DE10061515A1 - Verfahren zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung - Google Patents
Verfahren zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen sowie zur BlutgruppenbestimmungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder
Antigenen in einer Testflüssigkeit sowie zur Blutgruppenbestimmung durch
Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner, wobei das
Antigen bzw. der Antikörper oder der spezifische Bindungspartner in der
Testflüssigkeit ungebunden und/oder an einen Träger gebunden ist und wobei bei
positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden
Antigenen bzw. Antikörpern, den entsprechenden spezifischen Bindungs
partnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild
detektierbar ist, gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Die Erfindung betrifft
weiterhin die Verwendung von Mikrotiterplatten mit sich verjüngendem bzw.
bombierten Boden zur Durchführung eines Tests zum Nachweis von Anti
körpern oder Antigenen durch Detektion einer Agglutinationsreaktion sowie zur
Blutgruppenbestimmung.
Menschliche Blutgruppensubstanzen, aber auch eine Vielzahl von anderen in
einem Organismus gebildeten Substanzen, werden durch spezifische Antigen-
Antikörper-Reaktionen nachgewiesen. Diese Reaktion ist detektierbar über eine
Vernetzung, Agglutination, von Antigenen (Ag), Antikörpern (Ak) und bestimm
ten Trägersubstanzen, die Antigene oder Antikörper tragen, zu einem makros
kopisch erfaßbaren Komplex, dem Agglutinat.
Beispiele sind die erythrozytenseitige Blutgruppenbestimmung sowie die
Serumgegenprobe. Bei der erstgenannten werden an die Membran des Spender
erythrozyten gebundene Blutgruppen-Antigene durch Reaktion mit Antiseren
nachgewiesen, die Antikörper als spezifische Bindungspartner enthalten. Die
Antikörper sind bekannt (Such-Antikörper), die sich in einer Testflüssigkeit
befinden, zum Beispiel Testantikörper-Aufschwemmung, und die unbekannte
Erythrozyten (unbekannte Antigene) enthält. Die Agglutination wird unter
geeigneten Reaktionsbedingungen durch Reaktion von Antigen und Antikörper
hervorgerufen. Damit kann das System ABO und RH und darüber hinaus noch
eine Vielzahl von Antigenen bestimmt werden.
Bei der Serumgegenprobe sind die Erythrozyten bekannt, die bekannte Antigene
(Such-Antigene) aufweisen. Die Testflüssigkeit, zum Beispiel Serum, beinhaltet
die unbekannten körpereigenen Antikörper (sog. Isoagglutinine), die durch
Reaktion mit den Test-Erythrozyten nachgewiesen werden. Damit kann
ebenfalls die Blutgruppe, jedoch nur ABO, bestimmt werden.
Zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern sind aus der EP 0305337 B1
Verfahren bekannt, die positive bzw. negative Antigen-Antikörper-Reaktionen
in einem Reaktionsgefäß optisch sichtbar machen. In einem transparenten
Mikroreaktiongefäß, welches eine Dispersion oder Suspension inerter Partikel in
Form sogenannter Beads, zum Beispiel Agarose, und die bekannten, für die
nachzuweisenden Antigene bzw. Antikörper spezifischen Bindungspartner
enthält, wird eine vorbestimmte Menge einer Testflüssigkeit trägergebundener
Komplexe zugefügt, die nachzuweisende Antigene bzw. Antikörper an Träger
gebunden enthält. Anschließend wird die Mischung zur Sedimentation einem
Zentrifugierschritt ausgesetzt; die Sichtbarmachung einer Reaktion ist nur über
einen solchen Zentrifugierschritt möglich. Durch normale Gravitation wird eine
Sedimentation zum tiefsten Punkt des Gefäßes hin nicht erreicht.
Bei der Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes lagert sich dieser im stark
positiven Fall auf den inerten Partikel auf und ist im schwach positiven Fall
innerhalb der inerten Partikel vorhanden; bei Abwesenheit eines Antigen-
Antikörper-Komplexes, d. h. im negativen Fall, liegt das Sediment unter den
inerten Partikeln. Das Verfahren wird in einem einzigen länglich-schmalen
Mikroreaktionsgefäß durchgeführt, welches aus drei Abschnitten besteht,
nämlich einem oberen, einem mittleren und einem unteren Abschnitt, wobei der
obere und der untere Abschnitt zylindrisch gestaltet sind und der obere
Abschnitt einen größeren Durchmesser als der untere Abschnitt aufweist. Der
mittlere Abschnitt ist konisch gestaltet und verbindet die beiden benachbarten
Abschnitte miteinander; eine. Mehrzahl solcher Gefäße kann parallel in Form
einer Karte angeordnet sein und als handliche Einheit Verwendung finden.
Das Gefäß wird zentrifugiert und danach der Ort optisch ermittelt, an dem sich
die Träger ansammeln. Sammeln sich diese oberhalb der inerten Partikelschicht
an, so weist dies auf eine stark positive Antigen-Antikörper-Reaktion hin: Die zu
einem Agglutinat vernetzten Träger werden durch die Partikel daran gehindert,
gemäß der Zentrifugalkräfte zum Boden des Gefäßes durchzudringen. Bei nega
tiver Antigen-Antikörper-Reaktion dringen dagegen die nicht vernetzten Träger
zum Gefäßboden vor. Anschließend können die Agglutinationsreaktionen
identifiziert werden, indem das Reaktionsgefäß von der Seite betrachtet und die
Lage der Träger optisch erfaßt wird.
