JPS63177798A - 抗ひと子宮頚がん抗体、その製法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 この発明は、抗ひと子宮頚がん抗体、上記抗体の製法、
上記抗体を用いるがん細胞の検出方法、」−記抗体を産
生ずるハイブリドーマ、および」−記ハイブリドーマの
取得法に関ずろものである。

〔発明の背景〕

子宮がんは女性のがんの中では高い罹患率を示している
。その中でも、子宮頚がんは最も死亡数の多いがんであ
り、死亡例が減少する傾向にありながらも依然重要なが
んであるといえる。

子宮頚がんは、第１期に発見され手術等の治療を受ける
と５年生存率が８７０％と高いが、第２期では７１．４
％、第３期で５０，１％、第４期では１８２％と低下す
る。したがって、子宮頚がんにおいても他のがんと同様
に早期発見が重要である。

現在行われている子宮頚がんの診断法は、子宮頚部から
細胞を採取し、その細胞をスライドガラスに塗抹・固定
し、染色後顕微鏡によりがん細胞が存在ずろかどうかを
調べる、細胞診と呼ばれる方法である。この方法では、
細胞をパパニコラウ染色法またはキームザ染色法で染色
し、核縁の不整、核小体の肥大と増加、核と細胞質の不
同性、異常分裂像、多核細胞の有無等に基づいて、クラ
ス■（正常）、■（異常あるが悪性の疑なし）、■（悪
性の疑あり）、■（悪性の疑濃厚）、■（悪性と断定）
に分類する。しかし、この方法はがん細胞だけを特異的
に染色するものではないため、初期がんの細胞診による
診断は進行がんの診断に比較して難しく、相当の知識と
修練を要するといわれている。

一方では、子宮がんの集団検診受診者数が年々増加して
いるため、多数の臨床標本を検査しなければならず、細
胞診における染色方法をより迅速かつ客観的なものに改
善する必要に迫られているのが現状である。

この発明者は、細胞診における染色方法を改善するため
に、抗原抗体反応を利用することを考えた。すなわち、
もし子宮頚がん細胞に対して特異的な抗体が得られるな
らば、標識抗体法により子宮頚がん細胞を特異的に染色
することができる筈である。そこで、この発明者は、子
宮頚がん細胞に対する抗体を製造することを企てた。ま
たその抗体としては、ただ１種の抗原決定基とのみ特異
的に反応するモノクローナル抗体を得ることを試みた。

従来、モノクローナル抗体の製造法としては、動物を悪
性腫瘍細胞で免疫し、その動物から得た抗体産生細胞と
骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを得、ハイブ
リドーマの中から抗体を産生ずるものを選択し、選択し
たハイブリドーマの培養物中から抗体を得る方法〔ネイ
ヂコア（Ｎａｔｕｒｅ）２５６巻４９５頁、１９７５年
、および特公昭５８−４５４０７号〕が知られている。

しかし、子宮頚がん細胞がモノクローナル抗体の製造に
役立つ抗原決定基をもつかどうかは知られていない。こ
の発明者は、５一 研究を重ねた結果、子宮頚がん細胞に対する数種類のモ
ノクローナル抗体の製造に成功し、それが認識する抗原
決定基の細胞上における位置を確認し、またその抗体を
標識抗体法（蛍光または酵素抗体法）に用いて子宮頚が
ん細胞を特異的に染色することに成功し、それによって
子宮頚がんの早期診断を容易かつ迅速に行なうことを可
能にしたのである。

〔発明の構成〕

すなわち、この発明は、 （Ａ）ひと子宮頚がん細胞の抗原決定基に対して特異性
を有する抗体（特にモノクローナル抗体）、（Ｂ）ひと
子宮頚がん細胞で免疫した哺乳類（ひとを除く）の抗体
産生細胞と永久増殖性を有する細胞との融合によるハイ
ブリドーマを培養し、培養物からひと子宮頚がん細胞の
抗原決定基に対して特異性を有する抗体を分離採取する
ことを特徴とする、上記抗体の製法、 （Ｃ）検査すべき組織の試料を、ひと子宮頚がん細胞の
抗原決定基に対して特異性を有する抗体であっ６一 て標識をイ」シたものまたは付しないものと接触させ、
後者の場合にはさらに標識を付した第２抗体と接触させ
、標識を検索することを特徴とする、ひと子宮頚がん細
胞の検出方法、 （Ｄ）ひと子宮頚がん細胞で免疫した哺乳類（ひとを除
く）の抗体産生細胞と永久増殖性を有する細胞とを融合
させてなる、ひと子宮頚がん細胞の抗原性部位に対して
特異性を有する抗体を産生ずるハイブリドーマ、および （Ｅ）ひと子宮頚がん細胞で免疫した哺乳類（ひとを除
く）の抗体産生細胞と永久増殖性を有する細胞とを融合
させ、融合細胞からひと子宮頚がん細胞の抗原決定基に
対して特異性を有する抗体を産生ずるものを選択するこ
とを特徴とする、ハイブリドーマの取得法を提供するも
のである。

