WO2002045858A2 - Barriere de separation temporaire, recipient la comprenant et procede de mise en oeuvre d'un test dans ce recipient - Google Patents

Barriere de separation temporaire, recipient la comprenant et procede de mise en oeuvre d'un test dans ce recipient Download PDF

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WO2002045858A2
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Christine Betremieux
Jean Alain Chevaleyre
Sandie Menard
Gérard OVLAQUE
Christophe Vinzia
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    • G01N2035/00247—Microvalves
    • G01N2035/00267—Meltable plugs

Definitions

  • Temporary separation barrier, container comprising it and method for setting up a test in this container
  • the invention relates to a barrier for the temporary separation of a reaction vessel, to said reaction vessel as well as to a method for carrying out a test in the reaction vessel.
  • the reaction takes place in the first compartment and the second compartment is arranged to allow the revelation of the possible reaction, in particular by specific bonding of the reaction product with a substance placed in the second compartment.
  • This type of barrier has the function on the one hand of isolating the second compartment from the reaction medium and on the other hand of allowing, under the effect of external forces and at the desired time, the selective passage from the first to the second compartment certain elements of the reaction medium among the analyte, the reagent and the product of their reaction.
  • Such containers are for example intended to allow carrying out biological tests based on the reaction between an analyte present in a biological fluid and a reagent capable of forming a complex with said analyte.
  • This type of test typically applies to research, in blood or in a blood component, of antigens present on the surface of red blood cells using known anti-erythrocyte antibodies (erythrocyte typing) or research anti-erythrocyte antibodies using red blood cells on which specific antigens are present and / or attached.
  • Separation barriers of a physical type are already known, for example formed from a membrane or a sieve of plastic material, which are arranged between a first and a second compartment of a container.
  • This type of barrier has the disadvantage of not being modifiable after the introduction of the reaction medium into the first compartment.
  • this type of embodiment requires providing a particular barrier shape depending on the shape and / or the size of the container.
  • Separation barriers are also known, for example formed from agars, which are temporary.
  • this type of barrier has the drawbacks of poor reliability and of a phase change linked to a change in temperature which may not be desirable for the reaction which has to take place in the container.
  • the invention therefore aims to remedy all of these drawbacks by proposing in particular a separation barrier which can pass, in a simple and reliable manner, from a state impermeable to the reaction medium to a state where it is capable of allowing passage from the first to the second compartment certain elements among the analyte, the reagent or the product of their reaction, and this at the chosen time and without any particular constraint for the reaction which must take place in the container.
  • the invention provides a barrier for the temporary separation of a reaction vessel into at least a first compartment into which a reaction medium comprising an analyte and optionally a reagent is introduced and a second compartment intended receiving at least one of the elements from the reagent, the analyte and the reaction product, said barrier being formed of a material capable of passing, by the action of a specific chemical substance, from a first state in wherein said material is substantially impermeable to the reaction medium in a second state in which said material is capable of allowing at least one of said elements to pass through the reagent, the analyte and the product of the reaction.
  • the invention provides a reaction container comprising a barrier described above, said container being in the form of a micro-well of a micro-titration plate, said micro-well having a shape in U or V
  • the invention provides a method for carrying out a test in a reaction vessel described above, said method comprising the steps providing for:
  • FIG. 1 represents, in section and schematically, a container comprising a temporary separation barrier according to the invention.
  • a reaction vessel for example made of rigid plastic material, which is in the form of a micro-well of a micro-titration plate, said micro-well having a shape U.
  • the container is part of a device comprising eight micro-wells 1 of a micro-titration plate, and has a unit capacity of between 300 and 350 ⁇ l, a diameter of approximately 6 mm and a height about 8 mm.
  • the container 1 can be hermetically sealed with a peelable sheet, for example of special aluminum, so as to avoid possible pollution of its content.
  • the container 1 is divided by a temporary separation barrier 2 into a first compartment 3 into which a reaction medium comprising an analyte and optionally a reagent is introduced and a second compartment 4 intended to receive at least one of the elements from the reagent, the analyte and the product of their reaction.
  • the container 1 can be divided into more than two compartments 3, 4.
  • the container 1 can be divided into three compartments by two separate barriers 2, the first receiving the reaction medium, the second receiving the reaction product and containing a second reagent and the third receiving the reaction product to occur in the second compartment.
  • the container 1 has a U-shape, the opening part forming the first compartment 3 and the base part forming the second compartment 4.
  • the container 1 has in particular the function of allowing a possible reaction between an analyte and a reagent.
  • the barrier 2 is formed from a material, in particular a biological material which, in a first state, is substantially impermeable to the reaction medium so as to isolate the first compartment 3 from the second compartment 4.
  • the biological material in its first state by acting as a physical barrier vis-à-vis the reaction medium, allows the reaction to be carried out in the first compartment 3 without risk of diffusion of the reaction medium in the second compartment 4.
  • the barrier 2 has the function of isolating the second compartment 4, for example to subject the reaction medium to a particular treatment.
  • the container 1 also has the function of allowing the passage of certain elements of the reaction medium into the second compartment 4 in order, for example, to allow them to be brought into contact with a substance 5 such as a reagent or a substance allowing the character to be revealed in situ. positive or negative of the test.
  • the biological material forming barrier 2 is capable of passing, by the action of a specific chemical substance, from the first state to a second state in which said material is capable of allowing at least one of the elements to pass through.
  • reagent, the analyte and the product of their reaction In a first particular example, the biological material in its second state allows the revelation of the test in the first or in the second compartment 3, 4 depending on the elements which it lets through.
  • a substance 5 capable of specifically binding to the reaction product can be placed in the second compartment 4, for example by being fixed on substantially the entire curved internal wall 6 of the base part 7 of the container 1.
  • This embodiment is particularly desirable when the biological material does not allow only the reaction product, but the reaction product and the reagent or the analyte, to allow visualization of the presence of the reaction product by specific fixation. of it on substance 5.
