JPH02242697A - 抗ひと精子抗体、その製法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、抗ひと精子抗体、上記抗体の製法、上記抗
体を用いる精子受精能測定用試薬、上記抗体を産生ずる
ハイブリドーマ、および上記ハイブリドーマの取得法に
関するものである。

〔従来の技術〕

は乳類の精子は、射精された状態では受精能をらたず、
雌性の生殖路内において光体反応を受けて生理的機能変
化をとげ、受精能を獲得するに至ることが知られている
。光体反応に際しては、光体部分の細胞膜と外光体膜と
の間に融合がおこり、先体内酵素を放出するとともに、
両膜は精子からはなれ、精子は内光体膜を露出する。ま
た受精能は、射精された精子をインキュベーションする
ことによっても獲得されることが判明している。

従来、例えば不妊の診断または治療を目的とした、ひと
の精子の受精能測定法としては、古くから行なわれてい
る方法として、精液量、精子濃度、精子の運動性等を測
定する方法があるが、これは受精能そのものを観察する
方法ではないから、全く不正確なものである。また最近
の方法として、インキュベーションした精子がハムスタ
ー卵子（ひと精子と融合する能力をもつ）と融合するか
どうかを調べる方法（ハムスターテスト）があるが、こ
れは操作が繁雑であり、テストを行なう機関ごとに異な
った値が出るなど再現性が良好でないという、欠点があ
る。そのほか、種々の染色法を組み合わせる方法（トリ
プルスティン）もあるが、これも操作が繁雑であり、ま
た結果の信頼性が充分でない。

〔発明が解決しようとする課題〕

それ故、簡便かつ再現性があり、理論的根拠を備えた、
ひとの精子の受精能測定法の開発が望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

この発明者は、ひとの精子の受精能測定法を改善するた
めに、抗原抗体反応を利用することに着目した。そして
、研究を重ねた結果、受Ｍ能を獲得したひと精子に現わ
れる抗原性部位に特異性なポリクローン抗体およびモノ
クローン抗体の製造に成功し、またその抗体を標識抗体
法（蛍光または酵素抗体法）に用いて受精能をもつ精子
を特異性に染色することに成功し、それによって男性不
妊の診断を容易かつ迅速に行なうことを可能にしたので
ある。

〔発明の構成〕

すなわち、この発明は、 （Ａ）ひと精子先体（膜を含む）上の抗原性部位に対し
て特異性を有する抗体（特にモノクローン抗体）、 （Ｂ）ひと精子先体（膜を含む）上の抗原性部位で免疫
した哺乳類（ひとを除く）の抗体産生細胞と永久増殖性
を有する細胞との融合によるノ１イブリドーマを培養し
、培養物からひと精子先体（膜を含む）上の抗原性部位
に対して特異性を有する抗体を分離採取することを特徴
とする、上記抗体の製法、 （Ｃ）ひと精子先体（膜を含む）上の抗原性部位に対し
て特異性を有する抗体であって標識を付したものまたは
付しないものを含有し、後者の場合にはさらに標識を付
した第２抗体を含有する、ひと精子の受精能測定用試薬
。

（Ｄ）ひと精子先体（膜を含む）上の抗原性部位で免疫
した哺乳類（ひとを除く）の抗体産生細胞と永久増殖性
を有する細胞とを融合させてなる、ひと精子先体（膜を
含む）上の抗原性部位に対して特異性を有する抗体を産
生ずるハイブリドーマ、および （Ｅ）ひと精子先体（膜を含む）上の抗原性部位で免疫
した哺乳類（ひとを除く）の抗体産生細胞と永久増殖性
を有する細胞とを融合させ、融合細胞からひと精子先体
（膜を含む）上の抗原性部位に対して特異性を有する抗
体を産生ずるものを選択することを特徴とする、ハイブ
リドーマの取得法を提供するものである。