以下、上記の発明の詳細な説明する。

（抗体の製造） ！、免疫 この発明の抗体を製造するには、まずひと子宮頚がん細
胞で哺乳類の動物を免疫する。ひと子宮頚がん細胞とし
ては、初代培養細胞またはＩ−１ｅ　Ｌ　ａ細胞の様な
樹立培養細胞を用いることができる。

免疫は、例えば次のように行なう。細胞を、牛胎児血清
（１０％ｖ／ｖ）、ペニシリン（Ｉ　ＯＯＵ／ｍｌ）、
ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むダルベ
ツコ−ＭＥＭ培地（以下増殖培地と呼ぶ）の様な適当な
培地中で培養し、細胞が培養フラスコに一面に広がるま
で増殖後」−清を除去し、カルシウム及びマグネシウム
不含のりん酸緩衝液（ｐＨ７，２、以下ＰＢＳと呼ぶ）
を加えて洗い、ＰＢＳを細胞間にピペットで吹きつける
ことにより細胞を培養フラスコから剥がし取る。この方
法の方がトリプツンなどの蛋白分解酵素により細胞を剥
がし取るよりも細胞表面の抗原の損失が少ない。

遠心分離等の分離手段により子宮頚がん細胞を集め、マ
ウス、ラット等の哺乳類動物に免疫する。

哺乳類動物は、細胞融合する際の相手の永久増殖性細胞
と同系統の動物の方が望ましい。動物の週齢は、例えば
マウスでは５〜ｌＯ週齢がよい。性は雌雄どちらでもよ
い。免疫に用いるひと子宮頚がん細胞の数は、例えばマ
ウスの場合１匹あたり５ｘｌ　０６〜２ｘｌ　０７個が
好ましい。細胞は、例えばＰＢＳに懸濁させるか、また
はフロイントコンプリートアジュバントと１・１の比で
混合しエマルジョンにして動物の腹腔内、静脈内、皮下
等に投与するのが好ましい。この免疫操作を１〜３週間
隔で１〜５回行なう。最終免疫は、例えば細胞をＰＢＳ
に懸濁させ、動物の静脈内あるいは腹腔内に投与して行
なう。このようにして免疫した動物の体液または抗体産
生細胞からは、ポリクローナル抗体が得られる。

２、細胞融合 上記のようにしてひと子宮頚がん細胞で免疫した動物か
ら抗体産生細胞をとり出す。抗体産生細胞は、牌臓、リ
ンパ節、末梢血等から得られるが、牌臓が好ましい。例
えば、牌臓を最終免疫の２〜５日後に無菌的に摘出し、
ダルベツコ−ＭＥＭ培地中ではさみによって細切し肺臓
細胞を浮遊させた後、遠心分離ずろことにより胛臓細胞
を集めて用いる。

融合の相手の永久増殖性細胞としては、永久増殖性を有
する任意の細胞を用いることができるが、繁用されるの
は骨髄腫細胞である。永久増殖性細胞は抗体産生細胞と
同種の動物由来のものが好ましい。例えばマウスの場合
、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８゜Ｕｌ（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳ
　１／ｌ−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、ＳＰ２１０−Ａｇ
ｌ　４（ＳＦ３）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）、Ｐ３
Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６５３）などが用いられる。

また、永久増殖性細胞としては、８−アザグアニン耐性
細胞株、ヒボキサンチングアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ欠損細胞株のような、選別の際のマーカー
となり得る特性を有するものが好ましい。これらの細胞
株は、例えばアメリカンタイプ力ルヂャーコレクション
（ＡＴＣＣ）あるいは大日本製薬（株）より入手可能で
ある。融合に際しては、これらの永久増殖性細胞のいず
れかを増殖培地中で培養し、融合の前に例えばダルベツ
コ−ＭＥＭ培地で洗浄後遠心分離により集める。

