WO2008080544A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von minoren zellpopulationen in heterogenen zellpopulationen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von minoren zellpopulationen in heterogenen zellpopulationen Download PDF

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WO2008080544A1
WO2008080544A1 PCT/EP2007/011016 EP2007011016W WO2008080544A1 WO 2008080544 A1 WO2008080544 A1 WO 2008080544A1 EP 2007011016 W EP2007011016 W EP 2007011016W WO 2008080544 A1 WO2008080544 A1 WO 2008080544A1
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indicator
cell
membrane
bound
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Peter Schwind
Iwan Aebischer
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Medion Diagnostics Ag
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody

Definitions

  • the present invention relates to methods for the determination of minor cell populations in heterogeneous cell populations.
  • the methods are for enrichment and quantification of the minor cell population in heterogeneous cell populations such as fetomaternal hemorrhage; for the parallel determination of cell-bound analytes and thus for the determination of both cell populations in mixed field reactions after transfusion, in fetomaternal hemorrhage or in so-called chimeras; to detect an analyte present in low concentration on cells; and / or for determining the hematocrit value.
  • a device suitable for the method is provided.
  • FMH fetal hemorrhage
  • the standard dose of anti-D therapy is no longer sufficient protection.
  • standard immunization in the USA is 250 to 300 ⁇ g of anti-D (IgG), which results in sufficient prevention in a pregnant woman whose circulation has been transferred to 15 ml of fetal erythrocytes, ie 25 to 30 ml of fetal blood.
  • the standard dose administered is often lower, namely 100 to 150 ⁇ g anti-D (IgG), which protects at an FMH of 8-10 mL.
  • Any device that provides anti-D prophylaxis must use a method that detects a larger FMH than usual (Issitt PD and Anstee DJ., Applied Blood Group Serology [4 th edition], Montgomery Scientific Publications.) Chapter 41: Hemolytic disease of the newborn, pp. 1045-1050.
  • This test is based on the detection of erythrocyte aggregates and their microscopic evaluation. Detection of the fetal D antigen.
  • This test is based on the higher resistance of fetal erythrocytes to acid elution and its microscopic evaluation. Detection of fetal cells.
  • D antigen or hemoglobin F is labeled with appropriate antibodies and detected via fluorescent second antibody. Detection of fetal D antigen / hemoglobin. Garratty G, Arndt P. Transfusion 1995; 35: 157. Davis bra. Clin Lab Med 2001; 21: 829.
  • the test is the first test to determine an FMH based on a routine blood typing method (gel technique). It is based on the consumption of anti-D reagent by fetal erythrocytes. The reaction supernatant is incubated with D-positive test cells and centrifuged in the gel test. Detection of Fetal D Antigen Lapierre Y, Rigal D, Adam J, Josef D, Meyer F, Greber S, Drot C. Transfusion 1990; 30: 109. David M, Stelzer A, Wittmann G, Dudenhausen JW, Salama A. Z Obstetrics Neonatol 1999; 203: 241st
  • D antigen Another challenge for donor and recipient serology are weak or partial forms of the D antigen. Thanks to monoclonal antibodies and confirmation in the Indirect Coombs test, the typing of such weak blood groups appeared to be ensured until the DEL phenotype was described, which represents a particularly weak D expression ("normal” D: 10-30,000 antigens per erythrocyte (RBC ) D weak: 400 to 1000, DEL: ⁇ 30).
  • DEL can only be detected indirectly with extremely complex adsorption-elution tests comprising up to 10 washes.
  • DEL is of relevance for transfusion medicine, as D recipients of a DEL person can train anti-D antibodies. The problem is so worrying that it is currently being discussed in the scientific community, whether the D status of all (serological) D donors should be verified by molecular methods.
  • Transfusions should always be ABO same or compatible and D compatible. In certain cases, z. It is clinically indicated, for example, in pre-transfused patients, to transfuse same blood groups for other antigens. However, it is never possible to transfect blood group-identical in all blood groups (exception: autologous transfusion). As a result, after transfusions, the situation regularly arises that a person is diagnostically positive and negative for certain blood group characteristics. In diagnostics, so-called mixed-field reactions are found, as can be well detected by sensitive methods - especially those that can spatially separate individual erythrocytes and hemagglutinates during detection.
  • erythrocytes of our example are centrifuged through such an anti-K column, most of the cells will sediment on the bottom because they are K- and a small part will be held on or in the gel (K +), which corresponds to the detection of the above-described mixing field. If such erythrocytes are applied to the MDmulticard (Medion Diagnostics) as above, then a weak band in anti-K is also detectable. However, in contrast to the gel technique, the method disclosed in WO2005005991 can not simultaneously visualize the negatively reacting cell population. All other methods of the prior art have no properties comparable to the gel systems and the MDmulticard for the detection of mixed-field reactions.
  • the hematocrit or the total volume of erythrocytes expresses the volume-related proportion of erythrocytes in comparison to the total volume in whole blood in percent.
  • the volume of erythrocyte in the whole blood is influenced by the volume and the number of erythrocytes.
  • the hematocrit can typically be determined by centrifugation of blood-filled capillaries (Strumia MM, Samble AB, Hart ED, 1954, Am J Clin Path, 24: 1016), by centrifugal displacement setting the proportion of sedimented cellular components in relation to the total volume.
  • the hematocrit can be determined using electrical impedance methods.
  • the current flowing in an electrolyte solution between anode and cathode current is influenced by particles of other conductivity, which enter the stream.
  • the current changes are registered as pulses. From a certain pulse amplitude can be closed on a certain particle size and in hematology so that on a particular cell type, such as red blood cells. From a summation of pulses per volume measured, the cell count and hematocrit can be deduced (Sysmex KX-21N Operator's Manual, 1999).
  • the present invention is therefore based on the object of providing simple, cost-effective, rapid results, automatable methods for determining the minimum cell population in heterogeneous populations, such as fetomaternal hemorrhage or so-called chimeras. Furthermore, simple, rapid and sensitive methods for detecting an analyte present in low concentrations on cells, for determining the hematocrit value and / or for the parallel determination of cell-bound analytes in mixed-field reactions are to be provided. Preferably, the methods should have an increased sensitivity to known methods.
  • a porous membrane (2) suitable for penetrating cellular components having at least one indicator zone on the membrane which is capable of interacting with the cell-bound analyte, the indicator zone being at least one Contains binding element against the cellulary-bound analyte and at least one absorption region (3) on the membrane, which receives the liquid after passing through the indicator zones,
  • the at least one indicator zone lies between the task zone (5) and the absorption zone (3), and wherein the method for enrichment and quantification of the minor cell population in heterogeneous cell populations such as fetomaternal hemorrhage or so-called chimeras, for detecting a low concentration Cells present analyte, for determining the hematocrit value and / or for the parallel determination of cell-bound analytes in mixed field reactions is performed.
  • heterogeneous cell populations such as fetomaternal hemorrhage or so-called chimeras
  • the method comprises the steps:
  • the method according to this preferred embodiment is preferably carried out for enrichment and quantification of the minuscule cell population in heterogeneous cell populations, such as fetomaternal hemorrhage, or for detection of low-concentration analyte analytes.
  • This embodiment will hereinafter also be referred to as "incubation method”.
  • a lateral flow device is known. It is used for the simultaneous determination of erythrocyte antigens and serum components such as antibodies.
  • the lateral flow device known from this document is suitable for the methods specified according to the invention.
  • the disclosures of DE 10330982 A1 and WO2005 / 005986 are hereby incorporated in their entirety.
  • the lateral flow device is used as a flow cytometer in order to be able to maximally accumulate a second cell population which is present in a small amount in a heterogeneous cell mixture.
  • the enrichment is preferably carried out quantitatively by using a maximum amount of whole blood, and qualitatively by an incubation effect caused by volume increase.
  • the reading field in the lateral flow device is analogous to the flow cell in the flow cytometer. The background is kept small by washing out the more concentrated cell type and immobilizing the smaller one in the reading window.
  • the present method used to determine FMH is highly sensitive and allows the detection of approximately 0, 1% to 0.2% fetal D + cells in maternal blood).
  • the device used in the method comprises at least two indicator zones which are arranged one behind the other in the flow direction, so that the sample liquid flows through more than one indicator zone per flow track, the indicator zones containing binding elements against cell-bound analytes
  • Method includes: a) applying a blood sample containing erythrocytes to the application zone; b) applying a diluent to the feed zone; c) performing the assay; d) evaluating the assay by determining whether erythrocytes are bound to the indicator zone (s),
  • the method is carried out for the parallel determination of cell-bound analytes in fetomaternal hemorrhage (FMH), for the determination in mixed field reactions, for the detection of a homologous transfusion or for the determination of the hematocrit value.
  • FMH fetomaternal hemorrhage
  • an apparatus for the direct determination of cell-bound analytes in a fluid sample comprising:
  • a task zone (5) for applying the liquid sample a porous membrane capable of penetrating cellular components having at least two indicator zones on the membrane which are capable of interacting with the cell-bound analyte, the indicator zones being cell-bound binding elements
  • the lateral flow device provided according to the invention differs from that of WO2005 / 005991 in that, in the preferred embodiment shown here, it has two indicator zones lying one behind the other in order to be able to visualize both cell populations simultaneously in a mixed field.
  • the sensitivity for the detection of a mixed field is higher than in the only routine method so far that can be used to detect mixing fields, namely the gel technique (DiaMed).
  • the sensitivity of the method according to the invention allows the detection of a minor cell population, if their proportion is about 1 - 2% of the total population.
  • the method and the device enable highly sensitive detection of mixed-field agglutinations. This utility is also surprising because the skilled person would have believed that the first indicator zone after binding of the analyte-bound cells would act as a diffusion barrier for binding to the second indicator zone.
  • the lateral flow device can be used for hematocrit determination as a flow cytometer, which has at least two indicator positions one behind the other to be able to detect the erythrocyte concentration of a blood sample. The higher the concentration, the more points in a line give a positive signal.
  • the process can be extended to a 2D array by multiple traces of tile with z. B. each 5 anti-erythrocyte dots are placed side by side, the individual traces of flow have increasing or decreasing anti-red blood cell concentrations.
  • the use of the lateral flow device also allows the parallel performance of blood grouping and hematocrit determination.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a device suitable for carrying out the incubation method described above.
  • the reference signs have the following meaning: (1) carrier layer; (2) porous membrane; (3) absorption area; (4) sealing element; (5) task zone; and (6) indicator zone area.
  • FIG. 2 schematically shows a possible application pattern for the detection of mixed field reactions.
  • FIG. 3 shows the possible dimensions of the application pattern described in FIG. 2 on a membrane suitable for the detection of mixed-field reactions.
  • FIGS. 4A and 4B illustrate the detection of a mixed-field reaction with the aid of the two-indicator zone method according to the invention.
  • FIG. 4A shows the result of the examination of a blood sample with 100% A cc D. ee and 0% B CC D. EE.
  • Figure 4B shows the result of examining a blood sample with 98% A cc D. ee and 2% B CC D.EE.
  • FIG. 5 shows the determination of the hematocrit value with the aid of the method according to the invention.
  • heterogeneous cell populations means that one cell population is present in lesser amount or concentration relative to one or more other cell populations that are also present in the heterogeneous cell populations.
