ES2337702T3 - Anticuerpos monoclonales con especificidad por eritrocitos fetales. - Google Patents

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Abstract

Célula de hibridoma depositada con el número de acceso DSM ACC 2666 el 13 de julio de 2004 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH en Braunschweig, Alemania.

Description

Anticuerpos monoclonales con especificidad por eritrocitos fetales.
Introducción
Los desarrollos sociales han supuesto un aumento en las investigaciones prenatales. La amniocentesis o con menor frecuencia el muestreo de las vellosidades corónicas se realiza en uno de cada diez embarazos para el análisis prenatal por ejemplo de la trisomía 21. El riesgo de defectos cromosómicos aumenta con la edad de la madre. Esta es la causa por la que la amniocentesis se realiza en más del 50% de las mujeres embarazadas de 35 o más años. Sin embargo, la mayoría de los niños con defectos cromosómicos o genéticos nacen de mujeres con una edad inferior a 35, si se considera la cifra total. La probabilidad de una trisomía 21 es del 0,3% en los fetos de mujeres con una edad de 35 años o superior. Esto debe considerarse en el contexto de que el procedimiento de la amniocentesis comporta un riesgo del 0,5% de inducción de abortos. A partir de estas cifras es obvio que existe una gran necesidad de un procedimiento de diagnóstico alternativo que de los mismos resultados sin suponer riesgos para el nonato. Una estrategia podría ser aislar las células fetales de la sangre materna. Esto eliminaría riesgos para el feto.
Se ha estimado que puede encontrarse una célula fetal en de 10^{5} a 10^{7} de las células hemáticas nucleadas maternas. Otras investigaciones han demostrado que, en presencia de aberraciones cromosómicas pueden detectarse más células fetales en la circulación materna. Esto suscita la posibilidad de detectar un feto aneuploide mediante procedimientos no invasivos.
Se han identificado tres tipos de células fetales en la sangre materna: linfocitos, trofoblastos y glóbulos rojos nucleados (NRBC). Los linfocitos fetales se han detectado todavía de 1a 5 años después del nacimiento. Esta longevidad puede interferir con el diagnóstico adecuado en los siguientes embarazos.
Los trofoblastos son dianas atractivas porque pueden identificarse fácilmente por su morfología. Sin embargo, no pueden usarse fácilmente con fines diagnósticos porque, como son células de la placenta, pueden diferir de las células del feto: en aproximadamente 1% de las aberraciones cromosómicas diagnosticadas en los trofoblastos, el feto resultó estar sano.
Los glóbulos rojos nucleados (NRBC) fetales aparecen temprano en la circulación materna, sin embargo no persisten tras el nacimiento. Como tienen núcleo, son los candidatos preferidos para el análisis cromosómico. Sin embargo, hasta la fecha no pueden diferenciarse de forma fácil e inequívoca de las otras células hemáticas.
Se identifican a través de un perfil de marcadores que es característico de las células precursoras eritroides y que es diferente de otras subpoblaciones de células hemáticas. Las células hemáticas se han caracterizado extensamente mediante los denominados marcadores de clústeres de diferenciación (CD) como se ha definido en el 7º Taller de trabajo y conferencia sobre antígenos para la diferenciación de leucocitos humanos (Harrogate 2000). Las células eritroides inmaduras expresan CD71 y carecen de CD45 que se expresa en los leucocitos. Este conocimiento puede usarse para distinguir las células precursoras eritroides de otras células mononucleadas.
Para aislar e identificar las células fetales (1 entre de 10^{5} a 10^{7} células nucleadas maternas) deben cumplirse los criterios más rigurosos. No existe ningún marcador de la superficie celular disponible todavía que se exprese exclusivamente en los NRBC fetales. Para enriquecer en células fetales habitualmente se usan técnicas de separación de células inmunomagnéticas o por citometría de flujo o solas o combinadas. Los resultados del análisis cromosómico o genético de las células aisladas se han comparado con los resultados obtenidos con células amnióticas. Muchas investigaciones han demostrado la viabilidad técnica de la estrategia no invasiva con cohortes grandes.