Problematisch bei diesem Verfahren ist die Erfassung der schwachen Antigen-
Antikörper-Reaktionen, bei denen eine ungleichmässige, flockige Verteilung von
Agglutinat über die Füllhöhe der Partikel beobachtet wird. Diese Reaktionen
lassen sich daher nicht zuverlässig automatisch erfassen. Nachteilig ist auch
die Kartenform, in der die Gefäße angeordnet sind und die immer nur sechs
Untersuchungen zuläßt. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass nur von der
Seite eine Ablesung erfolgen kann.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Vermeidung der Nachteile des
Standes der Technik ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern oder
Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung anzugeben, welches einfach
durchführbar und leicht automatisierbar ist und insbesondere zu höchst
zuverlässigen Testergebnissen führt.
Die Aufgabe wird bei einem Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder
Antigenen in einer Testflüssigkeit bzw. einem Testgemisch sowie zur Blutgrup
penbestimmung durch Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bin
dungspartner, wobei das Antigen bzw. der Antikörper oder der spezifische
Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden und/oder an einen Träger
gebunden ist und wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein
Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern, den ent
sprechenden spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird,
welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, dadurch gelöst, dass ein
Mikroreaktionsgefäß mit einem sich wenigstens im Bodenbereich von oben nach
unten verjüngendem bzw. bombierten Querschnitt verwendet wird, welches im
Bereich der sich verjüngenden bzw. bombierten Wandung mit Fangstoffen,
nämlich Proteinen, wie Protein A und/oder G, und/oder Antigene und/oder
Antikörper, kodiert wird; eine Substanz in Form von feinen Kügelchen, soge
nannten Beads, in das Mikroreaktionsgefäß gefüllt wird; ein vorbestimmtes
Volumen der Testflüssigkeit auf die Beads dem Gefäß zugefügt wird, wobei der
spezifische Bindungspartner entweder der Testflüssigkeit oder den Beads
zugesetzt ist, oder eine weitere Flüssigkeit, die den spezifischen Bindungspartner
enthält, vor oder nach Zufügen der Testflüssigkeit dem Gefäß zugefügt wird; das
Mikroreaktionsgefäß einem Zentrifugierschritt ausgesetzt wird und das sich
ausbildende oder ausgebildete Sediment/Agglutinat in Aufsicht von oben oder
unten auf das Mikroreaktionsgefäß ausgewertet wird, wobei ein flächiges
Agglutinat (Rasenbildung) von Antigenen bzw. Antikörpern, Bindungspartnern
und Trägern auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion, hingegen eine
räumlich geringfügig ausgedehnte Ablagerung (Knopfbildung) von Trägern auf
eine negative Reaktion Antigen/Antikörper-Komplex hinweist.
Statt der Kodierung der Wandung des Mikroreaktionsgefäßes können auch die
Beads kodiert sein, indem eine Substanz in Farm von feinen Kügelchen,
sogenannten Beads, mit Fangstoffen, nämlich Proteinen, wie Protein A und/oder
G, und/oder Antigene und/oder Antikörper, Anti IgG, kodiert wird; ein Mikroreak
tionsgefäß mit einem sich wenigstens im Bodenbereich von oben nach unten
verjüngendem bzw. bombierten Querschnitt verwendet wird, in welches die
kodierten Beads mindestens im Bereich der sich verjüngenden Wandung gefüllt
werden; ein vorbestimmtes Volumen der Testflüssigkeit auf die Beads dem
Gefäß zugefügt wird, wobei der spezifische Bindungspartner entweder der Test
flüssigkeit oder den Beads zugesetzt ist, oder eine weitere Flüssigkeit, die den
spezifischen Bindungspartner enthält, vor oder nach Zufügen der Testflüssigkeit
dem Gefäß zugefügt wird; das Mikroreaktionsgefäß einem Zentrifugierschritt
ausgesetzt wird und das sich ausbildende oder ausgebildete Sediment/Agglutinat
in Aufsicht von oben oder unten auf das Mikroreaktionsgefäß ausgewertet wird,
wobei ein flächiges Agglutinat (Rasenbildung) von Antigenen bzw. Antikörpern,
Bindungspartnern und Trägern auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion,
hingegen eine räumlich geringfügig ausgedehnte Ablagerung (Knopfbildung) von
Trägern auf eine negative Reaktion Antigen/ Antikörper-Komplex hinweist.
Somit können zur Kodierung Proteine A und/oder G, Antikörper, Such-
Antikörper, bekannte Antikörper, Anti IgM oder Anti IgG, genommen werden.
