DE2923970A1 - Verfahren zur kontinuierlichen quantitativen bestimmung unterschiedlicher, langsam reagierender stoffe - Google Patents
Verfahren zur kontinuierlichen quantitativen bestimmung unterschiedlicher, langsam reagierender stoffeInfo
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Description
HOFPMANK · ifilTLJS & PARTNER 2923970
PAT E N TAN WALTE
DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN
ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) · D-8000 MONCHiN 81 · TELEFON (08?) 911087 . TElEX 05-2JÄ1?|PATHE)
32 221
— 3 —
. BIFOK AB, Annelündsvagen 3, Sollentuna, Schweden
Verfahren^ zur kontiruierlichen quantitativen
Bestimmung unterschiedlicher, langsam ■: reagierender. Stoffe
Die Erfindung stellt eine Weiterentwicklung der ursprünglichen Strömungs-Injektions-Analyse der Anmelderin dar, d.h.
einer Analyse mit Injektion einer Probe in eine kontinierlich strömende, kontinuiarliche Trägerlösung.
Das kontinuierliche Analyss-ver fahren der Anmelderin wird durch
eine Anzahl von Patenten und Patentanmeldungen in verschiedenen Ländern geschützt und die Grundsätze des Verfahrens
werden im einzelnen in der DT-OS 4 022 575 der Anmelderin beschrieben. ^s----
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- A ORIGINAL INSPECTED
292397Q
Eine Strömungs-Injektions-Analyse basiert darauf, daß die
Analyse derart ausgestaltet ist, daß ein reproduzierbarer Gradient der Probe in einer reagierenden Strömung erzeugt
wird, und daß Messungen der gebildeten Gradientenkurve, beispielsweise spektralphotometrische oder potentiometrisehe
Messungen, durchgeführt werden.
Jedoch kann man bei kinetischen Reaktionen durch Untersuchung der Reaktionsgeschwindigkeit eine bessere Selektivität und
Empfindlichkeit bei einer Probe erhalten. Derartige Geschwindigkeitsmessungen sind erforderlich, wenn Enzymaktivität und
katalytisch^ Aktivität gemessen werden. Die Grundlage für die
vorliegende Erfindung ist die Messung der chemischen Reaktionsgeschwindigkeit, Zur Bestimmung des linearen Teils der Reaktions-Empfindlichkeitskurve
zwecks Messung der Ableitung oder Steigung derselben, d.h. der Reaktionsgeschwindigkeit, mit Sicherheit,
ist es erwünscht, soviele Meßpunkte wie möglich ..-.für jede
einzelne Analyse zu erhalten. Dies ist bei der gegenwärtigen kontinuierlichen Strömungsanalyse schwierig zu erreichen, da
das einzig mögliche Analyseverfahren darin bestand, mehrere
Meßzellen oder Detektoren in Folge in der gleichen Strömung anzuordnen. Dies ist sehr schwerfällig und diskrete Analysen,
insbesondere in ihrer fortschrittlichsten Ausbildung mit Zentrifugal-Analysegeräten, haben eine Schlüsselposition für
Enzymanalysen,da daß Signal durch diese Geräte koninuierlich
erfaßt werden kann, sobald Reaktionsmittel und Probe miteinander vermischt wurden.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe liegt darin, eine Analayse bei langsamen Reaktionen in einfacherer und gleichzeitig
erheblich gründlicherer Weise durchzuführen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine
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ORIGINAL INSPECTED
Probe in eine kontinierlich strömende Trägerlösung injiziert wird, die vorausgehend mit einem Reagens versehen wurde, um
reproduzierbare Konzentrationsgradienten zu bilden, und daß die gebildete Probenzone in eine Meßzelle überführt wird, um die
Strömung dort angehalten wird, so daß die Reaktion in.·· ,.
der Meßzelle erfolgt, während eine für die Reaktion crar akteristische
Größe aufgezeichnet wird.