以下、上記の発明の詳細な説明する。

（抗体の製造） １、免疫 この発明の抗体を製造するには、まずひと精子先体（膜
を含む）上の抗原性部位で哺乳類の動物を免疫する。光
体が露出したひと精子は、例えば射精された精子を、例
えばひと血清アルブミンを含有するメディウムで前培養
するか、デオキシコール酸ナトリウムのような陰イオン
界面活性剤、または陽イオン、非イオン、両性等の界面
活性剤で処理するか、Ａ２３１８７のようなイオノフオ
アで処理することによって得られる。免疫は例えば次の
ように行なう。精子を集め、マウス、ラット等の哺乳類
動物に免疫する。哺乳類動物は、細胞融合する際の相手
の永久増殖性細胞と同系統の動物の方か望ましい。動物
の週給は、例えばマウスでは５〜ｌＯ週齢がよい。性は
雌雄どちらでもよい。免疫に用いるひと精子の数は、例
えばマウスの場合１匹あたり５Ｘ１０’〜２ＸｌＯ？個
が好ましい。精子は例えばＰＢＳに懸濁させるか、また
はフロイントコンプリートアジュバントとｌ：ｌの比で
混合しエマルジョンにして動物の腹腔内、静脈内、皮下
等に投与するのが好ましい。この免疫操作を１〜３週間
隔で１〜５回行なう。最終免疫は、例えば精子をＰＢＳ
に懸濁させ、動物の静脈内あるいは腹腔内に投与して行
なう。このようにして免疫した動物の体液または抗体産
生細胞からは、ポリクローン抗体が得られる一動物の抗
体価を測定し、充分上昇したとき抗体または産生細胞を
採取する。

２、細胞融合 上記のようにしてひと精子で免疫した動物から抗体産生
細胞をとり出す。抗体産生細胞は、膵臓、リンパ節、末
梢血等から得られるか、膵臓が好ましい。例えば、牌臓
を最終免疫の２〜５日後に無菌的に摘出し、ダルベツコ
−ＭＥＭ培地中ではさみによって細切し牌臓細胞を浮遊
させた後、遠心分離することにより牌臓細胞を集めて用
いる。

融合の相手の永久増殖性細胞としては、永久増殖性を有
する任意の細胞を用いることができるが、繁用されるの
は骨髄腫細胞である。永久増殖性細胞は抗体産生細胞と
同種の動物由来のものが好ましい。例えばマウスの場合
、Ｐ３ＵＩＰ３Ｘ６３Ａｇ’８．Ｕｌ（Ｐ３Ｕｌ）、Ｐ
３／ＮＳ　１／ｌ　−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、ＳＰ２
１０−Ａｇ１４（ＳＦ３）Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）
、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）などが用いられ
る。また、永久増殖性細胞としては、８−アザグアニン
耐性細胞株、ヒボキサンチングアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ欠損細胞株のような、選別の際のマー
カーとなり得る特性を有するものが好ましい。これらの
細胞株は、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）、藤沢薬品工業（株）または大日本製
薬（味）より入手可能である。融合に際しては、これら
の永久増殖性細胞のいずれかを増殖培地中で培養し、融
合の前に例えばダルベブコーＭＥＭ培地で洗浄後遠心分
離により集める。

融合は、例えば次のように行なう。抗体産生細胞（例え
ば牌臓細胞）と永久増殖性細胞（例えば骨髄腫細胞）を
細胞数比で２〜１０：ｌになるように混合し、３７℃に
保ちつつポリエチレングリコール（例えば平均分子量１
３００〜７５００．２０〜４０％）等の融合促進剤を徐
々に加えるか、または電気パルス（例えば約１０００Ｖ
／ｃｍのような高電圧の直流）を短時間作用させて細胞
融合を起させる。培養液を加え融合促進剤を希釈して融
合を停止させ、遠心分離により細胞を分離する。

次に、例えば細胞をヒボキサンチン、アミノプテリン、
チミジンを増殖培地に加えたＨＡＴ培地中に懸濁させ、
９６ウエルマイクロテストプレートに２００μｍ／ウェ
ルずつ分注し、３７℃、Ｃ０ｔ５％、湿度９５％のＣＯ
，インキュベータ中（以下、ＣＯ，インキュベータ中の
培養条件は全て上記と同一とする）で培養する。培養液
は２日間隔で半量ずつ新しいＨＡＴ培地と交換する。約
１週間培養後、交換する培地を増殖培地にヒボキサンチ
ン及びチミジンを添加したＨＴ培地に変える。

３゜ハイブリドーマのスクリーニング及びクローニング 次に、ＨＴ培地中で数日間培養し、ハイブリドーマのコ
ロニーがマイクロテストプレートのウェルの半分程度ま
で広がってきた時点でどのウェルのハイブリドーマがひ
と精子に対するモノクローン抗体を産生じているかをス
クリーニングする。