Vorteilhaft kann entweder die Wandung des Mikroreaktionsgefäßes - und hier
insbesondere der schräge Wandungsteil im Bodenbereich - oder es können die
Beads kodiert werden, wie auch die Kodiersubstanzen den Beads zugemischt
werden können. Ebenso ist es möglich, sowohl die Wandung des Mikroreak
tionsgefäßes als auch die Beads mit derartigen Fangstoffen zu kodieren.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass
die Reaktion in einem oben offenen und am Boden geschlossenen Mik
roreaktionsgefäß durchgeführt wird, das wenigstens in seinem bodennahen
Bereich einen sich verjüngenden oder bombierten Querschnitt aufweist, so dass
das Gefäß wenigstens in seinem bodennahen Bereich wenigstens teilweise eine
schräge bzw. gekrümmte Wandung besitzt, die in den Boden übergeht bzw. den
Boden bildet, mindestens in diesen bodennahen Bereich mit schräger bzw.
gekrümmter Wandung des Gefäßes die Beads eingefüllt sind; das vorbestimmte
Volumen der Testflüssigkeit in das Gefäß auf die Beads aufgegeben wird; das
Mikroreaktionsgefäß zentrifugiert wird, bis sich in der Grenzschicht zwischen
der schrägen Wandung des Mikroreaktionsgefäßes und der homogenen Schicht
aus der Substanz das sichtbare Sediment/Agglutinat ausbildet, wobei eine auf
der schrägen Wandung des Gefäßes in der Grenzschicht sich flächig ausbildende
Agglutinatschicht auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion hinweist und
ein insbesondere im Bereich des tiefsten Punktes des Bodens bzw. der schrägen
Wandung des Gefäßes sich bildende, räumlich geringfügig ausgedehnte Abla
gerung auf eine negative Reaktion ohne Antigen/Antikörper-Komplex hinweist.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt insbesondere darin, dass
eine Mehrzahl von Mikroreaktionsgefäßen in eine bekannte, handelsübliche
Mikrotiterplatte integriert sind, so dass über die Mikrotiterplatte gleichzeitig
soviel Untersuchungen erfolgen können, wie diese Mikroreaktionsgefäße auf
weist. Ebenso ist die Ablesung des Ergebnisses von oben oder unten möglich.
Diese Vorteile ermöglichen insbesondere auch die automatisierte Ablesung und
die Automatisierung des Verfahrens.
Wenn die Wandung des Mikroreaktionsgefäßes kodiert ist, so findet die Reaktion
zwischen Beads und Wandung in der Grenzschicht statt. Wenn hingegen die
Beads kodiert sind oder die Antikörper in die Beads eingemischt sind, findet die
Reaktion, Komplexbildung, zwischen den Beads oder oberhalb derselben statt.
Sind sowohl Wandung als auch Beads kodiert oder die Antikörper in die Beads
eingemischt, so findet die Reaktion sowohl zwischen den Beads und der Wandung
in der Grenzschicht zwischen den Beads oder oberhalb derselben statt.
In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung des Verfahrens wird die Analyse, ob in
einem Mikroreaktionsgefäß eine Antikörper-Antigen-Reaktion stattgefunden
hat, anhand des Sedimentationsbildes optisch durch eine Bedienperson oder
automatisch mittels eines Photometers oder mittels einer Video- oder CCD-
Kamera vorgenommen. Die Analyse, ob in einem Mikroreaktionsgefäß eine
Antikörper-Antigen-Reaktion stattgefunden hat, erfolgt ebenso photometrisch,
indem die Absorption des in der Vertiefung enthaltenen Gemischs entlang einer
vorbestimmten Linie gemessen und aufgezeichnet und das so ermittelte örtliche
Absorptionsprofil ausgewertet wird. Des Weiteren wird verfahrensgemäß für
eine feste Profilbreite die Profillänge ermittelt und eine positive bzw. negative
Reaktion dann diagnostiziert, wenn die Profillänge unterhalb bzw. oberhalb eines
vorbestimmten Wertes liegt.
Die Substanz besteht aus Beads zum Beispiel ein geeignetes Gel in Form
feinster Kügelchen, die Beads können aber auch inerte Glaskügelchen oder
Plastikkügelchen sein. Derartige Gel-Beads sind in handelsüblicher Form
erhältlich, beispielsweise Agarosebeads.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung einer Serumgegen
probe, die Isoagglutinine beinhaltet, oder zum Nachweis von irregulären Blut
gruppenantikörpern (Antikörper-Suchtest) oder zur erythrozytenseitigen Blut
gruppenbestimmung mittels bekannter Antikörper dient, dann enthält die
Testflüssigkeit Blutserum mit unbekannten Antikörpern oder unbekannte
Erythrozyten. Der Testflüssigkeit oder der Substanz aus Beads wird eine
Flüssigkeit zugefügt, die Testerythrozyten oder Testantikörper einer bekannten
Blutgruppe enthält. Im speziellen Fall, zum Beispiel für die Serumgegenprobe,
sind die Träger mit spezifischen Bindungspartner-Antigenen bekannter Blut
gruppe besetzt, die den nachzuweisenden Antikörper (Isoagglutinin) nachweisen.
Bei Blutgruppenantikörpern (Antikörper-Suchtest) sind es ebenfalls spezifische
Bindungspartner-Antigene, die auf den Erythrozyten sitzen. Diese zeigen dann
den irregulären Antikörper an. Bei erythrozytenseitiger Blutgruppenbe
stimmung ist das Trägerantigen nicht bekannt, sondern in der Testflüssigkeit
oder in der Substanz befindet sich der bekannte Suchantikörper.