  • concentration of the minor cell population relative to the entire heterogeneous cell population is thereby less than 50%, preferably less than 10%, more preferably less than 1%, especially less than 0.1%.
  • homologous transfusion means transfusions that are compatible in its essential characteristics, the more characteristics that are checked after such a transfusion, the more likely it is to be able to detect via mixing fields that have been transfused, and this probability can be determined by selecting the one to be determined Characteristics are intended to be used in the event of unauthorized blood doping by homologous transfusion.
  • autologous transfusion means own blood donation, by which donors and recipients are identical in all characteristics.
  • hematocrit means the proportion of erythrocytes [%] in the total blood volume. The following average values are observed: men: 44-52%, women: 37-47%.
  • chimera is used for an organism whose cells represent two or more zygotes.
  • the membrane of the device used in the invention is a porous membrane.
  • Preferred membrane materials are, for example, nitrocellulose (eg UniSart from Sartorius, HiFlow from Millipore, Whatman, AE99 or FF85 / 100 from Whatman Schleicher & Schuell), polyethylene ⁇ lateral FIo from Porex Corporation) or nylon ⁇ Novylon from CUNO) ,
  • the membrane has the largest possible pore size, since a high porosity of the membrane, the penetration of particular cellular components of the sample to be determined, for. B. of erythrocytes, favors in the porous structure.
  • the device according to the invention is not limited to these properties.
  • Preferred are all membranes with a high capillary flow rate, where the capillary flow rate is the time it takes for a dye solution to travel 40 mm on a given membrane.
  • Particularly preferred are membranes whose capillary flow rate is ⁇ 100.
  • a sealing element is arranged in the flow direction behind the application zone of the device according to the invention on the porous membrane.
  • Two- or three-dimensional sealing elements are used, which are placed on the porous membrane and with which a sample application chamber separated from the remaining surface of the porous membrane is used. zone is created.
  • the sealing element according to the invention has primarily the effect of a liquid barrier and allows the directional distribution of sample liquid and test reagents in the porous membrane. Furthermore, according to the invention, the sealing element seals off the sample application zone in order to prevent undesired liquid transfer to the other regions of the lateral flow device.
  • Preferred embodiments of the sealing element are the web or Trogtial Funnel-shape.
  • the shaping of the sealing element takes place by cutting processes from the material used to produce the sealing element.
  • the sealing element receives an inner opening
  • the preferred embodiments are round, square or rectangular, in the case of the funnel shape to the bottom (membrane contact side) of the sealing element tapered shapes.
  • Preferred materials for the sealing element are materials that are not water absorbent (hydrophobic).
  • the materials are coated on one side with an adhesive film, for example a pressure-sensitive or self-adhesive acrylate adhesive.
  • the sealing element can be bonded directly to the surface of the porous membrane.
  • the sealing element may be connected to the lateral flow housing, for example adhesively bonded, wherein in this embodiment the lateral flow housing presses the sealing element onto the surface of the porous membrane and thus the functions of the sealing element are achieved.
  • Preferred materials for the formation of two-dimensional density elements are any form of adhesive tapes or adhesive films (eg Tesa 4124 from Beiersdorf AG, ARcare 7815 from Adhesives Research).
  • Preferred materials for the formation of three-dimensional sealing elements are flexible, closed-cell elastomeric materials or flexible silicone materials with different material thicknesses, preferably 3-5 mm (eg. Cellular rubber EPDM 140 from Pitzner, silicone rubber or solid rubber, hardness 40 ° or less, from Castan).
  • single-piece multiple sealing elements with, for example, 20 individual cavities (trough shape) are arranged on a membrane.
  • the device according to the invention is capable of taking up liquid samples containing cells, such as whole blood, without filtering off the cells in the process.
  • the sealing element allows the application of large sample volumes on the porous membrane (task zone), without being flooded.
  • the sealing element supports the utilization of the receiving properties of the porous membrane.
  • the sealing element guarantees a directed sample flow.
  • the device according to the invention can work well with or without a sealing element.
  • the absorption region (absorption pad) of the device according to the invention mechanically stable materials are preferred, preferably with water absorption capacities of 20-30 g / 100 cm (eg Wicking Paper, Type 300, Whatman Schleicher and Schuell).
  • the contact between the absorption pad and the lateral flow membrane of the device according to the invention is produced by pressure and overlapping with the porous membrane. Accurate positioning of the absorbent pad on the membrane is achieved by adhering the absorbent pad to the backing sheet supporting the lateral flow membrane.
  • the components of the device according to the invention for the purpose of mechanical reinforcement are applied to a substrate or carrier layer.
  • the device according to the invention can function with or without a carrier layer.
  • a pressure-sensitive or self-adhesive acrylate adhesive are coated (eg 0.005 "polyester W / GL-187, G & L.)
  • the porous membrane and the absorption pad are fixed
  • double-sided adhesive backing layer becomes the adhesive second side for fixing the stack on other surfaces, for example, within the lateral flow housing used.
  • the device according to the invention is integrated in a housing, whereby the membrane components are pressed against one another and the housing assists the sealing element function.
  • the device according to the invention can work just as well with or without housing.
  • the method is carried out for the determination of fetomaternal hemorrhage (FMH), wherein the sample contains erythrocytes, wherein the indicator zone preferably contains an antibody or an antibody mixture.
  • FMH fetomaternal hemorrhage
  • the cell-containing sample may be any sample.
  • the cells are preferably blood-borne cells such as erythrocytes, leukocytes or platelets.
  • the cells are erythrocytes.
  • the erythrocyte-containing sample may in this case be selected from whole blood or blood cell concentrate.
  • the blood cell concentrate may be a resuspended erythrocyte sediment.
  • the diluent may in principle be any diluent known in the art.
  • the diluent is selected from physiological saline, Diluent 1, Diluent 2 (DiaMed), Diluent F (Medion Diagnostics). It is preferably used in the range of 100 ⁇ l to 200 ⁇ l for dilution of the cells.
  • the proportion of diluent in the total suspension is preferably lower than that of the whole blood or erythrocyte sediment used in order to effect a relatively high cell concentration and a slow flow of the erythrocytes.
  • Performing the assay involves incubating for a sufficient time so that the applied sample migrates from the application zone through the indicator zone (s) to the absorption region.
  • Evaluating the assay can be done with the naked eye or automated.
  • the indicator zones of the device according to the invention are located on the membrane and comprise binding elements which trap or bind the analytes to be determined in the sample. In the indicator zones, the binding reactions between the analyte and the binding element are detected. As particularly preferred binding elements, antibodies or antibody fragments or lectins are attached to the porous membrane.
  • the indicator zones preferably each comprise a binding element against an analyte to be examined.
  • the indicator zones can be point-shaped, line-shaped and / or wedge-shaped. Preferably, the line-shaped formation in the direction of flow.
  • the minore cell population is detected by a wedge-shaped formation of the indicator zone, which allows better visibility.
  • the method is used to determine an analyte present in low concentration on cells carried out, preferably the blood group DEL, and the indicator zone preferably contains an antibody or an antibody mixture.
  • the method of the invention may further comprise prior to step a) preparing an erythrocyte sediment by centrifuging the blood sample; Incubating the sediment with a bromelain, papain or ficin solution and resuspending the enzyme-treated sediment include (as described, for example, in AABB Technical Manual, 14th edition, 2003, 693 et seq.). Incubation takes place over a period of 5 to 60 minutes.
  • the enzymes to be used are generally available commercially.
  • the advantage of the enzymatic pretreatment is a stronger exposure of the D antigens to the erythrocytes and thus a higher sensitivity of the determination.
  • step a preferably approximately 100 ⁇ l to 500 ⁇ l blood sample or resuspended erythrocyte sediment are applied in step a). This significantly exceeds the amount of particles and volumes typically applied to lateral flow devices.
  • step b preferably about 100 ⁇ l to 200 ⁇ l of diluent are applied in step b).
  • the increased total liquid volume leads to a slowed flow, which leads to a quasi incubation of the analyte with the indicator zone.
  • the indicator zone contains an anti-D antibody
  • this is preferably selected from RUM-I, LDM-3, ESDIM, TH-28, MS-201, MS-26 and LDM-I, as commercially available from Millipore or Alba Bioscience are available.
  • antibody mixtures or affinity-purified polyclonal antisera can also be used.
  • the method for determining the hematocrit value is carried out, the indicator zone preferably contains an antibody or an antibody mixture, and in step d) the overall pattern in which the erythrocytes are bound to the indicator zones is determined.
  • the device comprises at least two indicator zones which are arranged in a flow track and wherein the indicator zones contain identical binding elements against the same cell-bound analyte.
  • the indicator zones may be point-shaped, line-shaped and / or wedge-shaped.
  • the minore cell population is detected by a wedge-shaped formation of the indicator zone, which allows better visibility.
  • the two-indicator zone method allows the representation of the minor cell population adjacent to the major cell population at the proximal location of the indicator zone in relation to the task zone, which is directed against the minor cell population.
  • Particularly preferred is an arrangement in which of the two indicator zones in a flow track, the respective proximal line-shaped in the flow direction and the respective distal point is applied.
  • the device has at least two traces of flow with at least two indicator zones and the concentration of the binding member increases or decreases from proximal to distal relative to the task zone. This allows a quantitative assessment of the amount of erythrocytes present in the sample in relation to the total volume and thus an approximate determination of the hematocrit.
  • the device preferably has at least two traces of flow with at least two indicator zones and the concentration of the antibody spots in a first flow track differs from the concentration in a second flow track.
  • the method according to the invention is carried out for the parallel determination of cell-bound analytes in mixed-field reactions or for the detection of a homologous transfusion
  • the device in this case contains at least two indicator zones, which are arranged one behind the other in the flow direction, so that the sample liquid per flow track flows through more than one indicator zone, wherein the indicator zones contain binding elements against different cell-bound analytes.
  • the cell-bound analyte is selected from a blood group antigen such as A, B, AB, D, C, c, E, e, Cw, K, k, Jka and / or Jkb.
  • a blood group antigen such as A, B, AB, D, C, c, E, e, Cw, K, k, Jka and / or Jkb.
  • Particularly preferred are the blood group antigens in the form of the reaction pairs A, B; D +, D-; K, k; C, c and / or E, e determined.
  • the binding element directed against the analyte is as defined above for the incubation method, preferably selected from an antibody, antibody fragment, lectin, lectin fragment or mixtures thereof.
  • an apparatus for performing the two-indicator zone method described above there is provided an apparatus for performing the two-indicator zone method described above.
  • test strips in each case 2 different antibodies are applied in series:
  • the test strips consist of a central task zone, two indicator zone areas and two absorption areas.