  • the second compartment 4 can be filled with the biological material forming the barrier 2 so that it also serves to protect the substance 5 capable of specifically binding to the reaction product.
  • the container 1 allows the chain reaction to be carried out by providing that a second reagent to react with the product of the reaction is placed in the second compartment 4.
  • a second reagent to react with the product of the reaction is placed in the second compartment 4.
  • provision may be made not to introduce a reagent in the first compartment 3 but for the latter to be disposed in the barrier 2 and / or in the second compartment 4.
  • the biological fluid is introduced into the first compartment 3 and, after a possible treatment, at least the analyte passes through the barrier 2 in its second state in order to be brought into contact with the reagent.
  • This embodiment makes it possible to bring the reagent and the analyte into contact at a given time and optionally with a determined kinetics in the case where the reagent is placed in the barrier 3.
  • the second compartment does not comprise any reagent or specific substance and the biological material in its second state only serves as a filter between the elements of the reaction medium.
  • the barrier also comprises the specific chemical substance capable of passing the material from its first to its second state.
  • radiation can initiate, at the desired moment, the action of the chemical substance on the material so as to cause it to pass from its first to its second state.
  • container 1 for example in V, containers 1 whose surface 6 on which the substance 5 is fixed is of convex shape, or even that the two compartments 3, 4 are not arranged vertically but for example transversely.
  • a container 1 intended to allow the realization and the development of a reaction between an analyte present in a biological fluid, in particular blood or a blood component such as a plasma or a serum, and a reagent.
  • the biological fluid and the reagent include protein elements and / or figurative elements.
  • the purpose of the analysis is to reveal the presence of a particular figurative element in the biological fluid.
  • the reagent which is able to bind specifically with the desired figured element to form a complex with it is then in protein form.
  • a particular example of such an analysis is when the analyte is a red cell carrying a blood group antigen and the reagent comprises a known antibody which is capable of binding to this antigen.
  • This analysis makes it possible in particular to determine the group or the phenotype of the red blood cell.
  • the terms “figured element” and “complex” refer respectively to the cellular elements of the biological fluid or of the reagent and to the complexes formed by specific bonds with these elements.
  • the purpose of the analysis is to reveal the presence of a particular protein element in the biological fluid.
  • the reagent which is able to bind specifically with the desired protein element to form a complex with it is then in figurative form.
  • a particular example of such an analysis is when the reagent comprises red cells carrying a known blood group antigen and the analyte is an antibody to a serum which is capable of binding to this antigen.
  • This analysis makes it possible in particular to determine the presence and the nature of an antibody of the immune type prior to a transfusion.
  • an embodiment of the substance 5 capable of specifically binding this with the complexes possibly formed is for example formed of human anti-immunoglobulin (AGH) antibodies of monoclonal and / or polyclonal origin, optionally supplemented with antibodies directed against determinants of serum proteins of the complement type.
  • AGH human anti-immunoglobulin
  • the biological material is, in its first state, in the form of a solid gel or of dense texture and, in its second state, in the form of a liquid.
  • Biological material using a mixture of sodium alginates, bovine albumin, sodium pyrophosphate and calcium chloride is used.
  • the biological material is introduced into the container 1 in liquid form and then the gelation is obtained after an incubation time greater than one hour.
  • This gelation time allows the fluid to distribute well above the substance 5 with a good surface condition.
  • the gel thus obtained allows the distribution of the reaction medium in the first compartment 3 at speeds of the order of 400 ⁇ l / sec without causing any leakage of reaction medium in the second compartment 4.
  • the transition between the first state and the second is achieved by a phase change of the biological material which is caused by a specific chemical substance.
  • the specific chemical substance capable of depolymerizing the gel described above is an agent complexing divalent ions, for example EDTA or sodium citrate, which causes its liquefaction.
  • the sodium alginates used have the property of forming, in the presence of divalent ions, a dense network (first state of the biological material). This network is however reversible because in the presence of agents complexing divalent ions, there is a rearrangement and / or dissociation of the alginate chains causing a liquefaction of the gel (second state of the biological material).
  • the kinetics of this liquefaction is linked to the concentration of sequestering agent, to the temperature and to possible agitation.
  • the density of the biological material in the second state may be different from the elements having to pass through the barrier 2.
  • the density of the biological material can be between that of the reaction product and that of the reagent so that on the one hand the reagent remains in the first compartment 3 and on the other hand at least the product of the reaction passes into the second compartment 4.
  • the density of the biological material in its second state may have a gradient in a longitudinal direction.
  • Separation can also be obtained by a difference in physico-chemical affinity, for example by a difference in miscibility, between the biological material on the one hand and the product of the reaction or the reagent on the other hand.
  • the biological material in its second state has the function, by its density and / or its composition, of allowing, under the effect of external forces, the passage of at least the product of the reaction in order to allow the test to be carried out in the second compartment 4.
  • this function may also be desirable, in order to avoid that the transfer of the reaction product does not entail, in particular by drainage effect, the reagent in the second compartment 4.
  • barrier 2 may also comprise an active product in the production and / or the development of the reaction between the reagent and the analyte, for example in the form of an enzymatic solution which will be released into the reaction medium when the biological material will pass into its second state.
  • an active product in the production and / or the development of the reaction between the reagent and the analyte, for example in the form of an enzymatic solution which will be released into the reaction medium when the biological material will pass into its second state.
  • a 1.2% (weight / volume) solution of partially hydrolyzed sodium alginates (manuronic acid / guluronic acid ratio between 0.8 and 1) and of 15 mM tetra-sodium pyrophosphate is prepared by dissolving an extract dry commercial alginates and sodium pyrophosphate in LISS buffer (Low lonic Strengh Solution). To ensure perfect dissolution of the product, vigorous stirring is carried out. Any bubbles formed are removed using softer stirring. This solution is stored at 4 ° C. Before use, the solution will be brought to room temperature.
  • a 150 g / l albumin solution is prepared by diluting with a LISS half-buffer a commercial albumin preparation at 300 g / l. This solution is stored at 4 ° C. Before use, the solution will be brought to room temperature.