Beim erfindungsgemäßen, sogenannten Strömungsstopverfahren wird
ein einzelnes Meßinstrument, wie beispielsweise ein Spektralphotometer oder ein Potentiometer verwendet, um die gewünschte
Größe zu ermitteln, wobei die Strömung durch die Meßzelle zu einem geeigneten Zeitpunkt angehalten wird. Die Strömung kann
dabei auf unterschiedliche Weise angehalten werden; beispielsweise kann die Pumpe für die Trägerlösung angehalten werden,
oder die Strömung kann mittels eines vor der Meßzelle liegenden Ventils gesperrt werden. Jedoch ist es ferner möglich, die
Strömung ohne Unterbrechung fortzuführen, indem sie mittels eines Nebenschlusses an der Meßzelle vorbeigeführt wird.
Die kontinuierliche Strömungs-Injektions-Analyse gestattet es,
durch ihre Ausgestaltung verschiedene Vorrichtungen zur Durchführung der eigentlichen Analyse zu verwenden. Dies ist etwas
völlig neues bei dem infrage stehenden Verfahren.
Bei normalen kinetischen Messungen können zwei reagierende Lösungen durch eine Mischkammer geführt werden, um eine vollständige
und unverzügliche Mischung der Reaktionslösungen miteinander zu erzielen, so daß die chemische Reaktion in der
augenblicklich homogenisierten Mischung innerhalb weniger Millisekunden erstmals ermittelt werden kann.
Jedoch ist eine so rasche Mischung in vielen Fällen, beispiels-
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ORIGINAL INSPECTED
weise bei Enzymanalysen, nicht erwünscht, bei welchen häufig eine verzögerte Phase der in Frage stehenden Größe von mehreren
Sekunden auftritt. Bei der Strömungs-Injektions-Analyse wird die Probenzone während des Durchtritts durch ein Rohr oder eine
Rohrschlange zuerst einer gesteuerten Dispersion in der Trägerlösung unterzogen ^ die vorausgehend mit einem Reagens
(der Enzymlösung) vermischt worden war, worauf die Strömung in der Meßzelle angehalten und die chemische Reaktion
kontinuierlich auf der Grundlage des reproduzierbaren, in der Strömung gebildeten Probengradienten ermittelt wird. In vielen
Fällen werden bessere Ergebnisse erhalten, wenn von den Konzentrationsgradienten ausgegangen wird, die während der
langsamen Dispersion der Probenzone gebildet werden, statt einer Beschränkung auf Messungen einer homogenen Lösung, die durch
eine rasche und effektive Mischung erhalten wurde.
Die Erfindung wird anschließend anhand eines Ausführungsbeispiels
in Verbindung mit den Zeichnungen beschrieben;
Es zeigen:
Fig. 1 eine erfindungsgemäße Analysevorrichtung,
Fig. 2 und 3 chaiakteristische Reaktionskurven, wie sie mit
der Analysevorrichtung erhalten werden, welche die Absorption A (dimensionslos) darstellen.
Fig. 4 eine Eichkurve für praktischen Einsatz und
Fig. 5 eine weitere erfindungsgemäße Analysevorrichtung.
Die spezifische Reaktion zwischen Glucosedehydrogenase und
P - D-Glucose wird zur kinetischen Bestimmung der Glucose zur
Untersuchung und überprüfung des Prinzips der Strömungs-Stopin jektion verwendet.
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ORlGlNAL INSPECTED
Es wurde ein im Handel erhältliches Glucose-Enzym-System von
Merck verwendet, wobei das "Coenzym Nicotinamidadeiiin--dinucleotide
NADH, als Chromophorer Indikator dient, der spektralphotometrisch bei 340 nm gemessen werden kann.
Analytical Chimica Acta, 89, (1977), Seiten 241-244 liefert
die zugrunde liegenden chemischen Zusammenhänge und Reagens-Zusammensetzungen,
sowie Prüfungen mit kinetischen Messungen an einer Stelle und an zwei Stellen.