  • Millipore HiFlow Plus 075 membranes are cut into strips of 19 x 75 mm (width / length; y / x) for a 10-pair version and glued to a backing layer (backing sheet eg from G & L) , It is operated with a central task zone (bidirectional flow) and in parallel rows on both sides of the task zone in the indicator zone area 0.3 ul lines or 0.1 .mu.l points of solutions of different blood group-specific monoclonal antibodies using a dispenser, eg. B. AD3200 (Biodot), applied, wherein in each case 2 different antibodies, one in each case as a point and a line in series are applied:
  • Anti-A clone Burma-1 (Millipore, TL); Anti-B clone LB-2 Millipore, TN); Anti-D clone LDM3 (Alba Bioscience, Z7180100); Anti-C clone MS-24 (Millipore, FFMU, KG); Anti-c clone MS-33 (Millipore, KN); Anti-E clones MS-80 + MS-258 (Millipore, TA); Clones anti-MS-21 + MS-63 (Millipore, FFMU, KL + KQ); Anti-K clone MS-56, (Millipore, KO); anti-k (Alba Clone, Alba Bioscience).
  • Anti-RBC (Rabbit IgG Fraction of anti Human RBC, Rockland, 209-4139)
  • the dilutions the antibodies are carried out in 15 mM potassium phosphate buffer pH 7.5, 10% (v / v) methanol) as follows: anti-A antibody 1: 3, anti-B antibody 1: 2, anti-AB antibody 1: 4, anti- D antibody 1: 4, anti-RBC antibody 1: 3. All other antibody solutions are not prediluted but adjusted to 10% (v / v) with methanol.
  • the membranes are dried after dispensing the antibodies for 20 min at 40 ° C and then stored at constant humidity until the test.
  • a 19 ⁇ 20 mm absorption pad (Whatman Schleicher & Schull, 300) which overlaps the membrane by 3 mm is glued on.
  • FIG. 2 and 3 illustrate the design of a lateral flow device suitable for carrying out the detection of a mixed field reaction.
  • FIG. 3 shows suitable dimensions which, however, are to be understood as exemplary.
  • Diluent F Medion Diagnostics
  • Test batch of erythrocyte sediment 50 ⁇ l of erythrocyte sediment (anticoagulated whole blood is centrifuged for 5 min at 1500 rpm, the erythrocyte sediment is in the lower, red-colored phase) are mixed with 400 ⁇ l Diluent F. 100 ⁇ l of the resulting suspension are applied to the application zone. If the application zone is "dry”, apply 300 ⁇ l of Diluent F. The result can be read after about 5 minutes and is expressed by a slightly red wedge ("crescent" - minore cell population) to a strongly red band or strongly red colored point (majore cell population).
  • FIGS. 4A and 4B illustrate the detection of a mixed-field reaction with the aid of the two-indicator zone method according to the invention.
  • FIG. 4A shows the result of the examination of a blood sample with 100% Acc D.ee and 0% B CCD. EE.
  • Figure 4B shows the result of examining a blood sample with 98% A ccD.ee and 2% B CCD.EE.
  • FIG. 4B shows the detection of the minimal cell population in the form of a light wedge (crescent) in relation to the major cell population.
  • Example 2 Homologous transfusion (blood doping) The test strips were prepared analogously to Example 1.
  • the result can be read off after approx. 5 minutes and is expressed by a slightly red wedge ("crescent" - minore cell population) up to a strongly red band or strongly red colored dot (majore cell population).
  • test strips were prepared as in Example 1, with only anti-D being applied.
  • individual antibodies and not antibody mixtures are applied.
  • Preferred antibodies RUM-I (Millipore); LDM-3 (Alba Bioscience); but also ESDIM (Alba Bioscience); TH-28; MS-201; MS-26 (Millipore); LDM-I (Alba Bioscience).
  • the result can be read off after approx. 15 minutes and is expressed by a slightly red wedge (minore cell population) up to a strongly red band (majore cell population).
  • Example 4 Detection of an erythrocyte characteristic present in extremely low antigenic density: DEL
  • test strips were prepared as in Example 3. Preferably, individual antibodies and no mixtures are applied. Preferred antibodies: RUM-I (Millipore); LDM-3 (Alba Bioscience).
  • Test batch a 400 ⁇ l of anticoagulated whole blood or freshly collected native blood are mixed with 100 ⁇ l of Diluent F. From the resulting suspension 300 ul are applied to the task zone. If the application zone is "dry”, apply 400 ⁇ L of Diluent F.
  • the result can be read off after approx. 20 minutes and is expressed by a slightly red wedge (minore cell population) up to a strongly red band (majore cell population).
  • test strips were prepared as in Example 1, with at least 2 (preferably 5) aliquots of the same antibody (anti-RBC) being applied in series.
  • Variant 1 The antibody concentrations decrease from proximal to distal;
  • Variant 2 There are several traces of flow, each with 2 (5) antibody spots, whereby the antibody concentration decreases from flow track to flow track;
  • Variant 3 combination of variant 1 and variant 2;
  • Variant 4 The proximal antibody plot is a line followed by several points:
  • the result can be read after about 5 minutes (see Figure 5).
  • erythrocyte sediment 50 ⁇ l of erythrocyte sediment are mixed with 400 ⁇ l Diluent F. 100 ⁇ l of the resulting suspension are applied to the application zone. If the application zone is "dry", 300 ⁇ l of Diluent F are applied.
  • the result can be read after about 5 minutes (see Figure 5).

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer zellulär-gebundenen Analyten in einer flüssigen Probe bereit, wobei das Verfahren durchgeführt wird unter Verwendung einer Vorrichtung umfassend: mindestens eine Aufgabezone (5) zum Auftragen der flüssigen Probe, eine zum Eindringen von zellulären Komponenten geeignete poröse Membran (2) mit mindestens einer Indikatorzone auf der Membran, die mit dem zellulär-gebundenen Analyten in Wechselwirkung treten kann, wobei die Indikatorzone wenigstens ein Bindungselement gegen den zellulär-gebundenen Analyten enthält und mindestens einen Absorptionsbereich (3) auf der Membran, welcher die Flüssigkeit nach Passieren der Indikatorzonen aufnimmt, wobei die mindestens eine Indikatorzone zwischen der Aufgabezone (5) und dem Absorptionsbereich (3) liegt, und wobei das Verfahren zur Anreicherung und zur Quantifizierung der minoren Zellpopulation in heterogenen Zellpopulationen wie bei fetomaternaler Hämorrhagie oder bei sogenannten Chimären, zum Nachweis eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten, zur Bestimmung des Hämatokritwertes und/oder zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in Mischfeldreaktionen durchgeführt wird.

Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR BESTIMMUNG VON MINOREN
ZELLPOPULATIONEN IN
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung von minoren Zellpopulationen in heterogenen Zellpopulationen. Die Verfahren sind zur Anreicherung und Quantifizierung der minoren Zellpopulation in heterogenen Zellpopulationen wie bei fetomaternaler Hämorrhagie; zur parallelen Bestimmung von zellu- lär-gebundenen Analyten und damit zur Bestimmung beider Zellpopulationen in Mischfeldreaktionen nach Transfusion, bei fetomaternaler Hämorrhagie oder bei sogenannten Chimären; zum Nachweis eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten; und/oder zur Bestimmung des Hämatokritwertes geeignet. Weiterhin wird eine für das Verfahren geeignete Vorrichtung bereitge- stellt.
Stand der Technik
FMH Bei einer Schwangerschaft kommt es regelmässig zur Passage von Blut aus dem Kreislauf des Fötus in den Kreislauf der Mutter (fetomaternale Hämorrhagie, FMH). Die Literatur spricht von 0,1 mL bis etwa 30 mL; ca. 96-98 % der Schwangerschaften haben eine FMH < 2 mL aber in 0.3 % der Schwangerschaften treten grossere Mengen als 30 mL über. Dies bedeutet bei einer angenomme- nen Blutmenge der Mutter von 5000 mL, dass 0,002 % bis 0,6 % einer zweiten Erythrozytensorte mit gegenüber der Mutter abweichendem Antigenprofil in den Kreislauf der Mutter übergegangen sind, was klinisch relevant wird, wenn dies zu einer Immunisierung führt. Prominentestes Beispiel ist eine D- Mutter, die mit einem D+ Fötus schwanger ist. Wenn die Mutter anti-D Antikörper ausbildet, kann dies bei einer weiteren Schwangerschaft mit einem D+ Fötus fatale Konsequenzen haben (Morbus hämolyticus neonatorum, MHN). Aus diesem Grunde wird in solchen Situationen der Mutter die sogenannte anti-D Prophylaxe verabreicht. Dennoch ist es von grossem Interesse, die Menge der FMH abschätzen zu können, da z. B. bei einer FMH von > 30 mL die Standard-Gabe der anti-D Therapie nicht mehr ausreichend schützt. So ist die Standardirnmunisierung in den USA 250 bis 300 ug anti-D (IgG), wodurch eine ausreichende Prävention bei einer Schwangeren erzielt wird, in deren Kreislauf 15 mL fötalen Erythrozyten, also 25 bis 30 mL fötales Blut übergegangen sind. In Europa ist die verabreichte Stan- dard-Dosis oft niedriger, nämlich 100 bis 150 ug anti-D (IgG), was bei einer FMH von 8-10 mL schützt. Jede Einrichtung, die anti-D Prophylaxe gibt, muss eine Methode im Einsatz haben, welche eine grossere FMH als üblich detektiert (Issitt PD and Anstee DJ. In: Applied Blood Group Serology [4th edition], Montgomery Scientific Publications. Chapter 41 : Hemolytic disease of the newborn. p. 1045- 1050.
Mit herkömmlichen blutgruppenserologischen Tests beispielsweise zum Nachweis des D-Antigens können solch geringe Mengen einer zweiten Population, wie oben beschrieben, nicht annähernd nachgewiesen werden.
Deshalb gibt es eine Anzahl distinkter Tests, welche speziell für die Detektion einer FMH entwickelt wurden. Diese weisen fötale Erythrozyten, das Blutgruppe D-Antigen oder Hämoglobin F nach.
Tests zum Nachweis einer FMH: Nachweisgrenze FMH Rosette-Test: ca. 10 mL
Dieser Test basiert auf dem Nachweis von Erythrozyten-Aggregaten und deren mikroskopischer Auswertung.Nachweis des fötalen D-Antigens .
(Jones AR, Silver S. Blood 1958; 13: 763. Sebring ES, Polesky HF. Transfusion 1982; 22:468. Sebring ES. In: Hemolytic disease of the newborn. Arlington VA; Am Assoc Blood Banks 1984: 87.)
KJeihauer-Betke Test: ca. 5 mL
Dieser Test basiert auf der höheren Resistenz fötaler Erythrozyten gegenüber Säu- re-Elution und deren mikroskopischer Auswertung. Nachweis fötaler Zellen.
(Kleihauer E, Braun H, Betke K. Klein Wschr 1957; 35:637.)
Durchflusszytometrie ca. 1 mL
D-Antigen bzw. Hämoglobin F wird mit entsprechenden Antikörpern markiert und über fluoreszierenden 2. Antikörper nachgewiesen. Nachweis des fötalen D- Antigens/Hämoglobins. Garratty G, Arndt P. Transfusion 1995; 35: 157. Davis BH. Clin Lab Med 2001; 21 :829.
Antikörper-Verbrauchs-Test: ca. 15 mL Der Test ist der erste Test zur Bestimmung einer FMH, der auf einer Routinemethode zur Blutgruppenbestimmung (Gel-Technik) aufbaut. Er basiert auf dem Verbrauch von anti-D Reagenz durch fötale Erythrozyten. Der Reaktions- Überstand wird mit D-positiven Testzellen inkubiert und im Geltest zentrifugiert. Nachweis des fötalen D- Antigens Lapierre Y, Rigal D, Adam J , Josef D, Meyer F, Greber S, Drot C. Transfusion 1990 ; 30 : 109. David M, Stelzer A, Wittmann G, Dudenhausen JW, Salama A. Z Geburtshilfe Neonatol 1999; 203:241.