スクリーニングは、例えば次のように行なう。ノ１イブ
リドーマが増殖して来ているウェルの培養上清を一部と
り、それがひと精子と反応するかどうかを例えば酵素抗
体法あるいは蛍光抗体法等の公知の標識抗体法で調べる
。

次に、例えば限界希釈法や軟寒天法等の公知の技術を用
いて、ひと精子と反応するモノクローナル抗体を産生じ
ているハイブリドーマをクローニングして単一のモノク
ローン抗体を産生ずるハイプリドーマの集団を選択する
。クローニング及びスクリーニングは２回以上繰り返す
ことが望ましい。

４、モノクローン抗体の製造 上記のようにして得られたハイブリドーマをインビトロ
（培養器具内または栄養培地中）及びインビボ（生体内
または動物組織中）で培養することによりモノクローン
抗体を産生させる。培養は、例えば次のように行なう。

インビトロでの培養では、増殖培地の様な適当な培地を
用い、例えばＣＯ。

インキュベータ中でハイブリドーマを培養する。

ハイブリドーマか増殖限度まで増殖した時点で培養液を
採取し、遠心分離のような固液分離手段でハイブリドー
マと培養上清を分離する。培養上清中のモノクローナル
抗体は目的によっては精製せずに用いることも可能であ
るか、分離する場合には例えば硫酸アンモニウムで塩析
し、０．０２Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７，２）で透析後、
ジエチルアミノエチルセルロースカラム等に通して精製
する。

培養上清から分離したハイブリドーマは、例えばジメチ
ルスルホキシド（５〜１０％Ｖ／Ｖ）及び牛胎児血清（
１０〜２０％ｖ／ｖ）を添加したダルベツコ−ＭＥＭの
様な適当な培地中に１−１０ＸＩＯ６個／ｍ（ｌの細胞
密度で懸濁させ、適当なアンプルに入れて徐々に一８０
℃以下に凍結させることにより、生きたままの状態で長
期保存することが可能である。特に、例えば液体窒素等
の超低温下ではハイブリドーマを半永久的に保存するこ
とができる。

ハイブリドーマをインビボで培養する場合には、任意の
動物にハイブリドーマを移植するが、細胞融合に用いた
膵臓細胞を採取した動物と同種のものを使用するのが好
ましい。例えばＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの場合に
は、ハイブリドーマの移植の１〜３週間前に２．６，１
０．１４−テトラメチルペンタデカン（プリスタン）０
．５＋＆を腹腔内に注射しておき、マウス１匹あたり２
〜１ＯＸｌＯ１１個のハイブリドーマを腹腔内に注射す
る。１〜２ａ間後にマウスの腹腔内にモノクローン抗体
を高濃度に含んだ腹水が貯留し腹部が肥大してくるので
、腹水を採取し培養上清の場合と同様に精製する。

５、モノクローン抗体の特性 上記のようにして得られたモノクローン抗体の特性の検
討は、例えば以下のようにして行なう。

まず、モノクローン抗体がひと精子のどの部位と反応す
るかを調べるために、公知の標識抗体法、例えば蛍光抗
体法または酵素抗体法を行なう。

次にモノクローン抗体の特異性の検討を、ひと精しよう
、マウス精子等との反応性を調べる公知の標識免疫測定
法（例えば酵素免疫測定法）によって行う。

（用途） この発明の抗体は、例えば不妊の診断・治療におけるひ
と精子の受精能の検出に用いられる。この検出は、検査
すべき精子を、標識を付したこの発明の抗体と接触させ
た後、標識検知手段によって精子に付着した標識を検索
するか、または標識を付していないこの発明の抗体と接
触させた後標識を付した第２抗体（この発明の抗体と結
合し得る抗体）と接触させ、標識検知手段によって精子
に付着した標識を検索することによって行なわれる。標
識としては、放射能、酵素、蛍光化合物（例えばフルオ
レスセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミ
ンイソチオシアネート）等が用いられる。第２抗体の製
造、および抗体に対する標識の付着は常法によって行な
われる。上記の検出方法には、（ａ）Ｉ識を付したまた
は付していないこの発明の抗体、（ｂ）必要に応じて、
標識を付した第２抗体を含む試薬、または上記（ａ）、
（ｂ）、および（ｃ）必要な他の試薬および器具（例え
ば精子採取器具、緩衝液、チャンバースライド等）を含
む、診断用キットを作成・使用するのが便利である。こ
の発明の抗体は受精能をもったひと精子の抗原決定基と
特異的に反応するため、不妊の診断の迅速化および客観
化に大きく寄与するものである。

