DE102006062619A1

DE102006062619A1 - Verfahren zur Bestimmung von minoren Zellpopulationen in heterogenen Zellpopulationen

Info

Publication number: DE102006062619A1
Application number: DE102006062619A
Authority: DE
Inventors: Peter Schwind; Iwan Dr. Aebischer
Original assignee: Medion Diagnostics AG
Current assignee: Grifols Diagnostic Solutions Inc
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2008-07-03
Anticipated expiration: 2026-12-30
Also published as: AU2007341650B2; MX2009006902A; US8841082B2; JP5484068B2; NZ578670A; DE102006062619B4; US20100136585A1; JP2010515030A; BRPI0722063A2; CA2674117A1; CN101606065A; EP2118661A1; RU2009128620A; AU2007341650A1; CA2674117C; WO2008080544A1; RU2456619C2

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer zellulär-gebundenen Analyten in einer flüssigen Probe bereit, wobei das Verfahren durchgeführt wird unter Verwendung einer Vorrichtung, umfassend: - mindestens eine Aufgabezone (5) zum Auftragen der flüssigen Probe, - eine zum Eindringen von zellulären Komponenten geeignete poröse Membran (2) mit mindestens einer Indikatorzone auf der Membran, die mit dem zellulär-gebundenen Analyten in Wechselwirkung treten kann, wobei die Indikatorzone wenigstens ein Bindungselement gegen den zellulär-gebundenen Analyten enthält und - mindestens einen Absorptionsbereich (3) auf der Membran, welcher die Flüssigkeit nach Passieren der Indikatorzonen aufnimmt, wobei die mindestens eine Indikatorzone zwischen der Aufgabezone (5) und dem Absorptionsbereich (3) liegt und wobei das Verfahren zur Anreicherung und zur Quantifizierung der minoren Zellpopulation in heterogenen Zellpopulationen wie bei fetomaternaler Hämorrhagie oder bei sogenannten Chimären, zum Nachweis eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten, zur Bestimmung des Hämatokritwertes und/oder zur parallelen Bestimmung von zellulärgebundenen Analyten in Mischfeldreaktionen durchgeführt wird.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung von minoren Zellpopulationen in heterogenen Zellpopulationen. Die Verfahren sind zur Anreicherung und Quantifizierung der minoren Zellpopulation in heterogenen Zellpopulationen wie bei fetomaternaler Hämorrhagie; zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten und damit zur Bestimmung beider Zellpopulationen in Mischfeldreaktionen nach Transfusion, bei fetomaternaler Hämorrhagie oder bei sogenannten Chimären; zum Nachweis eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten; und/oder zur Bestimmung des Hämatokritwertes geeignet. Weiterhin wird eine für das Verfahren geeignete Vorrichtung bereitgestellt.
Stand der Technik
FMH
Bei einer Schwangerschaft kommt es regelmässig zur Passage von Blut aus dem Kreislauf des Fötus in den Kreislauf der Mutter (fetomaternale Hämorrhagie, FMH). Die Literatur spricht von 0,1 mL bis etwa 30 mL; ca. 96–98% der Schwangerschaften haben eine FMH < 2 mL aber in 0.3% der Schwangerschaften treten grössere Mengen als 30 mL über. Dies bedeutet bei einer angenommenen Blutmenge der Mutter von 5000 mL, dass 0,002% bis 0,6% einer zweiten Erythrozytensorte mit gegenüber der Mutter abweichendem Antigenprofil in den Kreislauf der Mutter übergegangen sind, was klinisch relevant wird, wenn dies zu einer Immunisierung führt. Prominentestes Beispiel ist eine D-Mutter, die mit einem D+ Fötus schwanger ist. Wenn die Mutter anti-D Antikörper ausbildet, kann dies bei einer weiteren Schwangerschaft mit einem D+ Fötus fatale Konsequenzen haben (Morbus hämolyticus neonatorum, MHN). Aus diesem Grunde wird in solchen Situationen der Mutter die sogenannte anti-D Prophylaxe verabreicht. Dennoch ist es von grossem Interesse, die Menge der FMH abschätzen zu können, da z. B. bei einer FMH von > 30 mL die Standard-Gabe der anti-D Therapie nicht mehr ausreichend schützt. So ist die Standardimmunisierung in den USA 250 bis 300 ug anti-D (IgG), wodurch eine ausreichende Prävention bei einer Schwangeren erzielt wird, in deren Kreislauf 15 mL fötalen Erythrozyten, also 25 bis 30 mL fötales Blut übergegangen sind. In Europa ist die verabreichte Standard-Dosis oft niedriger, nämlich 100 bis 150 ug anti-D (IgG), was bei einer FMH von 8–10 mL schützt. Jede Einrichtung, die anti-D Prophylaxe gibt, muss eine Methode im Einsatz haben, welche eine grössere FMH als üblich detektiert (Issitt PD and Anstee DJ. In: Applied Blond Group Serology [4th edition], Montgomery Scientific Publications. Chapter 41: Hemolytic disease of the newborn. p. 1045–1050.
Mit herkömmlichen blutgruppenserologischen Tests beispielsweise zum Nachweis des D-Antigens können solch geringe Mengen einer zweiten Population, wie oben beschrieben, nicht annähernd nachgewiesen werden.
Deshalb gibt es eine Anzahl distinkter Tests, welche speziell für die Detektion einer FMH entwickelt wurden. Diese weisen fötale Erythrozyten, das Blutgruppe D-Antigen oder Hämoglobin F nach.

Tests zum Nachweis einer FMH: Nachweisgrenze FMH

Rosette-Test: ca. 10

mL
Dieser Test basiert auf dem Nachweis von Erythrozyten-Aggregaten und deren mikroskopischer Auswertung. Nachweis des fötalen D-Antigens.

(Jones AR, Silver S. Blond 1958; 13: 763. Sebring ES, Polesky HF. Transfusion 1982; 22:468. Sebring ES. In: Hemolytic disease of the newborn. Arlington VA; Am Assoc Blood Banks 1984: 87.)

Kleihauer-Betke Test:	ca. 5
mL

Dieser Test basiert auf der höheren Resistenz fötaler Erythrozyten gegenüber Säure-Flution und deren mikroskopischer Auswertung. Nachweis fötaler Zellen.

(Kleihauer E, Braun H, Betke K. Klein Wschr 1957; 35:637.)

Durchflusszytometrie	ca. 1
mL

D-Antigen bzw. Hämoglobin F wird mit entsprechenden Antikörpern markiert und über fluoreszierenden 2. Antikörper nachgewiesen. Nachweis des fötalen D-Antigens/Hämoglobins.

Garratty G, Arndt P. Transfusion 1995; 35:157.
Davis BH. Clin Lab Med 2001; 21:829.

Antikörper-Verbrauchs-Test:	ca. 15
mL

Der Test ist der erste Test zur Bestimmung einer FMH, der auf einer Routinemethode zur Blutgruppenbestimmung (Gel-Technik) aufbaut. Er basiert auf dem Verbrauch von anti-D Reagenz durch fötale Erythrozyten. Der Reaktions-Überstand wird mit D-positiven Testzellen inkubiert und im Geltest zentrifugiert.
Nachweis des fötalen D-Antigens

Lapierre Y, Rigal D, Adam J , Josef D, Meyer F, Greber S, Drot C. Transfusion 1990; 30:109.
David M, Stelzer A, Wittmann G, Dudenhausen JW, Salama A. Z Geburtshilfe Neonatol 1999; 203:241.

