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Technisches Gebiet:
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zum Nachweis von Antikörpern
und/oder Antigenen, wie zur Blutgruppenbestimmung, Antikörper-Suchtest,
Serumgegenprobe sowie zur Infektionsserologie, in einer Testflüssigkeit
durch Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner,
wobei die Antigene bzw. die Antikörper oder die spezifischen
Bindungspartner in der Testflüssigkeit
ungebunden und/oder an einen Träger gebunden
sind und das dergestalt hergestellte Probengemisch einem Inkubationsschritt
ausgesetzt wird, wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion
ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw.
den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches
optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, gemäß dem Oberbegriff
des Anspruchs 1.
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Stand der Technik:
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Menschliche Blutgruppensubstanzen,
aber auch eine Vielzahl von anderen in einem Organismus gebildeten
Substanzen, werden durch spezifische Antigen-Antikörper-Reaktionen nachgewiesen.
Diese Reaktion ist detektierbar über
eine Vernetzung, d.i. Agglutination, von Antigenen (Ag), Antikörpern (Ak)
und bestimmten Trägersubstanzen,
die Antigene oder Antikörper
tragen, zu einem makroskopisch erfaßbaren optisch nachweisbaren
Komplex, dem Agglutinat.
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Beispiele sind die erythrozytenseitige
Blutgruppenbestimmung sowie die Serumgegenprobe. Bei der erstgenannten
werden an die Membran des Spendererythrozyten gebundene Blutgruppen-Antigene
durch Reaktion mit Antiseren nachgewiesen, die Antikörper als
spezifische Bindungspartner enthalten. Die Antikörper sind bekannt (Such-Antikörper), die
sich in einer Testflüssigkeit
befinden, zum Beispiel Testantikörper-Aufschwemmung,
und die unbekannte Erythrozyten (unbekannte Antigene) enthält. Die
Agglutination wird durch Reaktion von Antigen und Antikörper hervorgerufen.
Damit kann das System ABO und RH und darüber hinaus noch eine Vielzahl
von Antigenen bestimmt werden. Bei der Serumgegenprobe sind die
Erythrozyten bekannt, die bekannte Antigene (Such-Antigene) aufweisen.
Die Testflüssigkeit,
zum Beispiel Serum, beinhaltet die unbekannten körpereigenen Antikörper (sog.
Isoagglutinine), welche durch Reaktion mit den Test-Erythrozyten nachgewiesen
werden. Damit kann ebenfalls die Blutgruppe, jedoch nur ABO, bestimmt
werden, Biotest, Lexikon der Immunologie, 2. Aufl., Medical Service
München,
Seite 36, 37.
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Diese Technik arbeitet mit nativen
Mikrotiterplatten mit Rundboden, wobei in die Vertiefungen der Platte
eine Serie von verschiedenen Antiseren, insbesondere Anti-A, Anti-B,
Anti-D und Rhesuskontrollserum, zur Bestimmung der Blutgruppe im
ABO-System, einpipettiert und mit den zu testenden Erythrozyten
in verdünnter Form
versetzt wird. Nach einer Inkubationszeit von wenigstens 20 Minuten
wird die Platte anzentrifugiert und vorsichtig aufgeschüttelt. Die
Gesamtbearbeitungszeit beträgt
cirka 40 Minuten. Eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion ist als Agglutinat
sichtbar, eine negative Reaktion ist als eine aufgeschwemmte Erythrozytensuspension
gegeben. Die Serumgegenprobe arbeitet in ähnlicher Weise.
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Das Verfahren ist nur aufwendig automatisierbar
und liefert oft keine Eindeutigkeit. Die Zuverlässigkeit der Detektion einer
positiven Reaktion hängt
von der Stärke
der Antikörper-Antigen-Bindung
ab: bei schwachen Bindungen können
die agglutinierten Erythrozyten durch äußere Störungen, insbesondere durch
das Aufschütteln,
wieder getrennt und somit fälschlich
als negative Reaktion diagnostiziert werden. Aus diesem Grunde ist
wegen des eventuell fehlenden klaren Reaktionsbildes die automatische
Unterscheidung zwischen positiver und negativer Reaktion, z.B. mittels
automatischer photometrischer Auswertung, praktisch nicht möglich, sondern
muß von
einer erfahrenen Bedienperson vorgenommen oder zumindest visuell überprüft werden und
ist deshalb sehr zeitaufwendig.
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Durch die
EP 0363510 A ist die sog.
Solid-Phase-Technik zum Auffinden von irregulären Antikörpern bekannt geworden, welche
auf kodierter Mikrotiterplattform ohne Gel basiert. Diese benötigt mehrfache
aufwendige Wasch- und Zentrifugierschritte. Die Gesamtabarbeitungszeit,
Inkubation 20 Min, Zentrifugation, Waschschritte, beträgt cirka
40 Min. Die positiven Ergebnisse sind als Monolayer (Rasen), die
negativen Ergebnisse als Knopf am Plattenboden zu sehen. Bedingt
durch diese Schritte sowie die lange Dauer ist eine Flexibilität der Abarbeitung
der Proben und somit Automatisation schlecht gegeben. Außerdem kann
mit dieser Technik nur bedingt und mit großem Aufwand die AB0-Rh und
Serumgegenprobe abgearbeitet werden.
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Aus der
EP 0305337 A1 ist zum Nachweis
von Antigenen oder Antikörpern
ein Verfahren zur optischen Sichtbarmachung von Komplexen von trägergebundenen
Antigenen mit Antikörpern
in Reaktionsgefäßen bekannt
geworden, welche ID-Gel-Technik genannt wird. Diese benützt sechs
parallele, mit Gel-Beads gefüllte Säulen in
Form einer Karte. Im oberen Bereich oberhalb der Säule befindet
sich ein zur Aufnahme der Probe dienendes, größeres Behältnis. Zwischen der unteren,
mit Gel gefüllten
Säule und
dem oberen Behältnis
muß bei
Befüllung
mit der Probe ein Luftpolster verbleiben; es erfolgt eine Ruhe-Inkubationsphase
von 15 Min bei 37 Grad C; die anschließende Zentrifugationszeit der
Karte beträgt
10 Minuten bei 85xg. Das Ergebnis wird durch eine seitliche Betrachtung
der Säule
abgelesen. Bei positiver Reaktion befinden sich die Agglutinate
auf dem Gel der Säule
oder im Gel der Säule
flockig verteilt. Bei einer negativen Reaktion befinden sich die
Erythrozyten in kompakter Form am Boden der Säule. Eine Verkürzung der
Inkubationszeit ist nicht möglich,
weil die Proben nicht mechanisch bewegt werden dürfen, weil sonst die Probe
während
der Inkubationsphase direkt mit dem Gel in Kontakt käme und dadurch
eine falsch-negative Reaktion angezeigt würde. Auch kann die g-Zahl nicht
erhöht
und damit die Zentrifugationszeit nicht erniedrigt werden, weil
sonst ebenfalls eine falsch-negative Reaktion angezeigt würde. Ebenso
sind für
die Serumgegenprobe und AB0-RH System gesonderte Karten notwendig,
wie für
die Unterscheidung von zum Beispiel IgG und IgM gesonderte Säulen einer Karte
notwendig sind. Bedingt durch die noch immer lange Inkubations-
und Zentrifugationszeit und der Kartenform sowie gesonderter Säulen für die einzelnen
Bestimmungen ist diese Technik für
eine Vollautomation nicht gut geeignet. Auch ist die Versendung
der Karten zu den Kunden problematisch, da das Gel bei einem Aufdemkopfstehen
der Säulen
aus denselben herauslaufen kann. Zu erwähnen ist noch, dass eine Pipettierung
des Gels aufgrund der hohen Viskosität und deren Verklebung nachträglich in
die Säule
problematisch ist.