Die Anordnung der Vorrichtung für die vorliegenden Untersuchungen
ist in Fig. 1 dargestellt. Die Enzym-und Trägerlösung wird mittels einer peristaltischen Pumpe 2 kontinuierlich
durch eine Rohrleitung 1 in einem kontinuierlichen Strom von 2,5 ml/min zu einem Thermostaten 3 geführt, der auf 37° C
eingestellt ist, wobei die Trägerströmung in einer ersten Rohrschlange 4 mit einem Durchmesser von 0,75 mm und einer
Länge von 450 mm gemäß dem dargestellten Äusführungsbeispiel auf konstanter Temperatur gehalten wird. Nach Durchtritt durch
die Rohrschlange 4 wird die Probe zu einer Probenzuführeinrichtung
5 geführt, die beispielsweise gemäß der schwedischen Patentschrift .,. (Patentanmeldung 76 10 11O-4) ausgebildet
sein kann, wobei das Gemisch aus Trägerlösung, Enzym und Probe kontinuierlich durch eine zweite Rohrschlange 6
fließt, die einen Durchmesser von 0^50 mm und eine Länge von
300 mm aufweist, und zwar zu einem Spektralphotometer 7, wo die Messung bei 340 nm statt findet. Die Lösung wird vom
Spektralphotometer 7 durch eine Rohrleitung 8 abgeführt. Wie die Rohrschlange 7 befinden sich die Rohrschlange 6 und das
Spektralphotometer 7 innerhalb des Thermostaten 3, der auf
37° C eingestellt ist.
Die erste Prüfserie wurde derart durchgeführt, daß die Glucosekonzentration
in der injizierten Probe*von 30 Mikrolitern
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von 1 auf 20 Millimol/Liter erhöht wurde und die Probenzone
wurde in der Meßzelle angehalten, sobald die aufgezeichnete Kurve ihr Maximum erreichte. Beim Unterbrechen der Strömung
während 9 Sekunden wurde ein Messzyklus erhalten, der aus drei Teilen besteht; (a) Probeninjektion, Dispersion und
Zuführung in die Meßzelle, 4,5 Sekunden; (b) Meßperiode bei angehaltener Strömung, 9 Sekunden, und (c) Waschperiode,
10 Sekunden, wonach unmittelbar die nächst Probe injiziert wurde. Fig. 2 zeigt die Zuführung der Probe zum Zeitpunkt
0, wobei die Strömung bei 4,5 Sekunden angehalten und bei 13,5 Sekunden erneut in Gang gesetzt wird. Dieses Verfahren
gestattet eine kinetische Mehrpunktbestimmung mit einer Arbeitsgeschwindigkeit von 150 Proben je Stunde.
Ein weiterer Aspekt der erfindungsgemäßen kinetischen Analyse
ist in Fig. 3 dargestellt, gemäß welcher in einer zweiten Prüfreihe die Konzentration in den injizierten Proben
konstant bei 15mM gehalten wurde, jedoch die Strömung zu
verschiedenen Zeitpunkten angehalten wurde. Die gestrichelten Kurven zeigen beim Anhalten die Abweichung gegenüber der
voll ausgezogenen Meßkurve, die bei kontinuierlicher Strömung erhalten worden ist. Durch das Vorliegen der Konzentrationsgradienten-Profile
standen unterschiedliche Reaktionsstufen zwischen der Probe und der reagierenden Lösung für die
Messung zur Verfügung. Somit «erhalten die aufgezeichneten
Ansprechkurven verschiedenen Winkel, und es ist wichtig, die kinetische Messung im gleichen Abschnitt der Meßzone durchzuführen,
wie dies bei der ersten Untersuchungsreihe erfolgte.
Für diese Art einer Analyse schafft die oben liegende Meßzelle eine Möglichkeit, reproduzierbar einen beliebigen Abschnitt
der einer Dispersion unterzogenen Meßzone nach einem maximalen Scheitelwert auszuwählen. Die erwähnte größere
Flexibilität für die Auswahl des Verhältnisses Probe/Reagens liefert viele interessante Aspekte für* die Analyse von
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ORIGINAL INSPECTED
Enzymen.
Auf der Basis des vorausgehend erwähnten Prinzips wurde eine Anzahl von Glucose-Analysen durchgeführt. Ausgehend von der
willkürlich ausgewählten Kurve nach Fig. 3 wurde eine Eichkurve mit einer Anzahl verschiedener Standardproben erstellt.