〔実施例〕

以下、この発明を、実施例によりさらに詳細に説明する
。

実施例！（抗ヒト精子１／クロ一ン抗体の作成）精子の
受精能を測定するためには、受精能を獲得した精子にの
み現れる抗原と反応するモノクローン抗体を得ることが
必要である。精子は一般に、卵子と結合する前に光体反
応と呼ばれる反応を起こして内部の内光体膜（以下ＩＡ
Ｍと略す）を露出させる。

このＪＡＭに特異的に存在する抗原を検出できる抗体な
らば、精子の受精能の発現に伴って精子表面と反応し得
ることになる。またその抗原は受精時の精子−卵子相互
認識に関係する可能性が高い。

そこでＩＡＭの露出する割合が高くなるような様々な条
件で精子を処理して免疫に用いた。

（実験方法） ひと精子懸濁液の調製 実験に使用したメディウムは、上口らの方法に従い、０
．３％ひと血清アルブミン（以下ＨＳＡと略す。シグマ
社、Ｆｒ、Ｖ）を添加した変法ピッガース・ホワイトン
・ホワイテインガム培地（以下風−ＢＷＷと略す）を用
いた。

成人男子より用手法にて採取した精液を３７℃、５％Ｃ
Ｏ，含有空気で３０〜６０分間液化さ仕た。

この＆０．５−を小試験管にとり、この上に１−ＢＷＷ
２＠１２を重層した。精液との接触面を増すため、小試
験管を約３０”に傾け、パラフィルムで蓋をして３７℃
、５％ＣＯ１含有空気中で６０分間精子の遊山を待った
。上清をマイクロピペッタ−（ギルソン社、ピペットマ
ンｐ−１０００）で吸い取り、精子を１−ＢＷＷで２回
洗浄した。得られた精子にｔａ−ＢＷＷ（ＨＳＡ濃度３
．５％を１ｍ１２加えて精子懸濁液とした。

得られた精子はＡ２３１８７処理をほどこして受精能獲
得、またはＩＡＭを露出させる処理を行なった。

Ａ２３１８７による処理 Ａ２３１８７により処理を施した精子は光体反応を起こ
す割合が高くなることが電顕的に観察されている。そこ
で上口らの方法に従い、メディウム中に最終１度【Ｏμ
ＭとなるようにＡ２３１８７（シグマ社、遊離酸）を加
え、１０分間反応させた後ｃｍ−ＢＷＷで２回洗浄して
免疫に使用した。

マウスへの免疫 上記処理を施したひと精子をそれぞれ１回当りｌＸｌ０
’個用意し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して免疫を行な
った。免疫は第Ｏ日、第２１日、第２８日行ない、以降
抗体価が上昇するまで２週問おきに免疫を行なった。１
回目はフロイント完全アジュバント、２回目はフロイン
ト不完全アジュバントとエマルジョンを作成してから、
３回目以降はＰＢＳで！！濁したままで投与した。２回
目以降は投与後３日目に眼底採血により血清を採取し抗
体価を間接蛍光抗体法（後述）により測定した。

十分抗体価が上昇したところで最終投与後３日目に牌臓
を摘出し、融合に使用した。

細胞融合とクローニング 融合、クローニングは定法に従った。

得られた牌細胞をポリエチレングリコール４０００（牛
丼特級）存在下でＰ３Ｕ１マウスミエローマ細胞株（藤
沢薬品工業（株））と融合させてハイブリドーマを作成
した。この中からひと精子と反応する抗体を産生ずるも
のをスクリーニングし、陽性株を限界希釈法によりクロ
ーニングして、モノクローン抗体産生株として樹立した
。

