CN101606065A - 测定异质性细胞群中的小细胞群的方法和装置 - Google Patents
测定异质性细胞群中的小细胞群的方法和装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101606065A CN101606065A CNA200780048573XA CN200780048573A CN101606065A CN 101606065 A CN101606065 A CN 101606065A CN A200780048573X A CNA200780048573X A CN A200780048573XA CN 200780048573 A CN200780048573 A CN 200780048573A CN 101606065 A CN101606065 A CN 101606065A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- zone
- indicator
- blood
- indicator zone
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 98
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 102
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 100
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 103
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 41
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 28
- 239000012749 thinning agent Substances 0.000 claims description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 7
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 claims description 6
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 claims description 5
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 claims description 5
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 claims description 5
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 claims description 5
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 claims description 5
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 claims description 5
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 5
- 102100027544 Blood group Rh(D) polypeptide Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 101000580024 Homo sapiens Blood group Rh(D) polypeptide Proteins 0.000 claims description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000270 Ficain Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 2
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 claims description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 2
- HGAZMNJKRQFZKS-UHFFFAOYSA-N chloroethene;ethenyl acetate Chemical compound ClC=C.CC(=O)OC=C HGAZMNJKRQFZKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000019836 ficin Nutrition 0.000 claims 1
- POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N ficin Chemical compound FI=CI=N POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 10
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 5
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 5
- VYQNWZOUAUKGHI-UHFFFAOYSA-N monobenzone Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1OCC1=CC=CC=C1 VYQNWZOUAUKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091005880 Hemoglobin F Proteins 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 2
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010407 Fetomaternal Transfusion Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 208000033571 alveolar capillary dysplasia with misalignment of pulmonary veins Diseases 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 208000002925 dental caries Diseases 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 208000001031 fetal erythroblastosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 208000004594 persistent fetal circulation syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
- G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
- G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及测定液体样品中的一种或多种细胞结合分析物的方法，实施所述方法使用的装置包括：至少一个用于施加液体样品的进样区域(5)；适于使得细胞组分渗透的多孔膜(2)，膜上具有至少一个指示剂区域，所述指示剂区域能够与细胞结合分析物反应并且包含至少一种针对细胞结合分析物的粘结剂；至少一个位于膜上的吸收区域(3)，在液体通过指示剂区域后吸收液体。所述至少一个指示剂区域位于进样区域(5)和吸收区域(3)之间。本方法用于浓缩和定量测定异质性细胞群中的小细胞群，例如在胎母输血或嵌合体等情形中，检测以低浓度存在于细胞上的分析物，测定血细胞比容值，和/或在混合-场反应中平行测定多种细胞结合分析物。
Description
技术领域
本发明涉及用于测定异质性细胞群中的小细胞群的方法。所述方法适于浓缩和定量测定异质性细胞群中的小细胞群，例如在胎母输血中；用于平行地测定多种细胞结合分析物，并且因此可在胎母输血情形或嵌合体情形中
用于在输血之后测定混合场反应(Mischfeldreaktionen)中的细胞群；用于检测以低浓度存在于细胞上的分析物；和/或用于测定血细胞比容值。本发明还提供适于所述方法的装置。
背景技术
FMH
在妊娠过程中，血液有规律地从胎儿循环流入母体循环(胎母输血(fetomaternal hemorrhage)，FMH)。根据文献资料记载，这一输血量为0.1ml至大约30ml；在大约96-98％的妊娠中，FMH小于2ml，但是在0.3％的妊娠中，超过30ml。估计母体血液量为5000ml，这就意味着有0.002％至0.6％抗原性质与母体不同的另一种红细胞进入母体循环，如果由此产生免疫反应则可能变成临床问题。最为显著的例子是一个D型母亲怀有一个D+型胎儿。如果母亲产生抗-D抗体，那么再次怀上D+型胎儿时可能产生致命的结果(新生儿溶血病，HDN)。由于这一原因，在这些情况下需对母亲实施“抗-D预防”。尽管如此，人们对能够由此估计FMH量仍有极大的兴趣，因为，例如在FMH＞30ml时，标准的抗-D疗法无法提供足够的保护。因此，在美国，标准免疫包括250至300μg的抗-D(IgG)，这足以为自身母体循环接收15ml的胎儿红细胞也就是25至30ml的胎儿血液的妊娠妇女提供足够保护。欧洲的标准剂量通常低些，即100至150μg抗-D(IgG)，这能为FMH为8-10ml的妊娠妇女提供保护。每个实施抗-D预防的机构都必须设法检测超过标准的FMH(Issitt PD和AnsteeDJ.在：应用血型血清(Applied Blood Group Serology)[第4版]，蒙哥马利科学出版社(Montgomery Scientific Publication)，第41章：新生儿溶血病(Hemolyticdisease of the newborn)，第1045-1050页)。
传统的血型-血清分析，例如用于检测D抗原的分析，根本不能检测如上所述如此小量的异质细胞群。
因此，曾开发了许多专门用于检测FMH的不同的分析方法。这些分析方法检测胎儿红细胞，血型抗原D或血红蛋白F。
FMH检测测试： FMH检测限
Rosette测试： 大约10ml
这一测试方法基于对红细胞聚集的检测及显微鉴定。胎儿D抗原检测。
(Jones A.R.，Sliver S.Blood 1958；13：763
Sebring E.S.，Polesky H.F.Transfusion 1982；22：468
Sebring E.S.in：Hemolytic disease of the newborn.
Arlington，VA；Am Assoc Blood Banks 1984：87.)
Kleihauer-Betke测试 大约5ml
这一测试方法基于胎儿红细胞对酸性洗提的较高的抵抗力及对其进行的显微鉴定。胎儿细胞检测。
(Kleihauer E.，Braun H.，Betke K.Klein Wschr 1957；35：637.)
流式细胞仪 大约1ml
D抗原或血红蛋白F用相应的抗体标记，用发荧光的第二抗体检测。胎儿D抗原/血红蛋白检测。
Garratty G.，Arndt P.Transfusion 1995；35：157.
David B.H.Clin Lab Med 2001；21：829.
抗体消耗测试： 大约15ml
这一测试方法是一种基于常规血型测定方法(凝胶技术)的FMH测定法。它是基于胎儿红细胞对抗-D试剂的消耗。反应上清液用D-阳性测试细胞孵育，然后象在凝胶测试中那样离心。胎儿D抗原检测。
Lapierre Y.，Rigal D.，Adam J.，Josef D.，Meyer F.，Greber S.，Drot C.Transfusion1990；30：109.
David M.，Stelzer A.，Wittmann G.，Dudenhausen J.W.，Salama A.Z.GeburtshilfeNeonatol 1999；203：241.