  • a solution of LISS buffer of calcium chloride at a concentration of 10 mM is used. This solution is stored at 4 ° C. Before use, the solution will be brought to room temperature.
  • a LISS buffer solution of ethylene diamine tetra-acetic tetrasodium salt is prepared at a concentration of 100 mM. The pH of this solution is adjusted to 7. This solution is stored at 4 ° C. Before use, the solution will be brought to room temperature.
  • a volume-to-volume mixture of the alginate and pyrophosphate solution and the albumin solution is carried out. After gentle stirring for a few minutes, to one volume of this solution is added one volume of the calcium chloride solution. This mixture is quickly homogenized and then distributed in micro-wells 1 at the rate of 100 ⁇ l per well before the start of gelation so as to completely cover the layer of AGH 5 (the time of preparation and handling of such a product must not exceed thirty minutes). A minimum one hour incubation provides a translucent and resistant gel.
  • the gelling step takes place slowly enough to allow easy industrialization of the device and the absence of washing allows its implementation easily and possibly fully automated.
  • micro-well 1 is then ready for use and must be stored at 4 ° C.
  • the depolymerization of the gel is obtained by dispensing approximately 50 ⁇ l per well 1 of a solution containing 100 mM of EDTA (other products complexing calcium ions can also be used). Complete liquefaction of the gel is obtained after an incubation of approximately 15 minutes at a temperature of 20 ° C.
  • the preparation and distribution of the barrier 2 of biological material are thus carried out in one step and, the fact of mixing in a precise order and at given concentrations the different constituents of this barrier 2 makes it possible to obtain a homogeneous gel throughout its mass and whose depolymerization is perfectly controllable and takes place simply in the axis of the microwells 1.
  • the passage of the material from its first state to its second state is carried out by introduction of the specific chemical substance into the first compartment 3.
  • the passage of the material from its first state to its second state is carried out by activation of the specific chemical substance, for example by means of radiation.
  • This embodiment is understood as well in the case where the specific chemical substance has been introduced into the first compartment as in the case where said substance is present in the barrier.
  • the method comprises a prior step of placing the biological barrier 2 inside the container 1.
  • the reagent and the specific chemical substance can be introduced simultaneously so that the reactions on the one hand between the analyte and the reagent and on the other hand between the biological material and the chemical substance take place simultaneously.
  • the reaction mixture present in the first compartment 3 can be subjected to conditions favoring the reaction between the analyte and the reagent, for example an incubation so as to increase the speed of the reactions before happen.
  • the external force comprises a centrifugal force whose intensity, direction and duration are adjusted to allow the transfer of the desired elements.
  • the external force comprises, possibly in addition to a centrifugal force, a magnetic force.
  • the magnetic force is created, for example by a permanent magnet or by an electromagnet, in a substantially longitudinal direction relative to the container 1.
  • the elements having to pass through the barrier must be or must be made sufficiently paramagnetic to migrate from the first compartment 3 to the second compartment 4 under the effect of the magnetic force.
  • red cells of which the group and the phenotype are known it is desired, using red cells of which the group and the phenotype are known, to detect and determine the nature of an antibody of the immune type, that is to say developed following immunization during a blood transfusion or pregnancy.
  • the presence of such antibodies can seriously compromise any new transfusion of incompatible blood in the system considered and in the event of pregnancy have serious consequences for the survival of the fetus.
  • This regularly performed analysis is called Irregular Agglutinin Research (RAI).
  • the reagent comprises red cells carrying a known blood group antigen and the analyte is an antibody capable of binding to this antigen.
  • this solution may include the gel depolymerizing agent.
  • the antibodies specifically linked to the red cell surface antigens will interact with the antibodies adsorbed on the internal wall 6 of the container 1.
  • red blood cell carpet in the case of a positive reaction, an image of red blood cell carpet will be formed, the uniformity and dimensions of which will depend on the quantity of antibodies sought. If the reaction is negative, a central point of red blood cells will appear in the bottom 7 of the container 1.
  • the analyte is a red cell carrying a blood group antigen and the reagent can comprise a known antibody which is capable of binding to this antigen.
  • the barrier 2 makes it possible, during an analysis, to carry out a temporary isolation of the reaction medium in the first compartment 3 in order to allow the reaction to be carried out or a treatment of the reaction medium and then, at the desired moment, to selectively pass a part of the elements present in the reaction medium to a second compartment 4 in order to allow the revelation of the positive or negative nature of the analysis or to allow the desired elements to be brought into contact with a reagent placed in the barrier 2 and / or in the second compartment 4.
  • barrier 2 allows
  • the barrier 2 can be used in containers 1 of any shape and in which the current solutions are not satisfactory.

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Abstract

Barrière (2) de séparation temporaire d'un récipient de réaction (1) en au moins un premier compartiment (3) dans lequel un milieu réactionnel comprenant un analyte et éventuellement un réactif est introduit et un deuxième compartiment (4) destiné à recevoir au moins l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction, ladite barrière (2) étant formée d'un matériau apte à passer, par l'action d'une substance chimique spécifique, d'un premier état dans lequel ledit matériau est sensiblement imperméable au milieu réactionnel à un deuxième état dans lequel ledit matériau est susceptible de laisser passer au moins l'un desdits éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction. L'invention concerne également un récipient comprenant une telle barrière et un procédé de mise en oeuvre d'un test dans ce récipient.

Description

Barrière de séparation temporaire, récipient la comprenant et procédé de mise en œuyre d'un test dans ce récipient
L'invention est relative à une barrière de séparation temporaire d'un récipient de réaction, audit récipient de réaction ainsi qu'à un procédé de réalisation d'un test dans le récipient de réaction.
Elle concerne particulièrement des barrières de séparation temporaire de récipients en deux compartiments destinés à recevoir respectivement le milieu réactionnel et certains éléments du milieu réactionnel parmi l'analyte, le réactif et le produit de leur réaction.