Mit diesen Tests werden entweder Erythrozytenantigene, fötale Erythrozyten oder das für fötale Erythrozyten charakteristische Hämoglobin F nachgewiesen. Allen diesen Methoden ist gemeinsam, dass zu Ihrer Durchführung zahlreiche Reagen- tien erforderlich sind, und die Durchführung der Tests sowohl zeit- als auch arbeitsaufwendig ist. Weiterhin sind alle Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass zu Ihrer Durchführung z. T. sehr teure Gerätschaften erforderlich sind (Mikroskop, Zentrifuge, Durchflusszytometer). Ferner ist den Verfahren gemeinsam, dass zu ihrer Durchführung besonders ausgebildetes Personal benötigt wird. Der Kleihau- er-Betke Test hat den zusätzlichen Nachteil, dass die Auswertung der Ergebnisse sehr subjektiv ist.
Schwache D-Merkmalsausprägungen (Dweak). insbesondere DEL
Eine weitere Herausforderung für die Spender- und Empfängerserologie sind schwache bzw. partielle Ausprägungen des D-Antigens. Dank monoklonaler Antikörper und Bestätigung im Indirekten Coombs-Test schien die Typisierung auch solch schwacher Blutgruppen gesichert, bis der Phänotyp DEL beschrieben wur- de, der eine besonders schwache D-Ausprägung darstellt („normales" D: 10- 30000 Antigene je Erythrozyt (RBC); D weak: 400 bis 1000; DEL: < 30).
Serologisch kann DEL nur indirekt mit äusserst aufwendigen, bis zu 10 Waschschritte umfassenden Adsorptions-Elutions-Tests nachgewiesen werden. Transfusionmedizinisch ist DEL von Relevanz, da D- Empfänger einer Konserve einer DEL Person anti-D Antikörper ausbilden können. Die Problematik ist so besorgniserregend, dass in der Fachwelt momentan diskutiert wird, ob der D Status aller (serologischen) D- Spender mit molekularen Methoden verifiziert werden sollte. Wagner T, Körmöczi GF, Buchte C, Vadon M, Lanzer G, Mayr WR, Legier TJ. Transfusion 2005; 45:520.
Mischfeldreaktionen, homologe Transfusion, Blutdoping
Transfusionen sollten immer ABO gleich oder kompatibel und D kompatibel verabreicht werden. In bestimmten Fällen, z. B. bei vortransfundierten Patienten, ist es klinisch indiziert, auch für weitere Antigene blutgruppengleich zu transfundie- ren. Es ist jedoch niemals möglich, in allen Blutgruppen blutgruppengleich zu transfundieren (Ausnahme: autologe Transfusion). Dadurch entsteht nach Transfusionen regelmässig die Situation, dass eine Person für gewisse Blutgruppenmerkmale diagnostisch positiv und negativ ist. In der Diagnostik findet man sogenannte Mischfeld-Reaktionen, wie sie mit sensitiven Methoden - insbesondere solchen, die einzelne Erythrozyten und Hämagglutinate beim Nachweis räumlich trennen können- auch gut nachgewiesen werden können. Wird beispielhaft einer K negativen Person (Blutgruppe kk), in deren Kreislauf 5000 mL Blut fliessen (Hämatokrit 45 %), ein Erythrozyten-Konzentrat von 300 mL (67 %) verabreicht, das K+ ist (Blutgruppe Kk oder KK), dann sind nominal rund 8 % der Erythrozyten dieser Person K+ und 92 % der Erythrozyten K-.
Eine solche Situation kann beispielsweise mit den heute weitverbreiteten Gelsystemen der Firmen DiaMed und Bio-Rad noch nachgewiesen werden. Bei dieser Technik wird eine verdünnte Suspension der Erythrozyten der zu untersuchenden Person durch eine unten geschlossene Gel-Chromatographie-Säule, die Anti- körper-Reagentien unterschiedlicher Spezifitäten enthalten kann, zentrifugiert. Freie, nichtagglutinierte Zellen sind in der Lage, das Gel zu passieren und bilden ein Sediment am Boden des Reaktionsgefasses, während Hämagglutinate auf oder in dem Gel zurückgehalten werden (Lapierre Y, Rigal D, Adam J , Josef D, Meyer F, Greber S, Drot C. Transfusion 1990 ; 30: 109.). Werden die Erythrozyten unse- res Beispiels durch eine solche anti-K haltige Säule zentrifugiert, so werden die meisten Zellen am Boden sedimentieren, weil sie K- sind und ein kleiner Teil wird auf oder in dem Gel festgehalten werden (K+), was dem Nachweis des oben geschilderten Mischfeldes entspricht. Wenn solche Erythrozyten wie oben in die MDmulticard (Medion Diagnostics) aufgebracht werden, so ist gleichfalls ein schwache Bande bei anti-K nachweisbar. Im Unterschied zur Gel-Technik kann das in WO2005005991 offenbarte Verfahren jedoch die negativ reagierende Zellpopulation nicht gleichzeitig sichtbar machen. Alle anderen Methoden des Standes der Technik haben keine den Gelsystemen und der MDmulticard vergleichbaren Eigenschaften zum Nachweis von Mischfeld-Reaktionen.
Homologe Transfusion und Blutdoping:
Nelson M, Popp H, Sharpe K, Ashenden M. Haematologica 2003; 88:1284.
Mischfeldreaktionen nach Transfusion:
Issitt PD and Anstee DJ. In: Applied Blood Group Serology (4th edition), Mont- gomery Scientific Publications. Chapter 3: Hemolytic disease of the newborn. p. 1045-1050.
Hämatokrit
Der Hämatokrit oder das Erythrozytengesamtvolumen drückt den volumenmässi- gen Anteil der Erythrozyten im Vergleich zum Gesamtvolumen in Vollblut in Prozent aus. Der volumenmässige Erythrozytenanteil am Gesamtblut wird durch das Volumen und die Zahl der Erythrozyten beeinflusst.
Der Hämatokrit lässt sich typischerweise durch Zentrifugation blutgefüllter Kapillaren bestimmen ( Strumia MM, Samble AB, Hart ED, 1954; Am J Clin Path; 24:1016), indem nach Zentrifugation der Anteil der sedimentierten zellulären Bestandteile im Verhältnis zum Gesamtvolumen gesetzt wird. Ebenso kann der Hämatokrit mithilfe elektrischer Impedanzverfahren bestimmt werden. Hierbei wird der in einer Elektrolytlösung zwischen Anode und Kathode fliessende Strom durch Partikel anderer Leitfähigkeit, welche in den Strom eintreten, beeinflusst. Die Stromänderungen werden als Impulse registriert. Aus einer bestimmten Impuls-Amplitude kann auf eine bestimmte Partikelgrösse und in der Hämatologie damit auf eine bestimmte Zellsorte, beispielsweise Erythrozyten, geschlossen werden. Aus einer Summierung von Impulsen pro gemessenem Volumen können die Zellzahl und der Hämatokrit abgeleitet werden (Sysmex KX-21N Operator's Manual, 1999).
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, einfache, kostengünstige, schnelle Ergebnisse lieferende, automatisierbare Verfahren zur Bestim- mung der minoren Zellpopulation in heterogenen Populationen wie bei fetomater- naler Hämorrhagie oder bei sogenannten Chimären bereitzustellen. Ferner sollen einfache, schnelle und sensitive Verfahren zum Nachweis eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten, zur Bestimmung des Hämatokritwertes und/oder zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in Mischfeldreaktionen bereitgestellt werden. Vorzugsweise sollen die Verfahren eine erhöhte Sensitivität gegenüber bekannten Verfahren aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorstehenden Aufgaben werden gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung eines oder mehrerer zellulär-gebundenen Analyten in einer flüssigen Probe, wobei das Verfahren durchgeführt wird unter Verwendung einer Vorrichtung umfassend:
- mindestens eine Aufgabezone (5) zum Auftragen der flüssigen Probe, eine zum Eindringen von zellulären Komponenten geeignete poröse Membran (2) mit mindestens einer Indikatorzone auf der Membran, die mit dem zellulär-gebundenen Analyten in Wechselwirkung treten kann, wobei die Indikatorzone wenigstens ein Bindungselement gegen den zellu- lär-gebundenen Analyten enthält und mindestens einen Absorptionsbereich (3) auf der Membran, welcher die Flüssigkeit nach Passieren der Indikatorzonen aufnimmt,
wobei die mindestens eine Indikatorzone zwischen der Aufgabezone (5) und dem Absorptionsbereich (3) liegt, und wobei das Verfahren zur Anreicherung und zur Quantifizierung der minoren Zellpopulation in heterogenen Zellpopulationen wie bei fetomaternaler Hämorrhagie oder bei sogenannten Chimären, zum Nachweis eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten, zur Bestimmung des Hämatokritwertes und/oder zur parallelen Bestimmung von zellulär- gebundenen Analyten in Mischfeldreaktionen durchgeführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Schritte:
a) Auftragen einer Zellen enthaltenden Probe auf die Aufgabezone; b) Auftragen eines Verdünnungsmittels; c) Durchführen des Assays; und d) Auswerten des Assays durch Bestimmen, ob Zellen an die Indikatorzone gebunden sind.
Das Verfahren gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform wird vorzugsweise zur Anreicherung und zur Quantifizierung der minoren Zellpopulation in heterogenen Zellpopulationen wie beispielsweise bei fetomaternaler Hämorrhagie oder zum Nachweis eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten durchgeführt.
Diese Ausführungsform wird nachstehend auch als „Inkubationsverfahren" bezeichnet. Aus der DE 10330982 Al und der WO2005/005986 ist eine Lateral-Fluss- Vorrichtung bekannt. Diese wird darin zur simultanen Bestimmung von erythro- zytären Antigenen und Serum-Komponenten wie Antikörper verwendet. Die aus dieser Druckschrift bekannte Lateral-Fluss- Vorrichtung ist für die erfϊndungsge- maß angegebenen Verfahren geeignet. Die Offenbarungen der DE 10330982 Al und WO2005/005986 werden hiermit vollumfänglich aufgenommen.
Die Lateral-Fluss- Vorrichtung wird erfindungsgemäß als Durchfiusszytometer genutzt, um in einem heterogenen Zellgemisch eine in geringer Menge vorhande- ne zweite Zellpopulation maximal anreichern zu können. Die Anreicherung erfolgt vorzugsweise quantitativ durch Nutzung einer maximalen Menge Gesamtblut, und qualitativ durch einen durch Volumenerhöhung verursachten Inkubationseffekt. Das Ablesefeld in der Lateral-Fluss- Vorrichtung ist analog der Durchflusszelle im Flow Cytometer. Der Hintergrund wird klein gehalten, indem die in grosserer Konzentration vorliegende Zellsorte ausgewaschen und die kleinere in dem Ablesefenster immobilisiert wird.