Mit diesen Tests werden entweder Erythrozytenantigene, fötale Erythrozyten oder das für fötale Erythrozyten charakteristische Hämoglobin F nachgewiesen. Allen diesen Methoden ist gemeinsam, dass zu Ihrer Durchführung zahlreiche Reagentien erforderlich sind, und die Durchführung der Tests sowohl zeit- als auch arbeitsaufwendig ist. Weiterhin sind alle Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass zu Ihrer Durchführung z. T. sehr teure Gerätschaften erforderlich sind (Mikroskop, Zentrifuge, Durchflusszytometer). Ferner ist den Verfahren gemeinsam, dass zu ihrer Durchführung besonders ausgebildetes Personal benötigt wird. Der Kleihauer-Betke Test hat den zusätzlichen Nachteil, dass die Auswertung der Ergebnisse sehr subjektiv ist.
Schwache D-Merkmalsausprägungen (Dweak), insbesondere DEL
Eine weitere Herausforderung für die Spender- und Empfängerserologie sind schwache bzw. partielle Ausprägungen des D-Antigens. Dank monoklonaler Antikörper und Bestätigung im Indirekten Coombs-Test schien die Typisierung auch solch schwacher Blutgruppen gesichert, bis der Phänotyp DEL beschrieben wurde, der eine besonders schwache D-Ausprägung darstellt („normales” D: 10–30000 Antigene je Erythrozyt (RBC); D weck: 400 bis 1000; DEL: < 30).
Serologisch kann DEL nur indirekt mit äusserst aufwendigen, bis zu 10 Waschschritte umfassenden Adsorptions-Flutions-Tests nachgewiesen werden. Transfusionmedizinisch ist DEL von Relevanz, da D-Empfänger einer Konserve einer DEL Person anti-D Antikörper ausbilden können. Die Problematik ist so besorgniserregend, dass in der Fachwelt momentan diskutiert wird, ob der D Status aller (serologischen) D-Spender mit molekularen Methoden verifiziert werden sollte.

Wagner T, Körmöczi GF, Buchta C, Vadon M, Lanzer G, Mayr WR, Legler TJ. Transfusion 2005; 45:520.

Mischfeldreaktionen, homologe Transfusion, Blutdoping
Transfusionen sollten immer ABO gleich oder kompatibel und D kompatibel verabreicht werden. In bestimmten Fällen, z. B. bei vortransfundierten Patienten, ist es klinisch indiziert, auch für weitere Antigene blutgruppengleich zu transfundieren. Es ist jedoch niemals möglich, in allen Blutgruppen blutgruppengleich zu transfundieren (Ausnahme: autologe Transfusion). Dadurch entsteht nach Transfusionen regelmässig die Situation, dass eine Person für gewisse Blutgruppenmerkmale diagnostisch positiv und negativ ist. In der Diagnostik findet man sogenannte Mischfeld-Reaktionen, wie sie mit sensitiven Methoden – insbesondere solchen, die einzelne Erythrozyten und Hämagglutinate beim Nachweis räumlich trennen können – auch gut nachgewiesen werden können. Wird beispielhaft einer K negativen Person (Blutgruppe kk), in deren Kreislauf 5000 mL Blut fliessen (Hämatokrit 45%), ein Erythrozyten-Konzentrat von 300 mL (67%) verabreicht, das K+ ist (Blutgruppe Kk oder KK), dann sind nominal rund 8% der Erythrozyten dieser Person K+ und 92% der Erythrozyten K–.
Eine solche Situation kann beispielsweise mit den heute weitverbreiteten Gelsystemen der Firmen DiaMed und Bio-Rad noch nachgewiesen werden. Bei dieser Technik wird eine verdünnte Suspension der Erythrozyten der zu untersuchenden Person durch eine unten geschlossene Gel-Chromatographie-Säule, die Antikörper-Reagentien unterschiedlicher Spezifitäten enthalten kann, zentrifugiert. Freie, nichtagglutinierte Zellen sind in der Lage, das Gel zu passieren und bilden ein Sediment am Boden des Reaktionsgefässes, während Hämagglutinate auf oder in dem Gel zurückgehalten werden (Lapierre Y, Rigal D, Adam J , Josef D, Meyer F, Greber S, Drot C. Transfusion 1990; 30:109.). Werden die Erythrozyten unse res Beispiels durch eine solche anti-K haltige Säule zentrifugiert, so werden die meisten Zellen am Boden sedimentieren, weil sie K– sind und ein kleiner Teil wird auf oder in dem Gel festgehalten werden (K+), was dem Nachweis des oben geschilderten Mischfeldes entspricht. Wenn solche Erythrozyten wie oben in die MDmulticard (Medion Diagnostics) aufgebracht werden, so ist gleichfalls ein schwache Bande bei anti-K nachweisbar. Im Unterschied zur Gel-Technik kann das in WO 2005005991 offenbarte Verfahren jedoch die negativ reagierende Zellpopulation nicht gleichzeitig sichtbar machen. Alle anderen Methoden des Standes der Technik haben keine den Gelsystemen und der MDmulticard vergleichbaren Eigenschaften zum Nachweis von Mischfeld-Reaktionen.
Homologe Transfusion und Blutdoping:

Nelson M, Popp H, Sharpe K, Ashenden M. Haematologica 2003; 88:1284.

Mischfeldreaktionen nach Transfusion:

Issitt PD and Anstee DJ. In: Applied Blood Group Serology (4th edition), Montgomery Scientific Publications. Chapter 3: Hemolytic disease of the newborn. p. 1045–1050.

Hämatokrit
Der Hämatokrit oder das Erythrozytengesamtvolumen drückt den volumenmässigen Anteil der Erythrozyten im Vergleich zum Gesamtvolumen in Vollblut in Prozent aus. Der volumenmässige Erythrozytenanteil am Gesamtblut wird durch das Volumen und die Zahl der Erythrozyten beeinflusst.
Der Hämatokrit lässt sich typischerweise durch Zentrifugation blutgefüllter Kapillaren bestimmen (Strumia MM, Samble AB, Hart ED, 1954; Am J Clin Path; 24:1016), indem nach Zentrifugation der Anteil der sedimentierten zellulären Bestandteile im Verhältnis zum Gesamtvolumen gesetzt wird. Ebenso kann der Hämatokrit mithilfe elektrischer Impedanzverfahren bestimmt werden. Hierbei wird der in einer Elektrolytlösung zwischen Anode und Kathode fliessende Strom durch Partikel anderer Leitfähigkeit, welche in den Strom eintreten, beeinflusst.
Die Stromänderungen werden als Impulse registriert. Aus einer bestimmten Impuls-Amplitude kann auf eine bestimmte Partikelgrösse und in der Hämatologie damit auf eine bestimmte Zellsorte, beispielsweise Erythrozyten, geschlossen werden. Aus einer Summierung von Impulsen pro gemessenem Volumen können die Zellzahl und der Hämatokrit abgeleitet werden (Sysmex KX-21N Operator's Manual, 1999).
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, einfache, kostengünstige, schnelle Ergebnisse lieferende, automatisierbare Verfahren zur Bestimmung der minoren Zellpopulation in heterogenen Populationen wie bei fetomaternaler Hämorrhagie oder bei sogenannten Chimären bereitzustellen. Ferner sollen einfache, schnelle und sensitive Verfahren zum Nachweis eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten, zur Bestimmung des Hämatokritwertes und/oder zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in Mischfeldreaktionen bereitgestellt werden. Vorzugsweise sollen die Verfahren eine erhöhte Sensitivität gegenüber bekannten Verfahren aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorstehenden Aufgaben werden gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung eines oder mehrerer zellulär-gebundenen Analyten in einer flüssigen Probe, wobei das Verfahren durchgeführt wird unter Verwendung einer Vorrichtung umfassend:

– mindestens eine Aufgabezone (5) zum Auftragen der flüssigen Probe,
– eine zum Eindringen von zellulären Komponenten geeignete poröse Membran (2) mit mindestens einer Indikatorzone auf der Membran, die mit dem zellulär-gebundenen Analyten in Wechselwirkung treten kann, wobei die Indikatorzone wenigstens ein Bindungselement gegen den zellulär-gebundenen Analyten enthält und
– mindestens einen Absorptionsbereich (3) auf der Membran, welcher die Flüssigkeit nach Passieren der Indikatorzonen aufnimmt,

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In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Schritte:

a) Auftragen einer Zellen enthaltenden Probe auf die Aufgabezone;
b) Auftragen eines Verdünnungsmittels;
c) Durchführen des Assays; und
d) Auswerten des Assays durch Bestimmen, ob Zellen an die Indikatorzone gebunden sind.