融合は、例えば次のように行なう、っ抗体産生細Ｙ０− 胞（例えば肺臓細胞）と永久増殖性細胞（例えば骨髄腫
細胞）を細胞数比で２〜１０・１になるように混合し、
３７°Ｃに保ちつつポリエチレングリコール等の融合促
進剤を徐々に加えて細胞融合を起さＵる。培養液を加え
融合促進剤を希釈して融合を停止させ、遠心分離により
細胞を分離する。次に、例えば細胞をヒボキサンチン、
アミノプテリン、チミジンを増殖培地に加えた＋（へＴ
培地中に懸副させ、９６ウエルマイクロテストプレート
に２００μｍ／ウェルずつ分注し、３７℃、Ｃ０９５％
、湿度９５％のＣＯ、インキュベータ中（以下、ＣＯ。

インキュベータ中の培養条件は全て上記と同一とする）
で培養する。培養液は２目間隔で早産ずつ新しいＨＡ　
Ｔ培地と交換する。約１週間培養後、交換する培地を増
殖培地にヒボキサンチン及びチミジンを添加したＩ−Ｔ
　Ｔ培地に変える。

３８ハイブリドーマのスクリーニング及びクローニング 次に、ＨＴ培地中で数日間培養し、ハイブリドーマのコ
ロニーがマイクロテストプレートのウェルの半分程度ま
で広がってきた時点でどのウェルのハイブリト−マが子
宮頚かん細胞に対するモノクローナル抗体を産生じてい
るかをスクリーニングする。スクリーニングは、例えば
次のように行なう。ハイブリドーマが増殖して来ている
ウェルの培養」−〆♂ｔを一部とり、それが培養子宮頚
がん細胞と反応するかどうかを例えば酵素抗体法あるい
は蛍光抗体法等の公知の標識抗体法で調べる。

次に、例えば限界希釈法や軟寒天法等の公知の技術を用
いて、子宮頚がん細胞と反応するモノクローナル抗体を
産生じているハイブリトーマをクローニングして単一の
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリトーマの集団を
選択する。クローニング及びスクリ−ニングは２回以上
繰り返すことが望ましい。

４、モノクローナル抗体の製造 上記のようにして得られたハイブリドーマをインビトロ
（培養器具内または栄養培地中）及びインビボ（生体内
または動物組織中）で培養することによりモノクローナ
ル抗体を産生させる。培養は、例えば次のように行なう
。インビトロでの培養では、増殖培地の様な適当な培地
を用い、例えばＣＯ，インキュベータ中でハイブリドー
マを培養する。ハイブリドーマが増殖限度まで増殖した
時点で培養液を採取し、遠心分離のような固液分離手段
でハイブリトーマと培養」二清を分離する。培養」−清
中のモノクローナル抗体は目的によっては精製せずに用
いることも可能であるが、分離する場合には例えば硫酸
アンモニウムで塩析し、００２Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７
，２）で透析後、ジェヂルアミノエヂルセルロースカラ
ム等に通して精製する。

培養」二清から分離したハイブリドーマは、例えばジメ
チルスルホキシド（５〜１０％Ｖ／Ｖ）及び牛胎児血清
（１０〜２０％ｖ／ｖ）を添加したダルベツコ−ＭＥＭ
の様な適当な培地中に１−１０ＸＩＯ”個／ｍｌの細胞
密度で懸創させ、適当なアンプルに入れて徐々に一８０
℃以下に凍結させることにより、生きたままの状態で長
期保存することが可能である。特に、例えば液体窒素等
の超低温下ではハイブリドーマを半永久的に保存するこ
とができる。

ハイブリドーマをインビボで培養する場合には、任意の
動物にハイブリドーマを移植するが、細胞融合に用いた
稗臓細胞を採取した動物と同種のものを使用するのが好
ましい。例えばＢＡＬＢ／ｃマウスの場合には、ハイブ
リドーマの移植の１〜３週間前に２．６，１０．１４−
テトラメヂルペンタデカン０．５ｍｌを腹腔内に注射し
ておき、マウス１匹あたり２〜１０ｘｌ　０６個のハイ
ブリドーマを腹腔内に注射する。１〜２週間後にマウス
の腹腔内にモノクローナル抗体を高濃度に含んだ腹水が
貯留し腹部が肥大してくるので、腹水を採取し培養」二
清の場合と同様に精製する。

５、モノクロルナル抗体の特性 」二記のようにして得られたモノクローナル抗体の特性
の検討は、例えば以下のようにして行なう。

まず、モノクローナル抗体が培養子宮頚がん細胞のどの
部位と反応するかを調べるために、公知の標識抗体法、
例えば蛍光抗体法または酵素抗体法を行う。

次にモノクローナル抗体の特異性の倹約を、培養ひと正
常細胞お、］；び培養ひとがん細胞との反応性並びに既
存のかん関連抗原との反応性を公知の標識免疫測定法（
例えば酵素免疫測定法）によって行う。