Einer der Flüssigkeiten bzw. dem Gemisch oder den Beads können zum
Zeitpunkt der Untersuchung Proteine, wie Protein A und/oder G, und/oder
Antigene, und/oder Antikörper (Anti-IgG (Coombsserum), Anti-C3d, Anti-IgM)
zugesetzt werden, was Einfluß auf die Reaktion nimmt. Die Träger innerhalb der
Testflüssigkeit sind Erythrozyten, Leukozyten, Blutplättchen, Latex-Partikel
oder Agarose-Partikel, Glaspartikel oder Kunststoffpartikel.
In vorteilhafter Weise kann somit das erfindungsgemäße Verfahren zur erythro
zytenseitigen Blutgruppenbestimmung, zur Bestimmung von irregulären
Antikörpern und zur Serumgegenprobe eingesetzt werden.
Die Querschnittsfläche des Gefäßes kann im Bereich der Füllhöhe der Substanz
wenigstens das Vierfache der Querschnittsfläche des Gefäßes im Bereich
unterhalb der Substanz betragen. Es werden Spitzboden- oder Rundboden-
Mikrotiterplatten oder Mikrotiterplatten, deren Boden bombiert ist, verwendet,
wobei das Mikroreaktionsgefäß eine Vertiefung einer Spitzboden- oder
Rundboden-Mikrotiterplatte sein kann.
Die Schicht aus den Beads sowie der Zentrifugierschritt haben die Aufgabe, eine
infolge Antigen-Antikörper-Reaktion erfolgte Agglutination der Antigen- und/oder
Antikörperträger, d. h. die vernetzten Antigen- und/oder Antikörperträger, durch
die Beads zu drücken und in Form einer flächigen Schicht ("Teppich" bzw.
"Rasen") im Bereich der V-Vertiefung oder bombierten Vertiefung sichtbar zu
machen und zu halten. Dagegen wandern unvernetzte Träger beim
Zentrifugieren an der schrägen Wandung entlang und sammeln sich
vorzugsweise (weil das Gefäß sich verjüngt) an dem tiefsten Teil des
Gefäßbodens unter Ausbildung eines räumlich erheblich weniger ausgedehnten,
im Idealfall punktförmigen, optisch erfaßbaren Gebildes ("Knopf") an.
Des Weiteren besitzt das Verfahren den Vorteil, dass als Mikroreaktionsgefäße
herkömmliche Mikrotiter-Wegwerfplatten mit V-förmiger oder bombierter
Vertiefung zum Einsatz kommen können, die kostengünstig und mit einem
Pippettierroboter leicht zu handhaben sind. Diese müssen zur Durchführung des
Verfahrens erfindungsgemäß kodiert werden; oder es werden die Beads kodiert
und anschließend in die Mikroreaktionsgefäße eingefüllt.
Die Auswertung erfolgt entweder mit dem bloßen Auge oder insbesondere
vollautomatisch mit einer Video- oder CCD-Kamera durch Aufsicht bzw.
Unteransicht oder Seitenansicht auf das Gefäß. Denkbar ist auch eine
photometrische Auswertung.
Die Träger, an welche die nachzuweisenden Antigene bzw. Antikörper oder die
spezifischen Bindungspartner gebunden sind, sind vorzugsweise Erythrozyten,
Leukozyten, Blutplättchen oder Latex-Partikel. Die Latex-Partikel können zur
einfacheren optischen Auswertung sichtbar gefärbt oder fluoreszenz-markiert
sein. Die Konzentration der Träger in der Reaktionsflüssigkeit ist so zu wählen,
dass das Agglutinat mit der gewählten optischen Detektionsmethode zuver
lässig detektierbar ist.
Erfindungsgemäß wird das Sedimentationsbild optisch durch Aufsicht von oben
oder unten auf das Reaktionsgefäß oder auch seitlich ausgewertet. Falls von
unten oder seitlich gemessen wird, muß das Mikroreaktionsgefäß transparent
sein. Es ist vorzugsweise auch transparent, falls von oben ausgewertet wird, um
den Kontrast der Träger zum Hintergrund zu erhöhen. Durch die
unterschiedlichen Gefäßquerschnitte im oberen Bereich der Substanz und in
deren unterem Bereich bzw. im Bereich des Gefäßbodens wird im Falle einer
Agglutination in der Grenzschicht ein flächiger "Teppich" bzw. "Rasen" aus
vernetzen Trägern erzeugt, während sich die Träger in einem in der Aufsicht
kleineren Bereich ansammeln, wenn keine Agglutination erfolgt. Die Antigen-
Antikörper-Reaktion kann somit optisch sehr einfach detektiert werden durch
Messung der räumlichen Ausdehnung der Ansammlung der Träger. Das
Sedimentationsbild kann visuell durch eine Bedienperson oder automatisch auf
photometrischem, flurometrischem Weg oder videogesteuert analysiert werden.
Da die Trägeransammlung im wesentlichen von oben oder unten vermessen
wird, ist eine besonders gute Automatisierbarkeit des Verfahrens gegeben. Ins
besondere Mikrotiterplatten mit einer Mehrzahl von Mikroreaktionsgefäßen, die
in einer Ebene angeordnet sind, lassen sich in Aufsicht von oben oder unten auf
die Platte besonders gut in einem Arbeitsgang auswerten.