Das Verfahren gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform wird vorzugsweise zur Anreicherung und zur Quantifizierung der minoren Zellpopulation in heterogenen Zellpopulationen wie beispielsweise bei fetomaternaler Hämorrhagie oder zum Nachweis eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten durchgeführt.
Diese Ausführungsform wird nachstehend auch als „Inkubationsverfahren" bezeichnet.
Aus der DE 10330982 A1 und der WO 2005/005986 ist eine Lateral-Fluss-Vorrichtung bekannt. Diese wird darin zur simultanen Bestimmung von erythrozytären Antigenen und Serum-Komponenten wie Antikörper verwendet. Die aus dieser Druckschrift bekannte Lateral-Fluss-Vorrichtung ist für die erfindungsgemäß angegebenen Verfahren geeignet. Die Offenbarungen der DE 10330982 A1 und WO 2005/005986 werden hiermit vollumfänglich aufgenommen.
Die Lateral-Fluss-Vorrichtung wird erfindungsgemäß als Durchflusszytometer genutzt, um in einem heterogenen Zellgemisch eine in geringer Menge vorhandene zweite Zellpopulation maximal anreichern zu können. Die Anreicherung erfolgt vorzugsweise quantitativ durch Nutzung einer maximalen Menge Gesamtblut, und qualitativ durch einen durch Volumenerhöhung verursachten Inkubationseffekt. Das Ablesefeld in der Lateral-Fluss-Vorrichtung ist analog der Durchflusszelle im Flow Cytometer. Der Hintergrund wird klein gehalten, indem die in grösserer Konzentration vorliegende Zellsorte ausgewaschen und die kleinere in dem Ablesefenster immobilisiert wird.
Dadurch passiert eine genügend grosse Anzahl auch einer Population in geringem Anteil die Antikörperbande, um auch diese sichtbar machen zu können. Dies wird ermöglicht durch eine Auswaschung der deutlich überproportional vorliegenden Population in großem Anteil.
Das vorliegende Verfahren angewandt zur Bestimmung von FMH ist hochsensitiv und ermöglicht den Nachweis von ca. 0,1% bis 0,2% fötalen D+-Zellen im mütterlichen Blut).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die in dem Verfahren verwendete Vorrichtung mindestens zwei Indikatorzonen, die in Fließrichtung hintereinander angeordnet sind, so dass die Probenflüssigkeit pro Fliessspur mehr als eine Indikatorzone durchströmt, wobei die Indikatorzonen Bindungselemente gegen zellulär-gebundene Analyten enthalten, und das Verfahren umfasst:

a) Auftragen einer Erythrozyten enthaltenden Blutprobe auf die Aufgabezone;
b) Auftragen eines Verdünnungsmittels auf die Aufgabezone;
c) Durchführen des Assays;
d) Auswerten des Assays durch Bestimmen, ob Erythrozyten an die Indikatorzone(n) gebunden sind,

Diese Ausführungsform wird nachstehend auch als „Zwei-Indikatorzonen-Verfahren" bezeichnet.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur direkten Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in einer flüssigen Probe bereitgestellt, die umfasst:

– eine Aufgabezone (5) zum Auftragen der flüssigen Probe,
– eine zum Eindringen von zellulären Komponenten geeignete poröse Membran mit mindestens zwei Indikatorzonen auf der Membran, die mit dem/den zellulär-gebundenen Analyten in Wechselwirkung treten können, wobei die Indikatorzonen Bindungselemente gegen zellulär-gebundene Analyten enthalten und
– mindestens einem Absorptionsbereich (3), welcher die Flüssigkeit nach Passieren der Indikatorzonen aufnimmt,