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Der
EP 0849595 B1 , welche auf der
EP 0305337 A1 aufbaut, ist
zu entnehmen, dass (Zitat)"kommerziell erhältliche Standartpartikel mit
einem Durchmesser von 3–7,5 μm nur unvollständig in
die Gelmatrix sedimentieren, während
größere, 11,9 μm, bzw. kleinere
synthetische Partikel < 1 μm nur schwach
in das Gel eindringen konnten. Eine Erhöhung der Parameter Zentrifugationsdauer,
von 10 Min bis auf 50 Min bzw. Zentrifugationsgeschwindigkeit von
1030 bis 1300 rpm brachte zwar eine bessere, aber immer noch keine
vollständige
Sedimentation. Selbst wenn durch diese beiden Maßnahmen eine optimale Sedimentation
hätte erreicht werden
können,
so ist doch eine Veränderung/Erhöhung der
Zentrifugationsdauer und -geschwindigkeit aus folgenden gründen sehr
nachteilig: 1. Das Verfahren der
EP 0849595 B1 soll ein im Vergleich zu vergleichbaren
Methoden besonders zeitunaufwendiges Verfahren erlauben. Bei einer
möglichen
Zentrifugationsdauer von 50 Min würde sich die angestrebte Testdauer
von 20 Minuten inklusive Inkubation damit verdreifachen. 2. Wie
dem Fachmann bekannt ist, verringert sich die Sensitivität in Gel-Zentrifugationsverfahren
mit steigender Zentrifugationsgeschwindigkeit" (Zitat Ende). Zum
Nachweis der Reaktion wird eine 10 minütige Zentrifugation bei 85
g angewandt.
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Der Zweck der Erfindung liegt darin,
eine neue Methode für
die AB0- sowie RH-Bestimmung,
für die Serumgegenprobe
sowie für
den Antikörpersuchtest
anzugeben, welche den modernen Anforderungen des Marktes entspricht,
nämlich
eine flexible und schnelle automatische Abarbeitung der Proben über einen
Vollautomaten mit Notfalleingabe für Patienten und Spender anzugeben.
Dazu muß die
Abarbeitungszeit möglichst
kurz sein, was bedeutet, dass die Inkubationszeit höchsten 5
bis 7 Minuten möglichst
separat in einer Platte und die Zentrifugationszeit 2 bis 4 Minuten
ebenso separat in einer Reaktionsplatte betragen darf, welche noch
die Anforderung erfüllen
müssen,
dass diese individuell beschickt werden können. Ebenso dürfen keine
Waschschritte vorhanden sein. Um Notfallpatienten vorziehen zu können, muß bei einer
Notfalleingabe zusätzlich
gewährleistet
sein, dass die inkubierenden Patientenseren oder -plasmen, welche
keine Priorität
besitzen, auch längere
Zeit ohne negative Beeinflussung der Ergebnisse, bis zirka 40 Minuten,
inkubieren können,
so dass ein Notfallpatient zwischendurch schnell abgearbeitet werden
kann; anschließend
wird die normale Routine wieder abgearbeitet. Ebenso muß die Abarbeitung
der Proben mit möglichst
gleichen Basisreagenzien durchgeführt werden können wie
auch die einfache Versandfähigkeit
der Reagenzien gewährleistet sein
muß.
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Technische Aufgabe:
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde,
unter Vermeidung der Nachteile des Standes der Technik ein Verfahren
zum Nachweis von Antikörpern
und/oder Antigenen, wie zur Blutgruppenbestimmung, Antikörper-Suchtest,
Serumgegenprobe sowie zur Infektionsserologie, mit hoher Empfindlichkeit
anzugeben, das in einfacher Weise durchführbar ist und zu einem hohen
Grad an Automatisierung geführt
werden kann, und das insbesondere in sehr kurzer Reaktionszeit zu
höchst
zuverlässigen
Testergebnissen der Proben führen
soll; es soll eine automatische Abarbeitung der Proben mittels eines
Automaten möglich
sein. Ebenso sollen Notfalleingaben von Untersuchungsproben von
Notfallpatienten möglich
sein, ohne dass dadurch eine Beeinträchtigung der übrigen Proben
erfolgt.
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Offenbarung der Erfindung
sowie deren Vorteile:
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Die Aufgabe wird gelöst durch
ein Verfahren der eingangs genannten Gattung, welches dadurch gekennzeichnet
ist, dass eine vorbestimmte Menge des inkubierten Probengemisches
auf eine vorbestimmte Menge eines Gemisches eines Puffers, Einbettpuffer,
mit Partikeln, Puffer-Partikel-Gemisch, abgekürzt PP-Gemisch genannt, welches sich innerhalb
eines Nachweisgefäßes befindet,
zugegeben wird, wobei der Einbettpuffer die Eigenschaft aufweist,
den Abstand zwischen den einzelnen Partikeln innerhalb des PP-Gemisches
zu minimieren und anschließend
das Nachweisgefäß einer
Zentrifugation unterworfen wird zur Sichtbarmachung der Reaktion
des Probengemisches im Nachweisgefäß, wobei das PP-Gemisch die
Positivreaktion fördert.
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In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung
des Verfahrens besteht der Einbettpuffer aus einer wässrigen Lösung aus
Dextran [(C6H10O5)n] und/oder Polyethylenglycol
[HO(C2H4O)nH], wobei vorteilhaft zur Herstellung sämtlicher
wässrigen
Lösungen
Laborwasser (Aqua bidest) verwendet wird. In weiterer vorteilhafter
Ausgestaltung des Verfahrens wird der wässrigen Lösung aus Dextran [(C6H10O5)n] und/oder Polyethylenglycol [HO(C2H4O)nH]
Glycocoll (H2NCH2COOH)
(Glycin) und/oder Trisodiumcitrat (C6H5O7Na3)
zugegeben.