这些方法用于检测红细胞抗原、胎儿红细胞或者胎儿红细胞的特征性血红蛋白F。所有这些方法的共同点在于：这些方法需要大量试剂，且费时费事。而且，这些方法都需要诸多仪器来实施，其中的一些仪器是非常昂贵的(例如显微镜，离心分离机，流式细胞仪)。这些方法的共同点还在于需要经特别培训的人员才能实施。此外，Kleihauer-Betke法的缺点还在于鉴定结果非常主观。
弱D(Dweak)特征表达，特别是DEL
供血者和接受者血清的另一个挑战是D抗原的微弱或部分表达(不完全表达)。依赖于单克隆抗体和间接Coomb试验确认，即使是对这样弱的血型进行的鉴定曾一度被视为是可靠的，直到发现DEL表型，该表型具有特别弱的D型表达(“常规”D：每红细胞10-30000抗原(RBC)；弱D型：400至1000；DEL：＜30)。
在血清学上，DEL仅能通过使用可多达10个清洗步骤的极复杂的吸收-洗提测试间接测定。输血需要考虑DEL，因为一个接受DEL型库存血的D型受血者会形成抗-D抗体。这一问题如此严重以致于目前专家间就是否应当对所有(血清学)D型供血者的D型状况用分子学方法进行确认存在争论。
Wagner T.，
G.F.，Buchta C.，Vadon M.，Lanzer G.，Mayr W.R.，LeglerT.J.Transfusion 2005；45：520
混合场反应，异体输血，血液回输
输血应当总是在相同的或相容的ABO型和相容的D型之间进行。在某些情况下，例如对于输过血的患者(vortransfundierten)，临床要求输就其它抗原而言亦为同型的同型血。然而，尚不可能做到所有血型全同的同型血(自体输血除外)。这常会导致这样的输血后现象，即，患者被诊断为对某些血型特征即有阳性又有阴性。在诊断中，“混合场反应”是存在的，就像采用高灵敏度方法-特别是能够在检测过程中空间分离单个红细胞和红细胞凝聚体的那些方法-也能看到的那样。例如，将300ml(67％)的红细胞浓缩液输给一个K-阴性的人(血型kk)，他的血液循环量为5000ml(45％的血细胞比容)，所述浓缩液为K+(血型Kk或KK)，于是，此人大约8％(公称值)的红细胞是K+，92％的红细胞是K-。
这种情况也可用例如现在被广泛使用的DiaMed和Bio-Rad的凝胶系统检测到。这一技术包括离心被检者的红细胞稀释悬浮液，令其通过-凝胶-层析柱，该层析柱底部封闭，并且可包含不同特性的抗体试剂。未凝集游离细胞能够通过凝胶并在反应容器的底部形成沉淀物，而红细胞凝集体则被截留在凝胶上或凝胶内(Lapierre Y.，Rigal D.，Adam J.，Josef D.，Meyer F.，Greber S.，Drot C.，Transfusion 1990；30：109)。如果前述示例中的红细胞通过一个包含抗-K的柱离心，与前文所述混合场检测结果相对应，大多数细胞将沉淀在底部，因为它们是K-，一小部分会被截留在凝胶上和凝胶内(K+)。如果将上述红细胞上样在MDmulticard(Medion诊断)上，同样可检测到一条位于抗-K处的弱带。然而，与凝胶技术相比，WO2005005991所述的方法不能同时显现反应阴性的细胞群。背景技术中所有其它方法，就检测混合场反应而言，不具有任何可与凝胶系统和MDmulticard相比的特性。
异体输血和血液回输：
Nelson M.，Popp H.，Sharpe K.，Ashenden M.Haematologica 2003；88：1284
输血后的混合场反应
Issitt PD和Anstee DJ.在：应用血型血清(Applied Blood Group Serology)[第4版]，蒙哥马利科学出版社(Montgomery Scientific Publication)，第41章：新生儿溶血疾病(Hemolytic disease of the newborn)，第1045-1050页。
血细胞比容
红细胞的血细胞比容或总容量指红细胞的容量和全血的总容量的比率，以百分比表达。红细胞与全血的容量比率受到红细胞的容量和数量影响。
血细胞比容一般可通过离心装有血液的毛细管来测定(StrumiaM.M.，Samble A.B.，Hart E.D.，1954；Am J Clin Path；24：1016)，离心后就可得出沉淀细胞成分与总容量的比率。血细胞比容的测定也可以借助于电阻抗方法。该方法中，电解溶液中阳极和阴极之间的电流受到引入其中的不同传导率的颗粒的影响。电流的变化以脉冲记录。因此，根据特定的脉冲幅度可推断出特定的颗粒尺寸，由此推定特定的血清学细胞类型，例如红细胞。细胞数量和血细胞比容可通过单位测定量的脉冲量累加推导得出(Sysmex KX-21NOperator’s，1999)。
因此，本发明的一个目标是提供简单、经济、可自动化的方法，该方法能够快速检定异质性细胞群中的小细胞群，例如在胎母输血或嵌合体情形中。本发明还意在提供用于检测以低浓度存在于细胞上的分析物，用于测定血细胞比容值和/或用于平行测定混合场反应中的多种细胞结合分析物的简单、快速、灵敏的方法。与现有方法相比，这些方法具有更高的灵敏度。
发明概述
本发明提供了一种用于测定液体样品中一种或多种细胞结合分析物的方法，由此实现了上述目标，实施所述方法使用的装置包括：
-至少一个进样区域(5)，用于施加液体样品，
-适于各种细胞成分透过的多孔膜(2)，膜上包括至少一个指示剂区域，所述指示剂区域能够与细胞结合分析物相互作用并含有至少一种针对细胞结合分析物的结合元素，以及
一至少一个位于膜上的吸收区域(3)，该区在液体通过指示剂区域后吸收液体，
其中，所述至少一个指示剂区域位于进样区域(5)和吸收区域(3)之间，并且，所述方法被用于浓缩和定量测定异质性细胞群中的小细胞群，例如在胎母输血或嵌合体情形中，用于检测以低浓度存在于细胞上的分析物，用于测定血细胞比容值和/或用于平行测定混合场反应中的多种细胞结合分析物。
在一个优选实施方式中，该方法包括以下步骤：
a)将包含细胞的液体样品加至进样区域；
b)施加稀释剂；
c)进行测试；并且
d)通过检测细胞是否结合于指示剂区域来评定测试。
根据这一优选实施方式的方法优选用于浓缩和用于定量测定异质性细胞群中的小细胞群，例如在胎母输血中，或者用于检测以低浓度存在于细胞上的分析物。
所述实施方式在下文亦称“孵育法”。
DE10330982A1和WO2005/005986已经披露了一种横向流动装置(Lateral-Fluss-Vorrichtung)。本文中，后者被用于同时测定红细胞抗原和血清成分例如抗体。在这一已出版公开中披露的横向流动装置适用于本发明的方法。本文在此纳入DE10330982A1和WO2005/005986的全部内容。
在本发明中，所述横向流动装置被用作流式细胞计，为的是能够最大限度浓缩少量存在于异质性细胞混合物中的另一种(或第二)细胞群。所述浓缩优选大量地进行，这可以通过使用最大总量的血液来实施，还可以利用容量增加引起的孵育效应。所述横向流动装置的读数域(Ablesefeld)与流动式细胞计中的流量池(Durch-flusszelle)类似。通过洗清高浓度存在的细胞类型和在读数窗固定低浓度细胞类型保持低背景。
结果，即使是一个低比例群也有足够大的数量通过抗体带，从而使这一群得以显现。这是通过洗去大量显著高比例群来实现的。
用于测定FMH的本方法高度灵敏，并且能够检出母体血液中大约0.1％至0.2％的胎儿D+细胞。
根据另一个优选实施例，方法中使用的装置包括至少两个在流动方向上依次前后设置的指示剂区域，设置的方式使得样品液体在每一条流动路径上通过超过一个指示剂区域，其中，所述指示剂区域含有针对细胞结合分析物的结合剂，并且该方法包括：
a)将包含红细胞的血液样品加至进样区域；
b)将稀释剂施加至进样区域；
c)进行所述测试；
d)通过检测红细胞是否被结合至指示剂区域来评定测试；
其中，所述方法被用于在胎母输血(FMH)中平行测定多种细胞结合分析物，用于混合场反应中的测定，用于检测异体输血或者用于测定血细胞比容值。
该实施例在下文中亦称“两-指示剂区域法”。
根据本发明的另一项内容，本发明提供一种用于直接测定液体样品中的细胞结合分析物的装置，该装置包括：