」　蛍光抗体法による染色 抗体のスクリーニングや抗体価の測定には間接蛍光抗体
法を用いた。

ｌＸｌ０”精子／−の精子懸濁液５０μｇに対し培養上
清又は抗血清のＰＢＳによる２０倍希釈液５０μＱを加
え、室温で２時間反応させた。ＰＢＳで２回洗浄後、第
２抗体として５％うし新生児血清（以下ＮＢＣＳと略す
）を含むＰＢＳで１２５倍に希釈したＦ［ＴＣＩｌ識や
ぎ抗マウス［ｇ（Ａ＋Ｍ＋ＧＸカッペル社）ｌＯμＱを
加え室温で１時間反応させた。その後ＰＢＳで２回洗浄
し、蛍光顕微鏡で観察した。

抗体産生細胞の増殖（インビボ） 対数増殖期にあるハイブリドーマを集めこれをブリスタ
ン（シグマ社、ｐ−１４０３）を予め（１０〜２０日前
）　０　、５　ｍＱ投与しであるＣ　Ｂ　Ｆ　ｌ（Ｂ　
ａＬｂ／ｃＸｃ５７ＢＬ／６）雄性マウスに、１匹当り
１−２ｘｌＯ’細胞投与する。細胞は約２週間を力１け
て腹水型癌細胞として増殖してくるので、体重が４０ｇ
以上となったところで腹水を採取し、８０℃で凍結した
後液体窒素中に保存した。

実施例２（抗ヒト精子モノクローン抗体の認識する抗原
の存在部位） （１）交叉反応 射出されたヒト精子には精漿中の成分が強く結合してお
り、通常の洗浄だけでは取り除くことができない。これ
らの成分は抗原性が強く、精子を免疫した場合には精漿
に対する抗体が出来てしまう可能性が強い。この発明が
目的とする抗体は精子の受精能獲得に伴う変化を検出で
きるものなので精漿とは反応しないことが望ましい。

（実験方法） ひと精漿の調製 成人男子より得た精液を３７°Ｃ，５％ＣＯ２含有空気
中で３０〜６０分間静置して液化させる。

この精液に−−ＢＷＷ溶液を当量加え、１５００ｘｇで
５分間遠心し精子を取り除く。上清をもう一度遠心して
完全に精子を取り除いたものを精漿として実験に用いた
。

精漿と抗体との反応性の検討 精漿との反応性はＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法）法
を用いて測定した。陽性コントロールとしてはひと精子
をプレート上にゲルタールアルデヒド（和光純薬）で固
定したものを、陰性コントロールとしては■−ＢＷＷ溶
液を用いた。

抗原を含む溶液５０μＱをＥＬ　Ｉ　ＳＡプレート（フ
ァルコン、３９１１）上にのせ、３７℃で一晩放置して
乾燥させ、抗原を吸着させた。０．０５％ツイーン２０
（牛丼−級）を含むトリス緩衝液食塩水（ｐＨ７、４以
下ツイーン−ＴＢＳと略す）で３回洗浄後５％ミルク（
真水スキムミルク）を含むＰＢ８２００μｇをのせ、１
時間室温で放置してブロックを行なった。

ツイーン−ＴＢＳで３回洗浄後、第一抗体として各抗体
腹水１％ＢＳＡ−ＰＢＳでｔ　ｏｏｏ倍希釈したものを
５０μｇ加えて２時間反応させ、洗浄後１％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳで１０００倍希釈したペルオキダーゼ標識やぎ抗マ
ウス１ｇ（Ａ十Ｍ十Ｇ）（カッペル）５０ｕ１２を加え
、室温で２時間反応させた。

洗浄後、基質を用いて発色させた。基質溶液としては、
０−フェニレンジアミン（牛丼−級）ヲ、０１％、Ｈ２
Ｏ，を１．２％含む０．１Ｍ＜えん酸緩衝液（ｐＨ４，
５）を１００μｇプレートに加えて遮光しながら３０分
間反応させた。その後！２．５％ＨｔＳ　Ｏ−５０ｕＱ
で反応を停止させ、４５０ｎｓの吸光度を測定した。

ひと精漿に対してＭＨ６１の抗体は反応性を示さなかっ
た。

（２）人工的な受精能の獲得に伴う精子の抗体との反応
性の変化 抗体によって精子の受精能を測定するためには、抗体が
受精能発現に伴って現れる抗原を認識することが必要で
ある。受精能を獲得した精子であることは、ひと卵子内
にその精子が侵入しない限り完全に証明されないガ（、
グリーンらは、電顕的観察ではあるが、イオノフオアＡ
２３１８７で処理した精子に光体反応を起こしたものが
増大することを報告している。そこで、新鮮な精子とＡ
２３１８７処理した精子との間の反応性に差を見いだす
ことが出来るか否かを検討した。

