie in den US Patenten Nr. US 4,683,195 und Nr. UC 4,683,202 beschrieben worden ist, und die sogenannte "Nucleic Acid Sequence Based Amplification" (NASBA), wie sie in der Europäischen Patentanmeldung EP 0,329,822 beschrieben worden ist, oder in J. Virol. Meth. 35, 273, 1991, Kievits et al..
  • Mit der PCR werden grosse Mengen von Deoxyribonukleinsäure (DNS) durch Behandeln einer Target-DNS-Sequenz mit Oligonukleotid-Primern erzeugt, so dass ein Primerextensionsprodukt synthetisiert wird, welches von dem Template durch den Einsatz von Wärmedenaturation getrennt ist, und wiederum als ein Template dient, was in der Verstärkung der Target-DNS-Sequenz resultiert. Wenn RNS mit der PCR zu amplifizieren ist, wird zuerst der RNS-Strang mit der Hilfe der reversen Transkriptase in einen DNS-Strang transkribiert. Zwischenprodukte in der Polymerasekettenreaktion bestehen nur aus DNS.
  • Mit der Hilfe der NASBA können grosse Mengen von Einzelstrang-RNS entweder aus Einzelstrang-RNS oder -DNS oder Doppelstrang-DNS erzeugt werden. Wenn RNS mit der NASBA zu amplifizieren ist, dann dient die ssRNS als ein Template für die Synthese eines ersten DNS-Stranges durch Verlängerung eines ersten Primers, der einen sRNS Polymerase Erkennungsort enthält. Dieser DNS-Strang dient wiederum als das Template für die Synthese eines zweiten, komplementären DNS-Stranges durch Verlängerung eines zweiten Primers, resultierend in einem Doppelstrang aktiven RNS-Polymerase Promoterort, und der zweite DNS-Strang dient als ein Template für die Synthese von grossen Mengen des ersten Templates, das ssRNS, mit der Hilfe einer RNS-Polymerase.
  • Alle Verstärkungsprozesse umfassen die Befestigung von Primern an Templates und nachfolgende Verlängerung von diesen Primern durch gewisse Nukleinsäure-Polymerasen, die sich abhängig von den angewandten Verstärkungstechniken unterscheiden können.
  • Ein Problem, das bei der Verstärkung von Nukleinsäuren angetroffen wird, ist dasjenige, dass Nukleinsäuren fähig sind, ver schiedene sekundäre Strukturen auszubilden. Nukleinsäurestränge können Sequenzen umfassen, die in der Ausbildung von, beispielsweise, Haarnadelschleifen resultieren können. Diese sekundären Strukturen könnten die Befestigung eines Primers an einem Template und die nachfolgende Verlängerung des Primers entlang dem Template behindern. Durch Interferenz mit dem Annealing oder Extension der Verstärkung-Primer vermindern diese sekundären Strukturen die Effizienz der Verstärkung.
  • Durch das Einbinden während der Verstärkung von Nukleotiden, die das normale Basenpaaren schwächen, wird die Ausbildung von sekundären Strukturen, wie die Ausbildung von inneren Schleifen, in dem Amplifikat vermieden. Mit dem Einbinden dieser Struktur destabilisierenden Nukleotiden werden die sekundären Strukturen destabilisiert und die Verstärkung wird effizienter werden.
  • Die Ausbildung der sekundären Strukturen in Nukleinsäuren ist auch bekannt, ein Problem bei der Sequenzierung von Nukleinsäuren zu sein, weil solche Strukturen, das heisst komprimierte Bereiche, in anomalen Migrationmustern während der Gelelektrophorese resultieren können. Der Ersatz von Inosin für Guanosin in den Nukleinsäure-Fragmenten, synthetisiert für die Sequenzierung von RNS, ist durch D. R. Mills et al. in P. N. A. S., Band 76, Seiten 2232–2235 beschrieben worden. Mit dem Einbringen von Inosin in die Nukleinsäure-Fragmente werden sekundäre Strukturen verhindert und die erhaltene Auflösung in Gelseparationen nach der Sequenzierung der Nukleinsäure ist daher verbessert.