また、モノクローナル抗体のイムノグロブリンクラスお
よびザブクラスの決定は、抗イムノグロブリンクラス・
ザブクラス抗体を用いた標識（例えば酵素）免疫測定法
によって行うことが出来る。

この発明の好ましい抗体は、モノクローナル抗体であっ
て、イムノグロブリンサブクラスＧ、ａまたはＧ２ｂに
属するものである。これら（Ｊｌひと子宮頚がん細胞の
抗原決定基に対して特異性を有する。

（用途） この発明の抗体は、例えば細胞診におけるひと子宮頚が
ん細胞の検出方法に用いられる。この検出方法は、検査
すべき組織の試料を、標識をイ」シたこの発明の抗体と
接触させた後、標識検知手段によって細胞に付着した標
識を検索するか、または標識を刺していないこの発明の
抗体と接触させた後標識をイ」シた第２抗体（この発明
の抗体と結合し得る抗体）と接触させ、標識検知手段に
よって細胞に付着した標識を検索することによって行な
われる。標識としては、放射能、酵素、蛍光化合物（例
えばフルオレスセインイソヂオシアネート、テトラメヂ
ルローダミンイソヂオシアネ−１−）等が用いられる。

第２抗体の製造、および抗体に対ずろ標識の付着は常法
によって行なわれる。」二記の検出方法には、（ａ）標
識をイ」シたまたは付していないこの発明の抗体、（ｂ
）必要に応じて、標識を付した第２抗体、および（ｃ）
必要な他の試薬および器具（例えば組織採取器具、緩衝
液、ヂャンバースライド等）を含む、診断用キットを作
成・使用するのが便利である。この発明の抗体はひと子
宮頚がん細胞と特異的に反応するため、子宮頚がんの診
断の迅速化および客観化に大きく寄与するものである。

［実施例］ 一１５＝ 以下、この発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例１．ヒト子宮頚がんに対するモノクローナル抗体
の製造 （１）免疫 ヒト子宮頚がん由来細胞であるＨ　ｅ　Ｌ　ａ細胞（大
日本製薬（株）から購入）を増殖培地中、ＣＯ２インキ
ユベータ内で培養した。細胞が単層を形成した段階で培
養液を捨て、培養容器底面に付着している細胞にＰＢＳ
をピペットで吹きつけることにより細胞を剥がしとり、
遠心分離（４００ｘ　ｇ、　５分間）して細胞を集めた
。

このＨｅＬａ細胞をＰＢＳに懸濁し、フロイントコンブ
リートアシコハン１−と１．１の割合で充分混合し、２
匹のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（６週令、雌、日本
ヂャールズリバー社）に１匹あたりＩＸＩ　Ｏ”個（０
，４ｍ１）の割で腹腔内に注射した。２週間後、」−記
と同様にして集めたＨ　ｅ　Ｌ　ａ細胞をＰＢＳに懸罰
させ、１匹あたりＩｘ１０７個（０，４，ｍｌ）の割で
尾静脈内に投与した。

（２）細胞融合 ２回目の免疫の３日後に、免疫された２匹のマウスから
肺臓を無菌的に摘出し、ダルベツコ−ＭＥＭ培地中に細
切した肺臓細胞を浮遊させ、２５０ｘｇで５分間、室温
で遠心分離して細胞を集めた。ダルベツコ−ＭＥＭ培地
で２回細胞を洗浄した後、融合まで室温に放置した。マ
ウスの骨髄腫細胞Ｎ５−１（大日本製薬（株）から購入
）は増殖培地中、Ｃ０２インキユベータ内で培養してお
いた。

細胞融合の直前にＮ５−１細胞を遠心管に移し、２００
　ｘｇで５分間、室温で遠心分離して細胞を集めた。細
胞をさらに２回タルベツコーＭＥＭ培地で洗浄し、融合
まで室温に放置した。

肺臓細胞１．５ＸＩ　０８個とＮ５−１細胞３　ｘｌＯ
７個を遠心管に移して混合し、４００　ｘｇで５分間、
室温で遠心した。上清を除去し、細胞をしっかりしたペ
レットにした。遠心管を３７℃に保ちつつ、これにダル
ベツコ−ＭＥＭ中３７°Ｃに温めた５０％ポリエヂレン
クリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ　４０００．メルク）１ｍｌを
１分間かけて徐々に加え、細胞と混合した。