Sin embargo, los procedimientos existentes todavía no son adecuados para el diagnóstico rutinario. Debe asegurarse que las células en investigación son inequívocamente células fetales. La identificación de los NRBC fetales solo puede lograrse mediante el reconocimiento de un marcador, que preferentemente se exprese en las células eritroides fetales o que se exprese o esté localizada de una forma que sea específica para las células fetales del torrente
sanguíneo.
La falta de marcadores, que identifiquen especialmente a las células fetales es el principal obstáculo para desarrollar un diagnóstico prenatal no invasivo fiable.
Huie et al. "Antibodies to human fetal erythroid cells from a nonimmune phage antibody library", Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 98 (5), 2001-02-27, páginas 2682-2687, XP002974719 describe anticuerpos contra células eritroides fetales humanas. Se generaron usando un nuevo tipo de colección de anticuerpos en fagos no inmunitarios en la que se presentan múltiples copias de fragmentos de anticuerpos en cada fago.
El objetivo de esta invención es la generación de anticuerpos, que permitan discriminar entre las células eritroides fetales y adultas y la identificación inequívoca de células fetales. Las células fetales reconocidas por estos anticuerpos preferentemente deberían poseer al menos en parte un núcleo celular intacto, expresar el antígeno CD71 y deberían carecer del antígeno CD45 conforme a los resultados publicados anteriormente.
Un objetivo adicional es proporcionar un procedimiento para la detección o identificación de células fetales y un procedimiento para la detección de aberraciones, defectos y/o variantes cromosómicos y/o genéticos en células
fetales.
Además, el objetivo de la invención es generar anticuerpos monoclonales, que reaccionen específicamente con células fetales así como una línea celular de hibridoma, que produzca esos anticuerpos, así como sus usos. Este objetivo se resuelve mediante la célula de hibridoma de acuerdo con la reivindicación 1, el anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 4, el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 y el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9. En las reivindicaciones dependientes respectivas se proporcionan mejoras adicionales de los anticuerpos, la célula de hibridoma y los procedimientos.
Para los fines de la presente invención, se han inmunizado a 5 ratones con células eritroides aisladas de sangre umbilical (CD71+, CD45-), que portaba el antígeno "i" tal como se define en el autoanticuerpo que se describe en el documento DE 100 35 433 A1. La inmunización con estas células abre la posibilidad de que, además de los anticuerpos contra antígeno "i", se generen también anticuerpos con especificidades contra marcadores nuevos, que podrían usarse para identificar células precursoras eritroides. Las células de bazo de los ratones inmunizados se fusionaron con una línea celular de mieloma para producir hibridomas de acuerdo con procedimientos estándar (Schetters H, Production of Monoclonal Antibodies, en: Methods of Immunological Analysis, Masseyeff RF, Albert WH y Staines NA (Ed.) Vol. 2, Capítulo 4.3, 230-245, VCH Weinheim, 1993).
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Diseño y procedimientos en detalle
En detalle, se inmunizó a los ratones con células hemáticas de cordón umbilical humano separadas por citometría de flujo (CD71+, antígeno-i+, CD19- y CD45-). Los sobrenadantes de los hibridoma se cribaron sobre células hemáticas de cordón umbilical mononucleares, mientras que la cantidad correspondiente de precursores eritroides se determinó mediante tinción citoquímica de frotis de sangre. Para el cribado de los hibridomas, se formuló un análisis por citometría de flujo de seis parámetros (cuatro colores, dispersión frontal y lateral) para la identificación simultánea de células precursoras eritroides, leucocitos, eritrocitos enucleados y para anticuerpos que reaccionan específicamente con células fetales. Además, se han realizado análisis inmunohistioquímicos con frotis de sangre fetal y cortes de hígado fetal de la 6ª a la 38ª semana de gestación así como con sangre de adulto, médula ósea normal de adulto y eritrocitos de adulto como controles.