  • Das Einbringen von einem Struktur destabilisierenden Basenanalog in DNS, amplifiziert mit der Polymerasekettenreaktion, ist durch Cetus Corporation in der PCT Anmeldung Nr. WO90/03443 beschrieben worden. Das Struktur destabilisierende Nukleotid, welches während der PCR-Verstärkung in dem Verfahren eingebunden wird, wie es durch Cetus beansprucht wird, ist 7-Deaza-2'-deoxyguanosin-5'-triphosphat (c7dGTP).
  • Der Einsatz von c7dGTP in der PCR resultiert in dem Einbinden von 7-Deazaguanin in dem amplifizierten DNS-Produkt. Dieses Analog unterscheidet sich vom normalen Guanin darin, dass die N-7 des Guaninringes ersetzt wird mit einer Methine-Moietät, die die Hoogsteen-Bindungs-Ausbildung ausschliesst. Für Verstärkungsprozesse mit DNS-Intermediaten erhöht das Einbinden von c7dGTP die Verstärkungseffizienz.
  • Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung für die Verstärkung von Nukleinsäure-Nukleotiden ist dadurch charakterisiert, dass Ribonukleotide während der NASBA-Verstärkung eingeführt werden, so dass das normale Basenpaaren geschwächt wird.
  • Gewisse RNS-Sequenzen sind dafür bekannt, dass sie sehr starke sekundäre Strukturen bilden, die nur sehr schwer zerrissen werden können. Die Ribonukleotide, die das normale Basenpaaren schwächen, werden mit einem Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung in Ribonukleinsäuren-Intermediate während der Verstärkung eingebunden, um die Ribonukleinsäure weniger fähig zu machen, sekundäre Strukturen auszubilden wie die Haarnadelschleifen, die die Verstärkung behindern können.
  • Als ein Ribonukleotid, welches das normale Basenpaaren schwächt, wird Inosin-Triphosphat (ITP) eingesetzt. ITP ist ein Analog von Guanin-Triphosphat (GTP). Inosin unterscheidet sich von Guanin, wenn es in einer Nukleinsäure eingebunden ist, darin, dass es nur zwei Wasserstoffbindungen mit Cytosin ausbildet, wohingegen Guanin drei Wasserstoffbindungen mit Cytosin bildet. I-C Basenpaare sind daher relativ schwach im Vergleich zu normalen G-C Basenpaaren. Sekundäre Strukturen, die normalerweise durch rela tiv starke G-C Basenpaare zusammengehalten werden, sind daher durch das Einbringen von ITP geschwächt oder bilden sich gar nicht aus. Das ITP wird in die Ribonukleinsäure während der Primerextension durch eine geeignete Nukleinsäurenpolymerase eingebunden. Da die so erhaltenen Nukleinsäurenstränge weniger fähig sind, sekundäre Strukturen auszubilden, werden sie als effizientere Templates in nachfolgenden Verstärkungszyklen eingesetzt.
  • Das Verfahren gemäss der Erfindung ist speziell nützlich in Verstärkungsverfahren wie NASBA, die, anders als die PCR, grosse Mengen von RNS-Intermediate erzeugen, beginnend von sowohl der DNS als auch von der RNS.
  • Das Einbinden von Inosin in DNS-Intermediate während der Verstärkung in PCR resultiert in häufigem Mismatching von Basen während der Primer-Extension, wie es in der oben erwähnten PCT Anmeldung der Cetus Corp. (WO 90/03443) erwähnt wird.
  • Erstaunlicherweise sind bei Verstärkungstechniken, bei denen RNS-Intermediate erzeugt werden, gute Ergebnisse erhalten worden und die Fehlerrate der Verstärkung ist gewiss nicht höher als bei der konventionellen Verstärkung, das heisst ohne das Einbinden von ITP.