さらに１分間、ピペットの先で細胞ペレットをかき混ぜ
続けた。次に３７°Ｃに温めたｌ０ｍ１のダルベツコ−
ＭＥＭ培地を５分間かけて混ぜながら加え、室温、４０
０　Ｘ　ｇで５分間遠心し、」二清を除去した。牛胎児
血清（１０％Ｖ／Ｖ）、ペニンリ：／（１００Ｕ／ｍｌ
）、ストレプトマーｒシン（１００μｇ／　ｍｌ）、ヒ
ポキサンチン（１ｘｌＯ−Ｍ）、アミノプテリン（４Ｘ
］０’Ｍ）、デミジン（１，６ｘｌＯ−５Ｍ）を含むダ
ルベツコ−ＭＥＭ培地（以下、ＨＡ　Ｔ培地と呼ぶ）を
６０ｍ１加えて細胞浮遊液を作り、９６ウエルマイクロ
テストプレート（ファルコン３０７２）３枚に２００μ
Ｉ／ウエルずつ分注し、ＣＯ，インキュベータ内で培養
した。

培養液は２目間隔で半量ずつ新しいＨＡ　Ｔ培地と交換
した。培養開始後７白目に、ハイブリドーマのコロニー
が肉眼で観察出来るようになったが、培地をＨＡ　Ｔ培
地からアミノプテリンだけを含まないＨＴ培地に変え培
養を続はノ；。

（３）ハイブリドーマのスクリーニング及びクローニン
グ 培養開始後１１日日目、ハイブリトーマのコロニーが９
６ウエルマイクロテストプレートのほとんどのウェルで
ウェルの底面積の半分程度まで増殖して来たので、子宮
頚がん細胞に対する抗体を産生じているかどうかをスク
リーニングした。

９６ウエルマイクロテストプレー１・にトＩｅＬａ細胞
を単層を形成するまで培養しておき、培養上清を除去後
ＰＢＳ中１％ｗ／ｖ牛血清アルブミン溶液（以下、１％
ＢＳＡと呼ぶ）でウェルを満たし、室温で１時間放置し
た。０．０５％ｖ／ｖツイーン２０添加りん酸緩衝液（
以下、ツイーン−ＰＢＳと呼ぶ）でウェルを３回洗浄後
、ハイブリドーマ培養上清を５０μｍ／ウェルずつ分注
し、室温で２時間放置した。ツイーン−ＰＢＳでウェル
を４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＴｇＧ＋
ＩｇＭうさぎ抗体（ザイメッドラボラトリーズ）の１０
００分の１希釈液を１００μｌ／ウエルずつ分注し、室
温で２時間放置した。ツイーン−ＰＢＳでウェルを４回
洗浄後、ｌＯＱｕｇ／＋ｍｌの２．２′−アジノビス（
３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルポン酸）（以下
、ＡＢＴＳと呼ぶ）と０．０３％過酸化水　素を含む０
．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐｒ−ｒ４．２）を１００μｍ
／ウェルずつ加え室温で３０分間反応させた。

２ｍＭのアジ化ナトリウム溶液を１００μｌ／ウエルず
つ分注して反応を停止させ、ウェルの青緑色の発色を観
察し、発色したウェル中に子宮頚がんに対する抗体が存
在すると判定した。

同様の操作を、正常人血清をＰＢＳで１０分の１に希釈
した溶液を１００μＸ／ウェル加え、４°Ｃで１晩放置
してコルティングした９６ウエルマイクロプレートにつ
いても行った。

ＨｅＬａ細胞と反応するモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマを含むウェルは、２８８ウエル中７ウエ
ルであり、正常人血清と反応するものは２８８ウエル中
０ウエルであった。

次にこの７ウエル中のハイブリドーマを限界希釈法でク
ローニングした。マウス（Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／ｃ。

３週令）の胸腺を無菌的に摘出し、ハサミで細切して胸
腺細胞を増殖培地に懸濁し、５ｘｌ　Ｏ’個個用ｍ１細
胞浮遊液を作り、そこにハイブリドーマを５個／ｍｌに
なるように希釈した液を２００μｌ／ウエルずつ９６ウ
エルマイクロテストプレートに分注し、ＣＯ２インキユ
ベータ内で培養した。培養開始後１２日回し、ハイブリ
ドーマのコロニーが１ウエルに１個だけ存在するウェル
の培養上清について、上記の抗子宮頚がん細胞モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行っ
た。