Dans un exemple particulier, la réaction se produit dans le premier compartiment et le deuxième compartiment est agencé pour permettre la révélation de l'éventuelle réaction, notamment par liaison spécifique du produit de la réaction avec une substance disposée dans le deuxième compartiment.
Ce type de barrières a pour fonction d'une part d'isoler le deuxième compartiment du milieu réactionnel et d'autre part de permettre, sous l'effet de forces externes et au moment voulu, le passage sélectif depuis le premier vers le deuxième compartiment de certains éléments du milieu réactionnel parmi l'analyte, le réactif et le produit de leur réaction.
De tels récipients sont par exemple destinés à permettre la réalisation de tests biologiques basés sur la réaction entre un analyte présent dans un fluide biologique et un réactif susceptible de former un complexe avec ledit analyte.
Ce type de tests s'applique typiquement à la recherche, dans du sang ou dans un composant sanguin, d'antigènes présents à la surface des globules rouges à l'aide d'anticorps anti-érythrocytaires connus (typage érythrocytaire) ou à la recherche d'anticorps anti-érythrocytaires à l'aide de globules rouges sur lesquels sont présents et/ou fixés des antigènes spécifiques. On connaît déjà des barrières de séparation de type physique, par exemple formées d'une membrane ou d'un tamis en matériau plastique, qui sont disposées entre un premier et un deuxième compartiment d'un récipient.
Ce type de barrières présente l'inconvénient de ne pas être modifiable après l'introduction du milieu réactionnel dans le premier compartiment.
Elles nécessitent donc d'être réalisées de façon très précise pour ne pas permettre la diffusion des éléments indésirables dans le deuxième compartiment tout en permettant la diffusion des éléments souhaités au moment voulu.
Le compromis entre ces deux contraintes antagonistes conduit généralement à une barrière de fiabilité médiocre qui soit laisse passer les éléments indésirables, notamment lors du versement du milieu réactionnel dans le premier compartiment, soit nécessite l'application d'une force extérieure sévère pour permettre le passage des éléments souhaités.
En outre, ce type de réalisation nécessite de prévoir une forme de barrière particulière en fonction de la forme et/ou de la taille du récipient.
On connaît également des barrières de séparation, par exemple formées de géloses, qui sont temporaires.
Mais ce type de barrières présente les inconvénients d'une fiabilité médiocre et d'un changement de phase lié à une modification de température ce qui peut ne pas être souhaitable pour la réaction devant se produire dans le récipient.
L'invention vise donc à remédier à l'ensemble de ces inconvénients en proposant notamment une barrière de séparation qui peut passer, de façon simple et fiable, d'un état imperméable au milieu réactionnel à un état où elle est susceptible de laisser passer depuis le premier vers le deuxième compartiment certains éléments parmi l'analyte, le réactif ou le produit de leur réaction, et ce au moment choisi et sans contrainte particulière pour la réaction devant se produire dans le récipient.
A cet effet, et selon un premier aspect, l'invention propose une barrière de séparation temporaire d'un récipient de réaction en au moins un premier compartiment dans lequel un milieu réactionnel comprenant un analyte et éventuellement un réactif est introduit et un deuxième compartiment destiné à recevoir au moins l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction, ladite barrière étant formée d'un matériau apte à passer, par action d'une substance chimique spécifique, d'un premier état dans lequel ledit matériau est sensiblement imperméable au milieu réactionnel à un deuxième état dans lequel ledit matériau est susceptible de laisser passer au moins l'un desdits éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction.
Selon un deuxième aspect, l'invention propose un récipient de réaction comprenant une barrière décrite ci-dessus, ledit récipient se présentant sous la forme d'un micro-puits d'une plaque de micro-titration, ledit micro-puits ayant une forme en U ou en V
Selon un troisième aspect, l'invention propose un procédé de réalisation d'un test dans un récipient de réaction décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant les étapes prévoyant de :
- introduire le milieu réactionnel dans le premier compartiment ;
- faire passer le matériau formant la barrière depuis son premier vers son deuxième état ;
- appliquer une force extérieure apte à permettre le passage de l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction depuis le premier compartiment vers le deuxième compartiment au travers de la barrière de matériau dans son deuxième état ; - révéler le caractère positif ou négatif du test.
D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit en référence à la figure 1 annexée qui représente, en coupe et de façon schématique, un récipient comprenant une barrière de séparation temporaire selon l'invention.
En relation avec la figure 1 , on décrit un récipient de réaction, par exemple en matériau plastique rigide, qui se présente sous la forme d'un micro-puits d'une plaque de micro-titration, ledit micro-puits ayant une forme en U.
Dans un exemple particulier, le récipient fait partie d'un dispositif comprenant huit micro-puits 1 d'une plaque de micro-titration, et a une contenance unitaire comprise entre 300 et 350 μl, un diamètre d'environ 6 mm et une hauteur d'environ 8 mm.
En outre, et préalablement à son utilisation, le récipient 1 peut être obturé hermétiquement par une feuille pelable, par exemple en aluminium spécial, de sorte à éviter la possible pollution de son contenu.
Le récipient 1 est divisé par une barrière de séparation temporaire 2 en un premier compartiment 3 dans lequel un milieu réactionnel comprenant un analyte et éventuellement un réactif est introduit et un deuxième compartiment 4 destiné à recevoir au moins l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de leur réaction.
En variante non représentée, et en fonction de la nature du test à réaliser, le récipient 1 peut être divisé en plus de deux compartiments 3, 4.
Par exemple, le récipient 1 peut être divisé en trois compartiments par deux barrières 2 distinctes, le premier recevant le milieu réactionnel, le deuxième recevant le produit de leur réaction et contenant un deuxième réactif et le troisième recevant le produit de la réaction devant se produire dans le deuxième compartiment. Dans la réalisation représentée sur la figure 1 , le récipient 1 présente une forme en U, la partie d'ouverture formant premier compartiment 3 et la partie de base formant deuxième compartiment 4.
Le récipient 1 a notamment pour fonction de permettre une éventuelle réaction entre un analyte et un réactif.