Dadurch passiert eine genügend grosse Anzahl auch einer Population in geringem Anteil die Antikörperbande, um auch diese sichtbar machen zu können. Dies wird ermöglicht durch eine Auswaschung der deutlich überproportional vorliegenden Population in großem Anteil.
Das vorliegende Verfahren angewandt zur Bestimmung von FMH ist hochsensitiv und ermöglicht den Nachweis von ca. 0, 1 % bis 0,2 % fötalen D+-Zellen im mütterlichen Blut).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Aus führungs form enthält die in dem Verfahren verwendete Vorrichtung mindestens zwei Indikatorzonen, die in Fließrichtung hintereinander angeordnet sind, so dass die Probenflüssigkeit pro Fliessspur mehr als eine Indikatorzone durchströmt, wobei die Indikatorzonen Bindungselemente gegen zellulär-gebundene Analyten enthalten, und das Verfahren umfasst: a) Auftragen einer Erythrozyten enthaltenden Blutprobe auf die Aufgabezone; b) Auftragen eines Verdünnungsmittels auf die Aufgabezone; c) Durchführen des Assays; d) Auswerten des Assays durch Bestimmen, ob Erythrozyten an die Indika- torzone(n) gebunden sind,
wobei das Verfahren zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analy- ten bei fetomaternaler Hämorrhagie (FMH), zur Bestimmung in Mischfeld- Reaktionen, zum Nachweis einer homologen Transfusion oder zur Bestimmung des Hämatokritwertes durchgeführt wird.
Diese Ausführungsform wird nachstehend auch als „Zwei-Indikatorzonen- Verfahren" bezeichnet.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur direkten Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in einer flüssigen Probe bereitgestellt, die umfasst:
eine Aufgabezone (5) zum Auftragen der flüssigen Probe, eine zum Eindringen von zellulären Komponenten geeignete poröse Membran mit mindestens zwei Indikatorzonen auf der Membran, die mit dem/den zellulär-gebundenen Analyten in Wechselwirkung treten können, wobei die Indikatorzonen Bindungselemente gegen zellulär-gebundene
Analyten enthalten und mindestens einem Absorptionsbereich (3), welcher die Flüssigkeit nach Passieren der Indikatorzonen aufnimmt, wobei die Indikatorzonen zwischen der Aufgabezone (5) und dem Absorptionsbe- reich (3) liegen, wobei die mindestens zwei Indikatorzonen in Fließrichtung hin- - I l -
tereinander angeordnet sind, so dass die Probenflüssigkeit pro Fliessspur mehr als eine Indikatorzone durchströmt.
Die erfindungsgemäß bereitgestellte Lateral-Fluss- Vorrichtung unterscheidet sich von jener der WO2005/005991 darin, dass sie erfindungsgemäß in der hier dargestellten bevorzugten Ausfuhrungsform zwei hintereinander liegende Indikatorzonen aufweist, um bei einem Mischfeld beide Zellpopulationen gleichzeitig sichtbar machen zu können. Die Sensitivität zum Nachweis eines Mischfeldes ist höher als bei der bisher einzigen Routine-Methode, mit welcher sich Mischfelder nach- weisen lassen, nämlich der Gel-Technik (Firma DiaMed). Die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt den Nachweis einer minoren Zellpopulation, wenn ihr Anteil ca. 1 - 2 % der Gesamtpopulation ausmacht.
Das Verfahren und die Vorrichtung ermöglichen den hochsensitiven Nachweis von Mischfeld- Agglutinationen. Diese Verwendbarkeit ist auch überraschend, da der Fachmann angenommen hätte, dass die erste Indikatorzone nach Bindung der Analyt-gebundenen Zellen als Diffusionsbarriere für die Bindung an die zweite Indikatorzone wirken würde.
Die Lateral-Fluss-Vorrichtung kann zur Hämatokrit-Bestimmung als Durchfluss- zytometer genutzt werden, das mindestens zwei hintereinander gelegene Indikatorpositionen aufweist, um die Erythrozyten-Konzentration einer Blutprobe nachweisen zu können. Je höher die Konzentration, umso mehr Punkte einer Linie geben ein positives Signal. Das Verfahren kann zu einem 2D-Array ausgeweitet werden, indem mehrere Fliessspuren mit z. B. jeweils 5 anti-Erythrozyten- Punkten nebeneinander gelegt werden, wobei die einzelnen Fliessspuren zunehmende oder absteigende anti-Erythrozyten-Konzentrationen haben. Die Verwendung der Lateral-Fluss- Vorrichtung ermöglicht auch die parallele Durchführung der Blutgruppenbestimmung und der Hämatokritbestimmung.
Legende Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung einer zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Inkubationsverfahrens geeigneten Vorrichtung. Die Referenzzeichen haben die nachstehende Bedeutung: (1) Trägerschicht; (2) poröse Membran; (3) Absorptionsbereich; (4) Dichtelement; (5) Aufgabezone; und (6) Indikatorzonenbereich.
Figur 2 zeigt schematisch ein mögliches Auftragsmuster zum Nachweis von Mischfeldreaktionen.
Figur 3 zeigt die möglichen Dimensionen des in Figur 2 beschriebenen Auftrags- musters auf einer zum Nachweis von Mischfeldreaktionen geeigneten Membran.
Die Figuren 4A und 4B verdeutlichen den Nachweis einer Mischfeld-Reaktion mit Hilfe des erfindungsgemäßen Zwei-Indikatorzonenverfahrens. Figur 4A zeigt hierbei das Ergebnis der Untersuchung einer Blutprobe mit 100 % A cc D. ee und 0 % B CC D. EE. Figur 4B zeigt das Ergebnis der Untersuchung einer Blutprobe mit 98 % A cc D. ee und 2 % B CC D. EE.
Figur 5 zeigt die Bestimmung des Hämatokritwertes mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Definitionen
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sollen die folgenden Begriffe wie nachstehend erläutert verstanden werden:
Der Begriff „minore Zellpopulation in heterogenen Zellpopulationen" bedeutet, dass eine Zellpopulation in geringerer Menge oder Konzentration vorliegt im Verhältnis zu einer oder mehreren anderen Zellpopulationen, die auch in den heterogenen Zellpopulationen vorliegen. Die Konzentration der minoren Zellpopulation bezogen auf die gesamte heterogene Zellpopulation beträgt hierbei weniger als 50 %, vorzugsweise weniger als 10 %, besonders bevorzugt weniger als 1 %, insbesondere weniger als 0,1 %.
Der Begriff „homologe Transfusion" bedeutet Transfusionen, die in den wesentlichen Merkmalen verträglich sind; je mehr Merkmale man nach einer solchen Transfusion überprüft, desto wahrscheinlicher ist es, über Mischfelder nachweisen zu können, dass transfundiert wurde. Diese Wahrscheinlichkeit kann durch Selektion der zu bestimmenden Merkmale maximiert werden. Solche Bestimmungen dienen zur Überführung bei unerlaubtem Blutdoping per homologer Transfusion.
Der Begriff „autologe Transfusion" bedeutet_Eigenblutspende, hierbei sind per definitionem Spender und Empfänger in allen Merkmalen identisch.
Der Begriff „Mischfeld" (engl, mixed field): Da Transfusionen abgesehen von der autologen Transfusion nicht in allen Antigenen blutgruppengleich sein können, kommt es in der Serologie zu Mischfeldern in Bezug auf differierende Antigen zw. Konserve und Empfänger. Der Begriff „DEL": Hierbei handelt es sich um ein besonders schwach ausgeprägtes D-Merkmal mit < 30 Antigenen/Zelle. Dies kann mit kommerziellen serologischen Methoden nicht mehr nachgewiesen werden. Der Begriff „Hämatokrit" bedeutet den_ Anteil der Erythrozyten [%] am gesamten Blutvolumen. Es werden folgende Durchschnittswerte beobachtet: Männer: 44-52 %; Frauen: 37-47 %.
Der Begriff „Chimäre" wird für einen Organismus verwendet, dessen Zellen zwei oder mehrere Zygotien repräsentieren.
Herstellung der Lateral-Fluss- Vorrichtung
Grundsätzlich sind sämtliche in der DE 10330982 Al und WO2005/005986 angegebenen Lateral-Fluss-Vorrichtungen geeignet.
Die Membran der erfindungsgemäß verwendeten Vorrichtung ist eine poröse Membran. Bevorzugte Membran-Materialien sind beispielsweise Nitrozellulose (z. B. UniSart von Sartorius, HiFlow von Millipore, Whatman, AE99 bzw. FF85/100 von Whatman Schleicher & Schuell), Polyethylen {Lateral FIo von Porex Corporation) oder Nylon {Novylon von CUNO). Vorzugsweise weist die Membran eine möglichst große Porengröße auf, da eine hohe Porosität der Membran das Eindringen insbesondere von zellulären Komponenten der zu bestimmenden Probe, z. B. von Erythrozyten, in die poröse Struktur begünstigt. Von besonderem Vorteil ist der Einsatz aufnehmender Membranen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist jedoch nicht auf diese Eigenschaften beschränkt. Bevorzugt werden alle Membranen mit einer hohen kapillaren Flussrate (Capillary Speed), wobei die kapillare Flussrate die Zeit ist, die eine Farblösung braucht, um 40 mm auf einer gegebenen Membran zurückzulegen. Besonders bevorzugt sind Membranen, deren kapillare Flussrate < 100 ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist in Fließrichtung hinter der Aufgabezone der erfindungsgemäßen Vorrichtung auf der porösen Membran ein Dichtelement angeordnet. Zur Anwendung kommen zwei- oder dreidimensionale Dichtelemente, die auf der porösen Membran platziert werden und mit de- nen eine von der übrigen Fläche der porösen Membran separierte Probenauftrags- zone geschaffen wird. Das Dichtelement hat erfindungsgemäß primär die Wirkung einer Flüssigkeitsbarriere und erlaubt die gerichtete Verteilung von Probenflüssigkeit und Testreagenzien in die poröse Membran. Weiterhin dichtet das Dichtelement erfindungsgemäß die Probenauftragszone ab zur Verhinderung ei- nes unerwünschten Flüssigkeitsübertritts in die anderen Bereiche der Lateral- Fluss- Vorrichtung.
Bevorzugte Ausführungsformen des Dichtelementes sind die Steg- oder Trogbzw. Trichter-Form. Die Ausformung des Dichtelementes erfolgt durch Schneide- prozesse aus dem zur Herstellung des Dichtelementes verwendeten Material. Im Fall der Trichter- bzw. Trogform erhält das Dichtelement eine innere Öffnung, deren bevorzugte Ausführungsvarianten runde, quadratische oder rechteckige, im Fall der Trichterform sich zur Unterseite (Membrankontaktseite) des Dichtelementes verjüngende Formen sind. Bevorzugte Materialien für das Dichtelement sind Materialien, die nicht wasser- aufnehmend (hydrophob) sind. In einer besonderen Ausführungsform sind die Materialien einseitig mit einem Klebstofffilm, beispielsweise einem drucksensitiven bzw. selbsthaftenden Acrylatklebstoff, beschichtet. Somit kann das Dichtelement direkt auf die Oberfläche der porösen Membran geklebt werden. Alternativ kann das Dichtelement mit dem Lateral-Fluss-Gehäuse verbunden, beispielsweise verklebt sein, wobei in dieser Ausführungsform das Lateral-Fluss-Gehäuse das Dichtelement auf die Oberfläche der porösen Membran drückt und damit die Funktionen des Dichtelementes erzielt werden.