Die Deutlichkeit des sichtbaren bzw. detektierbaren Reaktionsergebnisses
hängt unter anderem von der gewählten Gefäßform ab. Daher ist das Gefäß,
zumindest im Bereich der Schicht aus der Kügelchen-Substanz, sich konisch
verjüngend ausgebildet und besitzt eine sich verjüngend verlaufende oder schräg
umlaufende bzw. konische bzw. bombierte Wandung, z. B. eine V-Vertiefung
einer Spitzboden-Mikrotiterplatte oder eine bombierte, gerundete Vertiefung
einer Rundboden-Mikrotiterplatte, die in ihrem unteren Bereich eine schräge
Wandung aufweist, wobei die Schräge im Schnitt eine schiefe Ebene oder auch
eine gekrümmte Kurve sein kann. Gute Ergebnisse werden allgemein erzielt,
wenn die Querschnittsfläche des Gefäßes im Bereich der Füllhöhe der Kügel
chen-Substanz wenigstens das Vierfache der Querschnittsfläche des Gefäßes im
Bereich unterhalb der Substanz beträgt.
Vorzugsweise erfolgt die Analyse, ob in einem Mikroreaktionsgefäß eine
Antikörper-Antigen-Reaktion stattgefunden hat, photometrisch, indem die
Absorption des in der Vertiefung enthaltenen Gemischs entlang einer
vorbestimmten Linie gemessen und aufgezeichnet und das so ermittelte örtliche
Absorptionsprofil ausgewertet wird. Diese Auswertemethode ist gut für die
Auswertung einer Vielzahl von Proben, z. B. einer Mikrotiterplatte, in einem
Arbeitsgang und damit in einer automatisierten Farm des Verfahrens geeignet.
Indem nur ein Absorptionsprofil gemessen wird, ist die zu speichernde und
auszuwertende Datenmenge gegenüber beispielsweise Videoauswertung
verringert. Vorzugsweise wird dabei für eine feste Profilbreite die Profillänge
ermittelt. Eine positive bzw. negative Reaktion wird dann diagnostiziert, wenn
die Profillänge unterhalb bzw. oberhalb eines vorbestimmten Wertes liegt. Diese
Auswertemethode hat sich als besonders zuverlässig erwiesen.
Das Bild der Reaktionsgefäße kann alternativ mittels einer Video- oder CCD-
Kamera oder dergleichen aufgezeichnet werden. Durch Bildanalyse können
positive von negativen Reaktionen unterschieden werden. Eine weitere Möglich
keit zur Erfassung der Reaktionsbilder ist die Fluoreszenzmarkierung der Träger
und Detektion der räumlichen Emission von Fluoreszenzlicht.
Kurzbeschreibung der Zeichnung, in der zeigen:
Fig. 1 einen stark schematisierten Längsschnitt durch den Bodenbereich
eines Mikroreaktionsgefäßes, dessen Boden mit Fangstoffen
kodiert ist und welches mit Beads gefüllt ist und
Fig. 2 ein weiteres Mikroreaktionsgefäß, bei dem die Beads mit den
Fangstoffen kodiert sind, der Boden hingegen nicht.
Die Zeichnung zeigt in beiden Figuren stark schematisch vereinfacht darge
stellte Reaktionsgefäße im Längsschnitt, die Vertiefungen in Spitzboden-Mikro
titerplatten sind.
Fig. 1 zeigt schematisch ein Reaktionsgefäß 1 bzw. Mikroreaktionsgefäß im
Längsschnitt, welches z. B. Vertiefungen in Spitzboden-Mikrotiterplatten sind.
Die Mikroreaktionsgefäße 1 sind im oberen Bereich zylinderförmig und verjüngen
sich im unteren Bereich konisch. Sie enthalten bis zu einer bestimmten Füllhöhe
eine Substanz in Form von feinsten Kügelchen oder Beads 2, insbesondere
Beads aus einem Gel. Die Beads- oder Kügelchen-Schicht sollte wenigstens so
dick sein, dass die Wandung des Gefäßes im sich verjüngenden Bereich bedeckt
ist. Die dargestellten Größenverhältnisse sind nur stark schematisch darge
stellt; der Durchmesser der Kügelchen ist erheblich kleiner als der mittlere
Durchmesser der Erythrozyten.
Vor dem Einfüllen der Beads werden die Mikrotiterplatten kodiert. Mit der Be
zugsziffer 3 sind derartige Fangstoffe bezeichnet, bei denen es sich um Proteine,
wie Protein A und/oder G, und/oder Antigene und/oder Antikörper handelt.
Auf die Beads wird ein bestimmtes Volumen der Testflüssigkeit 4 aufgebracht,
welche Träger, Antigene und/oder Antikörper 5 enthält. Die Träger, die zum
Nachweis einer Antigen-Antikörper-Reaktion optisch detektiert werden, sind
hier stark übertrieben als Kreuze dargestellt.
Fig. 2 zeigt schematisch ein Reaktionsgefäße 6 im Längsschnitt, welches z. B.
Vertiefungen in Spitzboden-Mikrotiterplatten sind. Hier sind die Beads 7 mit
den Fangstoffen 8 kodiert: auf die Beads 7 ist wiederum die Testflüssigkeit 9
gefüllt, welche die Träger 10 enthält.