A cet effet, la barrière 2 est formée d'un matériau, notamment biologique qui, dans un premier état, est sensiblement imperméable au milieu réactionnel de sorte à isoler le premier compartiment 3 du deuxième compartiment 4.
Ainsi, le matériau biologique dans son premier état, en agissant comme une barrière physique vis-à-vis du milieu réactionnel, permet la réalisation de la réaction dans le premier compartiment 3 sans risque de diffusion du milieu réactionnel dans le deuxième compartiment 4.
Dans le cas où le milieu réactionnel ne contient pas de réactif, la barrière 2 a pour fonction d'isoler le deuxième compartiment 4 par exemple pour faire subir un traitement particulier au milieu réactionnel.
Le récipient 1 a également pour fonction de permettre le passage de certains éléments du milieu réactionnel dans le deuxième compartiment 4 afin par exemple de permettre leur mise en contact avec une substance 5 tel qu'un réactif ou une substance permettant la révélation in situ du caractère positif ou négatif du test.
A cet effet, le matériau biologique formant la barrière 2 est apte à passer, par action d'une substance chimique spécifique, du premier état à un deuxième état dans lequel ledit matériau est susceptible de laisser passer au moins l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de leur réaction. Dans un premier exemple particulier, le matériau biologique dans son deuxième état permet la révélation du test dans le premier ou dans le deuxième compartiment 3, 4 en fonction des éléments qu'il laisse passer.
Dans le cas où il laisse passer le réactif et l'analyte, la révélation se fera dans le premier compartiment 3 par visualisation de l'éventuelle présence du produit de la réaction.
Dans le cas où il laisse passer au moins le produit de la réaction, la révélation se fera dans le deuxième compartiment 4 par visualisation de l'éventuelle présence du produit de la réaction.
Dans ce dernier cas, une substance 5 apte à se lier spécifiquement au produit de la réaction peut être disposée dans le deuxième compartiment 4, par exemple en étant fixée sur sensiblement toute la paroi interne incurvée 6 de la partie de base 7 du récipient 1.
Cette réalisation est particulièrement souhaitable lorsque le matériau biologique ne laisse pas passer que le produit de la réaction, mais le produit de la réaction et le réactif ou l'analyte, afin de permettre la visualisation de la présence du produit de la réaction par fixation spécifique de celui-ci sur la substance 5.
En variante, le deuxième compartiment 4 peut être rempli du matériau biologique formant la barrière 2 de sorte que celui-ci serve également à la protection de la substance 5 apte à se lier spécifiquement au produit de la réaction.
Dans un deuxième exemple particulier, le récipient 1 permet la réalisation de réaction en chaîne en prévoyant qu'un deuxième réactif devant réagir avec le produit de la réaction soit disposé dans le deuxième compartiment 4. En variante de cet exemple, on peut prévoir de ne pas introduire de réactif dans le premier compartiment 3 mais que celui-ci soit disposé dans la barrière 2 et/ou dans le deuxième compartiment 4.
Ainsi, on introduit seulement le fluide biologique dans le premier compartiment 3 et, après un éventuel traitement, au moins l'analyte passe à travers la barrière 2 dans son deuxième état afin d'être mis en contact avec le réactif.
Cette réalisation permet de mettre en contact le réactif et l'analyte à un moment donné et éventuellement avec une cinétique déterminée dans le cas où le réactif est disposé dans la barrière 3.
Dans un troisième exemple particulier, le deuxième compartiment ne comprend ni réactif ni substance spécifique et le matériau biologique dans son deuxième état sert uniquement de filtre entre les éléments du milieu réactionnel.
Selon une réalisation, la barrière comprend en outre la substance chimique spécifique apte à faire passer le matériau depuis son premier vers son deuxième état.
Dans cette réalisation, un rayonnement peut initier, au moment souhaité, l'action de la substance chimique sur le matériau de sorte à le faire passer depuis son premier vers son deuxième état.
Dans d'autres modes de réalisation non représentés, on peut envisager d'autres formes de récipient 1 , par exemple en V, des récipients 1 dont la surface 6 sur laquelle est fixée la substance 5 est de forme convexe, ou encore que les deux compartiments 3, 4 ne soient pas disposés verticalement mais par exemple transversalement.
On décrit ci-dessous un mode de réalisation d'un récipient 1 destiné à permettre la réalisation et la révélation d'une réaction entre un analyte présent dans un fluide biologique, notamment du sang ou un composant du sang tel qu'un plasma ou un sérum, et un réactif.
Dans ce type de réaction, le fluide biologique et le réactif comprennent des éléments protéiques et/ou des éléments figurés.
Suivant une première utilisation, l'analyse a pour but de révéler la présence d'un élément figuré particulier dans le fluide biologique. Le réactif qui est apte à se lier spécifiquement avec l'élément figuré recherché pour former un complexe avec lui est alors sous forme protéique.
Un exemple particulier d'une telle analyse est lorsque l'analyte est une hématie portant un antigène de groupe sanguin et le réactif comprend un anticorps connu qui est susceptible de se lier à cet antigène. Cette analyse permet notamment de déterminer le groupe ou le phénotype de l'hématie.
Dans la description les termes « élément figuré » et « complexe » font respectivement références aux éléments cellulaires du fluide biologique ou du réactif et aux complexes formés par liaisons spécifiques avec ces éléments.
Suivant une deuxième utilisation, l'analyse a pour but de révéler la présence d'un élément protéique particulier dans le fluide biologique. Le réactif qui est apte à se lier spécifiquement avec l'élément protéique recherché pour former un complexe avec lui est alors sous forme figuré.
Un exemple particulier d'une telle analyse est lorsque le réactif comprend des hématies portant un antigène de groupe sanguin connu et l'analyte est un anticorps d'un sérum qui est susceptible de se lier à cet antigène. Cette analyse permet notamment de déterminer la présence et la nature d'un anticorps de type immun préalablement à une transfusion.
