SE418017B - Sett att kontinuerligt bestemma olika langsamt reagerande substanser kvantitativt med anvendning av en enda metcell - Google Patents

Description

'7806853-3 2 kerhet, är det önskvärt att få så många mätpunkter som möjligt för varje individuell analys. Detta är svårt att åstadkomma vid hittillsvarande kontinuerlig strömningsanalys, då den enda vä- gen har varit att placera flera mätceller eller detektorer i följd i samma strömning. Detta är ett klumpigt tillvägagångs- sätt och diskreta analyser, särskilt i sin mest avancerade form, med centrifugalanalysatorer, håller därför en nyckelposition för enzymanalyser genom att signalen kan avläsas kontinuerligt vid dessa instrument från det ögonblick reaganset och provet blandats.

Föreliggande uppfinning avser ett sätt att kontinuerligt bestämma olika långsamt reagerande substanser kvantitativt med användning av en enda mätcell, och kännetecknas av att ett prov injiceras i en kontinuerligt strömmande bärarlösning som i för- väg försatts med reagens, till att utforma en reproducerbar koncentrationsgradient, att den bildade provzonen ledes in i en mätcell, och att strömningen stoppas där, så att reaktionen för- löper inuti mätcellen under det att någon för reaktionens för- lopp karakteristisk storhet registreras.

Därvid kan strömningen stoppas på olika sätt, man kan exem- pelvis stanna pumpen för bärarlösningen eller stänga av strömnin- gen med en ventil före mätcellen, men man kan också låta ström- ningen fortgå kontinuerligt genom att leda den i en shuntledning förbi mätcellen.

Genom sin uppbyggnad medger den kontinuerliga flow injec- tion-analysen olika vägar för utförandet av själva analysen, som är helt unika för förfarandet.

För det första kan man vid vanliga, kinetiska mätningar leda två reagenslösningar genom en.blandniagskammare för att få en fullständig och ögonblicklig blandning av reaktionslös- ningarna med varandra, så att den kemiska reaktionen i den momen- tant homogeniserade blandningen kan börja avläsas redan inom ett fåtal millisekunder.

En dylik snabb blandning är emellertid icke önskvärd i många fall, exempelvis vid enzymatisk analys, där en första, retarderad fas av storleksordningen flera sekunder ofta före- kommer. vid flow injection-analys låter man därvid provzonen under passage genom ett rör eller en slinga först undergå en styrd dispersion i bärarlösningen, som tidigare blandats med reagens (enzymlösning), och stoppar sedan strömningen i mätcel- len och avläser den kemiska reaktionen kontinuerligt med ut- _ ._ .. . > - - » .. .. -- ».--.- - n* ~". -- - . _ - _ i; .l.swgb'f_;agfa-c__ëmfly¿r,.4ßfllw_;.,Å'Q.X___.'TU fï;s* ,v . .- vwqxg, åerfiqïq-gfiksggqflggn-.a-»g-fl...

I - v , _ . b ' _ _ p aàmwtø-.xmnßß-Cfl-g-m-r-i -a-...fian-a-...a ».,<».~ in» *pga-maa- 5 i 7806853-3 gàngspunkt från den reproducerbara provgradient som bildas i strömmen. Det ger i många fall bättre resultat att utgå från de koncentrationsgradienter som bildas vid den långsamma dis- persionen av provzonen i stället för att begränsa sig till mät- ningar på en homogen lösning erhållen genom snabb och eflèktiv blandning.

Uppfinningen skall beskrivas närmare i samband med ett utföringsexempel och de åtföljande ritningarna, som visar på fig. l en analysapparatur enligt uppfinningen, på fig. 2 och 5 principiella reaktionskurvor i apparaturen, på fig. 4 en kali- breringskurva för praktisk användning, samt på fig. 5 ett an- nat utförande av analysapparaturen enligt uppfinningen.

Den specifika reaktionen mellan glykosdehydrogenas och 9-D-glykos användes för den kinetiska bestämningen av glykos för undersökning och verifiering av stop flow injection-prin- cipen.

Ett kommersiellt system glykosenzym från Merck användes, varvid coenzymet nikotinamid-adenin-dennkleotid, NADH, tjänst- gör som en kromofor indikator, som kan mätas spektrofotome- triskt vid 540 nm. För den bakomliggande kemin och reagenskom- potionerna, samt försök med kinetiska mätningar i en och två punkter redogöres utförligt i Analytical Chimioa Acta, 89, (1977), p. 241 _ 244.