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In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens
wird der vorgenannten Lösung
oder den vorgenannten Lösungen
zur Haltbarmachung ein antibakterielles und/oder antivirales Mittel,
wie Natriumazid (NaN3) oder Antibiotika,
zugesetzt. Dadurch ist der Einbettpuffer lange haltbar und stabil,
zum Beispiel 1 Jahr. Der Puffer ist bei Zimmertemperatur lagerfähig, vorzugsweise
sollte er für
längere
Lagerzeiten bei Kühlschranktemperaturen
gelagert werden.
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Der Einbettpuffer besitzt den Vorteil,
dass bei der Verwendung von Dextran die kolloidale Lösung des Dextrans
die Zwischenräume
zwischen den Partikeln nach der Herstellung des Puffer-Partikel-Gemisches, PP-Gemisch,
verkleinert. Diese Tatsache rührt
offensichtlich von den Ketten des Dextrans her. Dadurch ist es möglich, beim
Zentrifugierschritt mit einer viel höheren Gravitation (g) zu arbeiten.
Und zwar kann der Zentrifugierschritt bei einer Beschleunigung von
cirka 80xg bis 20.000xg während
einer Zentrifugierzeit von 0,1 Minuten bis < 10 Minuten, bevorzugt 1.000xg bis
4.000xg während
einer bevorzugten Zentrifugierzeit zwischen 1 Minute bis 5 Minuten,
insbesondere 1.900 bis 2.600xg bei 2 Minuten, durchgeführt werden.
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Aufgrund der Tatsache, dass das PP-Gemisch
die Sichtbarmachung der Positivrekation fördert und stabilisiert, richtet
sich die Zentrifugationszeit und die Gravitation im Wesentlichen
nur danach, nach welcher Zeit und bei welcher Gravitation, g-Zahl,
eine negative Reaktion eindeutig nachzuweisen ist. Das bedeutet, dass
in diesem Fall die g-Zahl erhöht
werden kann, um die Zentrifugationszeit weiter herabzusetzen. Das
ist beim Stand der Technik nicht möglich, weil zum Beispiel bei
der ID-Gel-Technik ein enges Fenster an g-Zahl, 85xg, und Zentrifugationszeit,
10 Min., zwingend notwendig ist.
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Ein weiterer Vorteil des Verfahrens
besteht darin, dass das PP-Gemisch die Positivreaktion bzw. die Sichtbarmachung
der Monolayerschicht entscheidend fördert. Denn die mit IgG beladenen
Erythrozyten werden unter hohem Druck bei Verwendung von kodierten
Gefäßen an die
mit Anti-IgG kodierte Wandung gedrückt und festgehalten. Bedingt
durch das PP-Gemisch bzw. den Einbettpuffer sind die räumlichen
Abstände der
beteiligten Reaktionspartner bzw. Partikel sehr gering, weshalb
die hohe g-Zahl benötigt
wird, wodurch aber auch die Zentrifugierzeit herabgesetzt wird.
Selbst bei einer g-Zahl von 2500 und einer Zentrifugierzeit von > 10 Minuten blieb die
Positivreaktion des Monolayers stabil erhalten. Das heißt, bedingt
durch das PP-Gemisch bzw. den Einbettpuffer, bleiben über einen
großen
Gravitationsbereich, xg, die Ergebnisse praktisch unverändert.
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Des Weiteren besitzt der Einbettpuffer
den Vorteil, die Bindung zwischen Anti-IgG und IgG-Ery-Komplex zu fördern und
zu stabilisieren, nämlich
die Bindung zwischen Fab/Fc-Teil der Antikörper. Somit entsteht positiv
ein ausgeprägter
Rasen: Plastikwandung/Anti-IgG/IgG-Ery-Komplex. Das PP-Gemisch hat
des Weiteren den Vorteil, dass diese Monolayerschicht stabil bleibt
und festgehalten wird. Das bedeutet des Weiteren, dass eine erhöhte Empfindlichkeit
für den
Nachweis von Antikörpern
gegeben ist.
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Zum Beispiel hat die marktführende Standardmethode,
die ID-Gel-Technik, als Referenzmethode beim Nachweis von irregulären Antikörpern, welche
bekannt sind, von 95 Patientenseren im Vergleich zum erfindungsgemäßen Verfahren
eine Sensitivität
87,2% gegenüber
von 98% bei der Erfindung. Die Spezifität von 104 negativen Patienten
entsprach bei der ID-Gel-Technik 97%, beim Gegenstand der Erfindung
93%. Das ist deshalb plausibel, weil, je sensitiver ein Test ist,
umso geringer ist dessen Spezifität. Selbstverständlich ist
es möglich,
durch Feineinstellung die Balance zwischen Sensitivität und Spezifität optimal
bzw. im gewünschten Maß einzustellen,
wie durch Feineinstellung des Dextrans durch Konzentrationsänderung
oder durch dosierte Zugabe von Albumin, vorzugsweise RS.
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Im Folgenden ist ein Testergebnis
einer Refenzmethode des Standes der Technik gegenüber der
Erfindung wiedergegeben:
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Die Titer der Spalte 3 beruhen
auf einer Inkubationszeit von 5 Min und einer Zentrifugationszeit
von 2 Min bei 2054 g; das PP-Gemisch ist durch die Zufügung von
Albumin fein eingestellt. Die Titer der Spalte 3 beruhen
auf einer Inkubationszeit von 15 Min und einer Zentrifugationszeit
von 4 Min bei 2054 g; das PP-Gemisch
lag in der erfindungsgemäßen Grundeinstellung
mit Dextran ohne Albumin vor.
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Als Ergebnis aus diesen Tests ist
hinsichtlich der Erfindung zu entnehmen, dass, entgegen dem Stand der
Technik in der
EP 0849595
B1 , sich bei der Erfindung die Sensitivität mit steigender
Zentrifugationsgeschwindigkeit bzw. größer werdendem g und somit verkürzter Zentrifugationszeit
nicht verringert. Ebenso liegt auch bei abgekürzter Inkubationszeit die Sensitivität immer
noch wesentlich über
derjenigen der Referenzmethode. Bei der Benutzung einer Zentrifugation
von 2.500xg bei 2 Min Zentrifugationszeit sind die Ergebnisse völlig vergleichbar.
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Aufgrund der durch den Einbettpuffer
bedingten sehr geringen Abstände
der Partikel voneinander sind beim Nachweis von irregulären IgM-Antikörpern keine
Zusätze
von Anti-IgM jeglicher Art notwendig, so dass weder eine Kodierung
der Gefäßwandung,
noch eine solche der Partikel, Beads, oder als Einmischung mit Anti-IgM
erforderlich ist; die räumliche
Struktur von Ery/IgM/Ery-Komplex ist zu groß, so dass der Komplex bei der
Zentrifugation entweder auf dem PP-Gemisch verbleibt oder im PP-Gemisch
stecken bleibt.