Bei negativer Reaktion, also nichtagglutinierend, wandern die Träger auf Grund
der Zentrifugation auf den V-förmigen Boden des Gefäßes und wandern
(sedimentieren) weiter auf dem Boden in der Grenzschicht zur tiefsten Stelle des
Mikroreaktionsgefäßes. Der Zentrifugalkraft folgend sammeln sich die nicht
agglutinierten Träger am tiefsten Punkt des Gefäßes zu einem räumlich eng
umgrenzten Gebilde an, dass optisch leicht zu identifizieren und von den
flächigen Agglutinaten gut zu unterscheiden ist.
Bei einer positiven Reaktion werden die Erythrozyten mit den gebundenen
Antikörpern auf Grund des größeren Gewichts beim Zentrifugieren durch die
Beads-Schicht durchgedrückt. Die freien Antikörper sind hingegen leichter und
bleiben oben liegen oder oben schwimmend in der Flüssigkeit zurück.
Zum Antikörper-Suchtest inkubieren die bekannten Suchzellen 15 Minuten bei
ca. 37 Grad C mit dem zu untersuchenden Patientenserum. Dieses Gemisch
schwimmt auf den Beads. Oder dieses Gemisch wird extra inkubiert und wird
erst unmittelbar vor dem Zentrifugationsschritt oder auch dem Schüttelschritt
zugefügt. Dabei erfolgt eine Beladung mit inkompletten Antikörpern IgG. Durch
die folgende Zentrifugation werden die beladenen Suchzellen zwischen den Beads
auf die Plastikwandung zu durchgedrückt. Dort kommt es aufgrund der Kodie
rung zu einer Brückenbildung der kodierten Anti-IgG mit IgG auf Erythrozyten,
was sich als Rasen ausbildet. Die freien Antikörper und das Serum bleiben
hingegen an der Oberfläche, was als Siebeffekt zu bezeichnen ist.
Im Folgenden ist die Verfahrensweise zur Herstellung von kodierten
Mikrotiterplatten, die nicht gewaschen zu werden brauchen, beispielsweise von
Gel-Coombsplatten, beschrieben:
Es werden Spitzbodenplatten mit hoher Bindungskapazität genommen [Firma
Greiner ELISA-Platte, 96 85 × 127 V Material Microlon 600 (Binding capacity:
600 ng IgG/cm.cm)]. Zur Beschichtung wird 1 ml Anti IgG Hase (Fa. Ortho) +
19 ml Carbonat-Bicarbonate Puffer ph 9,6 (Fa. Sigma) genommen. Dies ent
spricht einer Verdünnung von 1 : 20; pro Mikroreaktionsgefäß wird 50 µl
(Mikroliter) in die Platte einpippetiert und diese abgedeckt. Die Platte muss bei
Raumtemperatur im Dunkeln ca. 17 Stunden inkubieren. Anschließend wird die
Platte mit 150 µl PBS Puffer Saline PH7,1 (Fa. Life Technologies) 3mal
gewaschen und im Dunkeln bei Zimmertemperatur getrocknet.
Mit diesen Proteinen werden sämtliche Subklassen für IgG abgedeckt.
Es werden Spitzbodenplatten mit hoher Bindungskapazität genommen [Firma
Greiner ELISA-Platte, V 96 85 × 127 V Material Microlon 600 (Binding
capacity: 600 ng IgG/cm.cm)]. Das Protein A und G wird im Verhältnis 1 : 2
gemischt; zum Beispiel 50 µl Protein A + 50 µl G. Dieses Gemisch wird mit 9,9 ml
PPS Puffer Saline PH 7,1 gemischt, was dann einer Proteinkonzentration von
0,01 mg/ml entspricht. Davon kommt in jedes Mikroreaktionsgefäß 50 µl in die
Platte, die dann abgedeckt wird. Die Platte muss bei Raumtemperatur im
Dunkeln ca. 17 Stunden inkubieren. Anschließend wird die Platte mit 150 µl PBS
Puffer Saline PH 7,1 l (Fa. Life Technologies) 3mal gewaschen und im Dunkeln
bei Zimmertemperatur getrocknet.
Eingesetzt wird Patientenserum; die Röhrchen werden 5 Minuten bei 1789 g
anzentrifugiert.
Manueller Ablauf: Es kann aber auch nur Liss als Verdünnungsmedium
genommen werden. Die ca. 3% Suchzellen 1 und 2, Selectogen (Ortho Molta)
werden mit 1 Teil Testerythrozyten und 2 Teile modifizierten Liss + 2 Teile
modifizierte Bromelinlösung, die nur als Verstärker dient, oder auch nur mit 4
Teile Liss versetzt. Dies entspricht einer 0,6% Erythrozytenaufschwemmung.
Ein Teil Patientenserum wird mit 1 Teil modifizierten Liss verdünnt.
Grenzschichttechnik bei 37 Grad C ohne Waschen mit Zentrifugieren.
Es werden einmal Rundbodenplatten und Spitzbodenplatten mit hoher Bin
dungskapazität (600 ng IgG/cm.cm) genommen. Die beschichteten Platten
werden luftdicht abgedeckt und bei 4-8 Grad C gelagert. Die Haltbarkeit der
Platten ist identisch den Elisaplatten und beträgt 6 Monate-1 Jahr.