  • Wenn NASBA als die Verstärkungstechnik eingesetzt wird, könnte das Einbinden von ITP während der Verstärkung sogar in einem 10 bis 100 mal höheren Verstärkungsfaktor resultieren. Dies bedeutet, dass, mit dem Einbinden von ITP, 10 bis 100 mal mehr RNS aus der ursprünglichen Menge von Nukleinsäure erzeugt werden kann, die in einer biologischen Probe vorliegt, als ohne das Einbinden von ITP.
  • Mit dem Verfahren gemäss der Erfindung kann ITP zu der Verstär kungsmischung hinzugefügt werden, die normale Ribonukleotide wie GTP, UTP, CTP und ATP enthält.
  • Das zugesetzte ITP ersetzt teilweise das normalerweise vorliegende GTP. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn nicht mehr als 50% des in einer Verstärkungsreaktionsmischung vorliegenden GTP mit ITP substituiert ist.
  • Wenn das Verhältnis von ITP : GTP zu hoch ist, wird die Verstärkung behindert. ITP hat sich als nicht so gut herausgestellt als ein Substrat für die bei der Verstärkung eingesetzten Enzyme, Nukleinsäurepolymerasen wie die T7polymerase, die mit NASBA eingesetzt wird, wie normales GTP. Das optimale Verhältnis von ITP : GTP ist als ungefähr bei 1 : 3 liegend aufgefunden worden. In dieser Art und Weise wird genug ITP in die amplifizierten Nukleinsäure eingebunden werden, um mit der Ausbildung von starren sekundären Strukturen zu interferieren, während die Verstärkung noch nicht durch die Menge von in der Verstärkungsreaktionsmischung vorliegendem ITP verhindert wird.
  • Ein Kit für die Verstärkung von Nukleinsäure, gemäss Anspruch 5, ist auch Gegenstand gemäss der vorliegenden Erfindung. Solch ein Verstärkungskit kann weiterhin geeignete Verstärkungsprimer für die spezifischen zu amplifizierenden Nukleinsäuren und andere Verstärkungsreagenzien wie die notwendigen Enzyme umfassen.
  • Eine Mischung gemäss Anspruch 4 ist auch Gegenstand der Erfindung. Ein Verfahren zur Erfassung der amplifizierten Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure zu einer komplementären Erfassungsprobe hybridisiert ist und wobei die zu erfassende Nukleinsäure mit dem Verfahren für die Verstärkung von Nukleinsäuren gemäss der Erfindung amplifiziert ist. Das Einbinden von Inosin resultiert in sowohl einer effizienteren Verstärkung als auch einer empfindlicheren Erfassung. Die Hybridisierung einer komplementären Erfassungsprobe zu der Nukleinsäure, die zu erfassen ist, kann auch durch das Auftreten von sekundären Strukturen in der amplifizierten Nukleinsäure bewirkt werden. Die sekundären Strukturen können das Oligonukleotid in seiner Bindung an die amplifizierten Nukleinsäuren behindern. Die Interferenz der sekundären Strukturen mit der Bindung eines markierten Oligonukleotids mit der Nukleinsäure kann die Empfindlichkeit gemäss dem Erfassungsverfahren vermindern. Mit dem Verfahren für die Erfassung von amplifizierten Nukleinsäuren wird die Empfindlichkeit erhöht, weil die Ausbildung von sekundären Strukturen, die mit dem Annealing der amplifizierten Nukleinsäuren und einem komplementären Oligonukleotid interferieren, verhindert wird.
  • Der Vorteil der Einbindung der interferierenden Nukleotide in der amplifizierten Nukleinsäure ist daher zweifach: nicht nur die Effizienz der Verstärkung wird erhöht, sondern auch die Empfindlichkeit des Erfassungsverfahrens, wobei Nukleinsäure durch Hybridisierung in einer Erfassungsprobe erfasst wird, wird markant erhöht.
  • Ein üblicher Weg, auf dem die Erfassung einer amplifizierten Nukleinsäure häufig ausgeführt wird, ist das Unterwerfen der Probe mit der amplifizierten Nukleinsäure einer Gelelektrophorese, Blotting des Gels auf einen Filter und Hybridisieren der Nukleinsäure mit einer Erfassungsprobe, wobei die Erfassungsprobe ein markiertes komplementäres Oligonukleotid ist.