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Gleiches gilt, wenn keine kodierten
Gefäße verwendet
werden, sondern entweder die Partikel, Beads, kodiert sind oder
die Fänger-Antikörper direkt
dem PP-Gemisch zugegeben
werden.
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In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens
wird ein PP-Gemisch verwendet, welches eine derart geringe Viskosität aufweist,
dass das PP-Gemisch in flüssiger
oder pastöser
Form vorliegt, welche gegenüber
dem Stand der Technik die Pipettierung des PP-Gemisches mittels
Stepper oder Pipette in das Nachweisgefäß gestattet.
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In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens
werden als Partikel innerhalb des Puffer-Partikel-Gemisches Beads
verwendet. Vorzugsweise werden als Beads Acryl, Gelatine, Polyacrylamide,
Solid nets, Silica, Ficoll, Percoll, Phtalate-Ester, Agarose oder
Dextran-Gel verwendet. Die Partikel, vorzugsweise die Beads, weisen einen
Durchmesser zwischen 1 μm
bis 300 μm,
vorzugsweise einen Beads-Trockendurchmesser
zwischen 1 μm
bis 300 μm,
auf. In einer bevorzugten Ausgestaltung hat sich die Verwendung
des Dextran-Gels SEPHADEX G-50 superfine, insbesondere zwischen
20 μm bis
50 μm zur
Herstellung des PP-Gemisches als vorteilhaft erwiesen. Auch SEPHADEX-Beads
zwischen 20 μm
bis 300 μm
sind geeignet und können
verwendet werden. Es hat sich gezeigt, dass Beads, welche eine Fraktionierung
des Dextrans vornehmen können,
am besten geeignet sind.
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Ein SEPHADEX G-50, nämlich SEPHADEX
G-50-50 superfine, besitzt einen Fraktionsrange von Dextran zwischen
500 und 10.000 MWt, und Globularproteine von 1.500 bis 30.000 MWt.
Zum Aufschwemmen (Swelling) der Beads wird bei SEPHADEX G-50-50
superfine 9–11
mLiter/Gramm Beads Flüssigkeit
benötigt. Je
weniger Flüssigkeit
zum Aufschwemmen der Beads benötigt
wird, um so größer wird
die benötigte
Grundzentrifugation. Zum Beispiel wird bei der Verwendung von SEPHADEX
G-25-50 superfine mit Globular-Protein 1.000–5.000 MWt, Dextrans: 100 bis
5.000 MWt sowie zum Aufschwemmen der Beads 4–6mL/-Gramm Beads, eine höhere Gravitation bei gleichbleibender
Zentrifugationszeit, zum Beispiel 2 Minuten, benötigt, wobei die Beadsgröße unverändert ist,
nämlich
20 μm bis
50 μm beträgt. Mitentscheidend
ist somit die Swellingzahl der Beads, die Fraktionsrange der Proteine
und Dextrans (angegeben in Molgewicht MWt). Wenn die Swellingzahl
sowie die Fraktionsrange größer gewählt werden,
zum Beispiel Dextran-Gel SEPHADEX G-100-50 superfine gewählt wird,
wird bei gewünschter
gleichbleibender Zentrifugationszeit eine geringere Gravitation benötigt. Das
bedeutet, dass bei geringer werdendem Fraktionsrange des Dextrans
oder der Globularproteine die g-Zahl der Zentrifugation bei gleichbleibender
Zentrifugationszeit erhöht
wird und umgekehrt.
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In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante
zum Nachweis von Antikörpern
und/oder Antigenen, wie zur Blutgruppenbestimmung, Antikörper-Suchtest, Serumgegenprobe
sowie zur Infektionsserologie, in einer Testflüssigkeit durch Reaktion mit
einem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner, wobei die Antigene
bzw. die Antikörper
oder die spezifischen Bindungspartner in der Testflüssigkeit
ungebunden und/oder an einen Träger
gebunden sind und das dergestalt hergestellte Probengemisch einem
Inkubationsschritt ausgesetzt wird, wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion
ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw.
den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches
optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, besteht dasselbe
darin, dass eine vorbestimmte Menge des inkubierten Probengemisches
auf eine vorbestimmte Menge eines Gemisches eines Puffers, Einbettpuffer,
mit Partikeln, Puffer-Partikel-Gemisch, abgekürzt PP-Gemisch, welches sich innerhalb eines
Nachweisgefäßes befindet,
zugegeben wird, wobei der Einbettpuffer die Eigenschaft aufweist,
den Abstand zwischen den einzelnen Partikeln innerhalb des PP-Gemisches
zu minimieren und anschließend
das Nachweisgefäß einer
Zentrifugation unterworfen wird zur Sichtbarmachung der Reaktion
des Probengemisches im Nachweisgefäß, wobei das PP-Gemisch die
Positivreaktion fördert,
wobei der Einbettpuffer aus einer wässrigen Lösung aus Dextran [(C6H10O5)n] und/oder Polyethylenglycol [HO(C2H4O)nH]
hergestellt ist, welchem Einbettpuffer Glycocoll (H2NCH2COOH) (Glycin) und/oder Trisodiumcitrat
(C6H5O7Na3) zugegeben werden kann, wobei als Partikel
in den Einbettpuffer Beads gegeben werden, welche Dextran-Gel SEPHADEX
G-50 superfine mit einem Trockendurchmesser von 20 μm bis 50 μm sind, wobei
anschließend
zur Sichtbarmachung einer Reaktion der Zentrifugierschritt bei einer Beschleunigung
von 1900 bis 2.600xg bei zirka 2 Minuten Zentrifugierzeit durchgeführt wird.
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In weiterer Ausgestaltung der Erfindung
wird das Probengemisch einem Inkubationsschritt unterworfen, welcher
bevorzugt in einem Inkubator durchgeführt wird und zwischen 1 Minute
bis 40 Minuten dauert, wobei während
der Inkubation eine Zwangsdurchmischung der Testflüssigkeit
erfolgt. Eine permanente Zwangsdurchmischung ist in der Immunhämatologie
nicht Stand der Technik. Diese Zwangsdurchmischung wird bevorzugt
durch Schütteln
oder Rühren
der Testflüssigkeit
erzielt. Die Zwangsdurchmischung verkürzt die Inkubationszeit und
beschleunigt dadurch die Reaktionszeit der Antigen-Antikörperreaktion
wie auch die Zwangsdurchmischung die Empfindlichkeit des Verfahrens
erhöht.