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Resultados
Se ha identificado un clon (número de acceso DSM ACC 2666 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)) con especificidad por un antígeno superficial que exclusivamente expresan las células eritroides fetales. El nuevo anticuerpo mostró unión inalterada a células eritroides de sangre fetal desde los primeros momentos de la gestación (6ª semana) hasta el nacimiento. Además, los exámenes detallados no mostraron reactividad con la superficie de los eritrocitos, eritroblastos o células linfáticas y mieloides de adulto. Este anticuerpo no reaccionó con células de órganos hemolíticos fetales.
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Conclusiones
La investigación demostró que el nuevo anticuerpo monoclonal se une específicamente a células eritroides fetales y así puede diferenciar entre los glóbulos rojos fetales y de adulto. Debido a que la expresión de este antígeno fetal en las etapas tempranas de la gestación puede hacer factible un diagnóstico prenatal no invasivo. Este anticuerpo puede aplicarse para diferentes técnicas de enriquecimiento y/o para la identificación de células eritroides fetales. Análisis detallado de las células de hibridomas
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Cribado de hibridomas que producen anticuerpos que reaccionan específicamente con los NRBC fetales
Dado que deben cribarse varios miles de hibridomas que producen anticuerpos para encontrar un clon adecuado, se ha planteado un procedimiento de alto rendimiento que a la vez mantiene la especificidad requerida. Se ha establecido un análisis de seis parámetros (4 canales de fluorescencia, dispersión frontal y lateral), que permitió la identificación simultánea de células precursoras eritroides, la diferenciación de los leucocitos de los eritrocitos enucleados y la identificación de nuevos anticuerpos en una única etapa. Las células analizadas se han teñido con un tinte de ácido nucleico (LDS751, Molecular Probes, N.º de catálogo 7595) y se han incubado con anticuerpos de los hibridomas clonados. Estos anticuerpos se sometieron a una reacción con un anticuerpo dirigido contra ellos, que se marcó con un tinte fluorescente (FITC) (de cabra contra IgG de ratón (H+L)-FITC, Caltag Laboratories, N.º de catálogo M35001). En posteriores experimentos para la caracterización de los anticuerpos, los anticuerpos se han marcado directamente con FITC.
La identificación de las células precursoras eritroides es posible debido a sus características de dispersión de luz y por su unión a anticuerpos específicos contra CD71 marcados con ficoeritrina (CD71 PE, Diatec, N.º de catálogo 3212). Los leucocitos podrían diferenciarse por su unión a anticuerpos específicos contra CD45 marcados con alloficocianina (CD45 APC, BD Pharmingen, N.º de catálogo 555485). Las células eritroides nucleadas y enucleadas pueden distinguirse por su unión o falta de unión del tinte de ácido nucleico. Con este procedimiento es posible identificar anticuerpos que se unen a las células diana que se desee, es decir los NRBC fetales, sin reacción cruzada con los eritrocitos o leucocitos adultos (Fig. 1).
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Exclusión de anticuerpos que reaccionan con antígenos de los eritrocitos adultos que incluyen los antígenos de los grupos sanguíneos habituales
Los antígenos de los grupos sanguíneos pueden encontrarse en los eritrocitos adultos y sus precursores en grandes cantidades. Por lo tanto, pueden inducir una respuesta inmunitaria mayor cuando se usan como antígenos. Los anticuerpos contra estos antígenos de grupos sanguíneos no son adecuados para la identificación de las células fetales. Para excluir los anticuerpos que se unen a los antígenos de los eritrocitos adultos que incluyen los antígenos de los grupos sanguíneos, se investiga su especificidad de unión hacia células fetales tras la absorción sobre los eritrocitos. Se han obtenido eritrocitos con los grupos sanguíneos AB Rh+ y se han estabilizado con un reactivo que suministra Meridian Diagnostics Europe, Bad Homburg. Los anticuerpos investigados se han incubado con números crecientes de eritrocitos y se han analizado antes y después para determinar su actividad de unión para las células diana. Se pensó que no existía reactividad de los anticuerpos hacia los antígenos de los grupos sanguíneos cuando la intensidad de la unión células precursoras eritroides nucleadas CD71+, CD45- no cambiaba tras la incubación con los eritrocitos (Fig. 2). Los anticuerpos seleccionados de ese modo no deben reaccionar con células hemáticas adultas para permitir la correcta identificación de las células precursoras eritroides fetales (Fig. 3).