-用于施加液体样品的进样区域(5)，
-适于被细胞成分透过的多孔膜，该膜上具有至少两个指示剂区域，所述指示剂区域能够与细胞结合分析物相互作用并且含有针对细胞结合分析物的结合剂，以及
-至少一个在液体通过指示剂区域后吸收液体的吸收区域(3)，
其中，所述指示剂区域位于进样区域(5)和吸收区域(3)之间，其中所述至少两个指示剂区域沿流动方向依次前后设置，设置方式使得样品液体能够在每一条流动路径上通过至少一个指示剂区域。
本发明的横向流动装置不同于WO2005/005991的，根据本发明，在此所述的优选实施方式中，两个指示剂区域依次前后设置，为的是能够使得混合场(Mischfelder)中的两个细胞群能同时显现。用于检测混合场的灵敏度高于此前检测混合场的仅有的常规方法，即凝胶技术(DiaMed)。本发明方法的灵敏度能够检出约占总群1-2％的小细胞群。
该方法和装置能够高灵敏度地检出混合场凝集。这一用途也是出人意料的，因为本领域技术人员原本会假定：第一指示剂区域在分析物-结合细胞与之结合之后会成为结合至第二指示剂区域的扩散障碍。
所述横向流动装置能够作为一个流动细胞计用于血细胞比容测定，该装置具有至少两个被依次前后设置的指示位置，目的是能够检测血液样品中的红细胞浓度。所述的浓度越高，线上越多点给出正信号。该方法可通过设置多条流动路径而被扩展为一个2D阵列，例如，每次，5个抗-红细胞点并列，每条流动路径的红细胞浓度依次递增或递减。
横向流动装置的使用还能够平行地测定血型和血细胞比容。
附图说明
图1所示为适于实施前述孵育法的装置的图解。附图标记具有下述含义：(1)支持层；(2)多孔膜；(3)吸收区域；(4)密封部件；(5)进样区域；(6)指示剂区域。
图2所示为用于检测混合-场反应的可能的应用模式。
图3所示为适于检测混合-场反应的图2所示应用模式在膜上的可能尺寸。
图4A和4B所示为借助本发明所述两-指示剂区域法进行的混和-场反应检测。图4A显示含有100％A CC D.ee和0％B CC D.EE的血液样品的检查结果。图4B显示含有98％A CC D.ee和2％B CC D.EE的血液样品的检查结果。
图5所示为借助于根据本发明的方法进行的血细胞比容值测定。
发明详述
定义
在本发明中，下述术语应当按照下面阐述的内容理解。
术语“异质性细胞群中的小细胞群”是指相比存在于该异质性细胞群中的一个或多个其它细胞群以低数量或低浓度存在的细胞群。基于异质性细胞群全体，小细胞群的浓度在此小于50％，优选小于10％，特别优选小于1％，尤其是小于0.1％。
术语“异体输血(homologe transfusion)”是指必要特征相容的输血；这样输血后核查的特征越多，越可能通过混合场测出进行过输血。测出的概率可通过选择被测特征来尽可能提高。这种测定可用于认定通过异体输血进行的非法血液回输。
术语“自体输血”是指自捐血液，捐献者和接受者在所有特征上相同。
术语“混合场”：因为除自体输血外的输血不可能做到在所有抗原上的全部同型，于是在血清学上产生了储存血液与接受者血液之间存在抗原差异的混合场。
术语“DEL”：这是一个表达特别弱的D特征，小于30抗原/细胞。不能通过市售血清学方法测出。
术语“血细胞比容”是指总血量中的红细胞比例[％]。下面的平均值为测得值：男性：44-52％；女性：37-47％。
术语“嵌合体”指这样的有机体，其细胞代表两个或更多的合子。
横向流动装置的准备
从原则上说，在DE10330982A1和WO2005/005986中所述的各种横向流动装置都是合适的。
根据本发明使用的装置的膜是多孔膜。膜材料优选的示例是硝化纤维(例如Sartorius生产的UniSart，Millipore，Whatman生产的HiFlow，WhatmanSchleicher-Schuell生产的AE99和FF85/100)，聚乙烯(Porex公司生产的Lateral Flo)或者尼龙(CUNO生产的Novylon)。膜以具有非常大孔径的为佳，因为膜的高多孔性有益于向多孔结构内的渗透，特别是待测样品中的细胞成分(例如红细胞)向多孔结构内的渗透。特别好的是使用吸收性膜。然而，本发明的装置并不局限于这些特性。优选各种具有高毛细流动速度(毛细作用速度)的膜，毛细流动速度是指染料溶液在给定的膜上移行40mm所需的时间。特别优选的是毛细流动速度＜100的膜。
在本发明的一个优选实施方式中，在多孔膜上，沿流动方向，在该装置的进样区域的下游设置密封部件。使用两维或三维密封部件，将它们放置于多孔膜上，用于形成与多孔膜的其余表面隔开的样品进样区域。根据本发明，密封部件的主要作用是作为液体屏障和使得样品液体和测试试剂以制导方式分散到多孔膜内。而且，根据本发明，密封部件将样品进样区域封阻隔开，从而防止不希望发生的液体进入横向流动装置的其它区域。
在优选的实施方式中，密封部件是网状或槽状和/或漏斗形状的。密封部件由用于制造密封部件的材料切割而成。如果是漏斗和槽状，密封部件具有内部开口，该开口的性状不限，优选圆型，正方形或矩形，在漏斗形密封部件中，该开口向密封部件的底部(膜接触一侧)逐渐收窄。
密封部件的优选材料是不吸水的材料(疏水材料)。在一特定实施方式中，材料的一面涂有一层胶粘膜，例如压敏性或自粘性丙烯酸酯胶粘剂。这样，密封部件能够直接粘合到多孔膜的表面。或者，密封部件可连接至例如结合(verklebt sein)在横向流动罩壳上(Lateral-Fluss-)，在这一实施方式中，横向流动罩壳将密封部件压在多孔膜的表面上，从而实现密封部件的功能。
制造二维密封部件的优选材料是各种形式的胶粘带或胶粘膜(例如BeiersdorfAG生产的Tesa，Adhesives Research生产的ARcare 7815)。
用于制造三维密封部件的优选材料是具有不同的材料厚度的柔性、闭孔弹性体材料或柔性硅酮材料(silikon-materialien)，优选厚度为3-5mm(例如Pitzner生产的闭孔橡胶EPDM140，Castan生产的硅橡胶或密实橡胶(Vollkautschuk)，Castan硬度40°或以下)。
在另一个优选实施方式中，在膜上设置多个连成一体的多个密封部件，多个密封部件连成的整体具有例如20个单独的腔体(槽状)。
由于本发明的这一设计，本发明的装置能够接收包含细胞的液体样品，例如全血，所述细胞不会在处理过程中被滤掉。密闭部件还允许将大量的样品施加至多孔膜(进样区域)而不至于溢出。密封部件因此支持多孔膜的吸收属性的功用。密封部件还确保样品的定向流动。然而，不论有或没有密封部件，本发明的装置都能够有效工作。
至于本发明装置的吸收区域(吸收垫)，优选机械性能稳定的材料，优选水吸收容量为20-30g/100cm2的那些(例如Whatman Schleicher和Schull生产的Wicking Paper，300型)。本发明装置的吸收垫和横向流动膜之间的接触是通过下压并叠合在多孔膜上实现的。吸收垫在膜上的精确定位是通过将吸收垫粘结(Verkleben)到支持横向流动膜的支持层(背衬片)上来实现。
在另一个实施方式中，本发明装置的部件安装在背衬片或支持层上，目的在于机械加固。然而，不论有或没有支持层，本发明装置都能够有效运作。优选这样的材料：机械性能稳定，不吸水，厚度以100μm或以上为佳，并在一面或两面覆盖有粘结膜(例如压敏性或自粘性丙烯酸酯胶粘剂，例如，0.005”Polyester W/GL-187，G&L)。多孔膜和吸收垫被固定在支持层。在采用双面胶粘支持层的情形中，第二胶粘面用于将该多层组件固定到其它表面上，例如固定到横向流动罩壳内的表明上。
在另一个实施方式中，本发明装置，有或没有支持层，在装配了本发明的各部件后，被整合到一罩壳内，于是，所述膜部件相互挤压，所述罩壳支持密封部件功能。然而，不论有或没有所述罩壳，本发明的装置都能良好的发挥其功能。
孵育法
优选实施方式之一中，本发明方法被用于测定胎母输血(FMH)，其中，样品包含红细胞，指示剂区域优选包含抗体或抗体混合物。
含细胞的样品可以是各种样品。细胞优选血液中的细胞，例如红细胞，白血球或血小板。优选细胞是红细胞的样品。本发明中，包含红细胞的样品可以选自全血或者血细胞浓缩液。本发明中，血液细胞浓缩液可以是红细胞沉淀物的重悬液。