Beim Antikörpersuchtest
hat sich vorzugsweise eine Inkubationszeit von 5 bis 7 Min, bei
der Blutgruppenbestimmung eine solche von 1 bis 5 Min und bei der
Serumgegenprobe eine solche von 2 bis 3 Min als vorteilhaft erwiesen.
Damit bietet sich eine Standardisierungszeit von 5 Min an, so dass
Blutgruppenbestimmung, Antikörpersuchtest
und Serumgegenprobe mit demselben PP-Gemisch und ein und derselben
Gravitationszahl sowie gleicher Zentrifugationszeit wie auch mit
ein und demselben Gefäß, zum Beispiel
Mikrotiterplatten, durchgeführt
werden können.
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Zur Durchführung des Inkubationsschrittes
sowie der Zwangsdurchmischung kann dem Probengemisch bzw. den Erythrozyten
Liss und/oder modifiziertes Liss zugesetzt werden. Hierbei kann
Liss ohne oder modifiziert mit Rinderalbumin verwendet werden. Es
wird folgendes Lis auf der Basis von Laborwasser verwendet:
Natriumclorid,
bevorzugt 1,788 g/Liter
Dinatriumhydrogenphosphat Na2HPO4, bevorzugt
0,204 g/Liter
Kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4, bevorzugt 0,233 g/Liter
Glycin H2NCH2COOH bevorzugt
18 g/Liter
Thymerosal C9H2HGO2SNA bevorzugt 0,20 g/Liter (Konservierungsmittel)
ergibt Liss mit 0,03 Mol bei einem ph-Wert von zirka 6,7.
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Von diesem Liss-Puffer werden zum
Beispiel 4 mLiter plus 0,5 mLiter Laborwasser plus 0,5 mLiter 22%-tiges
Rinderalbumin genommen und ergeben modifiziertes Liss.
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In einer weiteren Ausgestaltung des
Verfahren wird zur Feineinstellung der Reaktion dem PP-Gemisch Albumin,
wie BS-Serum, zugegeben wie auch gleichzeitig oder unabhängig davon
die Dextrankonzentration entsprechend angepaßt werden kann. In der vorangegangenen
Tabelle ist zum Beispiel in Spalte 3 eine Feineinstellung des PP-Gemisches über Rinderalbumin
erfolgt.
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In einer weiteren Ausgestaltung der
Erfindung werden bei der Anwendung derselben auf die Infektionsserologie
statt Erythrozyten als vorgegebene spezifische Bindungspartner mit
Proteinen kodierte, eingefärbte
Beads verwendet, welche ungefähr
das spezifische Gewicht der Erys aufweisen. Hierzu werden vorteilhaft
Standardpartikel – auch
im Gegensatz zum Stand der Technik der
EP 0849595 B1 – mit einem
Durchmesser von 3 μm
bis 7,5 μm
benutzt, welche in vorteilhafter Weise eingefärbt worden sind. Anschließend wird
dieses Reaktionsgemisch, welches den zu bestimmenden Analyten enthält, zur
Sichtbarmachung der Reaktion auf das PP-Gemisch gegeben.
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In einer weiteren Ausgestaltung des
Verfahren wird das Probengemisch in einem gesonderten Reaktionsgefäß zur Reaktion
gebracht und anschließend
das Probengemisch auf das PP-Gemisch innerhalb des Nachweisgefäßes aufgebracht.
Aufgrund der Verwendung von zwei Gefäßen, nämlich Reaktionsgefäß und Nachweisgefäß, ist eine
größere Flexibilität des Verfahrens
gegeben, außerdem
kann die permanente Zwangsbewegung des Probengemisches durchgeführt werden.
Diese Ausgestaltung ist besonders für eine automatische Abarbeitung
von Proben geeignet, weil, während
die erste Platte inkubiert, bei einem Notfall in diese Platte eine
individuelle Nachbeschickung erfolgen kann, welche Probe anschließend nach
der kurzen Inkubationszeit von 5 Minuten in der zweiten Platte oder
einem Streifen für
den Zentrifugenschritt weiter bearbeitet werden kann, hingegen die
auf die übrigen
Proben der ersten Platte einwirkende verlängerte Inkubationszeit keine
negativen Auswirkungen auf die nachfolgenden Ergebnisse hat.
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Selbstverständlich ist es ebenso möglich, bei
der Verwendung von kodierten Gefäßen das
Probengemisch vor der Inkubation direkt auf das im Gefäß befindliche
PP-Gemisch zu geben; hierbei findet eine Zwangsbewegung des Probengemisches
nicht statt. Die für
die Durchführung
des Verfahrens verwendeten Nachweisgefäße zur Aufnahme des PP-Gemisches
können
sowohl Rundboden- oder
Spitzboden- oder Flachbodengefäße als auch
Säulen
sein.
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In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens
wird ein hochmolekulares Dextran verwendet. Das Dextran weist ein
Molgewicht ungefähr
von 100 bis 40.000.000 g/Mol, vorzugsweise von 2.000.000 (2μ106) g/Mol, auf und liegt in einem Bereich
zwischen 0,1Gramm/Liter bis 500 Gramm/Liter, vorzugsweise 5Gramm/Liter
bis 40Gramm/Liter, insbesondere von 20Gramm/Liter, im Einbettpuffer
vor.
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In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens
weist das Polyethylenglycol ein Molgewicht ungefähr von 50 bis 40.000 g/Mol,
vorzugsweise 3500–4500
g/Mol, auf und liegt in einem Bereich zwischen 1Gramm/Liter bis 100Gramm/Liter,
bevorzugt zwischen 10Gramm/Liter bis 70Gramm/Liter, insbesondere
40 g/L, im Einbettpuffer vor.
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In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens
liegt das Glycocoll (Glyzin) in einem Bereich zwischen 1g/Liter
bis 100g/Liter, bevorzugt l0Gramm/Liter bis 25Gramm/Liter, insbesondere
18,0168 Gramm/Liter, im Einbettpuffer vor.
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In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens
liegt das Trisodiumcitrat (C6H5O7Na3) in einem Bereich
zwischen 0,01Gramm/ Liter bis 10Gramm/Liter, bevorzugt 1Gramm/Liter
bis 5Gramm/Liter, insbesondere 2,581 g/L, im Einbettpuffer vor.
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In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens
kann sich, in allen Varianten, der Einbettpuffer in einem ph-Bereich
von 4 bis 9, bevorzugt von 6,9 bis 7,1, befinden.
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In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens
wird zur Haltbarmachung dem PP-Gemisch
Natriumazid (NaN3) zugefügt, welches in einem Bereich
zwischen 0,01g/-Liter
bis l0Gramm/Liter, bevorzugt zwischen 0,5Gramm/Liter bis 2Gramm/-Liter, insbesondere
1 g/L, vorliegt.