Dans le cadre de ces deux exemples particuliers, une réalisation de la substance 5 apte à ce lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés est par exemple formée d'anticorps anti-immunoglobulines humaines (AGH) d'origine monoclonale et/ou polyclonale, éventuellement additionnée d'anticorps dirigés contre des déterminants de protéines sériques de type complément.
Ainsi, dans le cas d'une réaction positive, on observera un tapis de complexes recouvrant la surface réactive 8 et, dans le cas contraire, on observera un point de négativité dans le fond 7 du deuxième compartiment 4.
On décrit ci-dessous un exemple de réalisation du matériau biologique formant la barrière 2 de séparation temporaire.
Dans cet exemple, le matériau biologique se présente, dans son premier état, sous la forme d'un gel solide ou de texture dense et, dans son deuxième état, sous la forme d'un liquide.
On utilise un matériau biologique formé d'un mélange d'alginates de sodium, d'albumine bovine, de pyrophosphate de sodium et de chlorure de calcium.
Les interactions entre ces différents composés ne sont pas complètement connues, mais on peut toutefois avancer que les chaînes d'alginates interagissent par l'intermédiaire de leurs zones hydrophobes avec les molécules d'albumine et par l'intermédiaire de leurs zones d'acide guluronique avec les ions calcium. Le pyrophosphate de sodium permet quant à lui de maîtriser la réaction de polymérisation entre le calcium et l'alginate qui, sans lui, serait trop rapide pour fabriquer un gel avec une réticulation homogène.
Le matériau biologique est introduit dans le récipient 1 sous forme liquide puis la gélification est obtenue après un temps d'incubation supérieur à une heure.
Ce temps de gélification permet au fluide de bien se répartir au-dessus de la substance 5 avec un bon état de surface. Le gel ainsi obtenu permet la distribution du milieu réactionnel dans le premier compartiment 3 à des vitesses de l'ordre de 400 μl/sec sans provoquer de fuite de milieu réactionnel dans le deuxième compartiment 4.
Le passage entre le premier état et le deuxième est réalisé par un changement de phase du matériau biologique qui est provoqué par une substance chimique spécifique.
La substance chimique spécifique apte à dépolymériser le gel décrit ci-dessus est un agent complexant les ions divalents, par exemple l'EDTA ou le citrate de sodium, qui provoque sa liquéfaction.
En effet, les alginates de sodium utilisés ont la propriété de former, en présence d'ions divalents, un réseau dense (premier état du matériau biologique). Ce réseau est cependant réversible car en présence d'agents complexant les ions divalents, on constate un réarrangement et/ou une dissociation des chaînes d'alginates provoquant une liquéfaction du gel (deuxième état du matériau biologique).
La cinétique de cette liquéfaction est liée à la concentration en agent séquestrant, à la température et à une éventuelle agitation.
A partir du moment où la liquéfaction du gel est totale, plus rien ne s'oppose alors au transfert d'au moins le produit de la réaction depuis le premier compartiment 3 vers le deuxième compartiment 4.
Ce transfert peut se dérouler sous l'action de trois forces, utilisées en combinaison ou séparément :
- la gravité, par décantation naturelle du produit de la réaction ;
- les forces centrifuges adaptées ;
- les forces magnétiques dans le cas où au moins le produit de la réaction présente des propriétés paramagnétiques. Dans le cas où le transfert se fait sous l'action de la gravité et/ou d'une force centrifuge, la densité du matériau biologique dans le deuxième état peut être différente des éléments ayant à passer au travers de la barrière 2. Par exemple, la densité du matériau biologique peut être comprise entre celle du produit de la réaction et celle du réactif pour que d'une part le réactif reste dans le premier compartiment 3 et d'autre part au moins le produit de la réaction passe dans le deuxième compartiment 4.
En variante, la densité du matériau biologique dans son deuxième état peut présenter un gradient suivant une direction longitudinale.
La séparation peut être également obtenue par une différence d'affinité physico-chimique, par exemple par une différence de miscibilité, entre le matériau biologique d'une part et le produit de la réaction ou le réactif d'autre part.
Dans toutes ces réalisations, le matériau biologique dans son deuxième état a pour fonction, de par sa densité et/ou sa composition, de permettre, sous l'effet de forces externes, le passage d'au moins le produit de la réaction afin de permettre la réalisation du test dans le deuxième compartiment 4.
Dans le cas d'un transfert à l'aide d'une force magnétique, cette fonction peut également être souhaitable, afin d'éviter que le transfert du produit de la réaction n'entraîne, notamment par effet de drainage, le réactif dans le deuxième compartiment 4.
En variante, la barrière 2 peut comprendre en outre un produit actif dans la réalisation et/ou la révélation de la réaction entre le réactif et l'analyte, par exemple sous la forme d'une solution enzymatique qui sera relarguée dans le milieu réactionnel lorsque le matériau biologique passera dans son deuxième état. On décrit ci-dessous la préparation de la barrière biologique 8 présentée ci- dessus.
Préparation des différentes solutions
- Solution d'alginates et de pyrophosphate tétra-sodique
Une solution à 1 ,2 % (poids/volume) d'alginates de sodium partiellement hydrolyses (rapport acide manuronique / acide guluronique compris entre 0,8 et 1) et de pyrophosphate tétra-sodique 15 mM est préparée par dissolution d'un extrait sec d'alginates commercial et de pyrophosphate de sodium dans un tampon de LISS (Low lonic Strengh Solution). Afin d'assurer une parfaite dissolution du produit, une agitation vigoureuse est réalisée. Les éventuelles bulles formées sont éliminées à l'aide d'une agitation plus douce. Cette solution est conservée à 4°C. Avant utilisation, la solution sera ramenée à température ambiante.
- Solution d'albumine
Une solution d'albumine à 150 g/l est préparée par dilution au demi-tampon LISS d'une préparation commerciale d'albumine à 300 g/l. Cette solution est conservée à 4°C. Avant utilisation, la solution sera ramenée à température ambiante.
- Solution de chlorure de calcium
Une solution en tampon LISS de chlorure de calcium à une concentration de 10 mM est utilisée. Cette solution est conservée à 4°C. Avant utilisation, la solution sera ramenée à température ambiante.