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Die erfindungsgemäß bereitgestellte Lateral-Fluss-Vorrichtung unterscheidet sich von jener der WO 2005/005991 darin, dass sie erfindungsgemäß in der hier dargestellten bevorzugten Ausführungsform zwei hintereinander liegende Indikatorzonen aufweist, um bei einem Mischfeld beide Zellpopulationen gleichzeitig sichtbar machen zu können. Die Sensitivität zum Nachweis eines Mischfeldes ist höher als bei der bisher einzigen Routine-Methode, mit welcher sich Mischfelder nachweisen lassen, nämlich der Gel-Technik (Firma DiaMed). Die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt den Nachweis einer minoren Zellpopulation, wenn ihr Anteil ca. 1–2% der Gesamtpopulation ausmacht.
Das Verfahren und die Vorrichtung ermöglichen den hochsensitiven Nachweis von Mischfeld-Agglutinationen. Diese Verwendbarkeit ist auch überraschend, da der Fachmann angenommen hätte, dass die erste Indikatorzone nach Bindung der Analyt-gebundenen Zellen als Diffusionsbarriere für die Bindung an die zweite Indikatorzone wirken würde.
Die Lateral-Fluss-Vorrichtung kann zur Hämatokrit-Bestimmung als Durchflusszytometer genutzt werden, das mindestens zwei hintereinander gelegene Indikatorpositionen aufweist, um die Erythrozyten-Konzentration einer Blutprobe nachweisen zu können. Je höher die Konzentration, umso mehr Punkte einer Linie geben ein positives Signal. Das Verfahren kann zu einem 2D-Array ausgeweitet werden, indem mehrere Fliessspuren mit z. B. jeweils 5 anti-Erythrozyten-Punkten nebeneinander gelegt werden, wobei die einzelnen Fliessspuren zunehmende oder absteigende anti-Erythrozyten-Konzentrationen haben.
Die Verwendung der Lateral-Fluss-Vorrichtung ermöglicht auch die parallele Durchführung der Blutgruppenbestimmung und der Hämatokritbestimmung.
Legende
1 zeigt eine schematische Darstellung einer zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Inkubationsverfahrens geeigneten Vorrichtung. Die Referenzzeichen haben die nachstehende Bedeutung: (1) Trägerschicht; (2) poröse Membran; (3) Absorptionsbereich; (4) Dichtelement; (5) Aufgabezone; und (6) Indikatorzonenbereich.
2 zeigt schematisch ein mögliches Auftragsmuster zum Nachweis von Mischfeldreaktionen.
3 zeigt die möglichen Dimensionen des in 2 beschriebenen Auftragsmusters auf einer zum Nachweis von Mischfeldreaktionen geeigneten Membran.
Die 4A und 4B verdeutlichen den Nachweis einer Mischfeld-Reaktion mit Hilfe des erfindungsgemäßen Zwei-Indikatorzonenverfahrens. 4A zeigt hierbei das Ergebnis der Untersuchung einer Blutprobe mit 100% A cc D. ee und 0% B CC D. EE. 4B zeigt das Ergebnis der Untersuchung einer Blutprobe mit 98% A cc D. ee und 2% B CC D. EE.
5 zeigt die Bestimmung des Hämatokritwertes mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sollen die folgenden Begriffe wie nachstehend erläutert verstanden werden:
Der Begriff „minore Zellpopulation in heterogenen Zellpopulationen" bedeutet, dass eine Zellpopulation in geringerer Menge oder Konzentration vorliegt im Verhältnis zu einer oder mehreren anderen Zellpopulationen, die auch in den heterogenen Zellpopulationen vorliegen. Die Konzentration der minoren Zellpopulation bezogen auf die gesamte heterogene Zellpopulation beträgt hierbei weniger als 50%, vorzugsweise weniger als 10%, besonders bevorzugt weniger als 1%, insbesondere weniger als 0,1%.
Der Begriff „homologe Transfusion" bedeutet Transfusionen, die in den wesentlichen Merkmalen verträglich sind; je mehr Merkmale man nach einer solchen Transfusion überprüft, desto wahrscheinlicher ist es, über Mischfelder nachweisen zu können, dass transfundiert wurde. Diese Wahrscheinlichkeit kann durch Selektion der zu bestimmenden Merkmale maximiert werden. Solche Bestimmungen dienen zur Überführung bei unerlaubtem Blutdoping per homologer Transfusion.
Der Begriff „autologe Transfusion" bedeutet_Eigenblutspende, hierbei sind per definitionem Spender und Empfänger in allen Merkmalen identisch.
Der Begriff „Mischfeld" (engl. mixed field): Da Transfusionen abgesehen von der autologen Transfusion nicht in allen Antigenen blutgruppengleich sein können, kommt es in der Serologie zu Mischfeldern in Bezug auf differierende Antigen zw. Konserve und Empfänger.
Der Begriff „DEL": Hierbei handelt es sich um ein besonders schwach ausgeprägtes D-Merkmal mit < 30 Antigenen/Zelle. Dies kann mit kommerziellen serologischen Methoden nicht mehr nachgewiesen werden.
Der Begriff „Hämatokrit" bedeutet den_Anteil der Erythrozyten [%] am gesamten Blutvolumen. Es werden folgende Durchschnittswerte beobachtet: Männer: 44–52%; Frauen: 37–47%.
Der Begriff „Chimäre" wird für einen Organismus verwendet, dessen Zellen zwei oder mehrere Zygotien repräsentieren.
Herstellung der Lateral-Fluss-Vorrichtung
Grundsätzlich sind sämtliche in der DE 10330982 A1 und WO 2005/005986 angegebenen Lateral-Fluss-Vorrichtungen geeignet.
Die Membran der erfindungsgemäß verwendeten Vorrichtung ist eine poröse Membran. Bevorzugte Membran-Materialien sind beispielsweise Nitrozellulose (z. B. UniSart von Sartorius, HiFlow von Millipore, Whatman, AE99 bzw. FF85/100 von Whatman Schleicher & Schuell), Polyethylen (Lateral Flo von Porex Corporation) oder Nylon (Novylon von CUNO). Vorzugsweise weist die Membran eine möglichst große Porengröße auf, da eine hohe Porosität der Membran das Eindringen insbesondere von zellulären Komponenten der zu bestimmenden Probe, z. B. von Erythrozyten, in die poröse Struktur begünstigt. Von besonderem Vorteil ist der Einsatz aufnehmender Membranen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist jedoch nicht auf diese Eigenschaften beschränkt. Bevorzugt werden alle Membranen mit einer hohen kapillaren Flussrate (Capillary Speed), wobei die kapillare Flussrate die Zeit ist, die eine Farblösung braucht, um 40 mm auf einer gegebenen Membran zurückzulegen. Besonders bevorzugt sind Membranen, deren kapillare Flussrate < 100 ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist in Fließrichtung hinter der Aufgabezone der erfindungsgemäßen Vorrichtung auf der porösen Membran ein Dichtelement angeordnet. Zur Anwendung kommen zwei- oder dreidimensionale Dichtelemente, die auf der porösen Membran platziert werden und mit denen eine von der übrigen Fläche der porösen Membran separierte Probenauftrags zone geschaffen wird. Das Dichtelement hat erfindungsgemäß primär die Wirkung einer Flüssigkeitsbarriere und erlaubt die gerichtete Verteilung von Probenflüssigkeit und Testreagenzien in die poröse Membran. Weiterhin dichtet das Dichtelement erfindungsgemäß die Probenauftragszone ab zur Verhinderung eines unerwünschten Flüssigkeitsübertritts in die anderen Bereiche der Lateral-Fluss-Vorrichtung.
Bevorzugte Ausführungsformen des Dichtelementes sind die Steg- oder Trog- bzw. Trichter-Form. Die Ausformung des Dichtelementes erfolgt durch Schneideprozesse aus dem zur Herstellung des Dichtelementes verwendeten Material. Im Fall der Trichter- bzw. Trogform erhält das Dichtelement eine innere Öffnung, deren bevorzugte Ausführungsvarianten runde, quadratische oder rechteckige, im Fall der Trichterform sich zur Unterseite (Membrankontaktseite) des Dichtelementes verjüngende Formen sind.
Bevorzugte Materialien für das Dichtelement sind Materialien, die nicht wasseraufnehmend (hydrophob) sind. In einer besonderen Ausführungsform sind die Materialien einseitig mit einem Klebstofffilm, beispielsweise einem drucksensitiven bzw. selbsthaftenden Acrylatklebstoff, beschichtet. Somit kann das Dichtelement direkt auf die Oberfläche der porösen Membran geklebt werden. Alternativ kann das Dichtelement mit dem Lateral-Fluss-Gehäuse verbunden, beispielsweise verklebt sein, wobei in dieser Ausführungsform das Lateral-Fluss-Gehäuse das Dichtelement auf die Oberfläche der porösen Membran drückt und damit die Funktionen des Dichtelementes erzielt werden.
Bevorzugte Materialien für die Ausbildung von zweidimensionalen Dichtelementen sind jede Form von Klebebändern oder Klebefolien (z. B. Tesa 4124 von Beiersdorf AG, ARcare 7815 von Adhesives Research).
Bevorzugte Materialien für die Ausbildung von dreidimensionalen Dichtelementen sind flexible, geschlossenporige Elastomermaterialien oder flexible Silikonmaterialien mit unterschiedlichen Materialstärken, vorzugsweise 3–5 mm (z. B.
Zellkautschuk EPDM140 von Pitzner, Silikonkautschuk oder Vollkautschuk, Härte 40° oder weniger, von Castan).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind aus einem Stück bestehende multiple Dichtelemente mit beispielsweise 20 Einzelkavitäten (Trogform) auf einer Membran angeordnet.
Durch diese erfindungsgemäße Ausgestaltung ist die erfindungsgemäße Vorrichtung in der Lage, flüssige Proben, die Zellen enthalten, wie beispielsweise Vollblut, aufzunehmen, ohne die Zellen dabei abzufiltern. Weiterhin erlaubt das Dichtelement das Auftragen großer Probenvolumina auf die poröse Membran (Aufgabezone), ohne dass diese überschwemmt wird. Somit unterstützt das Dichtelement die Nutzung der aufnehmenden Eigenschaften der porösen Membran. Weiter garantiert das Dichtelement einen gerichteten Probenfluss. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann jedoch mit oder ohne Dichtelement gut funktionieren.
Für den Absorptionsbereich (Absorption-Pad) der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden mechanisch stabile Materialien bevorzugt, vorzugsweise mit Wasserabsorptionskapazitäten von 20–30 g/100 cm² (z. B. Wicking Papier, Typ 300, Whatman Schleicher und Schüll). Der Kontakt zwischen dem Absorptions-Pad und der Lateral Fluss-Membran der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird durch Andruck und Überlappung mit der porösen Membran hergestellt. Die genaue Positionierung des Absorptions-Pads auf der Membran wird durch Verkleben des Absorptions-Pads mit der, die Lateral Fluss-Membran tragenden Trägerschicht (backing sheet), erzielt.
In einer weiteren Ausführungsform sind die Komponenten der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Zwecke der mechanischen Verstärkung auf eine Unterlage bzw. Trägerschicht aufgebracht. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann jedoch mit oder ohne Trägerschicht funktionieren. Bevorzugt werden mechanisch stabile und nicht wasseraufnehmende Materialien, vorzugsweise mit Materialstärken von 100 μm oder mehr, die ein- oder zweiseitig mit einem Klebstofffilm, z. B. einem drucksensitiven bzw. selbsthaftenden Acrylatklebstoff, beschichtet sind (z. B. 0.005" Polyester W/GL-187, G & L). Auf der Trägerschicht werden die poröse Membran und das Absorption-Pad fixiert. Im Fall der doppelseitig klebenden Trägerschicht wird die klebende zweite Seite zur Fixierung des Stapels auf weiteren Flächen, z. B. innerhalb der Lateral-Fluss-Gehäuse, eingesetzt.