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Für
den Antikörpersuchtest
mittels des PP-Gemisches hat sich als vorteilhaft herausgestellt,
wenn die Innenwandungen der Nachweisgefäße mit Proteinen kodiert sind,
insbesondere mit Anti-IgG, Anti-IgA, Anti-IgM, Protein A, Protein
G und/oder mit einer Mischung derselben. Der in bekannter Weise
bei positiver Reaktion entstehende Rasen ist erfindungsgemäß äußerst stabil,
die Reaktion ist äußerst sensitiv.
Außerdem
hat sich gezeigt, dass derartig präparierte Platten vakuumverpackt
oder unter Schutzgas verpackt in einfachster Weise zu versenden
und im Kühlschrank
lange Zeit zu lagern sind.
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In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens
hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Fangproteine, zum
Beispiel Anti-IgG, stabilisiert werden. Zur Stabilisierung der an
den Innenwandungen der Nachweisgefäße befindlichen Proteine werden
Stabilisierungssubstanzen verwendet, wie Triton X-100 oder Albumin
oder Casein oder Gelatine oder Tween 20 oder Mischungen derselben
innerhalb eines Puffers. Diese bekannten Puffer mit den genannten
Substanzen, welche in der ELISA-Technik zum Blocken von unspezifischen
Reaktionen (falsch positiv oder erhöhter Background) verwendet
werden, dienen hier zur mechanischen Stabilisierung der Proteine
und somit zur Sichtbarmachung der positiven Reaktion. Eine Erklärung ist,
dass die Stabilisierungssubstanzen die Fangproteine einhüllend umgeben,
so dass die Fangproteine bei der hohen Zentrifugationszahl mechanisch
nicht weggebogen oder verschoben werden können. Diese Stabiliierung kann
entweder sofort nach der Kodierung oder erst vor der Verwendung
der kodierten Gefäße durchgeführt werden.
Hierzu hat sich gezeigt, dass, wenn keine Stabilisierung der Fangproteine
stattfindet, bei Durchführung
des Verfahrens keine vernünftig
positive Reaktion nachzuweisen ist, obwohl eine derartige Reaktion
aufgrund der Versuchsbedingungen zu erwarten gewesen wäre.
-
In einer weiteren Ausgestaltung des
Verfahren ist das gesonderte Reaktionsgefäß zur Reaktion des Probengemisches
während
der Inkubation mit einer Membran nach unten verschlossen, wobei
Reaktionsgefäß und Nachweisgefäß, in welchem
sich das PP-Gemisch befindet, ineinander bzw. aufeinander fügbar sind und
zur Sichtbarmachung der Reaktion das Reaktionsgefäß in bzw.
auf das Nachweisgefäß gefügt wird
und beide gemeinsam zentrifugiert werden, wobei während der
Zentrifugation der beiden Gefäße die Membran
des Reaktionsgefäßes wenigstens
teilweise für
das Probengemisch durchlässig
wird und dieses in das Nachweisgefäß eintritt.
-
Diese Ausgestaltung unter Verwendung
einer Membran, welche den Boden des Reaktionsgefäßes bildet, ist insbesondere
vorteilhaft für
eine manuelle Abarbeitung von Proben. Denn bei einer manuellen Abarbeitung
der Proben entfällt
der Pipettierschritt zum Einpipettieren des Reaktionsgemisches in
das Nachweisgefäß. In einer
weiteren Ausgestaltung des Verfahren sind Reaktionsgefäß und Nachweisgefäß ein und
dasselbe Gefäß sowohl
zur Durchführung
der Inkubation und Reaktion als auch des Nachweises der Reaktion,
wobei das Gefäß in zwei
Teile geteilt ist und sich im unteren Teil des Gefäßes das
PP-Gemisch befindet, welches durch eine Membran abgedeckt ist, und
oberhalb derselben im oberen Teil sich der Reaktionsraum für die Reaktion
des Probengemisches während
der Inkubation befindet. Während
der nachfolgenden Zentrifugation des Gefäßes wird die Membran wenigstens
teilweise für
das Probengemisch durchlässig.
Diese Ausgestaltung hat die allgemeinen Vorteile, dass das verwendete
Gel oder PP-Gemisch in das Gefäß schon
eingefüllt
sein kann und durch die Membran zuerst einmal sicher verschlossen
ist. Der weitere Vorteil besteht darin, dass nunmehr mit ein und
demselben Gefäß der Inkubationsschritt
mit der Zwangsbewegung des Probengemisches durchgeführt werden
kann.
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Bei dieser Ausgestaltung eines Probengefäßes mit
einer Membran kann das Gefäß praktisch
beliebig geformt sein, zum Beispiel eine Spitzboden- oder Rundboden- oder Flachboden-Mikrotiterplatte
oder eine Säule
sein. Eine Spitzboden- oder Rundboden-Mikrotiterplatte oder Streifen
wird von oben oder unten ausgewertet; eine Säule oder Flachbodenplatte oder
Streifen wird seitlich ausgewertet.
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Die Anwendung einer Membran kann
ebenso auf beliebige Partikel-Tests, zum Beispiel Gel-Tests, angewendet
werden. Ein derartiges Behältnis
zur Durchführung
eines Verfahrens zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen, wie
zur Blutgruppenbestimmung, Antikörper-Suchtest,
Serumgegenprobe sowie zur Infektionsserologie, in einer Testflüssigkeit
durch Reaktion mit einem vorge gebenen spezifischen Bindungspartner,
wobei die Antigene bzw. die Antikörper oder die spezifischen
Bindungspartner in der Testflüssigkeit
ungebunden und/oder an einen Träger
gebunden sind und das dergestalt hergestellte Probengemisch einem
Inkubationsschritt ausgesetzt wird, wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion
ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw.
den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches
optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, ist dadurch gekennzeichnet,
dass ein Behältnis,
welches ein Rundboden- oder Spitzboden- oder Flachbodengefäß oder eine Säule ist,
durch eine Membran in zwei Kammern getrennt ist, nämlich in
eine obere und eine untere Kammer, wobei die Membran die in der
unteren Kammer befindliche Nachweisschicht, zum Beispiel ein Gel,
zur optischen Sichtbarmachung einer stattgefundenen Reaktion abdeckt
und die obere Kammer den Reaktionsraum für die Aufnahme und Reaktion
des Probengemisches darstellt, wobei durch einen Zentrifugationsschritt
die Membran wenigstens teilweise durchlässig wird und dadurch das Probengemisch
vom Reaktionsraum in den Nachweisraum gelangt.