このクローニングおよびスクリーニングの操作を２回（
り返し、２種類のハイブリドーマ、ＩＣ２，２Ｇ１２を
樹立した。

（４）モノクローナル抗体の製造 樹立したハイブリドーマをそれぞれ増殖培地中に初期細
胞密度３ｘｌ　Ｏ’個／ｍｌで浮遊させ、ＣＯ。

インキュベータ内で培養し、４日後培養液を遠心分離（
４００ｘ　ｇ、　Ｉ　０分間）し、モノクローナル抗体
を含む培養上清を採取した。

インビボでのハイブリドーマの培養では、ハイブリドー
マを移植する２週間前にＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス
（８週令）の腹腔内に１匹あたり０．５ｍｌの２゜６．
１０．１４−テトラメチルペンタデカンを注射しておい
た。これらのマウスに２種類のハイブリドーマを１ｘ１
０７＠／ｍｌの細胞密度でダルベツコ−ＭＥＭ培地に懸
濁させた細胞浮遊液を１匹あたり０．５ｍｌずつ腹腔内
に注射した。１５日後マウスの腹腔内に貯留した腹水（
５〜８ｍ１）を注射器で吸引採取し、遠心分離（４００
ｘｇ、１０分間）後、モノクローナル抗体を含む腹水」
１清を採取した。

このようにして２種類のハイブリドーマ、ＩＣ２，２Ｇ
１２を培養し、それぞれのハイブリトーマが産生じたモ
ノクローナル抗体を次のようにして分離した。

モノクローナル抗体を含む培養上清もしくは腹水上〆ｎ
に４°Ｃて等量の飽和硫酸アンモニウムを徐々に加え塩
析し、００２Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７２）で２４時間透
析した。この透析画分を０．０２Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ
７，８）で平衡化したジエヂルアミノエヂルセルロース
カラム（ワットマン）に通し、溶離液を限外濾過した後
、２８０ｎｍにおける吸光度測定による蛋白濃度が約１
０ｍｇ／ｍｌになるまで減圧濃縮し、モノクローナル抗
体を含む濃縮成約３ｍｌを得た。

得られた抗体をそれぞれＭ−１、Ｍ−２と名付（プた。

これらは何れも、電気泳動法による分子量が約１５万で
あった。

実施例２．モノクローナル抗体の特性 （１）蛍光抗体法 ＨｅＬａ細胞を、ラブチックティッシュカルチャーチャ
ンバー／スライド（４８０４，マイルスラボラトリーズ
）内で、増殖培地中、初期細胞密度］　ｘｌＯ’個／ｍ
ｌで３日間培養後、培養上清を除去し、１％ＢＳＡで満
たした。室温で１時間放置後、ツイーン−ＰＢＳで３回
洗浄し、モノクローナル抗体を含む培養上清を２００μ
ｌずっ加え、室温で２時間反応させた。次に」１清を除
去し、ツイーン−ＰＢＳで４回洗浄後ＦＩＴＣ標識抗マ
ウスＩｇＧ＋ＩｇＭやぎ抗体溶液（ＰＢＳで１０分の１
希釈、ケーピーエル）を１００μｌずつ加え、３７°Ｃ
で３０分間反応させた。」１清を除去し、ＰＢＳで４回
洗浄後、蛍光顕微鏡にコン・ダイアフォトＴＭＤ−ＥＦ
）で検鏡した。

２種類のモノクローナル抗体のうちＭ−１ではＨｅ　Ｌ
　ａ細胞の細胞表面に強い蛍光が観察され、Ｍ−２では
Ｈｅｒ、ａ！ｎ胞の細胞間質に強い蛍光が観察された。

こうして、それぞれのモノクローナル抗体の認識する抗
原決定基の細胞上の位置が確認されノこ。

（２）モノクローナル抗体のクラス・ザブクラスの決定 ＨｅＬａ細胞を、９６ウエルマイクロテストプレート中
で培養し、単層を形成した時点で培養」二ｍを除去し、
Ｉ％ＢＳＡを加えて室温で１時間放置した。次に上清を
除去し、ツイーン−ＰＢＳで４回洗浄後、モノクローナ
ル抗体を含む培養」１清を１００μｍ／ウェルずっ分注
し、室温で２時間放置した。ツイーン−ＰＢＳで４回洗
浄後、ＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ　ＥＴＡ　ＫＩＴ（ザイメッ
ドラボラトリーズ）を用いて２種類のモノクローナル抗
体のクラス・ザブクラスを決定した（第１表）。