Apparaturuppsättningen vid de föreliggande försöken visas '"pà'fig: I. Genom en ledning l ledes enzym och bärarlösning kon- tinuerligt i en oavbruten strömning via en peristaltisk pump 2 1 en manga av 2,5 mi/min till en termostat 5, inställd på 57°G, där bärarströmmen termostateras i en första slinga 4 med en dia- meter av 0,75 mm och en längd av 450 mm i föreliggande fall. Ef- ter denna första slinga 4 tillsättes provet med en provtillsätt- ningsanordning 5, exempelvis av den typ som beskrives utförf ligt i vårt svenska patent nummer 7610110-4, -och blandningen av bärarlösning, enzym och prov får fortsätta ge- nom en andra slinga 6 med en diameter av 0,50 mm och en längd av 500 mm till en spektrofotometer 7, där mätningen sker vid 540 nm. Från spektrofotometern 7 ledes lösningen ut genom röret 8. Slingan 6 och spektrofotometern 7 befinner sig likscm sling- an 4 inuti den på 57°C inställda termostaten 3.

J > I - ' : ' ~ s' ~ ' ":' rnüqcçuf.. '“"'_!.',".:¥""*' i ...i-__ V-~V .i ...U .a .-..._-.-.,.»-^-1_.. -u ~ 'rinna-H alplwflfilfifim iflflflmïw i” Eiiww-'Mf - - , _ ä” ' q W.*(..4fië.v.l~.wv'-. ' » Y ^~ ~' " f" L-..___.- _....._._.. . -.-.._..-....._.....-... ..........,...-_-, _.- .. v.. _ _ .- ..--.-@-.-......_......~._.-.- _- . vsoessá- ¿ 4 Den första försöksserien gjordes så att koncentrationen av glykos i det injicerade provet, 50 mikrcliter, ökades från l till 20 millimol/l och provzonen stoppades i mätoellen så snart den registrerade kurvan nådde sitt maximum. När strömrfingen då avbröts under 9 sekunder erhölls härvid en mätcykel beståen- de av totalt 5 delar, a) provinjiceringen, dispergeringen och transporten in i detektorn, 4,5 sekunder, b) mätperioden med den stoppade strömningen, 9 sekunder, och c) tvättperioden, lO sekunder, varefter nästa prov omedelbart injicerades. På rig. 2 visas hur provet tillsättes vid tiden O, strömningen stoppas vid 4,5 sekunder och startas på nytt vid 15,5 sekunder. Denna me- tod medger en flerpunkts, kinetisk bestämning med en hastighet av 150 prover/h.

En annan aspekt på den kinetiska analysen enligt uppfin- ningen visas på fig. 5, där vid en andra försöksserie koncen- trationen i de injicerade proverna hölls konstant vid 15 mM, men strönningen stoppades vid olika tidpunkter. De strockadc kurvorna visar, hur vid ett stopp avvikelse sker från den hel- dragna mätkurva som fås vid kontinuerlig strömning, där genom förefintligheten av koncentrationsgradientprofiler olika reak- tionsstadier mellan prov och reagenslösning fanns tillgängliga för mätning. Följaktligen får de registrerade responskurvorna olika lutning, och det är därför viktigt att alltid göra den kinetiska mätningen i samma sektion av provzonen, såsom gjordes i den första experimentserien. För denna typ av analys ger topp- detektorn en möjlighet att reproducerbart välja vilken som helst sektion av den dispergerade provzonen efter den maximala top- pen. Denna ytterligare flexibilitet för valet av förhållandet prov/reagens ger många intressanta aspekter för analys av en- zymer.

På grundval av ovanstående principer har ett antal ana- lyser av glykos gjorts. En kalibreringskurva gjordes upp med utgångspunkt från en godtyckligt vald kurva på fig. 3 med ett antal olika standardprover. På kalibreringskurvan är lutningen inprickad i mm/H sekunder som funktion av mflol glykos. Nät- ningarna gjordes liksom beskrivits ovan vid en termostatering 1=111 57°c och maa Nim: som inaikamr och matning via 540 m.

Analyser gjordes sedan på samma prover med användning av vanlig autoanalysator enligt D. Banauch, W. Brümmer, W. Ebeling, . ..._... ..._ ..._ , " s-p V-f »--..-.~ ...._... 5 vsosasz-3 H. Metz, H. Rindfrey, H. Lang, K. Leybold och W. Rick, Z. Klin.

Chem. Klin. Biochem., 15 (1975) 101 och med vår nya metodik med användning av kalibreringskurvan pà fig. 4.

