FR2817961A1 - Barriere de separation temporaire, recipient la comprenant et procede de mise en oeuvre d'un test dans ce recipient - Google Patents

Abstract

Barrière (2) de séparation temporaire d'un récipient de réaction (1) en au moins un premier compartiment (3) dans lequel un milieu réactionnel comprenant un analyte et éventuellement un réactif est introduit et un deuxième compartiment (4) destiné à recevoir au moins l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction, ladite barrière (2) étant formée d'un matériau apte à passer, par l'action d'une substance chimique spécifique, d'un premier état dans lequel ledit matériau est sensiblement imperméable au milieu réactionnel à un deuxième état dans lequel ledit matériau est susceptible de laisser passer au moins l'un desdits éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction. L'invention conceme également un récipient comprenant une telle barrière et un procédé de mise en oeuvre d'un test dans ce récipient.

Description

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L'invention est relative à une barrière de séparation temporaire d'un récipient de réaction, audit récipient de réaction ainsi qu'à un procédé de réalisation d'un test dans le récipient de réaction.

Elle concerne particulièrement des barrières de séparation temporaire de récipients en deux compartiments destinés à recevoir respectivement le milieu réactionnel et certains éléments du milieu réactionnel parmi l'analyte, le réactif et le produit de leur réaction.

Dans un exemple particulier, la réaction se produit dans le premier compartiment et le deuxième compartiment est agencé pour permettre la révélation de l'éventuelle réaction, notamment par liaison spécifique du produit de la réaction avec une substance disposée dans le deuxième compartiment.

Ce type de barrières a pour fonction d'une part d'isoler le deuxième compartiment du milieu réactionnel et d'autre part de permettre, sous l'effet de forces externes et au moment voulu, le passage sélectif depuis le premier vers le deuxième compartiment de certains éléments du milieu réactionnel parmi l'analyte, le réactif et le produit de leur réaction.

De tels récipients sont par exemple destinés à permettre la réalisation de tests biologiques basés sur la réaction entre un analyte présent dans un fluide biologique et un réactif susceptible de former un complexe avec ledit analyte.

Ce type de tests s'applique typiquement à la recherche, dans du sang ou dans un composant sanguin, d'antigènes présents à la surface des globules rouges à l'aide d'anticorps anti-érythrocytaires connus (typage érythrocytaire) ou à la recherche d'anticorps anti-érythrocytaires à l'aide de globules rouges sur lesquels sont présents et/ou fixés des antigènes spécifiques.

On connaît déjà des barrières de séparation de type physique, par exemple formées d'une membrane ou d'un tamis en matériau plastique, qui sont disposées entre un premier et un deuxième compartiment d'un récipient.

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Ce type de barrières présente l'inconvénient de ne pas être modifiable après l'introduction du milieu réactionnel dans le premier compartiment. Elles nécessitent donc d'être réalisées de façon très précise pour ne pas permettre la diffusion des éléments indésirables dans le deuxième compartiment tout en permettant la diffusion des éléments souhaités au moment voulu.

Le compromis entre ces deux contraintes antagonistes conduit généralement à une barrière de fiabilité médiocre qui soit laisse passer les éléments indésirables, notamment lors du versement du milieu réactionnel dans le premier compartiment, soit nécessite l'application d'une force extérieure sévère pour permettre le passage des éléments souhaités.

En outre, ce type de réalisation nécessite de prévoir une forme de barrière particulière en fonction de la forme et/ou de la taille du récipient.

On connaît également des barrières de séparation, par exemple formées de géloses, qui sont temporaires.

Mais ce type de barrières présente les inconvénients d'une fiabilité médiocre et d'un changement de phase lié à une modification de température ce qui peut ne pas être souhaitable pour la réaction devant se produire dans le récipient.

L'invention vise donc à remédier à l'ensemble de ces inconvénients en proposant notamment une barrière de séparation qui peut passer, de façon simple et fiable, d'un état imperméable au milieu réactionnel à un état où elle est susceptible de laisser passer depuis le premier vers le deuxième compartiment certains éléments parmi l'analyte, le réactif ou le produit de leur réaction, et ce au moment choisi et sans contrainte particulière pour la réaction devant se produire dans le récipient.