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Pruebas de especificidad de un anticuerpo monoclonal seleccionado
Podría identificarse un clon de hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal del isotipo IgM que mostrara las características de unión necesarias en el procedimiento de cribado. Se denomina 4B9 y fue depositada por el solicitante de la presente patente o solicitud de patente el 13 de julio de 2004 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig) con el número de acceso DSM ACC 2666. Un segundo anticuerpo 4B8 que reconoce el mismo epítopo se menciona en las figuras 2 y 3.
Los eritroblastos fetales y adultos de forma potente y específica expresan glucoforina-A y, por lo tanto, pueden identificarse a través de esta proteína marcadora. La unión del anticuerpo monoclonal a estas células se visualizó mediante una tinción doble con inmunofluorescencia.
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Protocolo para la tinción inmunofluorescente
1
Fijar citocentrifugados o secciones de tejido congelado en acetona durante 10 min.
2
Secar durante 5 min.
3
Aplicar anticuerpo monoclonal contra glicoforina-A, DAKO M0819 diluido 1:100 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 1% albúmina sérica bovina (BSA) durante 60 min.
4
Enjuagar con PBS
5
Aplicar el fragmento F(ab) de cabra contra anticuerpo de ratón, Alexa Fluor 488 (Molecular Probes A-21044), verde, diluido 1:100 en PBS durante 60 min.
6
Enjuagar con PBS
7
Aplicar el anticuerpo monoclonal 4B9 (sobrenadante de hibridoma) durante 60 min.
8
Enjuagar con PBS
9
Aplicar anticuerpo de cabra contra IgM de ratón, Alexa Fluor 594 (Molecular Probes A-21044), rojo, durante 60 min.
10
Enjuagar con PBS
11
Teñir los núcleos celulares con DAPI (Molecular Probes), azul, diluido 1:300 en PBS durante 3 min.
12
Enjuagar con PBS
\newpage
13
Cubrir con medio de fluorescencia (S3023, DA-KO)
14
Visualizar con "Universalmikroskop Axioplan", Carl Zeiss, usando los conjuntos de filtros 02, 10 y 15 y fotografiar con un sistema de cámara digital, por ejemplo Visitron Systems GmbH
\quad
PBS: 8 g de NaCl, -1,3 g de Na_{2}HPO_{4}, 4 g NaH_{2}PO_{4} en 1 l de H_{2}O, pH 7,4.
\vskip1.000000\baselineskip
También se usó un procedimiento inmunoenzimático:
Protocolo para la tinción con fosfatasa alcalina contra fosfatasa alcalina (APAAP)
1
Fijar citocentrifugados o portas con tejido congelado en acetona durante 10 min.
2
Secar durante 5 min.
3
Incubar con anticuerpo monoclonal 4B9 (sobrenadante de hibridoma) durante 30 min.
4
Enjuagar con solución salina tamponada con Tris (TBS)
5
Incubar con complejo APAAP (D0651, DAKO), diluido 1:25 en TBS/HS (suero humano inactivado) durante 30 min.
6
Enjuagar con TBS
7
Repetir las etapas 5-7 dos veces durante 10 min. cada una
8
Enjuagar con TBS
9
Revelar los portas con sustrato
i.
Preparar la solución A: Mezclar 18 ml 0,2 mol/l de 2-amino-2metil-1,3-propandiol con 50 ml 0,05 mol/l de tampón Tris, a pH 9,7 y 600 mg de NaCl. Añadir 28 mg de levamisol.
ii.
Preparar la solución B: Disolver 35 mg de naftol AS-bifosfato en 0,42 ml de N,N-dimetilformami- da.
iii.
Preparar la solución C: Mezclar 0,14 ml de New Fuchsin al 5% con 0,35 de nitrito sódico al 4% de preparación reciente. Agitar durante 60 s.
iv.
Mezclar la solución A con la solución B, después añadir la solución C. Ajustar el pH a 8,7. Mezclar, filtrar y aplicar a los portas.
v.