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Im allgemeinen Fall kann das Behältnis auch
aus zwei gesonderten Gefäßen bestehen,
wobei das erste Gefäß nach unten
durch die Membran verschlossen ist und zur Aufnahme des Probengemisches
und Durchführung
gegebenenfalls einer Inkubation und der Reaktion dient, und das
zweite Gefäß die Nachweisschicht, zum
Beispiel ein Gel, enthält
und zur Sichtbarmachung der Reaktion dient und die beiden Gefäße ineinander bzw.
aufeinander fügbar
sind und beide Gefäße gemeinsam
zentrifugiert werden, wobei während
der Zentrifugation der beiden Gefäße die Membran des Reaktionsgefäßes wenigstens
teilweise für
das Probengemisch durchlässig
wird und dieses dadurch in das Nachweisgefäß eintritt. In beiden Fällen kann
natürlich
eine Zwangsbewegung des Probengemisches während der Inkubation erfolgen.
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Die Membran kann aus Kunststoff oder
Kautschuk oder aus einer Gummimischung bestehen oder ein Latex oder
ein Gel sein.
-
Beispiele zur Durchführung des
Verfahrens sind nachfolgend beschrieben. In der Zeichnung zeigen.
-
1 ein
V-Boden-Gefäß, beispielsweise
in einer Mikrotiterplatte, mit einer Membran
-
2 ein
Rundbodengefäß einer
Mikrotiterplatte mit einer Membran
-
3 ein
V-Boden-Gefäß mit einem
unterhalb einer Membran befindlichen Stachel zum Durchstechen der
Membran und
-
4 ein
V-Boden-Gefäß mit einem
oberhalb einer Membran angeordneten, nach unten beweglichen Stachel
zum Durchstechen der Membran.
-
Im nachfolgenden Beispiel wird von
kodierten Gefäßen ausgegangen.
Zur Verwendung kommen vorzugsweise handelsübliche V-Boden-ELISA-Platten,
welche in 12- oder 8-ter Riegel unterteilt sein können. Ein Kodierungspuffer
wird mit spezifischen Proteinen, wie Anti-IgG, im Verhältnis von
cirka 1:800 mit PbS-Puffer verdünnt und
eine Lösung
hergestellt. In ein jedes Gefäß werden
von der genannten Lösung
cirka 50yLiter einpippetiert. Das Gefäß wird einer Inkubation über Nacht
bei Raumtemperatur unterworfen. Die Lösung bzw. restliche Lösung aus
Kodierpuffer und spezifischen Proteinen wird entfernt und es wird
ein PbS-Puffer,
welcher eine zirka 1%tige Rinderlösung enthält, von 200yLiter in jedes
Gefäß hinzugefügt.
-
Das Gefäß wird während einer bis 2 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert, wonach zum Beispiel ein Auswaschen des
Gefäßes mittels
eins Waschpuffers erfolgt, in welchem zum Beispiel Tween 20 und
Rinderalbumin enthalten sind. Das Gefäß ist nunmehr als kodiertes
Gefäß fertig
präpariert
und steht zur weiteren Verwendung als Nachweisgefäß zur Verfügung. Diese
sind nach einer Vakuum- oder
Schutzgasverpackung sehr lange haltbar. Mit einer dergestalt kodierten
Platte kann ein Arbeitsablauf für
einen Antikörper-Suchtest,
zum Beispiel Antikörper-Suchzellen
von 1, 2 und 3, wie folgt durchgeführt werden:
In gesonderte
Reaktionsgefäße, welche
unbehandelte, handelsübliche
V-Bodengefäße, Mikrotiterplatte,
sein können,
werden 3mal 25μLiter
Serum oder Plasma plus 50 μLiter
Suchzellensuspension 1,2,3 zu 0,3%±0,1% eingegeben,
wobei die Arbeitsverdünnung
mit modifiziertem Liss-Puffer erfolgt. Die Gefäße werden bei cirka 37Grad
Celsius und gleichzeitig bei einer Schüttelfrequenz zwischen 700±25 UpM
während
5 Minuten inkubiert und ein Probengemisch erzeugt. Während der
Inkubation wird das Puffer-Gel-Gemisch mittels eines Steppers von
50 μLiter
in die Nachweisgefäße einpippetiert;
danach werden jeweils 50μLiter
des Probengemisches auf das PP-Gemisch in den Nachweisgefäßen einpippetiert.
Die Nachweisgefäße werden
einem Zentrifugierschritt während
cirka 2 Minuten bei cirka 20548 unterworfen. Anschließend wird
das Reaktionsergebnis innerhalb der Nachweisggefäße optisch ausgewertet entweder
visuell oder automatisch. Eine positive Reaktion zeigt sich als
Monolayer, Rasen, eine negative als Knopf. Da es sich um eine Mikrotiterplatte
handelt, wird das Ergebnis entweder durch Aufsicht von oben oder
unten abgelesen.
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Die mit Anti-IgG kodierte Platte
zeigt einmal IgG-Antikörper
und aufgrund des PP-Gemisches gleichzeitig auch eventuell vorhandene
IgM-Antikörper
an. Bei einer positiven Reaktion kann eine selektive Unterscheidung,
ob IgG- und/oder IgM-Antikörper
vorliegen, folgendermaßen
vorgenommen werden, indem eine zweite, unkodierte Platte mit PP-Gemisch
benutzt und der Test nochmals durchgeführt wird. Wird eine negative Reaktion
mit der zweiten Platte erhalten, dann liegt ein IgG-Antikörper vor.
Erscheint eine positive Reaktion gleich der kodierten Platte, dann
liegt ein IgM-Antikörper
vor.
-
Wenn die Reaktion in der zweiten
Platte gegenüber
derjenigen in der ersten Platte schwächer ausfällt, dann liegt eine Mischform
von IgG- und IgM-Antikörper
vor. Ebenso wird keine Kodierung von Anti-C3d benötigt, da
der Nachweis so empfindlich ist, dass die wenigen Komplement bildenden
IgG-Antikörper
zum Nachweis ausreichen. Falls keine IgM-Antikörper wegen eventueller unspezifischer
Reaktionen gewünscht
werden, können
reduzierende, bekannte Agenzien, zum Beispiel Natriumdithionit,
zur Reduktion bzw. Herabsetzung der IgM-Antikörper genommen werden.
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Beispielsweise werden zur AB0-RH-Bestimmung
sowie zusätzlich
zur Durchführung
der Serumgegenprobe wiederum eine unbehandelte Mikrotiterplatte
als Reaktionsgefäß verwendet.