  • Eine zu erfassende Nukleinsäure, die mit dem Verfahren gemäss der Erfindung amplifiziert wird, wird an den Filter in einer im wesentlich ungewundenen Form gebunden, weil die Ausbildung der sekundären Strukturen durch das Einbinden von Nukleotiden verhindert wird, die das normale Basenpaaren schwächen. weil sekun däre Strukturen fehlen, wird die Hybridisierung einer komplementären Sequenz an der amplifizierten Nukleinsäure, die auf einem Filter oder auf einer anderen festen Phase vorliegt, verbessert.
  • Natürlich ist das Erfassungsverfahren nicht auf das oben beschriebene Ausführungsbeispiel beschränkt. Jegliches Erfassungsverfahren, welches eine Hybridisierung der amplifizierten Nukleinsäure an eine komplementäre Sequenz umfasst, wird von der Wirkung der Einbindung von Inosin profitieren, wodurch die Ausbildung von sekundären Strukturen verhindert wird. Das Verfahren gemäss der Erfindung kann gleichfalls gut auf andere Erfassungsverfahren angewandt werden, wo die amplifizierte Nukleinsäure an eine komplementäre Sequenz hybridisiert wird.
  • Beispielsweise kann die Erfassungsprobe auch ein komplementäres Oligonukleotid sein, welches auf einer festen Phase immobilisiert ist, wie in einem Sandwich-Hybridisierungs-Assay. In diesem Fall ist die amplifizierte Nukleinsäure an die feste Phase durch Hybridisierung an das auf der festen Phase immobilisierte, komplementäre Oligonukleotid gebunden und kann durch Hybridisierung der immobilisierten amplifizierten Nukleinsäure mit einem zweiten, markierten, komplementären Oligonukleotid erfasst werden.
  • Weiterhin beschreibt die vorliegende Anmeldung ein Testkit für die Erfassung von amplifizierter Nukleinsäure. Solch ein Testkit kann geeignete Reagenzien für die Verstärkung der Nukleinsäure umfassen, umfassend eine Mischung von Nukleotiden, die eine gewisse Menge von Inosin, geeignete Verstärkungsprimer und Enzyme (Nukleinsäurepolymerasen) und Erfassungsmittel aufweisen, wie, beispielsweise, eine feste Phase mit komplementären Oligonukleotiden, die darauf immobilisiert sind, an dem die amplifizierte Nukleinsäure gebunden werden kann und ein zweites komplementäres markiertes Oligonukleotid.
  • Wenn jedoch die amplifizierte Nukleinsäure der Elektrophorese unterworfen wird, können geeignete Reagenzien zur Erfassung der Nukleinsäure nach der Beendigung der Elektrophorese in dem Testkit enthalten sein. Reagenzien für die Erfassung der amplifizierten Nukleinsäure nach der Elektrophorese können ein markiertes komplementäres Oligonukleotid umfassen, welches an der amplifizierten Nukleinsäure vor oder nach der Elektrophorese hybridisiert sein kann. Wenn das Oligonukleotid Enzym-markiert ist, kann das Testkit auch ein geeignetes Substrat für die Enzymmarkierung aufweisen.
  • Ein mögliches Ausführungsbeispiel gemäss der vorliegenden Erfindung wird in Beispiel 1 gegeben. Von diesem Beispiel und aus der 1, in der die Ergebnisse dargestellt sind, kann erkannt werden, dass das Einbinden von ITP in die Verstärkungsprozedur die Effizienz der Verstärkungsprozedur in markanter Weise verbessert und in einer höheren Empfindlichkeit während der Erfassung resultiert. Die Intensität des Signals, welches während der Erfassung erhalten wird, ist auf Grund der verbesserten Bindung des markierten Oligonukleotids an das Amplifikat erhöht.
  • Beispiel
  • Beispiel 1: Verstärkung eines Teiles des HCV Genoms mit NASBA und nachfolgende Erfassung der amplifizierten Nukleinsäure
  • Vector pGem7z f(+) (Promega) enthält einen Einschub an dem sma I Ort (multipler Klonierungsort), der 277 nt (UTR-Region) gemäss dem HCV Genom. Der Vector ist #14 genannt worden.