Solution d'EDTA tétra-sodique 4
Une solution en tampon LISS de sel d'éthylène diamine tétra-acétique tétra- sodique est préparée à une concentration de 100 mM. Le pH de cette solution est ajusté à 7. Cette solution est conservée à 4°C. Avant utilisation, la solution sera ramenée à température ambiante.
Préparation du gel
Le mélange extemporané avant utilisation est réalisé suivant un ordre précis.
Dans un premier temps, un mélange volume à volume de la solution d'alginates et de pyrophosphate et de la solution d'albumine est réalisée. Après une agitation douce pendant quelques minutes, à un volume de cette solution est ajouté un volume de la solution de chlorure de calcium. Ce mélange est homogénéisé rapidement puis réparti dans les micro-puits 1 à raison de 100 μl par puits avant le début de la gélification de sorte à recouvrir totalement la couche d'AGH 5 (le temps de préparation et de manutention d'un tel produit ne doit pas excéder trente minutes). Une incubation d'une heure minimum permet d'obtenir un gel translucide et résistant.
De plus, l'étape de gélification se déroule suffisamment lentement pour permettre une industrialisation facile du dispositif et l'absence de lavage permet sa mise en œuvre de façon aisée et éventuellement entièrement automatisée.
Le micro-puits 1 est alors prêt à l'emploi et doit être conservé à 4°C.
Dépolymérisation du gel
La dépolymérisation du gel est obtenue en distribuant environ 50 μl par puits 1 d'une solution contenant 100 mM d'EDTA (d'autres produits complexant les ions calcium peuvent être également utilisés). La liquéfaction complète du gel est obtenue après une incubation d'environ 15 minutes à une température de 20°C. La préparation et la répartition de la barrière 2 de matériau biologique sont ainsi réalisées en une étape et, le fait de mélanger suivant un ordre précis et à des concentrations données les différents constituants de cette barrière 2 permet d'obtenir un gel homogène dans toute sa masse et dont la dépolymérisation est parfaitement contrôlable et a lieu simplement dans l'axe des micro-puits 1.
On décrit ci-dessous les étapes du procédé de réalisation d'un test dans le récipient de réaction 1 décrit ci-dessus qui comprend les étapes prévoyant de :
- introduire le milieu réactionnel dans le premier compartiment 3 ;
- faire passer le matériau depuis son premier état vers son deuxième état ;
- appliquer une force extérieure apte à permettre le passage de l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction depuis le premier compartiment 3 vers le deuxième compartiment 4 au travers de la barrière 2 de matériau dans son deuxième état ;
- révéler le caractère positif ou négatif du test.
Selon une première réalisation, le passage du matériau depuis son premier état vers son deuxième état est réalisé par introduction de la substance chimique spécifique dans le premier compartiment 3.
Selon une deuxième réalisation, le passage du matériau depuis son premier état vers son deuxième état est réalisé par activation de la substance chimique spécifique, par exemple par l'intermédiaire d'un rayonnement.
Cette réalisation s'entend aussi bien du cas où la substance chimique spécifique a été introduite dans le premier compartiment que du cas où ladite substance est présente dans la barrière.
En variante, le procédé comprend une étape préalable de disposition de la barrière biologique 2 à l'intérieur du récipient 1. Dans un exemple de réalisation, le réactif et la substance chimique spécifique peuvent être introduits simultanément de sorte que les réactions d'une part entre l'analyte et le réactif et d'autre part entre le matériau biologique et la substance chimique se déroulent simultanément.
Préalablement à l'application de la force extérieure, le mélange réactionnel présent dans le premier compartiment 3 peut être soumis à des conditions favorisant la réaction entre l'analyte et le réactif, par exemple à une incubation de sorte à augmenter la vitesse des réactions devant se produire.
Dans un premier mode de réalisation, la force extérieure comprend une force centrifuge dont l'intensité, la direction et la durée sont ajustées pour permettre le transfert des éléments souhaités.
Dans un deuxième mode de réalisation, la force extérieure comprend, éventuellement en plus d'une force centrifuge, une force magnétique.
La force magnétique est créée, par exemple par un aimant permanent ou par un électro-aimant, dans une direction sensiblement longitudinale par rapport au récipient 1.
A cet effet, les éléments devant passer à travers la barrière doivent être ou doivent être rendus suffisamment paramagnétiques pour migrer depuis le premier compartiment 3 vers le deuxième compartiment 4 sous l'effet de la force magnétique.
On décrit ci-dessous, un premier et un deuxième exemple d'analyse réalisée avec ce procédé.
Dans le premier exemple, on souhaite, à l'aide d'hématies dont le groupe et le phénotype sont connus, détecter et déterminer la nature d'un anticorps de type immun, c'est-à-dire développé à la suite d'une immunisation au cours d'une transfusion sanguine ou d'une grossesse. La présence de tels anticorps peut compromettre gravement toute nouvelle transfusion de sang non compatible dans le système considéré et dans le cas d'une grossesse avoir des conséquences graves pour la survie du fœtus. Cette analyse régulièrement pratiquée est appelée Recherche d'Agglutinines Irrégulières (RAI).
Pour la mise en œuvre de ce type d'analyse, le réactif comprend des hématies portant un antigène de groupe sanguin connu et l'analyte est un anticorps susceptible de se lier à cet antigène.
L'opérateur dépose alors dans le premier compartiment 3 un volume de sérum ou de milieu biologique à étudier (environ 25 μl) et deux volumes de solution d'hématies indicatrices, par exemple préalablement traitées avec des particules paramagnétiques. En variante, cette solution peut comprendre l'agent dépolymérisant le gel.
L'opérateur dépose alors la micro-plaque ou la barrette sur une forme adaptée permettant si besoin est une incubation à 37°C puis l'ensemble est soumis à un champ magnétique et/ou à une force centrifuge.
Arrivés au contact avec la couche d'AGH 5, les anticorps liés spécifiquement aux antigènes de surface des hématies vont interagir avec les anticorps adsorbés sur la paroi interne 6 du récipient 1.