Eingesetzt wird Patientenserum. Die Röhrchen werden 5 Minuten bei 1789 g
anzentrifugiert.
Die handelsüblichen Agarosebeads, die normalerweise in der Chromatographie
eingesetzt werden (Fa. ICN), werden 3mal mit Suwasol (Fa. Ortho) und einmal
mit modifizierten Liss gewaschen. Anschließend werden 7,5 Teile Agarosebeads
und 2,5 Teile modifiziertes Liss vermischt. Die Haltbarkeit der Lösung ist
abhängig von dem Verfallsdatum des modifizierten Liss.
Die Suchzellen 1 und 2, Selctogen werden auf 0,6% mit modifizierten Liss
aufgeschwemmt. Pro Behältnis werden 50 µl Agarosebeads in die Platte
einpippetiert. Dann werden 25 µl Serum + 25 µl Suchzellen vermischt und
pippetiert. Anschließend wird 15 Minuten im modifizierten Liss aufgeschwemmt
und bei 37 Grad inkubiert. Die Rundbodenplatten werden am besten bei 965 g
für 2 Minuten anzentrifugiert und die Spitzbodenplatten 10 Minuten bei 135 g.
Die angegebenen Mengen der Substanzen, 25 µl Serum + 25 µl Suchzellen,
können auch extra während einer gewissen Zeit, zum Beispiel 15 Minuten,
inkubiert und anschließend auf die Beads in der Mikrotiterplatte gegeben
werden; es erfolgt anschließend der Schritt der Zentrifugation.
Gewerbliche Anwendbarkeit: Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere
zum Antikörper-Suchtest, zur Serumgegenprobe, zur erythrozytenseitigen
Blutgruppenbestimmung (ABO und RH-Formel), wie auch zur Kreuzprobe
geeignet. Mit dem Verfahren kann jede Antigen-Antikörper-Reaktion, die über
Partikel bestimmbar ist, durchgeführt werden. Das Verfahren ist insbesondere
in Krankenhäusern, in medizinischen Laboratorien oder in Einrichtungen zur
Blut- und Plasmagewinnung gewerblich anwendbar. Die besondere Nützlichkeit
des Verfahrens liegt in der vollautomatischen Durchführbarkeit des Verfahrens.
1
Gefäß
2
Beats
3
Kodierung (Anti-IgG)
4
Flüssigkeit
5
inkomplette Antikörper
6
Gefäß
7
Beets
8
Kodierung (Anti-IgG)
9
Flüssigkeit
10
inkompletter Antikörper
Claims (8)
1. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen in einer
Testflüssigkeit sowie zur Blutgruppenbestimmung durch Reaktion mit einem
vorgegebenen spezifischen Bindungspartner, wobei das Antigen bzw. der
Antikörper oder der spezifische Bindungspartner in der Testflüssigkeit
ungebunden und/oder an einen Träger gebunden ist und wobei bei positiver
Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen
bzw. Antikörpern, den entsprechenden spezifischen Bindungspartnern und den
Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist,
dadurch gekennzeichnet, daß
- 1. 1.1. ein Mikroreaktionsgefäß mit einem sich wenigstens im Bodenbereich von oben nach unten verjüngendem bzw. bombierten Querschnitt verwendet wird, welches im Bereich der sich verjüngenden bzw. bombierten Wandung mit Fangstoffen, nämlich Proteinen, wie Protein A und/oder G, und/oder Antigene und/oder Antikörper, kodiert wird;
- 2. 1.2. eine Substanz in Form von feinen Kügelchen, sogenannten Beads, in das Mikroreaktionsgefäß gefüllt wird;
- 3. 1.2 ein vorbestimmtes Volumen der Testflüssigkeit auf die Beads dem Gefäß zugefügt wird, wobei der spezifische Bindungspartner entweder der Test flüssigkeit oder den Beads zugesetzt ist, oder eine weitere Flüssigkeit, die den spezifischen Bindungspartner enthält, vor oder nach Zufügen der Testflüssigkeit dem Gefäß zugefügt wird;
- 4. 1.3 das Mikroreaktionsgefäß einem Zentrifugierschritt ausgesetzt wird und das sich ausbildende oder ausgebildete Sediment/Agglutinat in Aufsicht von oben oder unten auf das Mikroreaktionsgefäß ausgewertet wird,
2. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen in einer
Testflüssigkeit sowie zur Blutgruppenbestimmung durch Reaktion mit einem
vorgegebenen spezifischen Bindungspartner, wobei das Antigen bzw. der
Antikörper oder der spezifische Bindungspartner in der Testflüssigkeit
ungebunden oder an einen Träger gebunden ist und wobei bei positiver Antigen-
Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw.