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A cet effet, et selon un premier aspect, l'invention propose une barrière de séparation temporaire d'un récipient de réaction en au moins un premier compartiment dans lequel un milieu réactionnel comprenant un analyte et éventuellement un réactif est introduit et un deuxième compartiment destiné à recevoir au moins l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction, ladite barrière étant formée d'un matériau apte à passer, par action d'une substance chimique spécifique, d'un premier état dans lequel ledit matériau est sensiblement imperméable au milieu réactionnel à un deuxième état dans lequel ledit matériau est susceptible de laisser passer au moins l'un desdits éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction.

Selon un deuxième aspect, l'invention propose un récipient de réaction comprenant une barrière décrite ci-dessus, ledit récipient se présentant sous la forme d'un micro-puits d'une plaque de micro-titration, ledit micro-puits ayant une forme en U ou en V Selon un troisième aspect, l'invention propose un procédé de réalisation d'un test dans un récipient de réaction décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant les étapes prévoyant de : - introduire le milieu réactionnel dans le premier compartiment ; - faire passer le matériau formant la barrière depuis son premier vers son deuxième état ; - appfiquer une force extérieure apte à permettre le passage de l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction depuis le premier compartiment vers le deuxième compartiment au travers de la barrière de matériau dans son deuxième état ; - révéler le caractère positif ou négatif du test.

D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit en référence à la figure 1 annexée qui représente, en coupe et de façon schématique, un récipient comprenant une barrière de séparation temporaire selon l'invention.

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En relation avec la figure 1, on décrit un récipient de réaction, par exemple en matériau plastique rigide, qui se présente sous la forme d'un micro-puits d'une plaque de micro-titration, ledit micro-puits ayant une forme en U. Dans un exemple particulier, le récipient fait partie d'un dispositif comprenant

huit micro-puits 1 d'une plaque de micro-titration, et a une contenance unitaire comprise entre 300 et 350 gel, un diamètre d'environ 6 mm et une hauteur d'environ 8 mm.

En outre, et préalablement à son utilisation, le récipient 1 peut être obturé hermétiquement par une feuille pelable, par exemple en aluminium spécial, de sorte à éviter la possible pollution de son contenu.

Le récipient 1 est divisé par une barrière de séparation temporaire 2 en un premier compartiment 3 dans lequel un milieu réactionnel comprenant un analyte et éventuellement un réactif est introduit et un deuxième compartiment 4 destiné à recevoir au moins l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de leur réaction.

En variante non représentée, et en fonction de la nature du test à réaliser, le récipient 1 peut être divisé en plus de deux compartiments 3,4.

Par exemple, le récipient 1 peut être divisé en trois compartiments par deux barrières 2 distinctes, le premier recevant le milieu réactionnel, le deuxième recevant le produit de leur réaction et contenant un deuxième réactif et le troisième recevant le produit de la réaction devant se produire dans le deuxième compartiment.

Dans la réalisation représentée sur la figure 1, le récipient 1 présente une forme en U, la partie d'ouverture formant premier compartiment 3 et la partie de base formant deuxième compartiment 4.

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Le récipient 1 a notamment pour fonction de permettre une éventuelle réaction entre un analyte et un réactif.

A cet effet, la barrière 2 est formée d'un matériau, notamment biologique qui, dans un premier état, est sensiblement imperméable au milieu réactionnel de sorte à isoler le premier compartiment 3 du deuxième compartiment 4.

Ainsi, le matériau biologique dans son premier état, en agissant comme une barrière physique vis-à-vis du milieu réactionnel, permet la réalisation de la réaction dans le premier compartiment 3 sans risque de diffusion du milieu réactionnel dans le deuxième compartiment 4.