优选使用超过200μl的全血，这显著超过了横向流动装置的常规细胞添加量。由于进入系统的细胞数量大，通过流式细胞计的小细胞群的总数也增加，由此提高了检测能力。
稀释剂原则上可以是现有技术中的各种已知稀释剂。稀释剂优选生理盐水，稀释剂1，稀释剂2(DiaMed)，稀释剂F(Medion Diagnostics)。稀释剂用于稀释细胞，优选用100μl至200μl。与以前公开的方法不同，总悬浮液中稀释剂的比例以低于使用的全血或红细胞沉淀物中的稀释剂的比例为佳，从而形成较高的细胞浓度和较低的红细胞流量。
测试的进行包括孵育足够长的时间段，为的是让所加的样品从进样区域经过指示剂区域迁移至吸收区域。
该测试可以通过肉眼评定，也可以用自动化方法进行评定。
本发明装置的指示剂区域被设置于膜上并且包含捕获或者结合样品中待测分析物的结合元素。分析物和结合元素之间的结合反应在指示剂区域检测。较好的是，附着于多孔膜上的结合元素是抗体或抗体片断或[外源]凝集素。较好的是，指示剂区域在各种情形下含有针对待研究分析物的结合元素。指示剂区域可以是点状，线状和/或楔状。优选沿流动方向的线状设计。较好的是，小细胞群用楔状设计的指示剂区域检测，这能够获得更高的识别率。
根据另一个优选实施方式，本发明方法被用于测定以低浓度存在于细胞上的分析物，优选血型DEL，指示剂区域优选包含抗体或抗体混合物。
本发明方法还可以在步骤a)之前包括通过离心血液样品来预备红细胞沉淀物的步骤；通过菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶或无花果蛋白酶溶液孵育沉淀物的步骤以及将经酶处理的沉淀物重悬的步骤(参见AABB技术手册(TechnicalManual)，第14版，2003，693ff)。孵育时间为5分钟至60分钟的。所使用的酶通常是可购得的。酶预处理的优点之一是D抗体更多地曝露出来与红细胞相互作用，由此提高了检测的灵敏度。
本发明方法(不同的孵育方法)中，优选的是，在步骤a)中施加大约100μl至500μl的血液样品或红细胞沉淀物重悬液。这显著超过了通常向横向流动装置施加的颗粒数量及容量。
在本发明的方法中，优选的是，在步骤b)中施加100μl至200μl的稀释剂。扩大的液体总量减慢了流速，由此形成分析物在指示剂区域的准-孵育。
如果指示剂区域包含抗-D抗体，则后者以选自RUM-1，LDM-3，ESD1M，TH-28，MS-201，MS-26和LDM-1为佳，这些抗体能够从Millpore或AlbaBioscoence购得。但是，也可以使用抗体混合物或经亲合纯化的多克隆抗血清。
两-指示剂区域法和装置
以上关于孵育法的说明也适用于两-指示剂区域法，除了下面特别说明的不同之处。
在一优选实施方式中，本发明方法被用于测定血细胞比容值，所述指示剂区域优选包括抗体或抗体混合物，红细胞结合于指示剂区域的总体模式在步骤d)中测定。
在本发明方法的另一个优选实施方式中，所述装置包括至少两个设置在一条流动路径上的指示剂区域，所述指示剂区域包含针对同一细胞结合分析物的相同结合元素。
本发明的这一实施方式包括超过一个这样的指示剂区域系列。指示剂区域可以是点状，线状和/或楔状。优选在流动方向上的线状设计。有利的是，小细胞群采用楔状设计的指示剂区域检测，这能够获得超高的识别率。两指示剂区域法能够在显示主细胞群之外也显示小细胞群，小细胞群显示在针对小细胞群的指示剂区域内相对靠近进样区域的位置。特别优选的设置是：各种情形下，一条流动路径上的两个指示剂区域中的近端指示剂区域是流动方向上的线状，而远端指示剂区域为点状。
在一优选实施方式中，膜上有至少两个流动路径，所述流动路径在各种情形下有至少两个含不同结合元素的指示剂区域。
在本方法的另一个优选实施方式中，本发明装置具有至少两个流动路径，所述流动路径包括至少两个指示剂区域，结合元素的浓度从相对于进样区域而言的近端至远端递增或递减。由此可以定量检测样品中的相比总容量的红细胞的数量，由此可估算出血细胞比容。
此外，优选这样的装置：其具有至少两个流动路径，所述流动路径包含至少两个指示剂区域，并且，第一条流动路径上抗体点的浓度不同于第二条流动路径中抗体点的浓度。
另一个优选实施方式中，本发明的方法被用于平行地测定混合-场反应中的多种细胞结合分析物，或者用于检测异体输血，其中，所用装置包含至少两个指示剂区域，它们在流动方向上依次前后设置，设置方式使得样品液体在每一条流动路径中能够通过超过一个指示剂区域，所述指示剂区域包含针对不同细胞结合分析物的结合元素。
较好的是，细胞结合分析物选自血型抗原，例如A，B，AB，D，C，c，E，e，Cw，K，k，Jka和/或Jkb。特别优选的是能够通过反应对A，B；D+，D-；K，k；C，c和/或E，e测定的血型抗原。
针对分析物的结合元素，如前文在孵育法中所述，优选抗体，抗体片断，[外源]凝集素，[外源]凝集素片断，或其它们的混合物。
本发明还提供用于实施上述两-指示剂区域法的装置。
实施例
实施例1：混合场反应的测定
测试条的准备：每次采用两种不同抗体为一系列。
测试条由中心进样区域，两个指示剂区域和两个吸收区域构成。将MillporeHiFlow Plus 075型膜被切割成19×75mm(宽/长；y/x)的条状，用于10-对的设计方案，将它们粘在支持层(背衬片，例如用G&L的产品)上。采用中心进样区域(双向流动)，用分送器(例如AD3200(Biodot))将不同血型特异性单克隆抗体溶液按照0.3μl的线和0.1μl的点以平行排列的形式加到进样区域两侧的指示剂区域，每次采用两种不同的抗体为一系列，一种呈点状，另一种呈线形，它们是：。
抗-A-克隆Birma-1(Millipore，TL)；抗-B-克隆LB-2(Millpore，TN)；抗-D-克隆LDM3(Alba Bioscience，Z7180100)；抗-C-克隆MS-24(Millipore，KN)；抗-E-克隆MS-80+MS-258(Millpore，TA)；抗-e克隆MS-21+MS-63(Millpore，FFMU，KL+KQ)；抗-K-克隆MS-56，(Millpore，KO)；抗-k(Albalone，Alba Bioscience)。抗-RBC(Rabbit IgG Fractionof anti Human RBC，Rockland，209-4139)。
点状加样的抗体位于x＝22mm的位置(距离进样区域的左边)或者在x＝53mm的位置(距离进样区域的右边)，从距离膜上缘3.5mm处开始，各点之间沿y轴以3mm为间隔。线状加样的抗体位于x＝25-28mm的位置(距离进样区域的左边)或者在x＝37-50mm的位置(距离进样区域的右边)，从距离膜上缘3.5mm处开始，各线之间沿y轴以3mm为间隔。抗体以15mM PH 7.5含10％(v/v)甲醇的钾磷酸盐缓冲液如下稀释：抗-A抗体1∶3，抗-B抗体1∶2，抗-AB抗体1∶4，抗-D抗体1∶4，抗-RBC抗体：1∶3。其它抗体溶液都不预先稀释，而是与甲醇混合至10％(v/v)。
在分注抗体之后，膜在40℃中干燥20分钟，然后储存在恒湿环境中直至进行测试。将一个19×20mm的吸收垫(Whatman Schleicher&Schüll，300)粘贴至远离进样区域的两端，与膜交叠3mm。在y＝32.5-37.5mm处粘贴槽形密封部件(Pitzner生产的闭孔橡胶EPDM140)，由此将进样区域在膜的整个宽度上与其余膜隔开。
近段(线) 远端(点)
在进样区域的左边：
抗-A → 抗-B
抗-B → 抗-A
抗-D → 抗-RBC
抗-RBC → 抗-D
抗-K → 抗-k
在进样区域的右边：
抗-C → 抗-c
抗-c → 抗-C
抗-E → 抗-e
抗-e → 抗-E
抗-k → 抗-K
图2和3图示适用于检测混合-场反应的横向流动装置设计。合适的尺寸能够在图3中找到，但是这些应理解为仅仅是举例。
全血测试混合：
50μl的抗凝全血或新鲜采集自然血液(Nativblut)与200μl稀释剂F(MedionDiagnostics)混合。将100μl的所得悬浮液加至进样区域。当进样区域“走尽(trockengelaufen ist)”，施加300μl稀释剂F。