Es werden in dieselbe
- a) 50μLiter AntiA (Biotest Clone:
A003 IgM) einer mittels Liss-Puffer hergestellten Lösung von
1:100
50μLiter
AntiB (Biotest Clone: B005 IgM) einer mittels Liss-Puffer hergestellten
Lösung
von 1:100
50μLiter
AntiD einer mittels Liss-Puffer hergestellten Lösung von 1:30
50μLiter RH
mono-Control einer mittels Liss-Puffer hergestellten Lösung 1:30
einpippetiert,
- b) es werden jeweils 25μLiter
einer 0,6±0,2%tigen
Erythrozyten-Patientensuspension, in welcher Liss-Puffer enthalten
ist, auf die vorgenannt beschickten vier Gefäße aufpippetiert (das ist für die AB0-RH-erythrozytenseite
Bestimmung notwendig)
- c) es wird 4mal 50μLiter
Plasma (Serumgegenprobe) in weitere vier Reaktionsgefäße einpippetiert,
- d) es werden jeweils 25μLiter
einer 0,6±0,2%tigen
Suspension, in welcher Liss-Puffer
enthalten ist, mit A1-Zellen, A2-Zellen, B-Zellen und 0-Zellen hergestellt
und in die Reaktionsgefäße einpippetiert,
- e) die Probenmischungen werden während cirka 2 bis 5 Minuten
bei Raumtemperatur zwischen 18 bis 25 Grad Celsius und gleichzeitig
bei einer Schüttelfrequenz
zwischen 700 ± 25
UpM inkubiert,
- f) in acht unbehandelte, unkodierte Nachweisgefäße werden
8mal jeweils 25μLiter
PP-Gemisch mittels eines Steppers einpippetiert,
- g) nunmehr werden je 50μLiter
der Probenmischungen in die Nachweisgefäße auf das PP-Gemisch einpippetiert,
- h) die Nachweisgefäße werden
einem Zentrifugierschritt während
cirka 2 Minuten bei cirka 20548 unterworfen und die Reaktionsergebnisse
visuell oder automatisch ausgewertet. Eine negative Reaktion zeigt
sich als Knopf; eine positive Reaktion zeigt sich entweder auf oder
innerhalb des PP-Gemisches, was aber den Eindruck eines Rasens erweckt.
Da es sich um eine Mikrotiterplatte handelt, wird das Ergebnis entweder durch
Aufsicht von oben oder unten abgelesen.
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Ein Testkit besteht zum Beispiel
aus den folgenden Komponenten:
Mit Anti-IgG kodierte Platte
(Nachweisplatte)
Flasche mit PP-Gemisch
Flasche mit modifiziertem
Lis
3 Flaschen mit je Testzellen 1, 2, 3
handelsübliche Reaktionsplatte
-
Ein besonderer Vorteil eines derartigen
Testkits liegt in der einfachsten Versandfähigkeit und in seiner Flexibilität.
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In den 1 und 2 sind je ein V-Boden-Gefäß 1 und
ein Rundbodengefäß 3 mit
einer Membran 2 bzw. 4 gezeigt, welche an der Gefäßwandung
oberhalb des V-Bodens bzw. des Rundbodens über den gesamten Querschnitt
befestigt ist und das Gefäß in zwei
voneinander getrennte Teile trennt. Unterhalb der Membran 2, 4 innerhalb
des Gefäßes 1 bzw.
2 befindet sich das PP-Gemisch 5.
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Hinsichtlich der verwendeten Membran 2, 4 sind
die folgende Ausgestaltungsbeispiele gegeben. Eine Membran 2, 4 aus
Latex kann durch eine vorherige Perforation, vorzugsweise mit einem
Durchmesser von 6 bis 8 μm,
durchlässig
gemacht werden. Da Latex sehr flexibel ist, sind diese Löcher im
Ruhezustand geschlossen. Bei einer Zentrifugation von zum Beispiel
2.500xg eines Gefäßes, welches
vorher mit einer Probenmischung von 50 μLiter befüllt worden ist, hat diese Probenmischung
ein Gewicht von zirka 125 g, welches ausreicht, die Membranöffnungen
aufzuweiten und die Probenmischung bzw. die Erythrozyten passieren
zu lassen.
-
Oder eine Latexmembran 2, 4 hat
eine geringe Membrandicke und ist dergestalt vorgespannt, dass sie
bei der Zentrifugation des Gefäßes 1, 2 schon
bei einem Gewicht von einigen 10g reißt.
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Die 3 und 4 zeigen zwei weitere Möglichkeiten
der Ausführung.
Innerhalb eines V-Boden-Gefäßes 6 ist
oberhalb des V-Bodens eine Latexmembran 7 über den
gesamtem Querschnitt des Gefäßes 6 angeordnet und
zwar vorgespannt. Unterhalb der Latexmembran 7 befindet
sich – neben
dem PP-Gemisch 5 – an der schrägen Wandung
des V-Bodens ein Stachel 8, welcher in Richtung der Membran
aufragt und bis zur Membran 7 reicht.
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Der Stachel kann auch durch eine
scharfe Kante gebildet sein, welche an der Wandung des V-Bodens direkt
unterhalb der Membran ausgebildet ist.
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Während
der Zentrifugation bombiert die Membran 7 aufgrund der
Fliehkraft in Richtung des Bodens des Gefäßes nach unten und dringt in
den Stachel 8 ein oder drückt auf die Kante und wird
so zum Reißen gebracht.
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4 zeigt
ein weiteres V-Boden-Gefäß 9 mit
einer Membran 10, welche oberhalb des V-Bodens über den
gesamtem Querschnitt des Gefäßes 9 gespannt
ist. Oberhalb der Membran 10 ist an der Wandung des Gefäßes 9 ein
beweglicher Stachel 11 angeordnet, welcher bis zur Membran 10 reicht.
Weist dieser beispielsweise ein Gewicht von 0,5 g auf, so ergibt
sich bei einer Zentrifugation von 2.500xg ein Stachelgewicht von 1.250
g, so dass die Membran durchstoßen
und so zum Reißen
gebracht wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist spezifisch
und sehr sensitiv. Es ist einsetzbar für die vollständige Blutgruppenbestimmung,
den Antikörpersuchtest
sowie die Kreuzprobe. Es ist ein Einschrittzentrifugationsverfahren,
welches keiner Waschschritte bedarf. Eine vollständige Blutgruppenbestimmung
und ein Antikörpersuchtest
ist innerhalb von 7 Minuten möglich,
weshalb insbesondere das Verfahren notfalltauglich ist. Aufgrund der
variablen Inkubationszeiten ist das Verfahren notfalltauglich und
für eine
Halb- und Vollautomation sehr gut geeignet. Aufgrund der identischen
Basisreagenzien, Inkubationszeiten und Zentrifugationszeiten ist
die komplette Blutgruppenbestimmung mit Serumgegenprobe, Antikörpersuchtest
und Kreuzprobe auf einer Mikrotiterplatte möglich. Ebenso ist es möglich, auf
derselben Mikrotiterplatte Infektionsserologie, wie zum Beispiel Hepatitis
B, mitabzuarbeiten.