Dans le cas où le milieu réactionnel ne contient pas de réactif, la barrière 2 a pour fonction d'isoler le deuxième compartiment 4 par exemple pour faire subir un traitement particulier au milieu réactionnel.

Le récipient 1 a également pour fonction de permettre le passage de certains éléments du milieu réactionnel dans le deuxième compartiment 4 afin par exemple de permettre leur mise en contact avec une substance 5 tel qu'un réactif ou une substance permettant la révélation in situ du caractère positif ou négatif du test.

A cet effet, le matériau biologique formant la barrière 2 est apte à passer, par action d'une substance chimique spécifique, du premier état à un deuxième état dans lequel ledit matériau est susceptible de laisser passer au moins l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de leur réaction.

Dans un premier exemple particulier, le matériau biologique dans son deuxième état permet la révélation du test dans le premier ou dans le deuxième compartiment 3,4 en fonction des éléments qu'il laisse passer.

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Dans le cas où il laisse passer le réactif et l'analyte, la révélation se fera dans le premier compartiment 3 par visualisation de l'éventuelle présence du produit de la réaction.

Dans le cas où il laisse passer au moins le produit de la réaction, la révélation se fera dans le deuxième compartiment 4 par visualisation de l'éventuelle présence du produit de la réaction.

Dans ce dernier cas, une substance 5 apte à se lier spécifiquement au produit de la réaction peut être disposée dans le deuxième compartiment 4, par exemple en étant fixée sur sensiblement toute la paroi interne incurvée 6 de la partie de base 7 du récipient 1.

Cette réalisation est particulièrement souhaitable lorsque le matériau biologique ne laisse pas passer que le produit de la réaction, mais le produit de la réaction et le réactif ou l'analyte, afin de permettre la visualisation de la présence du produit de la réaction par fixation spécifique de celui-ci sur la substance 5.

En variante, le deuxième compartiment 4 peut être rempli du matériau biologique formant la barrière 2 de sorte que celui-ci serve également à la protection de la substance 5 apte à se lier spécifiquement au produit, de la réaction.

Dans un deuxième exemple particulier, le récipient 1 permet la réalisation de réaction en chaîne en prévoyant qu'un deuxième réactif devant réagir avec le produit de la réaction soit disposé dans le deuxième compartiment 4.

En variante de cet exemple, on peut prévoir de ne pas introduire de réactif dans le premier compartiment 3 mais que celui-ci soit disposé dans la barrière 2 et/ou dans le deuxième compartiment 4.

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Ainsi, on introduit seulement le fluide biologique dans le premier compartiment 3 et, après un éventuel traitement, au moins l'analyte passe à travers la barrière 2 dans son deuxième état afin d'être mis en contact avec le réactif.

Cette réalisation permet de mettre en contact le réactif et l'analyte à un moment donné et éventuellement avec une cinétique déterminée dans le cas où le réactif est disposé dans la barrière 3.

Dans un troisième exemple particulier, le deuxième compartiment ne comprend ni réactif ni substance spécifique et le matériau biologique dans son deuxième état sert uniquement de filtre entre les éléments du milieu réactionnel.

Selon une réalisation, la barrière comprend en outre la substance chimique spécifique apte à faire passer le matériau depuis son premier vers son deuxième état.

Dans cette réalisation, un rayonnement peut initier, au moment souhaité, l'action de la substance chimique sur le matériau de sorte à le faire passer depuis son premier vers son deuxième état.

Dans d'autres modes de réalisation non représentés, on peut envisager d'autres formes de récipient 1, par exemple en V, des récipients 1 dont la surface 6 sur laquelle est fixée la substance 5 est de forme convexe, ou encore que les deux compartiments 3,4 ne soient pas disposés verticalement mais par exemple transversalement.

On décrit ci-dessous un mode de réalisation d'un récipient 1 destiné à permettre la réalisation et la révélation d'une réaction entre un analyte présent dans un fluide biologique, notamment du sang ou un composant du sang tel qu'un plasma ou un sérum, et un réactif.

Dans ce type de réaction, le fluide biologique et le réactif comprennent des éléments protéiques et/ou des éléments figurés.