Ainsi, dans le cas d'une réaction positive se formera une image de tapis d'hématies dont l'homogénéité et les dimensions seront fonction de la quantité d'anticorps recherchés. Si la réaction est négative, un point central d'hématies apparaîtra dans le fond 7 du récipient 1.
Dans le deuxième exemple, on souhaite déterminer le groupe et le phénotype de l'hématie, et dans ce cas on utilise des sondes spécifiques (anticorps monoclonaux ou polyclonaux, lectines végétales) de certains déterminants des groupes sanguins. A cet effet, l'analyte est une hématie portant un antigène de groupe sanguin et le réactif peut comprendre un anticorps connu qui est susceptible de se lier à cet antigène.
La mise en œuvre de l'analyse est alors identique à celle présentée précédemment à la différence que, dans le cas de l'utilisation d'une force magnétique, ce sont les hématies à analyser qui peuvent être traitées de sorte à augmenter leur susceptibilité magnétique.
La barrière 2 permet, au cours d'une analyse, de réaliser un isolement momentané du milieu réactionnel dans le premier compartiment 3 afin de permettre la réalisation de la réaction ou un traitement du milieu réactionnel puis, au moment souhaité, de faire passer sélectivement une partie des éléments présents dans le milieu réactionnel vers un deuxième compartiment 4 afin de permettre la révélation du caractère positif ou négatif de l'analyse ou de permettre la mise en contact des éléments souhaités avec un réactif disposé dans la barrière 2 et/ou dans le deuxième compartiment 4.
En outre la barrière 2 permet
- une analyse séquentielle ou une séquence de distribution du milieu réactionnel qui précède une mise en contact du produit de la réaction avec une substance ;
- la protection d'une zone réactive du deuxième compartiment 4 qui contient une substance fragile ou excessivement réactive et devant être protégée en début d'analyse ;
- d'éviter une éventuelle contamination d'une zone réactive du deuxième compartiment 4 par le milieu réactionnel.
De part sa fluidité lors de sa mise en œuvre dans le récipient 1 , la barrière 2 peut être utilisée dans des récipients 1 de toute forme et dans lesquels les solutions actuelles ne sont pas satisfaisantes.

Claims

REVENDICATIONS
1. Barrière (2) de séparation temporaire d'un récipient de réaction (1 ) en au moins un premier compartiment (3) dans lequel un milieu réactionnel comprenant un analyte et éventuellement un réactif est introduit et un deuxième compartiment (4) destiné à recevoir au moins l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction, ladite barrière (2) étant caractérisée en ce qu'elle est formée d'un matériau apte à passer, par l'action d'une substance chimique spécifique, d'un premier état dans lequel ledit matériau est sensiblement imperméable au milieu réactionnel à un deuxième état dans lequel ledit matériau est susceptible de laisser passer certains desdits éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction.
2. Barrière selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le matériau se présente, dans son premier état, sous la forme d'un gel solide et, dans son deuxième état, sous la forme d'un liquide.
3. Barrière selon la revendication 2, caractérisée en ce que le matériau est de nature biologique formé d'un mélange d'alginates de sodium, d'albumine bovine, de pyrophosphate de sodium et de chlorure de calcium de sorte à former un gel avec une réticulation homogène, la substance chimique spécifique étant un agent complexant les ions divalents, par exemple l'EDTA, apte à liquéfier ledit gel.
4. Barrière selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la densité du matériau dans le deuxième état est différente de celle des éléments ayant à passer à travers la barrière (2).
5. Barrière selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un produit actif dans la réalisation et/ou la révélation de la réaction entre le réactif et l'analyte.
6. Barrière selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'elle comprend en outre la substance chimique spécifique.
7. Récipient de réaction (1 ) comprenant une barrière (2) selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un micro-puits d'une plaque de micro-titration, ledit micro-puits ayant une forme en U ou en V.
8. Récipient selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'une substance (5) apte à se lier spécifiquement au produit de la réaction est disposée dans le deuxième compartiment (4).
9. Récipient selon la revendication 8, caractérisé en ce que le deuxième compartiment (4) est rempli du matériau formant la barrière (2) de sorte que celui-ci serve également à la protection de la substance (5) apte à se lier spécifiquement au produit de la réaction.
10. Récipient selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le deuxième compartiment (4) comprend un réactif.
11. Procédé de réalisation d'un test dans un récipient de réaction (1 ) selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes prévoyant de :
- introduire le milieu réactionnel dans le premier compartiment (3) ; - faire passer le matériau formant la barrière (2) depuis son premier vers son deuxième état ;
- appliquer une force extérieure apte à permettre le passage de l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction depuis le premier compartiment (3) vers le deuxième compartiment (4) au travers de la barrière (2) de matériau dans son deuxième état ;
- révéler le caractère positif ou négatif du test.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que le passage du matériau depuis son premier état vers son deuxième état est réalisé par introduction de la substance chimique spécifique dans le premier compartiment (3).
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que le passage du matériau depuis son premier état vers son deuxième état est réalisé par activation de la substance chimique spécifique, par exemple par l'intermédiaire d'un rayonnement.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que l'éventuelle réaction entre le réactif et l'analyte se produit dans le premier compartiment (3) et la révélation de l'éventuelle réaction est réalisée dans le deuxième compartiment (4), le matériau dans son deuxième état étant alors apte à laisser passer au moins le produit de la réaction.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable de disposition de la barrière biologique (2) à l'intérieur du récipient (1 ).
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que le réactif comprend des hématies portant un antigène de groupe sanguin cpnnu et l'analyte est un anticorps susceptible de se lier à cet antigène, le procédé permettant notamment de déterminer la présence et la nature d'un anticorps de type immun préalablement à une transfusion.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que l'analyte est une hématie portant un antigène de groupe sanguin et le réactif comprend un anticorps connu qui est susceptible de se lier à cet antigène, le procédé permettant notamment de déterminer le groupe ou le phénotype de l'hématie.
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