红细胞沉淀物测试混合：
50μl红细胞沉淀物(抗凝全血以1500rpm离心5分钟；红细胞沉淀物位于下部红色相)与400μl稀释剂F混合。将100μl所得悬浮液施加至进样区域。当进样区域“走尽”时，施加300μl稀释剂F。
结果可在大约5分钟后读出，显示为微红色楔形(“半月”-小细胞群)直至深红色带或深红色点(主细胞群)。
图4A和4B图示借助本发明两-指示剂区域法进行的混合-场反应检测。图4A显示含100％A cc D.ee和0％B CC D.EE.的血液样品的检查结果。图4B显示含98％A cc D.ee和2％B CC D.EE.的血液样品的检查结果。
图4B显示，在主细胞群之上，检测到了小细胞群，呈浅楔形(半月)
实施例2：异体输血(血液回输)
测试条比照实施例1的方式准备。
近段(线) 远端(点)
抗-D → 抗-RBC
抗-RBC → 抗-D
抗-K → 抗-k
抗-k → 抗-K
抗-C → 抗-c
抗-E → 抗-e
抗-e → 抗-E
抗-Jka → 抗-Jkb
抗-Jkb → 抗-Jka
抗-Cw → 抗-RBC
抗-RBC → 抗-Cw
全血测试混合：
50μl的抗凝血剂全血或新鲜采集的自然血液与200μl稀释剂F混合。将100μl所得悬浮液加至进样区域。当进样区域“走尽”时，加300μl稀释剂F。
红细胞沉淀物测试混合：
50μl红细胞沉淀物与400μl稀释剂F混合。将100μl所得悬浮液加至进样区域。当进样区域“走尽”时，加300μl稀释剂F。
结果可在大约5分钟后读出，显示为微红色楔形(“半月”-小细胞群)直至深红色带或深红色点(主细胞群)。
实施例3：胎母输血检测(FMH)
测试条以比照实施例1的方式准备，仅加抗-D。优选施加单独的各抗体而不是抗体混合物。优选抗体：RUM-1(Millpore)；LDM-3(Alba Bioscience)；或者ESD1M(Alba Bioscience)；TH-28；MS-201；MS-26(Millpore)；LDM-1(AlbaBioscience)。
测试混合a)：
400μl的抗凝全血或新鲜采集的自然血液与100μl稀释剂F混合。将300μl所得悬浮液加至进样区域。当进样区域“走尽”时，加400μl稀释剂F。
结果可在大约20分钟后读出，显示为微红色楔形(“半月”-小细胞群)直至深红色带或深红色点(主细胞群)。
测试混合b)：类似于a)，但是血液经过Bromelase预处理。
3ml的抗凝全血或新鲜采集的自然血液以1500rpm离心3分钟。此后，将600μl的细胞沉淀物转移至另一个容器中与600μl购得的菠萝蛋白酶溶液(例如来自Medion Diagnostics的Bromelase)混合，在37℃下孵育15分钟。然后用0.9％的NaCl清洗3次。
为进行实际测试，以这种方式经菠萝蛋白酶处理并经清洗的100μl红细胞沉淀物与200μl AB-血浆和200μl稀释剂F(Medion Diagnostics)混合。将300μl所得悬浮液加至进样区域。当进样区域“走尽”，加450μl稀释剂F。
结果可在大约15分钟后读出，显示为微红色楔形(小细胞群)直至深红色带(主细胞群)。
实施例4：以极低的抗原密度存在的红细胞特征的检测：DEL
测试条以与实施例3中相似的方式准备
优选施加单个的各抗体而不是混合物。优选抗体：RUM-1(Millpore)；LDM-3(Alba Bioscience)。
测试混合a)：
400μl的抗凝全血或新鲜采集的自然血液与100μl稀释剂F混合。将300μl所得悬浮液被加至进样区域。当进样区域“走尽”时，加400μl稀释剂F。
结果可在大约20分钟后读出，显示为微红色楔形(小细胞群)直至深红色带(主细胞群)来指示
测试混合b)：类似于a)，但是血液经过Bromelase预处理。
3ml的抗凝全血或新鲜采集的自然血液以1500rpm离心3分钟。然后，将600μl的细胞沉淀物转移至另一个容器中与600μl购得的菠萝蛋白酶混合(例如来自Medion Diagnostics的Bromelase)，在37℃下孵育15分钟。然后用0.9％的NaCl清洗3次。
为了进行实际测试，以这种方式经菠萝蛋白酶处理并清洗的100μl红细胞沉淀物与200μl AB-血浆和200μl稀释剂F(Medion Diagnostics)混合。将300μl所得悬浮液被加至进样区域。当进样区域“走尽”，加450μl稀释剂F。
结果可在大约15分钟后读出，显示为微红色楔形(小细胞群)直至深红色带(主细胞群)。
实施例5：血细胞比容
测试条的准备如实施例1，每种情形下系列应用至少2(优选5)等份(Aliqote)的相同抗体(抗-RBC)。变化1：抗体浓度从近端至远端递减；变化2：每种情况下有2(5)个抗体点的多条流动路径，抗体浓度按流动路径排列递减；变化3：变化1和变化2的结合；变化4：近端抗体加样成线形，其后为多个点。
变化2的应用举例：
流动路径1 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC(c＝“1.0”)
流动路径1 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC(c＝“0.8”)
流动路径1 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC(c＝“0.6”)
流动路径1 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC(c＝“0.4”)
流动路径1 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC 抗-RBC(c＝“0.2”)
全血测试混合：
50μl的抗凝全血或新鲜采集自然血液与200μl稀释剂F混合。将100μl所得悬浮液加至进样区域。当进样区域“走尽”，加300μl稀释剂F。
结果可在大约5分钟后读出(cf.图5)。
红细胞沉淀物测试混合
50μl的红细胞沉淀物与400μl稀释剂F混合。将100μl所得悬浮液加至进样区域。当进样区域“走尽”，加300μl稀释剂F。
结果可在大约5分钟后读出(cf.图5)。
Claims (31)
1.一种用于测定液体样品中的一种或多种细胞结合分析物的方法，所述方法使用包括以下部件的装置进行：
-至少一个用于施加液体样品的进样区域(5)，
-适于细胞成分透过的多孔膜(2)，所述膜上具有至少一个指示剂区域，所述指示剂区域能够与细胞结合分析物相互作用并且包含至少一个针对细胞结合分析物的结合元素，以及
-至少一个位于膜上的吸收区域(3)，在液体通过指示剂区域后吸收液体，
其中，所述至少一个指示剂区域位于进样区域(5)和吸收区域(3)之间，所述方法用于在例如母婴输血或嵌合体等情形中浓缩和定量测定异质性细胞群中的小细胞群，用于检测以低浓度存在于细胞上的分析物，用于测定血细胞比容值和/或用于测定混合-场反应中的细胞结合分析物。
2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：
a)将包含细胞的样品加至进样区域；
b)施加稀释剂；
c)进行测试；
d)通过测定细胞是否结合于指示剂区域来评定测试。
3.根据权利要求2所述的方法，所述方法用于测定胎母输血(FMH)，其中，样品包含红细胞，指示剂区域以包含抗体或抗体混合物为佳。
4.根据权利要求2所述的方法，所述方法用于测定以低浓度存在于细胞上的分析物，优选弱D血型，特别是DEL，其中指示剂区域以包含抗体或抗体混合物为佳。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，进一步包括，在步骤a)之前，通过离心血液样品制备红细胞沉淀物；用菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶或无花果蛋白酶孵育沉淀物和重悬经酶处理的沉淀物。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，在步骤a)中加大约100μl至500μl的血液样品或重悬的红细胞沉淀物。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其中，步骤b)中加大约100μl至200μl的稀释剂。