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Suivant une première utilisation, l'analyse a pour but de révéler la présence d'un élément figuré particulier dans le fluide biologique. Le réactif qui est apte à se lier spécifiquement avec l'élément figuré recherché pour former un complexe avec lui est alors sous forme protéique.

Un exemple particulier d'une telle analyse est lorsque l'analyte est une hématie portant un antigène de groupe sanguin et le réactif comprend un anticorps connu qui est susceptible de se lier à cet antigène. Cette analyse permet notamment de déterminer le groupe ou le phénotype de l'hématie.

Dans la description les termes élément figuré et complexe font respectivement références aux éléments cellulaires du fluide biologique ou du réactif et aux complexes formés par liaisons spécifiques avec ces éléments.

Suivant une deuxième utilisation, l'analyse a pour but de révéler la présence d'un élément protéique particulier dans le fluide biologique. Le réactif qui est apte à se lier spécifiquement avec l'élément protéique recherché pour former un complexe avec lui est alors sous forme figuré.

Un exemple particulier d'une telle analyse est lorsque le réactif comprend des hématies portant un antigène de groupe sanguin connu et l'analyste est un anticorps d'un sérum qui est susceptible de se lier à cet antigène. Cette analyse permet notamment de déterminer la présence et la nature d'un anticorps de type immun préalablement à une transfusion.

Dans le cadre de ces deux exemples particuliers, une réalisation de la substance 5 apte à ce lier spécifiquement avec les complexes éventuellement formés est par exemple formée d'anticorps anti-immunoglobulines humaines (AGH) d'origine monoclonale et/ou polyclonale, éventuellement additionnée d'anticorps dirigés contre des déterminants de protéines sériques de type complément.

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Ainsi, dans le cas d'une réaction positive, on observera un tapis de complexes recouvrant la surface réactive 8 et, dans le cas contraire, on observera un point de négativité dans le fond 7 du deuxième compartiment 4.

On décrit ci-dessous un exemple de réalisation du matériau biologique formant la barrière 2 de séparation temporaire.

Dans cet exemple, le matériau biologique se présente, dans son premier état, sous la forme d'un gel solide ou de texture dense et, dans son deuxième état, sous la forme d'un liquide.

On utilise un matériau biologique formé d'un mélange d'alginates de sodium, d'albumine bovine, de pyrophosphate de sodium et de chlorure de calcium.

Les interactions entre ces différents composés ne sont pas complètement connues, mais on peut toutefois avancer que les chaînes d'alginates interagissent par l'intermédiaire de leurs zones hydrophobes avec les molécules d'albumine et par l'intermédiaire de leurs zones d'acide guluronique avec les ions calcium. Le pyrophosphate de sodium permet quant à lui de maîtriser la réaction de polymérisation entre le calcium et l'alginate qui, sans lui, serait trop rapide pour fabriquer un gel avec une réticulation homogène.

Le matériau biologique est introduit dans le récipient 1 sous forme liquide puis la gélification est obtenue après un temps d'incubation supérieur à une heure.

Ce temps de gélification permet au fluide de bien se répartir au-dessus de la substance 5 avec un bon état de surface.

Le gel ainsi obtenu permet la distribution du milieu réactionnel dans le premier compartiment 3 à des vitesses de l'ordre de 400 ul/sec sans provoquer de fuite de milieu réactionnel dans le deuxième compartiment 4.

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Le passage entre le premier état et le deuxième est réalisé par un changement de phase du matériau biologique qui est provoqué par une substance chimique spécifique.

La substance chimique spécifique apte à dépolymériser le gel décrit ci-dessus est un agent complexant les ions divalents, par exemple l'EDTA ou le citrate de sodium, qui provoque sa liquéfaction.

En effet, les alginates de sodium utilisés ont la propriété de former, en présence d'ions divalents, un réseau dense (premier état du matériau biologique). Ce réseau est cependant réversible car en présence d'agents complexant les ions divalents, on constate un réarrangement et/ou une dissociation des chaînes d'alginates provoquant une liquéfaction du gel (deuxième état du matériau biologique).