Bevorzugte Materialien für die Ausbildung von zweidimensionalen Dichtelemen- ten sind jede Form von Klebebändern oder Klebefolien (z. B. Tesa 4124 von Bei- ersdorf AG, ARcare 7815 von Adhesives Research).
Bevorzugte Materialien für die Ausbildung von dreidimensionalen Dichtelementen sind flexible, geschlossenporige Elastomermaterialien oder flexible Silikonmaterialien mit unterschiedlichen Materialstärken, vorzugsweise 3-5 mm (z. B. Zellkautschuk EPDM 140 von Pitzner, Silikonkautschuk oder Vollkautschuk, Härte 40° oder weniger, von Castan).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind aus einem Stück bestehende multiple Dichtelemente mit beispielsweise 20 Einzelkavitäten (Trogform) auf einer Membran angeordnet.
Durch diese erfindungsgemäße Ausgestaltung ist die erfindungsgemäße Vorrichtung in der Lage, flüssige Proben, die Zellen enthalten, wie beispielsweise Vollblut, aufzunehmen, ohne die Zellen dabei abzufiltern. Weiterhin erlaubt das Dichtelement das Auftragen großer Probenvolumina auf die poröse Membran (Aufgabezone), ohne dass diese überschwemmt wird. Somit unterstützt das Dichtelement die Nutzung der aufnehmenden Eigenschaften der porösen Membran. Weiter garantiert das Dichtelement einen gerichteten Probenfluss. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann jedoch mit oder ohne Dichtelement gut funktionieren.
Für den Absorptionsbereich (Absorptions-Pad) der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden mechanisch stabile Materialien bevorzugt, vorzugsweise mit Wasserabsorptionskapazitäten von 20-30 g/100 cm (z. B. Wicking Papier, Typ 300, Whatman Schleicher und Schüll). Der Kontakt zwischen dem Absorptions-Pad und der Lateral Fluss-Membran der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird durch Andruck und Überlappung mit der porösen Membran hergestellt. Die genaue Positionierung des Absorptions-Pads auf der Membran wird durch Verkleben des Absorptions-Pads mit der, die Lateral Fluss-Membran tragenden Trägerschicht (backing sheet), erzielt.
In einer weiteren Ausführungsform sind die Komponenten der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Zwecke der mechanischen Verstärkung auf eine Unterlage bzw. Trägerschicht aufgebracht. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann jedoch mit oder ohne Trägerschicht funktionieren. Bevorzugt werden mechanisch stabile und nicht wasseraufnehmende Materialien, vorzugsweise mit Materialstärken von 100 μm oder mehr, die ein- oder zweiseitig mit einem Klebstofffilm, z. B. einem drucksensitiven bzw. selbsthaftenden Acrylatklebstoff, beschichtet sind (z.B. 0.005" Polyester W/ GL-187, G & L). Auf der Trägerschicht werden die poröse Membran und das Absorptions-Pad fixiert. Im Fall der doppelseitig klebenden Trägerschicht wird die klebende zweite Seite zur Fixierung des Stapels auf weiteren Flächen, z. B. innerhalb der Lateral-Fluss-Gehäuse, eingesetzt.
In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Vorrichtung, entweder mit oder ohne Trägerschicht, auf der die Komponenten der erfindungsgemä- ßen Vorrichtung aufgebracht sind, in einem Gehäuse integriert, wodurch die Membran-Komponenten aneinander gedrückt werden und das Gehäuse die Dichtelementfunktion unterstützt. Dabei kann die erfindungsgemäße Vorrichtung jedoch mit oder ohne Gehäuse genauso gut funktionieren.
Inkubationsverfahren
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Bestimmung von fetomaternaler Hämorrhagie (FMH) durchgeführt, wobei die Probe Erythrozyten enthält, wobei die Indikatorzone vorzugsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch enthält.
Die Zellen enthaltende Probe kann eine beliebige Probe sein. Die Zellen sind vorzugsweise im Blut vorkommende Zellen wie Erythrozyten, Leukozyten oder Thrombozyten. Vorzugsweise sind die Zellen Erythrozyten. Die Erythrozyten enthaltende Probe kann hierbei ausgewählt sein aus Vollblut oder Blutzell- Konzentrat. Das Blutzell-Konzentrat kann hierbei ein resuspendiertes Erythrozy- tensediment sein.
Vorzugsweise werden mehr als 200 ul Vollblut eingesetzt. Dies übertrifft deutlich die üblicherweise auf Lateral-Fluss- Vorrichtungen aufgetragene Zellzahl. Durch die hohe dem System zur Verfügung gestellte Zellzahl steigt auch die das Durch- flusszytometer passierende Gesamtzahl der minoren Zellpopulation, was zu einer besseren Detektierbarkeit führt. Das Verdünnungsmittel kann grundsätzlich jedes im Stand der Technik bekannte Verdünnungsmittel sein. Vorzugsweise ist das Verdünnungsmittel ausgewählt aus physiologischer Kochsalzlösung, Diluent 1, Diluent 2 (DiaMed), Diluent F (Me- dion Diagnostics). Es wird bevorzugt im Bereich von 100 μl bis 200 μl zur Verdünnung der Zellen verwendet. Im Gegensatz zu früher offenbarten Methoden ist der Anteil Diluent an der Gesamtsuspension bevorzugt niedriger als der des eingesetzten Vollblutes oder Erythrozytensediments, um eine im Verhältnis hohe Zellkonzentration und einen langsamen Fluss der Erythrozyten zu bewirken.
Das Durchführen des Assays umfasst das Inkubieren über eine ausreichende Zeit, so dass die aufgetragene Probe von der Aufgabezone durch die Indikatorzone(n) bis zum Absorptionsbereich hindurchwandert.
Das Auswerten des Assays kann mit bloßem Auge oder automatisiert erfolgen.
Die Indikatorzonen der erfindungsgemäßen Vorrichtung befinden sich auf der Membran und umfassen Bindungselemente, die die zu bestimmenden Analyte in der Probe abfangen bzw. binden. In den Indikatorzonen werden die Bindungsreak- tionen zwischen Analyt und Bindungselement nachgewiesen. Als besonders bevorzugte Bindungselemente werden Antikörper bzw. Antikörperfragmente oder Lektine an der porösen Membran angebracht. Die Indikatorzonen umfassen vorzugsweise jeweils ein Bindungselement gegen einen zu untersuchenden Analyten. Die Indikatorzonen können punktförmig, strichförmig und/oder keilförmig ausge- bildet sind. Bevorzugt ist die strichförmige Ausbildung in Fliessrichtung. Vorteilhaft wird die minore Zellpopulation nachgewiesen durch eine keilförmige Ausbildung der Indikatorzone, die die bessere Erkennbarkeit ermöglicht.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Be- Stimmung eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten durchgefuhrt, vorzugsweise der Blutgruppe DEL, und die Indikatorzone enthält vorzugsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner vor Schritt a) das Herstellen eines Erythrozytensedimentes durch Zentrifugieren der Blutprobe; Inkubieren des Sediments mit einer Bromelain-, Papain- oder Ficin-Lösung und Resuspendieren des Enzym-behandelten Sediments umfassen (wie beispielsweise beschrieben in AABB Technical Manual, 14th edition, 2003, 693 ff.)- Die Inkubation wird über einen Zeitraum von 5 bis 60 Minuten durchgeführt. Die zu verwendenden Enzyme sind allgemein im Handel erhältlich.
Vorteil der enzymatischen Vorbehandlung ist eine stärkere Exposition der D- Antigene auf den Erythrozyten und damit höhere Sensitivität der Bestimmung.
In dem erfϊndungsgemäßen Verfahren (Variante Inkubationsverfahren) werden in Schritt a) bevorzugt ungefähr 100 μl bis 500 μl Blutprobe oder resuspendiertes Erythrozytensediment aufgetragen. Dies übertrifft deutlich die üblicherweise auf Lateral-Fluss- Vorrichtungen aufgetragene Partikel- und Volumenmenge.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden in Schritt b) bevorzugt ungefähr 100 μl bis 200 μl Verdünnungsmittel aufgetragen werden. Das vergrößerte Ge- samt-Flüssigkeitsvolumen fuhrt zu einem verlangsamten Fluss, der zu einer quasi Inkubation des Analyten mit der Indikatorzone führt.
Sofern die Indikatorzone einen anti-D-Antikörper enthält, ist dieser bevorzugt ausgewählt aus RUM-I, LDM-3, ESDlM, TH-28, MS-201, MS-26 und LDM-I, wie sie von Millipore oder Alba Bioscience kommerziell erhältlich sind. Jedoch können auch Antikörpergemische oder auch affinitätsgereinigte polyklonale Anti- seren verwendet werden.
Zwei-Indikatorzonen- Verfahren und Vorrichtung Die vorstehenden Erläuterungen für das Inkubationsverfahren gelten auch für das Zwei-Indikatorzonen- Verfahren, sofern nicht nachfolgend abweichend definiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Bestimmung des Hämatokrit- Wertes durchgeführt, die Indikatorzone enthält vorzugsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch und in Schritt d) wird das Gesamtmuster bestimmt, in dem die Erythrozyten an die Indikatorzonen gebunden sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens enthält die Vor- richrung mindestens zwei Indikatorzonen, die in einer Fliessspur angeordnet sind und wobei die Indikatorzonen identische Bindungselemente gegen denselben zellulär-gebundenen Analyten enthalten.
In dieser Ausführungsform der Erfindung sind mehr als eine solche Reihe von Indikatorzonen. Die Indikatorzonen können punktförmig, strichförmig und/oder keilförmig ausgebildet sind. Bevorzugt ist die strichförmige Ausbildung in Fliessrichtung. Vorteilhaft wird die minore Zellpopulation nachgewiesen durch eine keilförmige Ausbildung der Indikatorzone, die die bessere Erkennbarkeit ermöglicht. Das Zwei-Indikatorzonen- Verfahren ermöglicht die Darstellung der minoren Zellpopulation neben der majoren Zellpopulation bei in Bezug auf die Aufgabezone proximaler Lage der Indikatorzone, die gegen die minore Zellpopulation gerichtet ist. Besonders bevorzugt ist eine Anordnung, bei der von den zwei Indikatorzonen in einer Fliessspur die jeweils proximale strichförmig in Fliessrichtung und die jeweils distale punktförmig aufgetragen ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegen auf der Membran mindesten zwei Fliessspuren mit jeweils mindestens zwei mit unterschiedlichen Bindungselementen besetzten Indikatorzonen vor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens weist die Vorrichtung mindestens zwei Fliessspuren mit mindestens zwei Indikatorzonen auf und die Konzentration des Bindungselements nimmt von proximal nach distal relativ zur Aufgabenzone zu oder ab. Dies ermöglicht eine quantitative Beurteilung der in der Probe vorhandenden Menge an Erythrozyten im Verhältnis zum Gesamtvolumen und damit eine näherungsweise Bestimmung des Hämatokrit.