Antikörpern, den entsprechenden spezifischen Bindungspartnern und den
Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist,
dadurch gekennzeichnet, daß
eine Substanz in Form von feinen Kügelchen, sogenannten Beads, mit Fangstoffen, nämlich Proteinen, wie Protein A und/oder G, und/oder Antigene und/oder Antikörper, kodiert wird;
ein Mikroreaktionsgefäß mit einem sich von oben nach unten verjüngendem Querschnitt verwendet wird, in welches die kodierten Beads mindestens im Bereich der schrägen Wandung gefüllt wird;
ein vorbestimmtes Volumen der Testflüssigkeit auf die Beads dem Gefäß zugefügt wird, wobei der spezifische Bindungspartner entweder der Test flüssigkeit oder den Beads zugesetzt ist, oder eine weitere Flüssigkeit, die den spezifischen Bindungspartner enthält, vor oder nach Zufügen der Testflüssigkeit dem Gefäß zugefügt wird;
das Mikroreaktionsgefäß einem Zentrifugierschritt ausgesetzt wird und das sich ausbildende oder ausgebildete Sediment/Agglutinat in Aufsicht von oben oder unten auf das Mikroreaktionsgefäß ausgewertet wird,
wobei ein flächiges Agglutinat (Rasenbildung) von Antigenen bzw. Antikörpern, Bindungspartnern und Trägern auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion, hingegen eine räumlich geringfügig ausgedehnte Ablagerung (Knopfbildung) von Trägern auf eine negative Reaktion Antigen/Antikörper-Komplex hinweist.
eine Substanz in Form von feinen Kügelchen, sogenannten Beads, mit Fangstoffen, nämlich Proteinen, wie Protein A und/oder G, und/oder Antigene und/oder Antikörper, kodiert wird;
ein Mikroreaktionsgefäß mit einem sich von oben nach unten verjüngendem Querschnitt verwendet wird, in welches die kodierten Beads mindestens im Bereich der schrägen Wandung gefüllt wird;
ein vorbestimmtes Volumen der Testflüssigkeit auf die Beads dem Gefäß zugefügt wird, wobei der spezifische Bindungspartner entweder der Test flüssigkeit oder den Beads zugesetzt ist, oder eine weitere Flüssigkeit, die den spezifischen Bindungspartner enthält, vor oder nach Zufügen der Testflüssigkeit dem Gefäß zugefügt wird;
das Mikroreaktionsgefäß einem Zentrifugierschritt ausgesetzt wird und das sich ausbildende oder ausgebildete Sediment/Agglutinat in Aufsicht von oben oder unten auf das Mikroreaktionsgefäß ausgewertet wird,
wobei ein flächiges Agglutinat (Rasenbildung) von Antigenen bzw. Antikörpern, Bindungspartnern und Trägern auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion, hingegen eine räumlich geringfügig ausgedehnte Ablagerung (Knopfbildung) von Trägern auf eine negative Reaktion Antigen/Antikörper-Komplex hinweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass
- 1. 3.1 das die Reaktion in einem oben offenen und am Boden geschlossenen Mikroreaktionsgefäß durchgeführt wird, das wenigstens in seinem bodennahen Bereich einen sich verjüngenden oder bombierten Querschnitt aufweist, so dass das Gefäß wenigstens in seinem bodennahen Bereich wenigstens teilweise eine schräge oder gekrümmte Wandung besitzt, die in den Boden übergeht bzw. den Boden bildet,
- 2. 3.2 mindestens in diesen bodennahen Bereich mit schräger bzw. gekrümmter Wandung des Gefäßes die Beads eingefüllt sind;
- 3. 3.3 das vorbestimmte Volumen der Testflüssigkeit in das Gefäß auf die Beads aufgegeben wird;
- 4. 3.4 das Mikroreaktionsgefäß zentrifugiert wird, bis sich in der Grenzschicht zwischen der schrägen bzw. gekrümmten Wandung des Mikroreaktions gefäßes und der homogenen Schicht aus der Substanz das sichtbare Sediment/ Agglutinat ausbildet, wobei eine insbesondere auf der schrägen Wandung des Gefäßes sich flächig ausbildende Agglutinatschicht auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion hinweist und ein insbesondere im Bereich des tiefsten Punktes des Bodens bzw. der schrägen oder gekrümmten Wandung des Gefäßes sich bildende, räumlich geringfügig ausgedehnte Ablagerung auf eine negative Reaktion ohne Antigen/Anti körper-Komplex hinweist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
dass die Analyse, ob in einem Mikroreaktionsgefäß eine Antikörper-Antigen-
Reaktion stattgefunden hat, anhand des Sedimentationsbildes optisch durch
eine Bedienperson oder automatisch mittels eines Photometers oder mittels
einer Video- oder CCD-Kamera oder eines Fluormeters vorgenommen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
dass die Beads aus einem Gel bestehen.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass Spitzboden- oder Rundboden-Mikrotiterplatten verwendet werden und das
Mikroreaktionsgefäß eine Vertiefung einer Spitzboden- oder Rundboden-
Mikrotiterplatte ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
dass das Mikroreaktionsgefäß anstatt einem Zentrifugierschritt einem
Schüttelschritt unterworfen wird.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass sowohl die Wandung des Mikroreaktionsgefäßes wenigstens im Bereich des
Bodens als auch die Beads mit Fangstoffen kodiert werden.
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---|---|---|---|
DE10061515A DE10061515A1 (de) | 1999-12-09 | 2000-12-11 | Verfahren zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung |
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DE10061515A Ceased DE10061515A1 (de) | 1999-12-09 | 2000-12-11 | Verfahren zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung |
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-
2000
- 2000-12-11 DE DE10061515A patent/DE10061515A1/de not_active Ceased
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