La cinétique de cette liquéfaction est liée à la concentration en agent séquestrant, à la température et à une éventuelle agitation.

A partir du moment où la liquéfaction du gel est totale, plus rien ne s'oppose alors au transfert d'au moins le produit de la réaction depuis le premier compartiment 3 vers le deuxième compartiment 4.

Ce transfert peut se dérouler sous l'action de trois forces, utilisées en combinaison ou séparément : - la gravité, par décantation naturelle du produit de la réaction ; - les forces centrifuges adaptées ; - les forces magnétiques dans le cas où au moins le produit de la réaction présente des propriétés paramagnétiques.

Dans le cas où le transfert se fait sous l'action de la gravité et/ou d'une force centrifuge, la densité du matériau biologique dans le deuxième état peut être différente des éléments ayant à passer au travers de la barrière 2. Par exemple,

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la densité du matériau biologique peut être comprise entre celle du produit de la réaction et celle du réactif pour que d'une part le réactif reste dans le premier compartiment 3 et d'autre part au moins le produit de la réaction passe dans le deuxième compartiment 4.

En variante, la densité du matériau biologique dans son deuxième état peut présenter un gradient suivant une direction longitudinale.

La séparation peut être également obtenue par une différence d'affinité physico-chimique, par exemple par une différence de miscibilité, entre le matériau biologique d'une part et le produit de la réaction ou le réactif d'autre part.

Dans toutes ces réalisations, le matériau biologique dans son deuxième état a pour fonction, de par sa densité et/ou sa composition, de permettre, sous l'effet de forces externes, le passage d'au moins le produit de la réaction afin de permettre la réalisation du test dans le deuxième compartiment 4.

Dans le cas d'un transfert à l'aide d'une force magnétique, cette fonction peut également être souhaitable, afin d'éviter que le transfert du produit de la réaction n'entraîne, notamment par effet de drainage, le réactif dans le deuxième compartiment 4.

En variante, la barrière 2 peut comprendre en outre un produit actif dans la réalisation et/ou la révélation de la réaction entre le réactif et l'analyte, par exemple sous la forme d'une solution enzymatique qui sera relarguée dans le milieu réactionnel lorsque le matériau biologique passera dans son deuxième état.

On décrit ci-dessous la préparation de la barrière biologique 8 présentée cidessus.

Préparation des différentes solutions

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Solution d'alginates et de pyrophosphate tétra-sodique Une solution à 1, 2 % (poids/volume) d'alginates de sodium partiellement hydrolysés (rapport acide manuronique/acide guluronique compris entre 0,8 et 1) et de pyrophosphate tétra-sodique 15 mM est préparée par dissolution d'un extrait sec d'alginates commercial et de pyrophosphate de sodium dans un tampon de LISPS (Low lonic Strengh Solution). Afin d'assurer une parfaite dissolution du produit, une agitation vigoureuse est réalisée. Les éventuelles bulles formées sont éliminées à l'aide d'une agitation plus douce. Cette solution est conservée à 4 C. Avant utilisation, la solution sera ramenée à température ambiante.

- Solution d'albumine Une solution d'albumine à 150 g/l est préparée par dilution au demi-tampon LISPS d'une préparation commerciale d'albumine à 300 gli. Cette solution est conservée à 4 C. Avant utilisation, la solution sera ramenée à température ambiante.

- Solution de chlorure de calcium Une solution en tampon LISPS de chlorure de calcium à une concentration de 10 mM est utilisée. Cette solution est conservée à 4 C. Avant utilisation, la solution sera ramenée à température ambiante.

- Solution d'EDTA tétra-sodique Une solution en tampon LISPS de sel d'éthylène diamine tétra-acétique tétrasodique est préparée à une concentration de 100 mM. Le pH de cette solution est ajusté à 7. Cette solution est conservée à 4 C. Avant utilisation, la solution sera ramenée à température ambiante.