（実験方法） ひと精子懸濁液の調製 実施例１の方法に従った。Ａ２３１８７をこの懸濁液中
に最終濃度ＩＯμＭとなるように加え１０分間反応させ
た。その後５００　Ｘｇで遠心分離してＡ２３１８７を
除き、５−ＢＷＷで２回洗浄したものをＡ２３１８７精
子とした。

ひと　　との反応　式の検討 間接蛍光抗体法により精子を染色した。この精子を蛍光
顕微鏡で観察し、精子の染色パターンと、その存在割合
を計測した。

（実験結果） 第１表（部位、％） 洗浄　　　　　　　　Ａ２３１１１７処理坑体　ＩＴＩ
ＩＡ　　菖　ＡＴＩＩＴＩＩ　　＾　Ｅ　　ＩＩ　　Ｐ
　　ＴＥＡＴＮＤＥ　　９８２−−−−−　　９０８−
−−−−２Ｍ１１６１　−−３１−−９６　１ｌ−４５
２２−２１−２１３（但し、Ｗは全体、Ｔは地部、頭部
、Ａは光体、Ｅは赤道部、Ｍは中片、Ｐは後城、Ｎは無
染色を示す）ＭＨ６１抗体は、新鮮な精子とはほとんど
反応廿ず、精子をＡ２３１８７で処理した場合に反応を
示した。ＭＨ６１抗体は洗浄精子とはほとんど反応しな
いが、Ａ２３１８７で処理した精子とは高率で反応した
。また、その結合部位はアクロソーム部分や頭部に限局
されていた。このような結果は、マウス精子において報
告されている受精能獲得精子に特異的なＯＢＦ’　ｌ　
３抗原とよく類似していた。もしも、ＭＨ６１により認
識される抗原が、受精に関与する物質であれば、抗体の
添加によって受精は阻害されるはずである。そこで、Ｍ
Ｈ６１抗体の精子機能に及ぼす影響を検討した。

実施例３（各モノクローン抗体の精子機能に及ぼす影響
） （１）精子凝集活性 抗体のあるものは、強い精子凝集活性を持つ、これによ
り多くの精子が架橋されると見かけの精子濃度が低下し
、結果として受精が阻害される。

（実験方法） ひと精子懸濁液の調製 実施例１の方法に従った。

採取した精子は１０μＭのＡ２３１８７と１０分間反応
させ、実験に使用した。

抗体の精子凝集活性の観察 活性をマイクロタイター法により、測定した。

１％ＢＳＡ（シグマ社、Ｆｒ、Ｖ）を含むＰ　Ｂ　Ｓ　
（ＢＳＡ−ＰＩ３Ｓ）で５００倍希釈した抗体腹水を、
血球凝集反応用プレートの小孔でＢＳＡ−ＰＢＳで２倍
連続希釈を行なった。それぞれの抗体希釈液５０μｇに
５０μｇの精子懸濁液（ｔ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’精子／ｌ１ｆ
２）を加えて２倍希釈し、３７℃、５％ＣＯを含有空気
中で１時間反応させた。小孔中の精子について位相差顕
微鏡（Ｘ１６０）で凝集性を観察した。

なお、陰性コントロールとしてＰ３Ｕｌマウスミニロー
ス細胞株の腹水を同様に希釈して用いた。

（実験結果） 抗体の精子凝集活性を第２表に示す。

第２表 希釈率 腹水　　１０００　２０００　４０００　８０００　１
６０００３２０００３ＵＩ ＹＰ　　　　　　　＋＋＋　　　←＋＋　　　＋＋＋　
　　＋＋＋　　　　　　＋＋　　　　　＋十Ｍｌ（６１ 陽性コントロールとして用いた抗ひと精子抗体ＹＰには
強い精子凝集活性が認められたが、陰性コントロールと
して用いたＰ３Ｕ１やＭＨ６１には全く精子凝集活性は
認められなかった。