Incubar durante 10-20 min. a temperatura ambiente.
vi.
Enjuagar con agua del grifo.
vii.
Aplicar tinción de contraste con ácido de Meyer Haemalaun durante 5 min..
viii
Dejar aparecer el "azul" en agua del grifo durante 10 min. y cubrir con gelatina de glicerol de Kaiser.
\quad
TBS (solución salina tamponada con Tris): Disolver 43,33 g de NaCl y 39,40 g de Tris- HCl en 5 l de H_{2}O dest. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH.
\quad
TBS/HS: 9 partes de TBS + 1 parte de suero humano inactivado
\quad
Controles negativos: anticuerpo monoclonal de isotipo idéntico o suero hiperinmunitario murino.
\vskip1.000000\baselineskip
Exclusión de anticuerpos que reaccionan con CD71
Los anticuerpos generados con la estrategia de inmunización empleada pueden estar dirigidos contra CD71. Para excluir estos anticuerpos, se realizaron análisis que muestran si los anticuerpos contra CD71 compiten por el mismo sitio de unión. Se preincubó anticuerpo 4B8 biotinilado con células mononucleares de sangre de cordón umbilical. Después se añadió anticuerpo específico contra CD71 no marcado (Anti-CD71, Clon DF1513, DPC Biermann, Bad Nauheim, Germany). Después del marcado con estreptavidina-DTAF, se analizó mediante citometría de flujo si los anticuerpos contra CD71 habían sustituido al anticuerpo 4B8. Como muestra de control positivo para este experimento competitivo, se añadió anticuerpo 4B8 no marcado en lugar de CD71. Estos análisis demostraron que los anticuerpos 4B8 y CD71 no compiten por el mismo epítopo no compiten por el mismo epítopo, mientras que la adición de anticuerpo 4B8 no marcado disminuyó la señal.
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Resultados
\bullet El antígeno que reacciona con 4B9 se expresaba sobre la superficie de los eritroblastos fetales. Esto pudo demostrarse con células fetales desde la semana 6 hasta la semana 38 de gestación. En la Fig. 4 el anticuerpo 4B9 reconoció todos los eritroblastos fetales positivos para glicoforina-A.
\bullet Los eritroblastos de la médula ósea adulta normal eran negativos para 4B9. Por el contrario, todas las células eritropoyéticas eran positivas para glicoforina-A. Sólo en 1 de 32 casos se observó una expresión granular intracelular en el citoplasma de eritroblastos basófilos tempranos.
\bullet El antígeno que reaccionaba con 4B9 no se encontró en los hepatocitos de adulto ni fetales. También dieron negativo las células Kupffer, los macrofagos, las células endoteliales y sinosoides.
\bullet Un análisis detallado de las células hemolinfáticas en los adultos demostró la ausencia de reactividad en las células linfáticas y mieloides.
\bullet Todos los órganos hemolíticos fetales dieron negativo. Esto es aplicable tanto a las células linfáticas como mieloides.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Resultados detallados de la reactividad del anticuerpo monoclonal 4B9
1
2
A continuación, se describen las figuras 1 a 4 en detalle
Figuras
Figura 1
Se tiñen células hemáticas mononucleares de cordón umbilical con anticuerpos marcados (contra CD45, contra CD71 y el anticuerpo en investigación, 4B9) y un tinte de ADN. La unión de los anticuerpos se cuantificó con un citómetro de flujo.
a) Esta figura 1a muestra un diagrama con las propiedades de dispersión de las células precursoras eritroides. Para la posterior caracterización, se usaron las células caracterizadas mediante sus propiedades de dispersión de luz de la región R1.
b) La Fig. 1b muestra un diagrama de las propiedades de fluorescencia de las células de la región R1 y marcadas con anticuerpo contra CD71 y tinte LDS751 que marca todos los núcleos. La región R2 incluye células nucleadas que expresan o no expresan el antígeno CD71.
c) La Fig. 1c muestra un diagrama de las propiedades de fluorescencia de las células de la región R2 incubadas con anticuerpos contra CD71 y anticuerpos contra CD45. Las células de la región R3 expresan el antígeno CD71 pero no el antígeno CD45. Este diagrama demuestra la diferenciación entre las células eritroides nucleadas positivas para CD71 (Región R3) y los leucocitos positivos para CD45.
d) La Fig. 1d muestra un diagrama de las propiedades de fluorescencia de las células de la región R2. La células de la región R4 expresan el antígeno CD71 y se unen al anticuerpo 4B9. Así, el anticuerpo 4B9 se une preferentemente a células positivas para CD71, que son negativas para CD45.