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Préparation du gel Le mélange extemporané avant utilisation est réalisé suivant un ordre précis.

Dans un premier temps, un mélange volume à volume de la solution d'alginates et de pyrophosphate et de la solution d'albumine est réalisée. Après une agitation douce pendant quelques minutes, à un volume de cette solution est ajouté un volume de la solution de chlorure de calcium. Ce mélange est homogénéisé rapidement puis réparti dans les micro-puits 1 à raison de 100 gel par puits avant le début de la gélification de sorte à recouvrir totalement la couche d'AGH 5 (le temps de préparation et de manutention d'un tel produit ne doit pas excéder trente minutes). Une incubation d'une heure minimum permet d'obtenir un gel translucide et résistant.

De plus, t'étape de gélification se déroule suffisamment lentement pour permettre une industrialisation facile du dispositif et l'absence de lavage permet sa mise en oeuvre de façon aisée et éventuellement entièrement automatisée.

Le micro-puits 1 est alors prêt à l'emploi et doit être conservé à 4 C.

Dépolymérisation du gel La dépolymérisation du gel est obtenue en distribuant environ 50 jjl par puits 1 d'une solution contenant 100 mM d'EDTA (d'autres produits complexant les ions calcium peuvent être également utilisés). La liquéfaction complète du gel est obtenue après une incubation d'environ 15 minutes à une température de 20oC.

La préparation et la répartition de la barrière 2 de matériau biologique sont ainsi réalisées en une étape et, le fait de mélanger suivant un ordre précis et à des concentrations données les différents constituants de cette barrière 2 permet d'obtenir un gel homogène dans toute sa masse et dont la dépolymérisation est parfaitement contrôlable et a lieu simplement dans l'axe des micro-puits 1.

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On décrit ci-dessous les étapes du procédé de réalisation d'un test dans le récipient de réaction 1 décrit ci-dessus qui comprend les étapes prévoyant de : - introduire le milieu réactionnel dans le premier compartiment 3 ; - faire passer le matériau depuis son premier état vers son deuxième état ; - appliquer une force extérieure apte à permettre le passage de l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction depuis le premier compartiment 3 vers le deuxième compartiment 4 au travers de la barrière 2 de matériau dans son deuxième état ; - révéler le caractère positif ou négatif du test.

Selon une première réalisation, le passage du matériau depuis son premier état vers son deuxième état est réalisé par introduction de la substance chimique spécifique dans le premier compartiment 3.

Selon une deuxième réalisation, le passage du matériau depuis son premier état vers son deuxième état est réalisé par activation de la substance chimique spécifique, par exemple par l'intermédiaire d'un rayonnement.

Cette réalisation s'entend aussi bien du cas où la substance chimique spécifique a été introduite dans le premier compartiment que du cas où ladite substance est présente dans la barrière.

En variante, le procédé comprend une étape préalable de disposition de la barrière biologique 2 à l'intérieur du récipient 1.

Dans un exemple de réalisation, le réactif et la substance chimique spécifique peuvent être introduits simultanément de sorte que les réactions d'une part entre l'analyte et le réactif et d'autre part entre le matériau biologique et la substance chimique se déroulent simultanément.

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Préalablement à l'application de la force extérieure, le mélange réactionnel présent dans le premier compartiment 3 peut être soumis à des conditions favorisant la réaction entre l'analyte et le réactif, par exemple à une incubation de sorte à augmenter la vitesse des réactions devant se produire.

Dans un premier mode de réalisation, la force extérieure comprend une force centrifuge dont l'intensité, la direction et la durée sont ajustées pour permettre le transfert des éléments souhaités.

Dans un deuxième mode de réalisation, la force extérieure comprend, éventuellement en plus d'une force centrifuge, une force magnétique.

La force magnétique est créée, par exemple par un aimant permanent ou par un électro-aimant, dans une direction sensiblement longitudinale par rapport au récipient 1.

A cet effet, les éléments devant passer à travers la barrière doivent être ou doivent être rendus suffisamment paramagnétiques pour migrer depuis le premier compartiment 3 vers le deuxième compartiment 4 sous l'effet de la force magnétique.