＝２４− （３）既知がん関連抗原に対する抗体との交差性この発
明のモノクローナル抗体が既知のかん関連抗原と反応す
るかどうかを、既知がん関連抗原に対する抗体によるモ
ノクローナル抗体結合抑制を指標として調べた。既知が
ん関連抗原としてＣＥＡ、フェリチン、ＡＦＰ、β、−
ミクログロブリンについて検討した。

ＨｅＬａ細胞を、９６ウエルマイクロテストプレートに
単層を形成するまで培養し、培養」１清を除去後１％Ｂ
ＳＡをウェルに満たし、室温で１時間放置した。ツイー
ン−ＰＢＳで３回洗浄後、抗ＣＥＡうさぎ抗体（ダコー
）、抗フェリヂンうさぎ抗体（ダコー）、抗ＡＦＰうさ
ぎ抗体（ヘキスト）、抗β２−ミクログロブリンうさぎ
抗体（生化学工業）をそれぞれ牛血清アルブミン（０，
１％Ｗ／Ｖ）、ツイーン２ＫＯ，（１５％ｖ／ｖ）を含
む１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液で５０分の１に希釈し、］
００Ｉｚｌ／ウェルずつ分注し、室温で３時間放置した
。ツイーン−ＰＢＳで４回洗浄後、モノクローナル抗体
を含む培養上清を１００μＩ／ウエルずつ分注し、室温
で２時間放置した。ツイーン−Ｐ　１３　Ｓでウェルを
４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ→−
ＴｇＭうさぎ抗体（ザイメットラボラトリーズ）の１０
００分の１希釈液を１００μｌ／ウエルずっ分注し、室
温で２時間放置した。ツイーン−ＰＢＳでウェルを４回
洗浄後、１００μｇ　／　ｍ　］のＡＢＴＳと００３％
過酸化水素を含む０．１Ｍ＜えん酸緩衝液（ｐＨ４，２
）を１００μｌ／ウエルずっ加え、室温で３０分間反応
させた。２ｍＭのアジ化ナトリウム溶液を１００μｍ／
ウェルずっ分注して反応を停止させ、４１４μｍにおけ
る吸光度を測定した（タイターテックマルヂスキャン、
フロララボラトリーズ）。

その結果、既知がん関連抗原に対する抗体を大過剰に反
応させているにもかかわらず、モノクローナル抗体と抗
原であるＨ　ｅ　Ｌ　ａ細胞との結合がほとんと抑制さ
れないことから、この発明のモノクローナル抗体はこれ
らの既知抗原とは反応しないと考えられる（第２表）。

第２表 〔表中の数値は、 を示ず。］ （４）培養ひと正常細胞および培養ひとがん細胞との反
応性 培養ひと正常細胞としてＰｌｏｗ４０００（胎児腎）培
養ひとがん細胞としてＣ３２（メラニン欠乏性黒色腫）
、Ｇ４０２（腎平滑筋芽腫）、ＭＩＡ　ＰａＣａ−２（
膵臓がん）、ＰＡ−１（卵巣奇形腫）、ＨＴ−１１，９
７（膀胱がん）、ＣＯＬ　Ｏ−２０１（結腸線がん）Ｚ
Ｒ−７５−１（乳がん）、ＩＭＲ−３２（神経芽細胞腫
）ＭＯＬＴ−３（急性リンパ芽球白血病）〔いずれも大
日本製薬（株）から購入〕を、９６ウエルマイクロテス
トプレート上で単層を形成するまで培養した。培養」−
清を除去後１％ＢＳ八をウェルに満たし、室温で１時間
放置した。ツイーン−ＰＢＳで３回洗浄後、モノクロー
ナル抗体を含む培養」−清を１００μｍ／ウェルずつ分
注し、室温で２時間放置した。ツイーン−ＰＢＳてウェ
ルを４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ
　−１−Ｉ　ｇＭうさぎ抗体（ザイメットラボラトリー
ズ）の１０００分の１希釈液を１００μｌ／ウエルずつ
分注し、室温で２時間放置した。ツイーン−ＰＢＳで４
回洗浄後、Ｉ　ＯＯμｇ／ｍｌのＡＢＴＳと００３％過
酸化水素を含む０．１Ｍ＜えん酸緩衝液（ｐＨ４２）を
１００μｌ／ウエルずつ加え室温で３０分間反応させた
。２ｍＭのアジ化ナトリウム溶液を１００μＩ／ウエル
ずつ分圧して反応を停止させ、４１４μｍにおける吸光
度を測定した（タイターチックマルチスキャン、フロラ
ラボラトリーズ）。