  • Die Transkription mit T7-polymerase ist gemäss dem Promega Protokoll durchgeführt worden, womit der (+)RNS-Strang erzeugt worden ist.
  • In vitro erzeugtes (+)RNS ist amplifiziert worden gemäss der (standard) NASBA-sop.
  • ITP ist zu dem 2.5 NM NASBA Puffer hinzugefügt worden, wobei das ITP : GTP Verhältnis 1 : 3 gewesen ist.
  • Die amplifizierte Nukleinsäure ist einer Elektrophorese auf einem nativen Gelsystem (3% Nusive/1% Agarose) unterworfen worden und auf eine Zetaproben-Membran geblotted und hybridisiert worden an ein 32P markiertes Oligonukleotid, komplementär zu einem inneren Fragment des Amplifikats.
  • Proben mit verschiedenen Ausgangsmengen von Nukleinsäure-Molekülen (Eingangs-Mengen variierend zwischen 102 und 108 Molekülen) sind der Verstärkung unterworfen worden.
  • Die erhaltenen Ergebnisse sind mit den Ergebnissen verglichen worden, wenn dieselben Nukleinsäurensegmente ohne das Hinzufügen von ITP amplifiziert worden sind.
  • Die Ergebnisse sind in der 1 dargestellt. Aus dieser Figur kann erkannt werden, dass 102 Moleküle Ausgangsstoff einer Nukleinsäure, die in Gegenwart von ITP amplifiziert worden ist, bereits zu einem erfassbaren Band in dem Gel führte, wohingegen Nukleinsäuren, die in Abwesenheit von ITP amplifiziert worden sind, nur ein erfassbares Signal ergaben, wenn die Verstärkung mit 104 Molekülen Ausgangsstoff begonnen worden ist.

Claims (5)

  1. Verfahren für die Verstärkung einer Target-Nukleinsäuresequenz mit den Schritten a) des Vorsehens eines DNS-Templates, welches der Target-Sequenz entspricht, umfassend einen doppelsträngigen Promoter, der von einer DNS-abhängigen RNS-Polymerase erkannt wird, b) der Transkription von multiplen Kopien von RNS von dem besagten DNS-Template unter Einsatz der DNS-abhängigen RNS-Polymerase und einer Inosin umfassenden Mischung von Ribonukleotiden, in denen Inosin-Triphosphat-Nukleotide (ITP) nicht mehr als 50 Prozent der Guanosin-Triphosphat-Nukleotide (GTP) ersetzen, c) Benutzen der erzeugten RNS, in denen die Inosin-Nukleotide als ein Template für die nachfolgende Generation einer neuen Menge des doppelsträngigen Templates eingebaut worden sind, und Wiederholen der Schritte b) und c), um die Menge an RNS zu verstärken.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verhältnis ITP zu GTP ungefähr 1 zu 3 ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem die DNS-abhängige RNS-Polymerase T7 Polymerase ist.
  4. Reaktionsmischung zum Ausführen eines auf Transkription basierenden Verstärkungsverfahrens – mit einer DNS-abhängigen RNS-Polymerase, – mit einer Inosin enthaltenden Mischung von Ribonukleotiden, in denen Inosin-Triphosphat-Nukleotide (ITP) nicht mehr als 50 Prozent der Guanosin-Triphosphat-Nukleotide (GTP) ersetzen.
  5. Kit zum Durchführen des Verfahrens nach Anspruch 1 – mit einer Enzymmischung für eine auf Transkription basierende Verstärkungsreaktion mit einer DNS-abhängigen RNS-Polymerase, – mit einer Inosin enthaltenden Mischung von Ribonukleotiden, in denen Inosin-Triphosphat-Nukleotide (ITP) nicht mehr als 50 Prozent der Guanosin-Triphosphat-Nukleotide (GTP) ersetzen, – optional andere Verstärkungsagenzien.
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