8.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其中，抗-D抗体选自RUM-1，LDM-3，ESD1M，TH-28，MS-201，MS-26和LDM-1。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述装置包括至少两个在流动方向上依次前后设置的指示剂区域，设置的方式使得样品液体在每一条流动路径上通过超过一个指示剂区域，其中，指示剂区域包含针对细胞结合分析物的结合元素，并且所述方法包括：
a)将包含红细胞的血液样品加至进样区域；
b)将稀释剂加至进样区域；
c)进行测试；
d)通过测定红细胞是否结合于指示剂区域来评定测试；
其中，所述方法用于在胎母输血(FMH)情形中平行测定多种细胞结合分析物，用于混合场反应中的测定，用于检测异体输血或者用于测定血细胞比容值。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法用于测定血细胞比容值，其中，所述指示剂区域以包括抗体或抗体混合物为佳，在步骤d)中测定红细胞与指示剂区域的整体结合模式。
11.根据权利要求10所述的方法，所述装置包括至少两个设置在单条流动路径中的指示剂区域，所述指示剂区域包含针对相同细胞结合分析物的相同结合元素。
12.根据权利要求10或11所述的方法，所述装置具有至少两条流动路径，所述流动路径包含至少两个指示剂区域，并且结合元素的浓度从相对于进样区域的近端至远端递增或递减。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，所述装置具有至少两条流动路径，所述流动路径包含至少两个指示剂区域，并且，一条流动路径中抗体的浓度不同于另一条流动路径中抗体的浓度。
14.根据权利要求9所述的方法，所述方法用于在混合-场反应中平行测定多种细胞结合分析物，或者用于检测异体输血，所述装置包括至少两个在流动方向上依次前后设置的指示剂区域，设置的方式使得样品液体在每一条流动路径中通过超过一个指示剂区域，所述指示剂区域包含针对细胞结合分析物的结合元素。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，所述细胞结合分析物选自血型抗原，所述血型抗原例如A，B，AB，D，C，c，E，e，Cw，K，k，Jka和/或Jkb。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，用反应对A，B；D+，D-；K，k；C，c和/或E，e来测定血型抗原。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，针对分析物的结合元素选自抗体，抗体片段，[外源]凝集素，[外源]凝集素片段，或它们的混合物。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，一张或多张膜(2)以聚乙烯，硝化纤维或尼龙构成的为佳。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，膜(2)上设置至少一个位于进样区域(5)下游和指示剂区域上游的密封部件(4)。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，所述装置的部件安装于支持层(1)上以进行机械加固。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，所述装置的部件整合在一个罩壳内。
22.以下定义的装置用于测定胎母输血或嵌合体，用于测定以低浓度存在于细胞上的分析物，用于测定血细胞比容值和/或用于在液体样品中在混合-场反应中平行测定多种细胞结合分析物的用途，所述装置包括：
-至少一个用于施加液体样品的进样区域(5)，
-适于细胞成分透过的多孔膜(2)，所述膜上具有至少一个指示剂区域，所述指示剂区域能够与细胞结合分析物相互作用并且包含至少一个针对细胞结合分析物的结合元素，以及
-至少一个位于膜上的吸收区域(3)，在液体通过指示剂区域后吸收液体，
其中，所述指示剂区域位于进样区域(5)和吸收区域(3)之间。
23.根据权利要求22所述的用途，所述装置被用于测定FMH。
24.根据权利要求22所述的用途，所述装置被用于测定以低浓度存在于细胞上的分析物。
25.根据权利要求24所述的用途，所述分析物是弱D血型，特别是DEL。
26.根据权利要求22所述的用途，所述装置被用于测定血细胞比容值。
27.用于直接测定液体样品中的细胞结合分析物的装置，包括
-用于施加液体样品的进样区域(5)，
-适于细胞成分透过的多孔膜，所述膜上具有至少两个指示剂区域，所述指示剂区域能够与细胞结合分析物相互作用并且包含针对细胞结合分析物的结合元素，以及
-至少一个吸收区域(3)，在液体通过指示剂区域后吸收液体，
所述指示剂区域位于进样区域(5)和吸收区域(3)之间。
其中，所述至少两个指示剂区域前后依次设置在流动方向上，设置的方式使得样品液体在每一条流动路径中通过超过一个指示剂区域。
28.根据权利要求27所述的装置，所述细胞结合分析物选自血型抗原，所述血型抗原例如A，B，AB，C，c，E，e，Cw，K，k，Jka和/或Jkb。
29.根据权利要求28所述的装置，其中，用反应对A，B；D+，D-；K，k；C，c和/或E，e来测定血型抗原。
30.根据权利要求29所述的装置，所述膜包括至少两条流动路径，所述流动路径在每种情形下有至少两个含不同结合元素的指示剂区域。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的装置，其中指示剂区域是点状，线状和/或楔状的。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102006062619A DE102006062619B4 (de) | 2006-12-29 | 2006-12-29 | Verfahren zur Bestimmung von minoren Zellpopulationen in heterogenen Zellpopulationen |
| DE102006062619.2 | 2006-12-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101606065A true CN101606065A (zh) | 2009-12-16 |
Family
ID=39323825
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA200780048573XA Pending CN101606065A (zh) | 2006-12-29 | 2007-12-14 | 测定异质性细胞群中的小细胞群的方法和装置 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8841082B2 (zh) |
| EP (1) | EP2118661A1 (zh) |
| JP (1) | JP5484068B2 (zh) |
| CN (1) | CN101606065A (zh) |
| AU (1) | AU2007341650B2 (zh) |
| BR (1) | BRPI0722063A2 (zh) |
| CA (1) | CA2674117C (zh) |
| DE (1) | DE102006062619B4 (zh) |
| MX (1) | MX2009006902A (zh) |
| NZ (1) | NZ578670A (zh) |
| RU (1) | RU2456619C2 (zh) |