モノクローナル抗体をＨｅ　Ｌ　ａ細胞と反応させたと
きの吸光度と他の培養細胞と反応さＵ゛たときの吸光度
を比較すると、Ｍ〜１とＨＴ−１１９７が強く、ＭＩＡ
ＰａＣａ−２及びＣ−３２が弱く反応した以外は、（Ｊ
とんど反応しないことが認められた。この結果から、こ
れらのモノクローナル抗体が子宮頚がん細胞とかなり特
異的に反応することが確認された（第３表）。

第３表 〔表中の符号は、 ＜０．２５ニー、０．２６−０．５０：±、０．５１０
．７５：→−１０，７６−１，００，＋−＋−を示す。

〕 試験例１．子宮頚がんの細胞診 綿棒あるいは木製またはプラスチック製のへらを用いて
子宮腔部を擦過し、さらに子宮頚管内に回転しながら擦
過し、スライドグラスに細胞を均一に塗抹した。９５％
エタノール液中で２０分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄
後、０．３％過酸化水素を含むＰＢＳ中に３０分間放置
し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻止した。ＰＢＳで
３回洗浄後、２％馬面清中に３０分間放置した。モノク
ローナル抗体を含む培養上清１ｍｌをスライドグラスの
細胞塗抹」二に滴下し、室温で１時間反応させた。ＰＢ
Ｓで３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ
うさぎ抗体（ザイメットラボラトリーズ）の１０００分
の１希釈液１ｍｌを細胞塗抹」二に滴下し、室温で３０
分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、２５０μｇ／ｍ
ｌの３，３゛−ノアミノベンジジン・４塩酸塩と０．０
３％過酸化水素を含むＰＢＳ中に室温下７分間放置した
。ＰＢＳで３回洗浄後、ヘマトギノリンにより室温で５
分間核染色した。流水中で１０分間水洗後、９５％エタ
ノール液中で１０分間放置し、キンロール中で１５分間
放置した。余分なキジロールをふきとり、乾燥しないう
ちに封入し、顕微鏡観察した。

２種のモノクローナル抗体とも正常例とは全く反応せず
、子宮頚がん症例とは金側反応が陽性となった（第４表
）。

第４表

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）ひと子宮頚がん細胞の抗原決定基に対して特異性
   を有する抗体。
2. （２）モノクローナル抗体である、特許請求の範囲第１
   項記載の抗体。
3. （３）イムノグロブリンサブクラスＧ＿２ａまたはＧ＿
   ２ｂに属するものである、特許請求の範囲第２項記載の
   抗体。
4. （４）ひと子宮頚がん細胞で免疫した哺乳類（ひとを除
   く）の抗体産生細胞と永久増殖性を有する細胞との融合
   によるハイブリドーマが産生するものである、特許請求
   の範囲第２項記載の抗体。
5. （５）ひと子宮頚がん細胞で免疫した哺乳類（ひとを除
   く）の抗体産生細胞と永久増殖性を有する細胞との融合
   によるハイブリドーマを培養し、培養物からひと子宮頚
   がん細胞の抗原決定基に対して特異性を有する抗体を分
   離採取することを特徴とする、上記抗体の製法。
6. （６）培養を栄養培地中で行なう、特許請求の範囲第５
   項記載の製法。
7. （７）培養を動物組織中で行なう、特許請求の範囲第５
   項記載の製法。
8. （８）検査すべき組織の試料を、ひと子宮頚がん細胞の
   抗原決定基に対して特異性を有する抗体であって標識を
   付したものまたは付しないものと接触させ、後者の場合
   にはさらに標識を付した第２抗体と接触させ、標識を検
   索することを特徴とする、ひと子宮頚がん細胞の検出方
   法。
9. （９）標識が蛍光化合物、酵素または放射性同位元素で
   ある、特許請求の範囲第８項記載の方法。
10. （１０）ひと子宮頚がん細胞で免疫した哺乳類（ひとを
    除く）の抗体産生細胞と永久増殖性を有する細胞とを融
    合させてなる、ひと子宮頚がん細胞の抗原性部位に対し
    て特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマ。
11. （１１）ひと子宮頚がん細胞で免疫した哺乳類（ひとを
    除く）の抗体産生細胞と永久増殖性を有する細胞とを融
    合させ、融合細胞からひと子宮頚がん細胞の抗原決定基
    に対して特異性を有する抗体を産生するものを選択する
    ことを特徴とする、ハイブリドーマの取得法。