（２）ハムスターテストにおける精子の融合、結合に及
ぼす抗体の影響 （実験方法） 培養には上口らの方法に従い、３，５％Ｈ９Ａを含むｔ
ａ−ＢＷＷを、精子、卵子の調製にはＨ８Ａ濃度０．３
％のものを用いた。

実験の概略は下記の通りである。

コールデンハムスター　　ひと精子 卵丘細胞除去卵 光体反応精子 融合測定 ひと精子懸濁液の調製 前記の方法に従った。卵子に媒精する前に、３７℃、５
％ＣＯ３含有空気中で１時間の前培養を行なった。

ハムスター卵子の調製 ヤナギマチらの方法に従った。

幼若雌性ゴールデンハムスターに、ＰＭＳ（帝国臓器）
３０　ｉ、ｕ、後注射後４８時間目に、ＨＣＧ（帝国臓
器）を３０　ｉ、ｕ、注射し、その後１７時時間−脱血
致死させた。開腹後輪卵管を取りだし、ｍＢＷＷの入っ
た時計皿上にのせ、実体顕微鏡下（×２０）柄付き針を
用い卵管膨大部を突き破り、卵胞上皮塊中の卵を取りだ
し、１回洗浄した。卵を０．１％ヒアルロニダーゼ（シ
グマ社、タイプｆＳ）で３分間処理して無卵胞上皮とし
、ｔａ−ＢＷＷで３回洗浄した。続いて０．１％トリプ
シン（シグマ社、タイプ■）で２分間処理して無透明帯
とし、−−ＢＷＷで３回洗浄した後実験に供した。

ハムスターテスト １０〜１５６１（７）卵ヲ含ムａ　−ＢＷＷ（ＨＳ　Ａ
　　８度３．５％）溶液中に最終濃度１０００倍希釈と
なるように抗体腹水を加え、これに最終濃度！×ｌＯ”
ｓｐｅｒｍ／−となるように精子を媒精し、溶液量を０
．４ｍ１２とした。４時間後に卵を取りだし、位相差顕
微鏡（ｘ３２０）で観察した゛。゛なお、陰性コントロ
ールとしてＰ３Ｕｌマウスミエローマ細胞株の腹水を用
いた。

（実験結果） 第３表 腹水　　　　実験数　試験　　被侵入部　　　融合指数
　　結合精子（１／１００Ｇ希！ＩＲ）　　　　　　卵
子敢　　（％）（平均侵入精子／卵）敢／卵Ｐ３Ｕｌ　
　　　　　　　６　　　　　４９　　　　　７Ｓ、４ｔ
７．Ｏ１，９１１０，４２１１，４ｔ２．５０＊＊＊　
　　　　　　　０ ＭＨ８１５４１２Ｚ、８±６．Ｏ＋１．２９ｔＱ、１０
　　　　３０６ｔ１２６＊　　　　　　　　　　　　　
ネ＊　　　　　　　　　　　　…対照に対する有意差：
　　ｐ＜０．０５、　ｐ＜ｏ、ｏ＋、　　ｐ＜　Ｏ，Ｇ
Ｏｌひと精子のハムスター卵との結合に関して、ＭＨ６
１は有意な抑制を示した。また、卵への精子の融合も著
しく抑えられ、この抗原が受精に関与するものであるこ
とが判明した。この中でＤＢは新鮮な精子とＡ２３１８
７で処理した精子との間で有為な反応性の違いを認めな
かった。この発明において好適な抗体は精子の受精能を
測定するものなので、受精も有意に制御するだけでなく
新鮮精子とＡ２３１８７処理を行った精子で反応性が変
化するような抗体であることが望ましい。そこで、ＭＨ
６１抗体について、更に詳しく検討した。

実施例４（ひと精子とモノクローン抗体との反応様式） ヤナギマチによってハムスターテストが提唱されて以来
、実際の精子受精能との相関性についての研究がなされ
てきた。タルポットらは位相差電子顕微鏡による観察か
ら、ハムスター弁上のひと精子がすべて光体反応を起こ
した状聾で結合していると報告している。