In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Vorrichtung, entweder mit oder ohne Trägerschicht, auf der die Komponenten der erfindungsgemäßen Vorrichtung aufgebracht sind, in einem Gehäuse integriert, wodurch die Membran-Komponenten aneinander gedrückt werden und das Gehäuse die Dichtelementfunktion unterstützt. Dabei kann die erfindungsgemäße Vorrichtung jedoch mit oder ohne Gehäuse genauso gut funktionieren.
Inkubationsverfahren
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Bestimmung von fetomaternaler Hämorrhagie (FMH) durchgeführt, wobei die Probe Erythrozyten enthält, wobei die Indikatorzone vorzugsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch enthält.
Die Zellen enthaltende Probe kann eine beliebige Probe sein. Die Zellen sind vorzugsweise im Blut vorkommende Zellen wie Erythrozyten, Leukozyten oder Thrombozyten. Vorzugsweise sind die Zellen Erythrozyten. Die Erythrozyten enthaltende Probe kann hierbei ausgewählt sein aus Vollblut oder Blutzell-Konzentrat. Das Blutzell-Konzentrat kann hierbei ein resuspendiertes Erythrozytensediment sein.
Vorzugsweise werden mehr als 200 μl Vollblut eingesetzt. Dies übertrifft deutlich die üblicherweise auf Lateral-Fluss-Vorrichtungen aufgetragene Zellzahl. Durch die hohe dem System zur Verfügung gestellte Zellzahl steigt auch die das Durchflusszytometer passierende Gesamtzahl der minoren Zellpopulation, was zu einer besseren Detektierbarkeit führt.
Das Verdünnungsmittel kann grundsätzlich jedes im Stand der Technik bekannte Verdünnungsmittel sein. Vorzugsweise ist das Verdünnungsmittel ausgewählt aus physiologischer Kochsalzlösung, Diluent 1, Diluent 2 (DiaMed), Diluent F (Medion Diagnostics). Es wird bevorzugt im Bereich von 100 μl bis 200 μl zur Verdünnung der Zellen verwendet. Im Gegensatz zu früher offenbarten Methoden ist der Anteil Diluent an der Gesamtsuspension bevorzugt niedriger als der des eingesetzten Vollblutes oder Erythrozytensediments, um eine im Verhältnis hohe Zellkonzentration und einen langsamen Fluss der Erythrozyten zu bewirken.
Das Durchführen des Assays umfasst das Inkubieren über eine ausreichende Zeit, so dass die aufgetragene Probe von der Aufgabezone durch die Indikatorzone(n) bis zum Absorptionsbereich hindurchwandert.
Das Auswerten des Assays kann mit bloßem Auge oder automatisiert erfolgen.
Die Indikatorzonen der erfindungsgemäßen Vorrichtung befinden sich auf der Membran und umfassen Bindungselemente, die die zu bestimmenden Analyte in der Probe abfangen bzw. binden. In den Indikatorzonen werden die Bindungsreaktionen zwischen Analyt und Bindungselement nachgewiesen. Als besonders bevorzugte Bindungselemente werden Antikörper bzw. Antikörperfragmente oder Lektine an der porösen Membran angebracht. Die Indikatorzonen umfassen vorzugsweise jeweils ein Bindungselement gegen einen zu untersuchenden Analyten. Die Indikatorzonen können punktförmig, strichförmig und/oder keilförmig ausgebildet sind. Bevorzugt ist die strichförmige Ausbildung in Fliessrichtung. Vorteilhaft wird die minore Zellpopulation nachgewiesen durch eine keilförmige Ausbildung der Indikatorzone, die die bessere Erkennbarkeit ermöglicht.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Bestimmung eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten durchgefürt, vorzugsweise der Blutgruppe DEL, und die Indikatorzone enthält vorzugsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner vor Schritt a) das Herstellen eines Erythrozytensedimentes durch Zentrifugieren der Blutprobe; Inkubieren des Sediments mit einer Bromelain-, Papain- oder Ficin-Lösung und Resuspendieren des Enzym-behandelten Sediments umfassen (wie beispielsweise beschrieben in AABB Technical Manual, 14th edition, 2003, 693ff.). Die Inkubation wird über einen Zeitraum von 5 bis 60 Minuten durchgeführt. Die zu verwendenden Enzyme sind allgemein im Handel erhältlich.
Vorteil der enzymatischen Vorbehandlung ist eine stärkere Exposition der D-Antigene auf den Erythrozyten und damit höhere Sensitivität der Bestimmung.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren (Variante Inkubationsverfahren) werden in Schritt a) bevorzugt ungefähr 100 μl bis 500 μl Blutprobe oder resuspendiertes Erythrozytensediment aufgetragen. Dies übertrifft deutlich die üblicherweise auf Lateral-Fluss-Vorrichtungen aufgetragene Partikel- und Volumenmenge.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden in Schritt b) bevorzugt ungefähr 100 μl bis 200 μl Verdünnungsmittel aufgetragen werden. Das vergrößerte Gesamt-Flüssigkeitsvolumen führt zu einem verlangsamten Fluss, der zu einer quasi Inkubation des Analyten mit der Indikatorzone führt.
Sofern die Indikatorzone einen anti-D-Antikörper enthält, ist dieser bevorzugt ausgewählt aus RUM-1, LDM-3, ESD1M, TH-28, MS-201, MS-26 und LDM-1, wie sie von Millipore oder Alba Bioscience kommerziell erhältlich sind. Jedoch können auch Antikörpergemische oder auch affinitätsgereinigte polyklonale Antiseren verwendet werden.
Zwei-Indikatorzonen-Verfahren und Vorrichtung
Die vorstehenden Erläuterungen für das Inkubationsverfahren gelten auch für das Zwei-Indikatorzonen-Verfahren, sofern nicht nachfolgend abweichend definiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Bestimmung des Hämatokrit-Wertes durchgeführt, die Indikatorzone enthält vorzugsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch und in Schritt d) wird das Gesamtmuster bestimmt, in dem die Erythrozyten an die Indikatorzonen gebunden sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens enthält die Vorrichtung mindestens zwei Indikatorzonen, die in einer Fliessspur angeordnet sind und wobei die Indikatorzonen identische Bindungselemente gegen denselben zellulär-gebundenen Analyten enthalten.
In dieser Ausführungsform der Erfindung sind mehr als eine solche Reihe von Indikatorzonen. Die Indikatorzonen können punktförmig, strichförmig und/oder keilförmig ausgebildet sind. Bevorzugt ist die strichförmige Ausbildung in Fliessrichtung. Vorteilhaft wird die minore Zellpopulation nachgewiesen durch eine keilförmige Ausbildung der Indikatorzone, die die bessere Erkennbarkeit ermöglicht. Das Zwei-Indikatorzonen-Verfahren ermöglicht die Darstellung der minoren Zellpopulation neben der majoren Zellpopulation bei in Bezug auf die Aufgabezone proximaler Lage der Indikatorzone, die gegen die minore Zellpopulation gerichtet ist. Besonders bevorzugt ist eine Anordnung, bei der von den zwei Indikatorzonen in einer Fliessspur die jeweils proximale strichförmig in Fliessrichtung und die jeweils distale punktförmig aufgetragen ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegen auf der Membran mindesten zwei Fliessspuren mit jeweils mindestens zwei mit unterschiedlichen Bindungselementen besetzten Indikatorzonen vor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens weist die Vorrichtung mindestens zwei Fliessspuren mit mindestens zwei Indikatorzonen auf und die Konzentration des Bindungselements nimmt von proximal nach distal relativ zur Aufgabenzone zu oder ab. Dies ermöglicht eine quantitative Beurteilung der in der Probe vorhandenden Menge an Erythrozyten im Verhältnis zum Gesamtvolumen und damit eine näherungsweise Bestimmung des Hämatokrit.
Weiterhin bevorzugt weist die Vorrichtung mindestens zwei Fliessspuren mit mindestens zwei Indikatorzonen auf und die Konzentration der Antikörper-Spots in einer ersten Fliessspur unterscheidet sich von der Konzentration in einer zweiten Fliessspur.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in Mischfeld-Reaktionen oder zum Nachweis einer homologen Transfusion durchgeführt, die Vorrichtung enthält hierbei mindestens zwei Indikatorzonen, die in Fließrichtung hintereinander angeordnet sind, so dass die Probenflüssigkeit pro Fliessspur mehr als eine Indikatorzone durchströmt, wobei die Indikatorzonen Bindungselemente gegen unterschiedliche zellulär-gebundene Analyten enthalten.
Bevorzugt ist der zellulär-gebundene Analyt ausgewählt aus einem Blutgruppenantigen wie A, B, AB, D, C, c, E, e, Cw, K, k, Jka und/oder Jkb. Besonders bevorzugt werden die Blutgruppenantigene in Form der Reaktionspaare A, B; D+, D–; K, k; C, c und/oder E, e bestimmt.
Das gegen den Analyten gerichtete Bindungselement ist wie vorstehend für das Inkubationsverfahren definiert bevorzugt ausgewählt aus einem Antikörper, Antikörperfragment, Lektin, Lektin-Fragment oder Gemischen davon.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Zwei-Indikatorzonen-Verfahrens bereitgestellt. Beispiele
Beispiel 1: Bestimmung von Mischfeld-Reaktionen
Herstellung der Teststreifen: wobei jeweils 2 verschiedene Antikörper in Reihe aufgetragen werden:
Die Teststreifen bestehen aus einer zentralen Aufgabezone, zwei Indikatorzonenbereichen und zwei Absorptionsbereichen. Membranen der Sorte Millipore HiFlow Plus 075 werden in Streifen auf eine Größe von 19 × 75 mm (Breite/Länge; y/x) für eine 10-Paar-Ausführung zurechtgeschnitten und auf eine Trägerschicht (Backing Sheet z. B. von G&L) aufgeklebt. Es wird mit zentraler Aufgabezone gearbeitet (bidirektionaler Fluss) und in parallelen Reihen zu beiden Seiten der Aufgabezone werden im Indikatorzonenbereich 0.3 ul Linien bzw. 0,1 μl Punkte von Lösungen verschiedener blutgruppenspezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung eines Dispensers, z. B. AD3200 (Biodot), aufgetragen, wobei jeweils 2 verschiedene Antikörper, einer jeweils als Punkt und einer als Linie in Reihe aufgetragen werden:
Anti-A-Klon Birma-1 (Millipore, TL); Anti-B–Klon LB-2 Millipore, TN); Anti-D-Klon LDM3 (Alba Bioscience, 27180100); Anti-C-Klon MS-24 (Millipore, FFMU, KG); Anti-c-Klon MS-33 (Millipore, KN); Anti-E-Klons MS-80 + MS-258 (Millipore, TA); Klons Anti-e MS-21 + MS-63 (Millipore, FFMU, KL + KQ); Anti-K-Klon MS-56, (Millipore, KO); anti-k (AlbaClone, Alba Bioscience). Anti-RBC (Rabbit IgG Fraction of anti Human RBC, Rockland, 209–4139)
Die Positionierung der als Punkte aufgetragenen Antikörper erfolgt in Position x = 22 mm (links der Aufgabezone) bzw. in Position x = 53 mm (rechts der Aufgabezone) beginnend 3.5 mm von der Membranoberseite in Abständen von jeweils 3 mm entlang der y-Achse. Die Positionierung der als Linien aufgetragenen Antikörper erfolgt in Position x = 25–28 mm (links der Aufgabezone) bzw. in Position x = 47–50 mm (rechts der Aufgabezone) beginnend 3.5 mm von der Membranoberseite in Abständen von jeweils 3 mm entlang der y-Achse. Die Verdünnungen der Antikörper erfolgen in 15 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5, 10% (v/v) Methanol) wie folgt: Anti-A Antikörper 1:3, anti-B Antikörper 1:2, anti-AB Antikörper 1:4, anti-D Antikörper 1:4, anti-RBC Antikörper 1:3. Alle anderen Antikörperlösungen werden nicht vorverdünnt, jedoch mit Methanol auf 10% (v/v) versetzt.