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Figura 2
La Fig. 2 describe la absorción de los anticuerpos monoclonales 4B8 y 4B9 con eritrocitos adultos, y después la determinación de su capacidad de unión a células hemáticas del cordón umbilical. Se demuestra que ni el anticuerpo 4B8 ni el anticuerpo 4B9 son absorbidos por los glóbulos rojos adultos. Para los controles positivos y negativos, se usaron anticuerpos contra CD71 y glicoforina A.
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Figura 3
Investigación por citometría de flujo de la unión de los anticuerpos monoclonales 4B8 y 4B9 a células hemáticas de cordón umbilical y a células hemáticas adultas (eje x: intensidad de la fluorescencia).
a) Este histograma muestra células hemáticas de cordón umbilical negativas sin tinción, con el rótulo "sin marcar" y células hemáticas de cordón umbilical incubadas con anticuerpos 4B8 marcados (con el rótulo 4B8) y 4B9 (con el rótulo 4B9). Esto demuestra que las células hemáticas de cordón umbilical son teñidas por los anticuerpos 4B8 y 4B9.
b) En esta figura, las células hemáticas adultas muestran la misma intensidad de fluorescencia (ejes x), independientemente de si se incuban con los anticuerpos 4B8 ("4B8") o 4B9 ("4B9") o sin anticuerpo ("sin marcar"). Por lo tanto, los anticuerpos 4B8 y 4B9 no se unen a las células hemáticas adultas.
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Figura 4
Análisis inmunofluorescentes e inmunoenzimáticos de las células hemáticas fetales.
A) y B) Las células eritropoyéticas fetales positivas para glicoforina A (rotuladas con "G") expresan el antígeno 4B9 (fluorescentes, regiones negras de las células dibujadas esquemáticamente en la Fig. 4B). Los núcleos de las células se tiñen con DAPI y se marcan con "B". Obviamente, los glóbulos rojos nucleados y enucleados son positivos para el antígeno 4B9. A1 y B1 muestran la fotografía de la fluorescencia original y A2, B2 dibujos esquemáticos de A1 y B1 respectivamente.

Claims (10)

1. Célula de hibridoma depositada con el número de acceso DSM ACC 2666 el 13 de julio de 2004 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH en Braunschweig, Alemania.
2. Anticuerpo monoclonal expresado por la célula de hibridoma de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 2 que reacciona con un antígeno superficial presente en los glóbulos rojos fetales y su células precursoras nucleadas, y que no reacciona con los antígenos superficiales de las células eritroides adultas.
4. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque reacciona con células eritroides fetales pero no con el antígeno CD71.
5. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 4 para la detección e identificación de células fetales en una muestra.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación precedente para la detección e identificación de células fetales en una muestra de sangre materna.
7. Procedimiento para la detección o identificación de células fetales en una muestra, caracterizado por el marcado de dichas células fetales mediante un anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 4.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación precedente, caracterizado porque la muestra es de sangre materna.
9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque las células que se unen al anticuerpo monoclonal se separan mediante una de citometría de flujo, separación en fase sólida, separación con perlas inmunomagnéticas y cribado sobre superficies plásticas.
10. Procedimiento para la detección de aberraciones, defectos y/o variantes cromosómicos y/o genéticos en las células fetales que comprende las etapas de detectar o identificar las células fetales mediante un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 9, y posterior a dicha detección o identificación de células fetales, analizar dichas células fetales marcadas para determinar las aberraciones, defectos y/o variantes cromosómicos y/o genéticos.
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