| WO (1) | WO2008080544A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105319358A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-02-10 | 中华人民共和国陕西出入境检验检疫局 | 多种蚊媒传染病胶体金全血红细胞分离联检装置及方法 |
| CN106415273A (zh) * | 2014-05-26 | 2017-02-15 | 盖立复诊断解决方案公司 | 用于通过不完全抗体检测血型抗原的装置及方法 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103096894A (zh) | 2010-03-26 | 2013-05-08 | 盖尔德马研究及发展公司 | 用于治疗红斑的包含溴莫尼定的组合物 |
| KR20170018974A (ko) | 2010-03-26 | 2017-02-20 | 갈데르마 리써어치 앤드 디벨로프먼트 | 홍반의 유효하고 안전한 치료를 위한 개선된 방법 및 조성물 |
| CA2819260A1 (en) | 2010-12-15 | 2012-06-21 | Cytosed, Inc. | Antibody-linked immuno-sedimentation agent and method of isolating a target from a sample using same |
| US8486717B2 (en) * | 2011-01-18 | 2013-07-16 | Symbolics, Llc | Lateral flow assays using two dimensional features |
| RU2470304C2 (ru) * | 2011-02-14 | 2012-12-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Антидопинговый центр" | Способ определения трансфузии гомологичной крови при допинговом контроле спортсменов |
| US9874556B2 (en) | 2012-07-18 | 2018-01-23 | Symbolics, Llc | Lateral flow assays using two dimensional features |
| US20140295490A1 (en) * | 2013-01-30 | 2014-10-02 | Asta Fluidic Technologies, Inc. | Fetal red blood cell detection |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3975156A (en) * | 1975-11-10 | 1976-08-17 | Ortho Diagnostics, Inc. | Method and material for detecting and quantitating fetal erythrocytes in adults |
| JPS5696245A (en) * | 1979-12-28 | 1981-08-04 | Fuji Photo Film Co Ltd | Material for measuring hematocrit value |
| US4943522A (en) * | 1987-06-01 | 1990-07-24 | Quidel | Lateral flow, non-bibulous membrane assay protocols |
| US5153117A (en) * | 1990-03-27 | 1992-10-06 | Genetype A.G. | Fetal cell recovery method |
| JP3005303B2 (ja) * | 1991-01-31 | 2000-01-31 | 湧永製薬株式会社 | 測定装置 |
| US5432054A (en) * | 1994-01-31 | 1995-07-11 | Applied Imaging | Method for separating rare cells from a population of cells |
| NL1003570C2 (nl) * | 1996-07-11 | 1998-01-15 | Stichting Centraal Lab | Methode voor antigeen- en antistofbepaling in de bloedgroepserologie. |
| US6924153B1 (en) * | 1997-03-06 | 2005-08-02 | Quidel Corporation | Quantitative lateral flow assays and devices |
| JP2000111555A (ja) * | 1998-10-02 | 2000-04-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 血液型判定法 |
| US6203757B1 (en) * | 1998-12-02 | 2001-03-20 | Bionike, Inc. | Fluid sample distriution system for test device |
| MXPA03006284A (es) * | 2001-01-15 | 2003-09-16 | Dsm Ip Assets Bv | Dispositivo de ensayo. |
| US6565808B2 (en) * | 2001-05-18 | 2003-05-20 | Acon Laboratories | Line test device and methods of use |
| DE60219642T2 (de) * | 2001-09-04 | 2008-01-17 | Iq Corp. B.V. | Bestimung und quantifizierung von erythrocytenpopulation in proben |
| US6927068B2 (en) * | 2002-01-30 | 2005-08-09 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Rapid and non-invasive method to evaluate immunization status of a patient |
| DE10330981B4 (de) * | 2003-07-09 | 2010-04-01 | Medion Diagnostics Ag | Vorrichtung und Verfahren zur simultanen Durchführung von Blutgruppenbestimmung, Serumgegenprobe und Antikörpersuch-Test |
| DE10330983A1 (de) * | 2003-07-09 | 2005-01-27 | Prisma Diagnostika Gmbh | Vorrichtung für Lateral-Fluss-Tests |
| DE10330982A1 (de) * | 2003-07-09 | 2005-02-17 | Prisma Diagnostika Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur simultanen Bestimmung von Blutgruppenantigenen |