Die Membranen werden nach dem Dispensieren der Antikörper für 20 min bei 40°C getrocknet und anschließend bei konstanter Luftfeuchte bis zur Testdurchführung aufbewahrt. An beiden zur Aufgabezone distalen Enden wird ein mit der Membran um 3 mm überlappendes 19 × 20 mm großes Absorption-Pad (Whatman Schleicher & Schüll, 300) aufgeklebt. Die Aufgabezone wird durch Aufkleben eines trogformigen Dichtelements (Zellkautschuk EPDM 140 von Pitzner) in Position y = 32.5–37.5 mm über die gesamte Membranbreite von der übrigen Membran separiert.

Proximal (Linie)	Distal (Punkt)
Links der Aufgabezone:
Anti-A	-> Anti-B
Anti-B	-> Anti-A
Anti-D	-> Anti-RBC
Anti-RBC	-> Anti-D
Anti-K	-> Anti-k
Rechts der Aufgabezone:
Anti-C	-> Anti-c
Anti-c	-> Anti-C
Anti-B	-> Anti-e
Anti-e	-> Anti-B
Anti-k	-> Anti-K

Die 2 und 3 veranschaulichen die Ausgestaltung einer zur Durchführung des Nachweises einer Mischfeldreaktion geeigneten Lateral-Fluss-Vorrichtung. 3 sind geeignete Dimensionen zu entnehmen, die jedoch als beispielhaft verstanden werden sollen.
Testansatz Vollblut:
50 μl antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden mit 200 μl Diluent F (Medion Diagnostics) gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 100 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 300 μl Diluent F aufgetragen.
Testansatz Erythrozyten-Sediment:
50 μl Erythrozyten-Sediment (antikoaguliertes Vollblut wird für 5 min bei 1500 U/min zentrifugiert; das Erythrozytensediment befindet sich in der unteren, rot gefärbten, Phase) werden mit 400 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 100 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 300 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca 5 Minuten abgelesen werden und drückt sich durch einen leicht roten Keil („Halbmond” – minore Zellpopulation) bis zu einer stark roten Bande bzw. stark rot gefärbten Punkt (majore Zellpopulation) aus.
Die 4A und 4B verdeutlichen den Nachweis einer Mischfeld-Reaktion mit Hilfe des erfindungsgemäßen Zwei-Indikatorzonenverfahrens. 4A zeigt hierbei das Ergebnis der Untersuchung einer Blutprobe mit 100% Acc D.ee und 0% B CCD.EE. 4B zeigt das Ergebnis der Untersuchung einer Blutprobe mit 98% A ccD.ee und 2% B CCD.EE.
In 4B ist der Nachweis der minoren Zellpopulation in Form eines leichten Keils (Halbmond) gegenüber der majoren Zellpopulation zu entnehmen.
Beispiel 2: Homologe Transfusion (Blutdoping)

Die Teststreifen wurden analog Beispiel 1 hergestellt.