Weiterhin bevorzugt weist die Vorrichtung mindestens zwei Fliessspuren mit mindestens zwei Indikatorzonen auf und die Konzentration der Antikörper- Spots in einer ersten Fliessspur unterscheidet sich von der Konzentration in einer zweiten Fliessspur.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in Mischfeld-Reaktionen oder zum Nachweis einer homologen Transfusion durchgeführt, die Vorrichtung enthält hierbei mindestens zwei Indikatorzonen, die in Fließrichtung hintereinander angeordnet sind, so dass die Probenflüssigkeit pro Fliessspur mehr als eine Indikatorzone durchströmt, wobei die Indikatorzonen Bindungselemente gegen unterschiedliche zellulär-gebundene Analyten enthalten.
Bevorzugt ist der zellulär-gebundene Analyt ausgewählt aus einem Blutgruppen- antigen wie A, B, AB, D, C, c, E, e, Cw, K, k, Jka und/oder Jkb. Besonders bevorzugt werden die Blutgruppenantigene in Form der Reaktionspaare A, B; D+, D-; K, k; C, c und/oder E, e bestimmt.
Das gegen den Analyten gerichtete Bindungselement ist wie vorstehend für das Inkubationsverfahren definiert bevorzugt ausgewählt aus einem Antikörper, Antikörperfragment, Lektin, Lektin-Fragment oder Gemischen davon.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Zwei-Indikatorzonen- Verfahrens bereitgestellt. Beispiele Beispiel 1: Bestimmung von Mischfeld-Reaktionen
Herstellung der Teststreifen: , wobei jeweils 2 verschiedene Antikörper in Reihe aufgetragen werden: Die Teststreifen bestehen aus einer zentralen Aufgabezone, zwei Indikatorzonenbereichen und zwei Absorptionsbereichen. Membranen der Sorte Millipore HiFlow Plus 075 werden in Streifen auf eine Größe von 19 x 75 mm (Breite/Länge; y/x) für eine 10-Paar- Ausführung zurechtgeschnitten und auf eine Trägerschicht (Backing Sheet z. B. von G&L) aufgeklebt. Es wird mit zentraler Auf- gabezone gearbeitet (bidirektionaler Fluss) und in parallelen Reihen zu beiden Seiten der Aufgabezone werden im Indikatorzonenbereich 0.3 ul Linien bzw. 0,1 μl Punkte von Lösungen verschiedener blutgruppenspezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung eines Dispensers, z. B. AD3200 (Biodot), aufgetragen, wobei jeweils 2 verschiedene Antikörper, einer jeweils als Punkt und einer als Linie in Reihe aufgetragen werden:
Anti-A-Klon Birma-1 (Millipore, TL); Anti-B-Klon LB-2 Millipore, TN); Anti- D-Klon LDM3 (Alba Bioscience, Z7180100); Anti-C-Klon MS-24 (Millipore, FFMU, KG); Anti-c-Klon MS-33 (Millipore, KN); Anti-E-Klons MS-80 + MS- 258 (Millipore, TA); Klons Anti-e MS-21+MS-63 (Millipore, FFMU, KL+KQ); Anti-K-Klon MS-56, (Millipore, KO); anti-k (AlbaClone, Alba Bioscience). Anti- RBC (Rabbit IgG Fraction of anti Human RBC, Rockland, 209-4139) Die Positionierung der als Punkte aufgetragenen Antikörper erfolgt in Position x = 22 mm (links der Aufgabezone) bzw. in Position x = 53 mm (rechts der Aufgabe- zone) beginnend 3.5 mm von der Membranoberseite in Abständen von jeweils 3 mm entlang der y-Achse. Die Positionierung der als Linien aufgetragenen Antikörper erfolgt in Position x = 25-28 mm (links der Aufgabezone) bzw. in Position x = 47 - 50 mm (rechts der Aufgabezone) beginnend 3.5 mm von der Membranoberseite in Abständen von jeweils 3 mm entlang der y-Achse. Die Verdünnungen der Antikörper erfolgen in 15 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5, 10% (v/v) Methanol) wie folgt: Anti-A Antikörper 1 :3, anti-B Antikörper 1 :2, anti-AB Antikörper 1 :4, anti-D Antikörper 1 :4, anti-RBC Antikörper 1 :3. Alle anderen Antikörperlösungen werden nicht vorverdünnt, jedoch mit Methanol auf 10 % (v/v) ver- setzt.
Die Membranen werden nach dem Dispensieren der Antikörper für 20 min bei 40°C getrocknet und anschließend bei konstanter Luftfeuchte bis zur Testdurchführung aufbewahrt. An beiden zur Aufgabezone distalen Enden wird ein mit der Membran um 3 mm überlappendes 19 x 20 mm großes Absorptions-Pad (What- man Schleicher & Schüll, 300) aufgeklebt. Die Aufgabezone wird durch Aufkleben eines trogförmigen Dichtelements (Zellkautschuk EPDM 140 von Pitzner) in Position y = 32.5-37.5 mm über die gesamte Membranbreite von der übrigen Membran separiert.
Proximal (Linie) Distal (Punkt)
Links der Aufgabezone:
Anti-A -> Anti-B
Anti-B -> Anti-A
Anti-D -> Anti-RBC Anti-RBC -> Anti-D
Anti-K -> Anti-k
Rechts der Aufgabezone:
Anti-C -> Anti-c
Anti-c -> Anti-C Anti-E -> Anti-e
Anti-e -> Anti-E Anti-k -> Anti-K
Die Figuren 2 und 3 veranschaulichen die Ausgestaltung einer zur Durchfuhrung des Nachweises einer Mischfeldreaktion geeigneten Lateral-Fluss- Vorrichtung. Figur 3 sind geeignete Dimensionen zu entnehmen, die jedoch als beispielhaft verstanden werden sollen.
Testansatz Vollblut:
50 μl antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden mit 200 μl Diluent F (Medion Diagnostics) gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 100 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 300 μl Diluent F aufgetragen.
Testansatz Erythrozvten-Sediment: 50 μl Erythrozvten-Sediment (antikoaguliertes Vollblut wird für 5 min bei 1500 U/min zentrifugiert; das Erythrozytensediment befindet sich in der unteren, rot gefärbten, Phase) werden mit 400 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 100 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 300 μl Diluent F aufgetragen. Das Ergebnis kann nach ca 5 Minuten abgelesen werden und drückt sich durch einen leicht roten Keil („Halbmond" - minore Zellpopulation) bis zu einer stark roten Bande bzw. stark rot gefärbten Punkt (majore Zellpopulation) aus.
Die Figuren 4A und 4B verdeutlichen den Nachweis einer Mischfeld-Reaktion mit Hilfe des erfindungsgemäßen Zwei-Indikatorzonenverfahrens. Figur 4A zeigt hierbei das Ergebnis der Untersuchung einer Blutprobe mit 100 % Acc D.ee und 0 % B CCD. EE. Figur 4B zeigt das Ergebnis der Untersuchung einer Blutprobe mit 98 % A ccD.ee und 2 % B CCD.EE. In Figur 4B ist der Nachweis der minoren Zellpopulation in Form eines leichten Keils (Halbmond) gegenüber der majoren Zellpopulation zu entnehmen.
Beispiel 2: Homologe Transfusion (Blutdoping) Die Teststreifen wurden analog Beispiel 1 hergestellt.
Proximal (Linie) Distal (Punkt)
Anti-D -> Anti-RBC
Anti-RBC -> Anti-D
Anti-K -> Anti-k Anti-k -> Anti-K
Anti-C -> Anti-c
Anti-c -> Anti-C
Anti-E -> Anti-e
Anti-e -> Anti-E Anti-Jka -> Anti-Jkb
Anti-Jkb -> Anti-Jka
Anti-Cw -> Anti-RBC
Anti-RBC -> Anti-Cw
Testansatz Vollblut:
50 μl antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden mit 200 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 100 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 300 μl Diluent F aufgetragen. Testansatz Erythrozyten-Sediment:
50 μl Erythrozyten-Sediment werden mit 400 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 100 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 300 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca 5 Minuten abgelesen werden und drückt sich durch einen leicht roten Keil („Halbmond" - minore Zellpopulation) bis zu einer stark roten Bande bzw. stark rot gefärbten Punkt (majore Zellpopulation) aus.
Beispiel 3: Nachweis einer fetomaternalen Hämorrhagie (FMH)
Die Teststreifen wurden wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei lediglich anti-D aufgetragen wird. Bevorzugt werden einzelne Antikörper und nicht Antiköper- Gemische aufgetragen. Bevorzugte Antikörper: RUM-I (Millipore); LDM-3 (Al- ba Bioscience); aber auch ESDlM (Alba Bioscience);, TH-28; MS-201 ; MS-26 (Millipore); LDM-I (Alba Bioscience).
Testansatz a):
400 μl antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden mit 100 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 300 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 400 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca. 20 Minuten abgelesen werden und drückt sich durch einen leicht roten Keil (minore Zellpopulation) bis zu einer stark roten Bande aus (majore Zellpopulation). Testansatz b): Analog zu a), aber Blut wird mit Bromelase vorbehandelt
3 mL antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden für 3 min bei 1500 rpm zentrifugiert. Danach werden 600 μl des Zellsediments in ein zweites Gefäss überfuhrt und dort mit 600 μl einer kommerziellen Bromelain- Lösung (z. B. Bromelase von Medion Diagnostics) gemischt und für 15 min bei 37 ° C inkubiert. Danach wird 3 mal mit 0.9 % NaCl gewaschen.
Für den eigentlichen Test wird 100 μl des so bromelisierten und gewaschenen Erythrozytensediments mit 200 μl AB-Plasma und 200 μl Diluent F (Medion Diagnostics) gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 300 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufagbezone „trockengelaufen" ist, werden 450 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca 15 Minuten abgelesen werden und drückt sich durch einen leicht roten Keil (minore Zellpopulation) bis zu einer stark roten Bande aus (majore Zellpopulation).
Beispiel 4: Nachweis eines Erythrozytenmerkmals, das in extrem geringer Antigendichte vorliegt: DEL
Die Teststreifen wurden wie in Beispiel 3 hergestellt. Bevorzugt werden einzelne Antikörper und keine Gemische aufgetragen. Bevorzugte Antikörper: RUM-I (Millipore); LDM-3 (Alba Bioscience).
Testansatz a): 400 μl antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden mit 100 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 300 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 400 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca. 20 Minuten abgelesen werden und drückt sich durch einen leicht roten Keil (minore Zellpopulation) bis zu einer stark roten Bande aus (majore Zellpopulation).
Testansatz b): Analog zu a), aber Blut wird mit Bromelase vorbehandelt
3 mL antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden für 3 min bei 1500 rpm zentrifugiert. Danach werden 600 μl des Zellsediments in ein zweites Gefäss überführt und dort mit 600 μl einer kommerziellen Bromelin- Lösung (z. B. Bromelase von Medion Diagnostics) gemischt und für 15 min bei 37 ° C inkubiert. Danach wird 3 mal mit 0.9 % NaCl gewaschen.