| ES2337702T3 (es) * | 2004-03-31 | 2010-04-28 | Adnagen Ag | Anticuerpos monoclonales con especificidad por eritrocitos fetales. |
| US20070059782A1 (en) * | 2005-09-13 | 2007-03-15 | Graham Henry A | Magnetic particle tagged blood bank reagents and techniques |
-
2006
- 2006-12-29 DE DE102006062619A patent/DE102006062619B4/de active Active
-
2007
- 2007-12-14 AU AU2007341650A patent/AU2007341650B2/en active Active
- 2007-12-14 JP JP2009543363A patent/JP5484068B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-12-14 NZ NZ578670A patent/NZ578670A/en unknown
- 2007-12-14 EP EP07856754A patent/EP2118661A1/de not_active Withdrawn
- 2007-12-14 RU RU2009128620/15A patent/RU2456619C2/ru active
- 2007-12-14 BR BRPI0722063-4A2A patent/BRPI0722063A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2007-12-14 CA CA2674117A patent/CA2674117C/en active Active
- 2007-12-14 US US12/448,574 patent/US8841082B2/en active Active
- 2007-12-14 CN CNA200780048573XA patent/CN101606065A/zh active Pending
- 2007-12-14 WO PCT/EP2007/011016 patent/WO2008080544A1/de active Application Filing
- 2007-12-14 MX MX2009006902A patent/MX2009006902A/es active IP Right Grant
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106415273A (zh) * | 2014-05-26 | 2017-02-15 | 盖立复诊断解决方案公司 | 用于通过不完全抗体检测血型抗原的装置及方法 |
| CN106415273B (zh) * | 2014-05-26 | 2019-04-19 | 盖立复诊断解决方案公司 | 用于通过不完全抗体检测血型抗原的装置及方法 |
| US11169160B2 (en) | 2014-05-26 | 2021-11-09 | Grifols Diagnostic Solutions Inc. | Device and method for detecting blood group antigens by means of an incomplete antibody |
| CN105319358A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-02-10 | 中华人民共和国陕西出入境检验检疫局 | 多种蚊媒传染病胶体金全血红细胞分离联检装置及方法 |
| CN105319358B (zh) * | 2015-11-27 | 2017-01-18 | 中华人民共和国陕西出入境检验检疫局 | 多种蚊媒传染病胶体金全血红细胞分离联检装置及方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2674117A1 (en) | 2008-07-10 |
| DE102006062619B4 (de) | 2012-04-26 |
| WO2008080544A1 (de) | 2008-07-10 |
| DE102006062619A1 (de) | 2008-07-03 |
| US20100136585A1 (en) | 2010-06-03 |
| JP2010515030A (ja) | 2010-05-06 |
| AU2007341650B2 (en) | 2013-08-22 |
| NZ578670A (en) | 2012-05-25 |
| BRPI0722063A2 (pt) | 2014-04-01 |
| MX2009006902A (es) | 2009-07-07 |
| RU2009128620A (ru) | 2011-02-10 |
| EP2118661A1 (de) | 2009-11-18 |
| CA2674117C (en) | 2017-10-10 |
| AU2007341650A1 (en) | 2008-07-10 |
| US8841082B2 (en) | 2014-09-23 |
| RU2456619C2 (ru) | 2012-07-20 |
| JP5484068B2 (ja) | 2014-05-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5090733B2 (ja) | 血液型決定、血清クロスチェック及び抗体検索試験を同時に行うための装置及び方法 | |
| CN101606065A (zh) | 测定异质性细胞群中的小细胞群的方法和装置 | |
| KR101214620B1 (ko) | 혈액형 항원을 동시에 결정하는 장치 및 방법 | |
| Jarujamrus et al. | Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper | |
| CN103926400A (zh) | 特异性测定IgM和IgG和IgA血型抗体的试纸条 | |
| US20220003789A1 (en) | Device and method for detecting blood group antigens by means of an incomplete antibody | |
| US20080227208A1 (en) | Devices and Methods for Detection of Occult Blood | |
| CN215415461U (zh) | 一种新型侧向层析检测装置 | |
| CN211905398U (zh) | 一种IgG血型抗体效价快速检测试条 | |
| BR112016026095B1 (pt) | Dispositivos e processo para a determinação de analitos ligados à célula em uma amostra líquida, processo para produzir os dispositivos e usos dos mesmos para análises de sangue | |
| MXPA06000346A (en) | Device and method for simultaneously identifying blood group antigens | |
| NZ725664B2 (en) | Device and method for detecting blood group antigens by means of an incomplete antibody |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20091216 |