この事実をらとにハムスター卵子上の精子を間接蛍光抗
体法で染色し、光体反応を起こした精子に対する反応性
を検討した。

（実験方法） ひと精子懸濁液の調製 調製は森らの方法に従った。３７℃、５％ＣＯ８含有空
気中でひと精液を液化させた。５−ＢＷＷで希釈した９
０％、４７％のパーコール（ファルマシア社）を用意し
、小試験管に９０％パーコール２ｍ１２を最下層、次い
で４７％パーコール２−１精液１ａ＋１２の順に重層さ
せた。８００　Ｘｇで３０分間遠心分離を行なうと最下
層に運動性の良好な成熟精子が沈殿するので、これをマ
イクロピペッタ−（ギルソン社、ピペットマンｐ−ｔｏ
ｏｏ）で吸い取り、園−ＢＷＷで１回洗浄後、涌−ＢＷ
Ｗ（Ｉ（ＳＡＡ濃度３５％）ｌ−を加え、３７℃、５％
ＣＯ３含有空気中で４時間の前培養を行ない実験に供し
た。

ハムスター卵子の調製 実施例３の方法に従った。

鷹邊箸光抗体法による染色 ｃｍ　−Ｂ　ＷＷ（Ｉ　Ｓ　Ａ濃度３．５％）０．４ｉ
＆中に１０〜２０個のハムスター卵子を加え、更にひと
精子を最終濃度ｔｘｔｏ＠精子／−となるように媒精を
行なった。

媒精後３時間目にメディウム中に最終濃度１０００倍希
釈となるように抗体の腹水を加え、３７℃、５％ＣＯを
含有空気中で１５分間反応させた。

卵子をａ−ＢＷＷにて１回洗浄した後ＦＩＴＣ標識やぎ
抗マウスＩｇ（Ａ＋Ｍ十Ｇ）溶液１５μＱ中に移し、室
温で１５分間反応させた。ｍ−ＢＷＷ溶液で１回洗浄後
、卵子についた精子を蛍光顕微鏡で観察した。

（実験結果） ＭＨ６１とハムスター卵子上の精子との反応性精子懸濁
液中にはＭＨ６１抗体に対して反応しないものや中片部
が光るものなどが存在しているが、ハムスター卵子上に
結合したものはほとんどすべて頭部全体が染色されるも
のであった。

これは先述のタルポットらの報告とらあわせ考えると、
ＭＨ６１抗体が受精可能精子を特異的にみわけることを
示している。

特許出願人　扶桑薬品工業株式会社

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ひと精子先体（膜を含む）上の抗原性部位に対し
   て特異性を有する抗体。
2. （２）モノクローン抗体である、請求項１記載の抗体。
3. （３）ひと精子先体（膜を含む）上の抗原性部位で免疫
   した哺乳類（ひとを除く）の抗体産生細胞と永久増殖性
   を有する細胞との融合によるハイブリドーマが産生する
   ものである、請求項２記載の抗体。
4. （４）ひと精子先体（膜を含む）上の抗原性部位で免疫
   した哺乳類（ひとを除く）の抗体産生細胞と永久増殖性
   を有する細胞との融合によるハイブリドーマを培養し、
   培養物からひと精子先体（膜を含む）の抗原性部位に対
   して特異性を有する抗体を分離採取することを特徴とす
   る、上記抗体の製法。
5. （５）培養を栄養培地中で行なう、請求項４記載の製法
   。
6. （６）培養を動物組織中で行なう、請求項４記載の製法
   。
7. （７）ひと精子先体（膜を含む）上の抗原性部位に対し
   て特異性を有する抗体であって標識を付したものまたは
   付しないものを含有し、後者の場合にはさらに標識を付
   した第２抗体を含有する、ひと精子の受精能測定用試薬
   。
8. （８）標識が蛍光化合物、酵素または放射性同位元素で
   ある、請求項７記載の試薬。
9. （９）ひと精子先体（膜を含む）上の抗原性部位で免疫
   した哺乳類（ひとを除く）の抗体産生細胞と永久増殖性
   を有する細胞とを融合させてなる、ひと精子先体（膜を
   含む）上の抗原性部位に対して特異性を有する抗体を産
   生するハイブリドーマ。
10. （１０）ひと精子先体（膜を含む）上の抗原性部位で免
    疫した哺乳類（ひとを除く）の抗体産生細胞と永久増殖
    性を有する細胞とを融合させ、融合細胞からひと精子先
    体（膜を含む）上の抗原性部位に対して特異性を有する
    抗体を産生するものを選択することを特徴とする、ハイ
    ブリドーマの取得法。