On décrit ci-dessous, un premier et un deuxième exemple d'analyse réalisée avec ce procédé.

Dans le premier exemple, on souhaite, à l'aide d'hématies dont le groupe et le phénotype sont connus, détecter et déterminer la nature d'un anticorps de type immun, c'est-à-dire développé à la suite d'une immunisation au cours d'une transfusion sanguine ou d'une grossesse. La présence de tels anticorps peut compromettre gravement toute nouvelle transfusion de sang non compatible dans le système considéré et dans le cas d'une grossesse avoir des conséquences graves pour la survie du foetus. Cette analyse régulièrement pratiquée est appelée Recherche d'Agglutinines Irrégulières (RAI).

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Pour la mise en oeuvre de ce type d'analyse, le réactif comprend des hématies portant un antigène de groupe sanguin connu et l'analyte est un anticorps susceptible de se lier à cet antigène.

L'opérateur dépose alors dans le premier compartiment 3 un volume de sérum ou de milieu biologique à étudier (environ 25 Ill) et deux volumes de solution d'hématies indicatrices, par exemple préalablement traitées avec des particules paramagnétiques. En variante, cette solution peut comprendre l'agent dépolymérisant le gel.

L'opérateur dépose alors la micro-plaque ou la barrette sur une forme adaptée permettant si besoin est une incubation à 37 C puis l'ensemble est soumis à un champ magnétique et/ou à une force centrifuge.

Arrivés au contact avec la couche d'AGH 5, les anticorps liés spécifiquement aux antigènes de surface des hématies vont interagir avec les anticorps adsorbés sur la paroi interne 6 du récipient 1.

Ainsi, dans le cas d'une réaction positive se formera une image de tapis d'hématies dont l'homogénéité et les dimensions seront fonction de la quantité d'anticorps recherchés. Si la réaction est négative, un point central d'hématies apparaîtra dans le fond 7 du récipient 1.

Dans le deuxième exemple, on souhaite déterminer le groupe et le phénotype de l'hématie, et dans ce cas on utilise des sondes spécifiques (anticorps monoclonaux ou polyclonaux, lectines végétales) de certains déterminants des groupes sanguins.

A cet effet, l'analyte est une hématie portant un antigène de groupe sanguin et le réactif peut comprendre un anticorps connu qui est susceptible de se lier à cet antigène.

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La mise en oeuvre de l'analyse est alors identique à celle présentée précédemment à la différence que, dans le cas de l'utilisation d'une force magnétique, ce sont les hématies à analyser qui peuvent être traitées de sorte à augmenter leur susceptibilité magnétique.

La barrière 2 permet, au cours d'une analyse, de réaliser un isolement momentané du milieu réactionnel dans le premier compartiment 3 afin de permettre la réalisation de la réaction ou un traitement du milieu réactionnel puis, au moment souhaité, de faire passer sélectivement une partie des éléments présents dans le milieu réactionnel vers un deuxième compartiment 4 afin de permettre la révélation du caractère positif ou négatif de l'analyse ou de permettre la mise en contact des éléments souhaités avec un réactif disposé dans la barrière 2 et/ou dans le deuxième compartiment 4.

En outre la barrière 2 permet : - une analyse séquentielle ou une séquence de distribution du milieu réactionnel qui précède une mise en contact du produit de la réaction avec une substance ; - la protection d'une zone réactive du deuxième compartiment 4 qui contient une substance fragile ou excessivement réactive et devant être protégée en début d'analyse ; - d'éviter une éventuelle contamination d'une zone réactive du deuxième compartiment 4 par le milieu réactionnel.

De part sa fluidité lors de sa mise en oeuvre dans le récipient 1, la barrière 2 peut être utilisée dans des récipients 1 de toute forme et dans lesquels les solutions actuelles ne sont pas satisfaisantes.