Für den eigentlichen Test wird 100 μl des so bromelisierten und gewaschenen Erythrozytensediments mit 200 μl AB-Plasma und 200 μl Diluent F (Medion Diagnostics) gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 300 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 450 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca 15 Minuten abgelesen werden und drückt sich durch einen leicht roten Keil (minore Zellpopulation) bis zu einer stark roten Bande aus (majore Zellpopulation). Beispiel 5: Hämatokrit
Die Teststreifen wurden wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei jeweils mindestens 2 (bevorzugt 5) Aliquote des selben Antikörpers (anti-RBC) in Reihe aufgetragen werden. Variante 1 : Die Antikörper-Konzentrationen nehmen von proximal zu distal ab; Variante 2: Es gibt mehrere Fliessspuren mit je 2 (5) Antikörperpunkten, wobei die Antikörper-Konzentration von Fliessspur zu Fliessspur abnimmt; Variante 3: Kombination von Variante 1 und Variante 2; Variante 4: Die proximale Antikörper-Auftragung ist eine Linie, gefolgt von mehreren Punkten:
Beispielhafte Auftragung für Variante 2:
Fliessspur 1 : anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti- RBC (C = " 1.0")
Fliessspur 1 : anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti- RBC (c = "0.8")
Fliessspur 1 : anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti- RBC (c = "0.6")
Fliessspur 1 : anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti- RBC (c = "0.4") Fliessspur 1 : anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti-RBC anti- RBC (c = "0.2")
Testansatz Vollblut:
50 μl antikoaguliertes Vollblut oder frisch abgenommenes Nativblut werden mit 200 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 100 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 300 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca. 5 Minuten abgelesen werden (vgl. Figur 5).
Testansatz Ervthrozyten-Sediment:
50 μl Erythrozyt en-Sediment werden mit 400 μl Diluent F gemischt. Von der resultierenden Suspension werden 100 μl auf die Aufgabezone aufgetragen. Wenn die Aufgabezone „trockengelaufen" ist, werden 300 μl Diluent F aufgetragen.
Das Ergebnis kann nach ca. 5 Minuten abgelesen werden (vgl. Figur 5).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer zellulär-gebundenen Analyten in einer flüssigen Probe, wobei das Verfahren durchgeführt wird unter Verwendung einer Vorrichtung umfassend:
mindestens eine Aufgabezone (5) zum Auftragen der flüssigen Probe, eine zum Eindringen von zellulären Komponenten geeignete poröse Membran (2) mit mindestens einer Indikatorzone auf der Membran, die mit dem zellulär-gebundenen Analyten in Wechselwirkung treten kann, wobei die Indikatorzone wenigstens ein Bindungselement gegen den zellulär-gebundenen Analyten enthält und mindestens einen Absorptionsbereich (3) auf der Membran, welcher die Flüssigkeit nach Passieren der Indikatorzonen aufnimmt,
wobei die mindestens eine Indikatorzone zwischen der Aufgabezone (5) und dem Absorptionsbereich (3) liegt, und wobei das Verfahren zur Anreicherung und zur Quantifizierung der minoren Zellpopulation in heterogenen Zellpopulationen wie bei fetomaternaler Hämorrhagie oder bei sogenannten Chimären, zum Nachweis eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten, zur Bestimmung des Hämatokritwertes und/oder zur parallelen Bestimmung von zellulärgebundenen Analyten in Mischfeldreaktionen durchgeführt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
a) Auftragen einer Zellen enthaltenden Probe auf die Aufgabezone; b) Auftragen eines Verdünnungsmittels; c) Durchführen des Assays; und d) Auswerten des Assays durch Bestimmen, ob Zellen an die Indikatorzone gebunden sind.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Verfahren zur Bestimmung von feto- maternaler Hämorrhagie (FMH) durchgeführt wird, wobei die Probe Erythrozyten enthält, wobei die Indikatorzone vorzugsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch enthält:
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Verfahren zur Bestimmung eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten, vorzugsweise die Blutgruppe Dweak, insbesondere DEL durchgeführt wird und wobei die Indikatorzone vorzugsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch enthält.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verfahren ferner vor Schritt a) das Herstellen eines Erythrozytensedimentes durch Zentrifugieren der
Blutprobe; Inkubieren des Sediments mit einer Bromelain-, Papain- oder Ficin- Lösung und Resuspendieren des Enzym-behandelten Sediments umfasst.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei in Schritt a) ungefähr 100 μl bis 500 μl Blutprobe oder resuspendiertes Erythrozytensediment aufgetragen werden.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei in Schritt b) ungefähr 100 μl bis 200 μl Verdünnungsmittel aufgetragen werden.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei der anti-D-Antikörper ausgewählt ist aus RUM-I, LDM-3, ESDlM, TH-28, MS-201, MS-26 und LDM- I.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1 , wobei die Vorrichtung mindestens zwei Indikatorzonen enthält, die in Fließrichtung hintereinander angeordnet sind, so dass die Probenflüssigkeit pro Fliessspur mehr als eine Indikatorzone durchströmt, wobei die Indikatorzonen Bindungselemente gegen zellulär-gebundene Analyten enthalten, und das Verfahren umfasst:
a) Auftragen einer Erythrozyten enthaltenden Blutprobe auf die Aufgabezone; b) Auftragen eines Verdünnungsmittels auf die Aufgabezone; c) Durchfuhren des Assays; d) Auswerten des Assays durch Bestimmen, ob Erythrozyten an die Indika- torzone(n) gebunden sind,
wobei das Verfahren zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten bei fetomaternaler Hämorrhagie (FMH), zur Bestimmung in Mischfeld- Reaktionen, zum Nachweis einer homologen Transfusion oder zur Bestimmung des Hämatokritwertes durchgeführt wird.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Verfahren zur Bestimmung des Hä- matokrit-Wertes durchgeführt wird, die Indikatorzone vorzugsweise einen Antikörper oder ein Antikörpergemisch enthält und wobei in Schritt d) das Gesamt- muster bestimmt wird, in dem die Erythrozyten and die Indikatorzonen gebunden sind.
1 1. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Vorrichtung mindestens zwei Indikatorzonen enthält, die in einer Fliessspur angeordnet sind und wobei die Indika- torzonen identische Bindungselemente gegen denselben zellulär-gebundene Analyten enthalten.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei die Vorrichtung mindestens zwei Fliessspuren mit mindestens zwei Indikatorzonen aufweist und die Konzent- ration des Bindungselements von proximal nach distal relativ zur Aufgabenzone zunimmt oder abnimmt.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Vorrichtung mindestens zwei Fliessspuren mit mindestens zwei Indikatorzonen aufweist und sich die Konzentration des Antikörpers in einer ersten Fliessspur von der Konzentrati- on in einer zweiten Fliessspur unterscheidet.
14. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Verfahren zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in Mischfeld-Reaktionen oder zum Nachweis einer homologen Transfusion durchgeführt wird, die Vorrichtung min- destens zwei Indikatorzonen enthält, die in Fließrichtung hintereinander angeordnet sind, so dass die Probenflüssigkeit pro Fliessspur mehr als eine Indikatorzone durchströmt, wobei die Indikatorzonen Bindungselemente gegen unterschiedliche zellulär-gebundene Analyten enthalten.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der zellulär-gebundene Analyt ausgewählt ist aus einem Blutgruppenantigen wie A, B, AB, D, C, c, E, e, Cw, K, k, Jka und/oder Jkb.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Blutgruppenantigene in Form der Reaktionspaare A, B; D+, D-; K, k; C, c und/oder E, e bestimmt werden.
17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das gegen den Analyten gerichtete Bindungselement ausgewählt ist aus einem Antikörper, Antikörperfragment, Lektin, Lektin-Fragment oder Gemische davon.
18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Membran oder die Membranen (2) vorzugsweise aus Polyethylen, Nitrocellulose oder Nylon, besteht.
19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei hinter der Aufgabezone (5) und vor den Indikatorzonen auf der Membran (2) mindestens ein Dichtelement (4) angeordnet ist.
20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Komponenten der Vorrichtung zur mechanischen Verstärkung auf eine Trägerschicht (1) aufgebracht sind.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Komponenten der Vorrichtung in einem Gehäuse integriert sind.
22. Verwendung einer Vorrichtung zur Bestimmung von fetomateraaler Hä- morrhagie oder bei sogenannten Chimären, zur Bestimmung eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten, zur Bestimmung des Häma- tokritwertes und/oder zur parallelen Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in Mischfeldreaktionen in einer flüssigen Probe, wobei die Vorrichtung um- fasst:
mindestens eine Aufgabezone (5) zum Auftragen der flüssigen Probe, - eine zum Eindringen von zellulären Komponenten geeignete poröse
Membran (2) mit mindestens einer Indikatorzone auf der Membran, die mit dem zellulär-gebundenen Analyten in Wechselwirkung treten kann, wobei die Membran wenigstens ein Bindungselement gegen einen zellulärgebundenen Analyten enthält und - mindestens einem Absorptionsbereich (3) auf der Membran, welcher die
Flüssigkeit nach Passieren der Indikatorzonen aufnimmt,
wobei die Indikatorzone zwischen der Aufgabezone (5) und dem Absorptionsbereich (3) liegt.
23. Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Vorrichung zur Bestimmung von FMH verwendet wird.
24. Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Vorrichtung zur Bestimmung eines in geringer Konzentration auf Zellen vorhandenen Analyten verwendet wird.
25. Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei der Analyt die Blutgruppe Dweak, insbesondere DEL ist.
26. Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Vorrichtung zur Bestimmung des Hämatokrit- Wertes verwendet wird.
27. Vorrichtung zur direkten Bestimmung von zellulär-gebundenen Analyten in einer flüssigen Probe umfassend
eine Aufgabezone (5) zum Auftragen der flüssigen Probe, eine zum Eindringen von zellulären Komponenten geeignete poröse Membran mit mindestens zwei Indikatorzonen auf der Membran, die mit dem/den zellulär-gebundenen Analyten in Wechselwirkung treten können, wobei die Indikatorzonen Bindungselemente gegen zellulär-gebundene
Analyten enthalten und mindestens einem Absorptionsbereich (3), welcher die Flüssigkeit nach Passieren der Indikatorzonen aufnimmt,
wobei die Indikatorzonen zwischen der Aufgabezone (5) und dem Absorptionsbereich (3) liegen, wobei die mindestens zwei Indikatorzonen in Fließrichtung hintereinander angeordnet sind, so dass die Probenflüssigkeit pro Fliessspur mehr als eine Indikatorzone durchströmt.
28. Vorrichtung gemäß Anspruch 27, wobei der zellulär-gebundene Analyt ausgewählt ist aus einem Blutgruppenantigen wie A, B, AB, C, c, E, e, Cw, K, k, Jka und/oder Jkb.
29. Vorrichtung gemäß Anspruch 28, wobei die Blutgruppenantigene in Form der Reaktionspaare A, B; D+, D-; K, k; C, c und/oder E, e bestimmt werden.
30. Vorrichtung gemäß Anspruch 29, wobei auf der Membran mindesten zwei Fliessspuren mit jeweils mindestens zwei mit unterschiedlichen Bindungselemen- ten besetzten Indikatorzonen vorliegen.
31. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei die Indikatorzonen punktförmig, strichfö rmig und/oder keilförmig ausgebildet sind.
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