Följande resultat i mMo1 glykos/l erhölls: Autoanalysator Steg flow 5,5 5,6 8,6 9,5 4.7 4,9 6,5 6,4 Som framgår av dessa resultat fås med användning av upp- finningen resultat som överensstämmer mycket bra med tidigare metoder, men på ett mycket snabbare och enklare sätt.

Då enzym- eller substratlösningen ofta är mycket dyrbara, är det av ekonomiska skäl fördelaktigt att icke hela tiden vara tvungen att pumpa den genom analysapparaten, då den endast be- höver finias i den del av strömmen som innehåller provzonen.

Detta krav uppfyllas med en apparatur av det slag som visas på fig. 5, där två exakt synkroniserade injektionsventiler använ- des, den ena med 10 mikroliters volym för provinjiceringen, och den andra 9 på 50 mikroliter för injiceringen av enzymreagenset.

\ Bärarströmmen utgjordes av destillerat vatten. Ledningarna ll ' och 12 var noggrant avoassade, vardera med en längd av 10 Cm och en innerdiameter av 0,5 mm, för att ge en exakt synkro- nisering av provzonen och reagenszonen vid mötespurkten 15. Be- teckningarna på fig. 5 i övrigt har samma betydelser som mot- svarande beteckningar çà fig. 1.

På fig. 5 visas liksom på fig. l en termostatering av strömmarna mellan den peristatiska pumpen 2 och provtillsätt- ningsventilerna. Vid det senare utförandet enligt fig. 5 kan emellertid denna termostatering före tillsättningen undvaras, då någon reaktion icke sker förrän efter mötespunkten l5, och ledningarna ll och 12 är tillräcklig för att säkerställa en tem- peraturjämvikt innan reaktionen sker efter mötespunkten 15.

Bestämningen av glykos med användning av glykosdehydroge- nas som enzym, baserad på den tidigare angivna kamin, gav re- sultat som var identiska med dem som erhölls när bärarströmmen hela tiden bestod av glykosdehydrogenas i fosfatbuffert, fig. l-4. Även om enzymreagenslösningen måste vara mera koncentrerad vid reagensinjicering än vid den kontinuerligt strömmande rea- i _ ~ \ I _ . ...f _. _ ...<......_.~-._......... > I ........>. . . , ..4__,,._,,,. vsosàszëá 6 genslösningen då reagenszonen dispergeras, fås ändock en avse- värd inbesparing av enzymreagens. När sålunda pumpningstiden vid det första försöket var totalt 15 sekunder, och pumpnings- hastigheten 2,5 ml/min, motsvarande 0,6 ml, 1,4 kU/1, åtgick vid det andra försöket med enzymin¿ektion endast 0,05 ml enzym ,O4 kU/l glykoshydrogenas, dvs. enzymförbrukningen reducerades till en fjärdedel. Genom att vatten användes som bärarlösning slipper man dessutom helt ifrån någon tvättning av apparaturen mellan olika analyser, eller kan i varje fall re- ducera tvättningen till ett minimum. per analys, 7

Claims (5)

.~__fln_ß_-<.-_.~......_.-..fi..~- ....,....... _......_......,...., u. _ _ ..~ ...kr ,_ _ , 7 '7806853-3 Patentkrav

1. l. Sätt att kontinuerligt bestämma olika långsamt rea- gerande substanser kvantitativt med användning av en enda mät- cell, k ä n n e t e c k n a t av att ett prov injíceras i en kontinuerligt strömmande bärarlösning som i förväg försatts med reagens, till att utforma en reproducerbar koncentrationsgra- dient, att den bildade provzonen ledes in i en mätoell, och att strömningen stoppas där, så att reaktionen förlöper inuti mät- cellen under det att någon för reaktionens förlopp karakteris- tisk storhet registreras.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att den registrerade kurvans lutning, dvs. reaktionshastigheten, bestämmas i en viss punkt, och att den önskade föreningens mängd beräknas ur kurvans lutning i denna punkt.

3. 5. Sätt enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att ett substrat bestämmas genom utnyttjande av ett enzyms selektivt katalytiska verkan.

4. Sätt enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att den enzymatiska eller katalytiska aktiviteten mätfs med användning av ett överskott av substrat.

5. Sätt enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k- n a t av att bärarlösningen består av vatten eller buffert- lösning och att både prov och reagens injiceras samtidigt genom två eller flera provtillsättningsanordningar på sådant sätt att ¿ provzon och reagenszon mötes nedströms som reproduoerbara kon- É centrationsgradienter, varigenom åtgàngen av dyrbara analys- kemikalier nedbringas. v r -É lv ~= *M-'«'\'r~: -«.*íi.'§,~»_ac~'axy-.