Claims (17)

1. REVENDICATIONS 1. Barrière (2) de séparation temporaire d'un récipient de réaction (1) en au moins un premier compartiment (3) dans lequel un milieu réactionnel comprenant un analyte et éventuellement un réactif est introduit et un deuxième compartiment (4) destiné à recevoir au moins l'un des éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction, ladite barrière (2) étant caractérisée en ce qu'elle est formée d'un matériau apte à passer, par l'action d'une substance chimique spécifique, d'un premier état dans lequel ledit matériau est sensiblement imperméable au milieu réactionnel à un deuxième état dans lequel ledit matériau est susceptible de laisser passer au moins l'un desdits éléments parmi le réactif, l'analyte et le produit de la réaction.
2. 2. Barrière selon la revendication 1, caractérisée en ce que le matériau se présente, dans son premier état, sous la forme d'un gel solide et, dans son deuxième état, sous la forme d'un liquide.
3. 3. Barrière selon la revendication 2, caractérisée en ce que le matériau est de nature biologique formé d'un mélange d'alginates de sodium, d'albumine bovine, de pyrophosphate de sodium et de chlorure de calcium de sorte à former un gel avec une réticulation homogène, la substance chimique spécifique étant un agent complexant les ions divalents, par exemple l'EDTA, apte à liquéfier ledit gel.
4. 4. Barrière selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la densité du matériau dans le deuxième état est différente de celle des éléments ayant à passer à travers la barrière (2).
5. 5. Barrière selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un produit actif dans la réalisation et/ou la révélation de la réaction entre le réactif et l'analyte.

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6. 6. Barrière selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'elle comprend en outre la substance chimique spécifique.
7. 7. Récipient de réaction (1) comprenant une barrière (2) selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un micro-puits d'une plaque de micro-titration, ledit micro-puits ayant une forme en U ou en V.
8. 8. Récipient selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'une substance (5) apte à se lier spécifiquement au produit de la réaction est disposée dans le deuxième compartiment (4).
9. 9. Récipient selon la revendication 8, caractérisé en ce que le deuxième compartiment (4) est rempli du matériau formant la barrière (2) de sorte que celui-ci serve également à la protection de la substance (5) apte à se lier spécifiquement au produit de la réaction.
10. 10. Récipient selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le deuxième compartiment (4) comprend un réactif.
11. 11. Procédé de réalisation d'un test dans un récipient de réaction (1) selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes prévoyant de : - introduire le milieu réactionnel dans le premier compartiment (3) ; - faire passer le matériau formant la barrière (2) depuis son premier vers son deuxième état ; - appliquer une force extérieure apte à permettre le passage de l'un des éléments parmi le réactif, l'analyste et le produit de la réaction depuis le premier compartiment (3) vers le deuxième compartiment (4) au travers de la barrière (2) de matériau dans son deuxième état ; - révéler le caractère positif ou négatif du test.

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12. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le passage du matériau depuis son premier état vers son deuxième état est réalisé par introduction de la substance chimique spécifique dans le premier compartiment (3).
13. 13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que le passage du matériau depuis son premier état vers son deuxième état est réalisé par activation de la substance chimique spécifique, par exemple par l'intermédiaire d'un rayonnement.
14. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que l'éventuelle réaction entre le réactif et l'analyte se produit dans le premier compartiment (3) et la révélation de l'éventuelle réaction est réalisée dans le deuxième compartiment (4), le matériau dans son deuxième état étant alors apte à laisser passer au moins le produit de la réaction.
15. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable de disposition de la barrière biologique (2) à l'intérieur du récipient (1).
16. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que le réactif comprend des hématies portant un antigène de groupe sanguin connu et l'analyte est un anticorps susceptible de se lier à cet antigène, le procédé permettant notamment de déterminer la présence et la nature d'un anticorps de type immun préalablement à une transfusion.
17. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que l'analyte est une hématie portant un antigène de groupe sanguin et le réactif comprend un anticorps connu qui est susceptible de se lier à cet antigène, le procédé permettant notamment de déterminer le groupe ou le phénotype de l'hématie.