Proximal (Linie)	Distal (Punkt)
Anti-D	-> Anti-RBC
Anti-RBC	-> Anti-D
Anti-K	-> Anti-k
Anti-k	-> Anti-K
Anti-C	-> Anti-c
Anti-c	-> Anti-C
Anti-E	-> Anti-e
Anti-e	-> Anti-E
Anti-Jka	-> Anti-Jkb
Anti-Jkb	-> Anti-Jka
Anti-Cw	-> Anti-RBC
Anti-RBC	-> Anti-Cw

Testansatz Vollblut:
50 μl antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden mit 200 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 100 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 300 μl Diluent F aufgetragen.
Testansatz Erythrozyten-Sediment:
50 μl Erythrozyten-Sediment werden mit 400 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 100 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 300 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca 5 Minuten abgelesen werden und drückt sich durch einen leicht roten Keil („Halbmond” – minore Zellpopulation) bis zu einer stark roten Bande bzw. stark rot gefärbten Punkt (majore Zellpopulation) aus.
Beispiel 3: Nachweis einer fetomaternalen Hämorrhagie (FMH)
Die Teststreifen wurden wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei lediglich anti-D aufgetragen wird. Bevorzugt werden einzelne Antikörper und nicht Antiköper-Gemische aufgetragen. Bevorzugte Antikörper: RUM-1 (Millipore); LDM-3 (Alba Bioscience); aber auch ESD1M (Alba Bioscience);, TH-28; MS-201; MS-26 (Millipore); LDM-1 (Alba Bioscience).
Testansatz a):
400 μl antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden mit 100 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 300 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 400 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca. 20 Minuten abgelesen werden und drückt sich durch einen leicht roten Keil (minore Zellpopulation) bis zu einer stark roten Bande aus (majore Zellpopulation).
Testansatz b): Analog zu a), aber Blut wird mit Bromelase vorbehandelt
3 mL antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden für 3 min bei 1500 rpm zentrifugiert. Danach werden 600 μl des Zellsediments in ein zweites Gefäss überführt und dort mit 600 μl einer kommerziellen Bromelain-Lösung (z. B. Bromelase von Medion Diagnostics) gemischt und für 15 min bei 37°C inkubiert. Danach wird 3 mal mit 0.9% NaCl gewaschen.
Für den eigentlichen Test wird 100 μl des so bromelisierten und gewaschenen Erythrozytensediments mit 200 μl AB-Plasma und 200 μl Diluent F (Medion Diagnostics) gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 300 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufagbezone „trockengelaufen" ist, werden 450 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca 15 Minuten abgelesen werden und drückt sich durch einen leicht roten Keil (minore Zellpopulation) bis zu einer stark roten Bande aus (majore Zellpopulation).
Beispiel 4: Nachweis eines Erythrozytenmerkmals, das in extrem geringer Antigendichte vorliegt: DEL
Die Teststreifen wurden wie in Beispiel 3 hergestellt. Bevorzugt werden einzelne Antikörper und keine Gemische aufgetragen. Bevorzugte Antikörper: RUM-1 (Millipore); LDM-3 (Alba Bioscience).
Testansatz a):
400 μl antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden mit 100 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 300 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 400 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca. 20 Minuten abgelesen werden und drückt sich durch einen leicht roten Keil (minore Zellpopulation) bis zu einer stark roten Bande aus (majore Zellpopulation).
Testansatz b): Analog zu a), aber Blut wird mit Bromelase vorbehandelt
3 mL antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden für 3 min bei 1500 rpm zentrifugiert. Danach werden 600 μl des Zellsediments in ein zweites Gefäss überführt und dort mit 600 μl einer kommerziellen Bromelin-Lösung (z. B. Bromelase von Medion Diagnostics) gemischt und für 15 min bei 37°C inkubiert. Danach wird 3 mal mit 0.9% NaCl gewaschen.
Für den eigentlichen Test wird 100 μl des so bromelisierten und gewaschenen Erythrozytensediments mit 200 μl AB-Plasma und 200 μl Diluent F (Medion Diagnostics) gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 300 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 450 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca 15 Minuten abgelesen werden und drückt sich durch einen leicht roten Keil (minore Zellpopulation) bis zu einer stark roten Bande aus (majore Zellpopulation).
Beispiel 5: Hämatokrit
Die Teststreifen wurden wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei jeweils mindestens 2 (bevorzugt 5) Aliquote des selben Antikörpers (anti-RBC) in Reihe aufgetragen werden. Variante 1: Die Antikörper-Konzentrationen nehmen von proximal zu distal ab; Variante 2: Es gibt mehrere Fliessspuren mit je 2 (5) Antikörperpunkten, wobei die Antikörper-Konzentration von Fliessspur zu Fliessspur abnimmt; Variante 3: Kombination von Variante 1 und Variante 2; Variante 4: Die proximale Antikörper-Auftragung ist eine Linie, gefolgt von mehreren Punkten:
Beispielhafte Auftragung für Variante 2:

Fliessspur 1: anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC (c = "1.0")
Fliessspur 1: anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC (c = "0.8")
Fliessspur 1: anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC (c = "0.6")
Fliessspur 1: anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC (c = "0.4")
Fliessspur 1: anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC (c = "0.2")

Testansatz Vollblut:
50 μl antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden mit 200 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 100 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 300 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca. 5 Minuten abgelesen werden (vgl. 5).
Testansatz Erythrozyten-Sediment:
50 μl Erythrozyten-Sediment werden mit 400 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 100 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 300 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca. 5 Minuten abgelesen werden (vgl. 5).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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- DE 10330982 A1 [0022, 0022, 0045]
- WO 2005/005986 [0022, 0022, 0045]
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Claims

Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer zellulär-gebundenen Analyten in einer flüssigen Probe, wobei das Verfahren durchgeführt wird unter Verwendung einer Vorrichtung umfassend: – mindestens eine Aufgabezone (5) zum Auftragen der flüssigen Probe, – eine zum Eindringen von zellulären Komponenten geeignete poröse Membran (2) mit mindestens einer Indikatorzone auf der Membran, die mit dem zellulär-gebundenen Analyten in Wechselwirkung treten kann, wobei die Indikatorzone wenigstens ein Bindungselement gegen den zellulär-gebundenen Analyten enthält und – mindestens einen Absorptionsbereich (3) auf der Membran, welcher die Flüssigkeit nach Passieren der Indikatorzonen aufnimmt, wobei die mindestens eine Indikatorzone zwischen der Aufgabezone (5) und dem Absorptionsbereich (3) liegt, und wobei das Verfahren zur Anreicherung und zur Quantifizierung der minoren Zellpopulation in heterogenen Zellpopulationen wie bei fetomaternaler Hämorrhagie oder bei sogenannten Chimären, zum Nachweis eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten, zur Bestimmung des Hämatokritwertes und/oder zur parallelen Bestimmung von zellulärgebundenen Analyten in Mischfeldreaktionen durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Auftragen einer Zellen enthaltenden Probe auf die Aufgabezone; b) Auftragen eines Verdünnungsmittels; c) Durchführen des Assays; und d) Auswerten des Assays durch Bestimmen, ob Zellen an die Indikatorzone gebunden sind.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Verfahren zur Bestimmung von fetomaternaler Hämorrhagie (FMH) durchgeführt wird, wobei die Probe Erythrozyten enthält, wobei die Indikatorzone vorzugsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch enthält:
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Verfahren zur Bestimmung eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten, vorzugsweise die Blutgruppe Dweak, insbesondere DEL durchgeführt wird und wobei die Indikatorzone vorzugsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verfahren ferner vor Schritt a) das Herstellen eines Erythrozytensedimentes durch Zentrifugieren der Blutprobe; Inkubieren des Sediments mit einer Bromelain-, Papain- oder Ficin-Lösung und Resuspendieren des Enzym-behandelten Sediments umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei in Schritt a) ungefähr 100 μl bis 500 μl Blutprobe oder resuspendiertes Erythrozytensediment aufgetragen werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei in Schritt b) ungefähr 100 μl bis 200 μl Verdünnungsmittel aufgetragen werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei der anti-D-Antikörper ausgewählt ist aus RUM-1, LDM-3, ESD1M, TH-28, MS-201, MS-26 und LDM-1.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Vorrichtung mindestens zwei Indikatorzonen enthält, die in Fließrichtung hintereinander angeordnet sind, so dass die Probenflüssigkeit pro Fliessspur mehr als eine Indikatorzone durchströmt, wobei die Indikatorzonen Bindungselemente gegen zellulär-gebundene Analyten enthalten, und das Verfahren umfasst: a) Auftragen einer Erythrozyten enthaltenden Blutprobe auf die Aufgabezone; b) Auftragen eines Verdünnungsmittels auf die Aufgabezone; c) Durchführen des Assays; d) Auswerten des Assays durch Bestimmen, ob Erythrozyten an die Indikatorzone(n) gebunden sind, wobei das Verfahren zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten bei fetomaternaler Hämorrhagie (FMH), zur Bestimmung in Mischfeld-Reaktionen, zum Nachweis einer homologen Transfusion oder zur Bestimmung des Hämatokritwertes durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Verfahren zur Bestimmung des Hämatokrit-Wertes durchgeführt wird, die Indikatorzone vorzugsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch enthält und wobei in Schritt d) das Gesamtmuster bestimmt wird, in dem die Erythrozyten and die Indikatorzonen gebunden sind.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Vorrichtung mindestens zwei Indikatorzonen enthält, die in einer Fliessspur angeordnet sind und wobei die Indikatorzonen identische Bindungselemente gegen denselben zellulär-gebundene Analyten enthalten.
Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei die Vorrichtung mindestens zwei Fliessspuren mit mindestens zwei Indikatorzonen aufweist und die Konzent ration des Bindungselements von proximal nach distal relativ zur Aufgabenzone zunimmt oder abnimmt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Vorrichtung mindestens zwei Fliessspuren mit mindestens zwei Indikatorzonen aufweist und sich die Konzentration des Antikörpers in einer ersten Fliessspur von der Konzentration in einer zweiten Fliessspur unterscheidet.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Verfahren zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in Mischfeld-Reaktionen oder zum Nachweis einer homologen Transfusion durchgeführt wird, die Vorrichtung mindestens zwei Indikatorzonen enthält, die in Fließrichtung hintereinander angeordnet sind, so dass die Probenflüssigkeit pro Fliessspur mehr als eine Indikatorzone durchströmt, wobei die Indikatorzonen Bindungselemente gegen unterschiedliche zellulär-gebundene Analyten enthalten.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der zellulär-gebundene Analyt ausgewählt ist aus einem Blutgruppenantigen wie A, B, AB, D, C, c, E, e, Cw, K, k, Jka und/oder Jkb.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Blutgruppenantigene in Form der Reaktionspaare A, B; D+, D–; K, k; C, c und/oder E, e bestimmt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das gegen den Analyten gerichtete Bindungselement ausgewählt ist aus einem Antikörper, Antikörperfragment, Lektin, Lektin-Fragment oder Gemische davon.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Membran oder die Membranen (2) vorzugsweise aus Polyethylen, Nitrocellulose oder Nylon, besteht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei hinter der Aufgabezone (5) und vor den Indikatorzonen auf der Membran (2) mindestens ein Dichtelement (4) angeordnet ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Komponenten der Vorrichtung zur mechanischen Verstärkung auf eine Trägerschicht (1) aufgebracht sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Komponenten der Vorrichtung in einem Gehäuse integriert sind.
Verwendung einer Vorrichtung zur Bestimmung von fetomaternaler Hämorrhagie oder bei sogenannten Chimären, zur Bestimmung eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten, zur Bestimmung des Hämatokritwertes und/oder zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in Mischfeldreaktionen in einer flüssigen Probe, wobei die Vorrichtung umfasst: – mindestens eine Aufgabezone (5) zum Auftragen der flüssigen Probe, – eine zum Eindringen von zellulären Komponenten geeignete poröse Membran (2) mit mindestens einer Indikatorzone auf der Membran, die mit dem zellulär-gebundenen Analyten in Wechselwirkung treten kann, wobei die Membran wenigstens ein Bindungselement gegen einen zellulärgebundenen Analyten enthält und – mindestens einem Absorptionsbereich (3) auf der Membran, welcher die Flüssigkeit nach Passieren der Indikatorzonen aufnimmt, wobei die Indikatorzone zwischen der Aufgabezone (5) und dem Absorptionsbereich (3) liegt.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Vorrichung zur Bestimmung von FMH verwendet wird.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Vorrichtung zur Bestimmung eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten verwendet wird.
Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei der Analyt die Blutgruppe Dweak, insbesondere DEL ist.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Vorrichtung zur Bestimmung des Hämatokrit-Wertes verwendet wird.
Vorrichtung zur direkten Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in einer flüssigen Probe umfassend – eine Aufgabezone (5) zum Auftragen der flüssigen Probe, – eine zum Eindringen von zellulären Komponenten geeignete poröse Membran mit mindestens zwei Indikatorzonen auf der Membran, die mit dem/den zellulär-gebundenen Analyten in Wechselwirkung treten können, wobei die Indikatorzonen Bindungselemente gegen zellulär-gebundene Analyten enthalten und – mindestens einem Absorptionsbereich (3), welcher die Flüssigkeit nach Passieren der Indikatorzonen aufnimmt, wobei die Indikatorzonen zwischen der Aufgabezone (5) und dem Absorptionsbereich (3) liegen, wobei die mindestens zwei Indikatorzonen in Fließrichtung hintereinander angeordnet sind, so dass die Probenflüssigkeit pro Fliessspur mehr als eine Indikatorzone durchströmt.
Vorrichtung gemäß Anspruch 27, wobei der zellulär-gebundene Analyt ausgewählt ist aus einem Blutgruppenantigen wie A, B, AB, C, c, E, e, Cw, K, k, Jka und/oder Jkb.
Vorrichtung gemäß Anspruch 28, wobei die Blutgruppenantigene in Form der Reaktionspaare A, B; D+, D–; K, k; C, c und/oder E, e bestimmt werden.
Vorrichtung gemäß Anspruch 29, wobei auf der Membran mindesten zwei Fliessspuren mit jeweils mindestens zwei mit unterschiedlichen Bindungselementen besetzten Indikatorzonen vorliegen.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei die Indikatorzonen punktförmig, strichförmig und/oder keilförmig ausgebildet sind.