In der Eichkurve ist die Steigung in mm/4 Sekunden als Funktion von mMol Glucose angegeben. Wie bereits erwähnt wurde, erfolgten
die Messungen bei einer durch einen Thermostaten aus 37° C konstant gehaltenen Temperatur und mit NADH als Indicator
und Messung bei 340 nm.
Es wurden Analysen der Proben unter Verwendung eines üblichen
AutoaiaJ-ysators gemäß D. Banauch, W. Brummer, W. Ebeling,
H. Metz, H. Rindfrey, H. Lang, K. Leybold und W. Rick, Z. Klin,
durchgeführt, entsprechend Chem. Klin. Biochem., 13 (1975) 101, und mit dem erfindungsgemäßen neuen Verfahren unter Verwendung
der Eichkurve nach Fig. 4.
Dabei wurden folgende Ergebnisse in mMol Glucose/Liter erhalten;
Autoanlysator Strömungs s top
5.3 5.6
8.6 9.5
4.7 4.9 6.5 6.4
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, liefert die Anwendung der Erfindung Ergebnisse, die sehr gut mit bekannten Verfahren
übereinstimmen, die jedoch schneller und einfacher erhalten werden.
Da die Enzym·'- oder Substratlösung häufig sehr teuer ist, ist
es wirtschaftlich von Vorteil, wenn man nicht, immer gezwungen ist, die Lösung durch die Analysevorrichtung zu pumpen, da
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ORIGINAL INSPECTED
sie lediglich in jenem Abschnitt der Strömung vorliegen muß, der die Meßzone bildet. Diese Forderung wird durch die Vorrichtung
gemäß Fig. 5 erfüllt, in welcher zwei genau synchronisierte Injektionsventile verwendet werden, wovon eines ein Volumen
von 10 Mikroliter zur Probeninjektion aufweist und das andere Injektionsventil 9 ein Volumen von 30 Mikroliter zur Injektion
des Enzym-Reagens. Die Trägerströmung bestand aus destilliertem Wasser. Die Rohrleitungen 11 und 12 wurden sorgfälltig angepaßt,
wobei jede eine Länge von 11 mm und einen Innendurchmesser
von 0,5 mm aufwies, um eine genaue Synchronisierung der Meßzone und der Reaktionszone am Treffpunkt 13 zu gestatten.
Die anderen Bezugszeichen nach Fig. 5 haben die gleiche Bedeutung wie die entsprechenden Bezugszeichen der Fig. 1.
Wie in Fig. 1 wird auch in Fig. 5 die Strömung zwischen der peristaltischen Pumpe 2 und den Probeneingabeventilen durch
einen Thermostaten auf konstanter Temperatur gehalten. In der letztgenannten Ausführungsform nach Fig. 5 kann jedoch die
Temperaturkonstanthaltung vor einer Zugabe vermieden werden, da eine Reaktion erst nach dem Treffpunkt 13 stattfindet und
die Rohrleitungen 11 und 12 ausreichen, um ein Temperaturgleichgewicht
zu gewährleisten, bevor die Reaktion anschließend., nach dem Treffpunkt 13 stattfindet.
Die Bestimmung von Glucose - mittels Glucosehydrogenase als Enzym auf der Grundlage der vorausgehend aufgeführten chemischen
Daten liefert Ergebnisse, die jenen entsprechen, welche erhalten wurden, wenn die Trägerströmung immer aus Glucosehydrogenase
im Phosphatpuffer gemäß Fig. 1"4 bestand. Selbst
wenn die Enzym-Reagenslösung bei der Reaktionsinjektion konzentrierter sein muß als in einer kontinuierlich strömenden
Reaktionslösung bei dispergierter Reaktionszone, wird eine
beträchtliche Einsparung an Enzym-Reagens erhalten. Betrug die Pumpzeit bei der ersten Untersuchung insgesamt 15 Sekunden
und die Pumpgeschwindigkeit 2,5 ml/Minute, entsprechend 0,6ml,
ORIGINAL INSPECTED
1.4 kU/1, so wurden in der zweiten Prüfung nur 0,03 ml
Enzym je Analyse verbraucht, 7,04 kü/1 Glunsehydrogenase,
womit die Enzymerzeugung auf ein viertel verringert wurde. Durch Verwendung von Wasser als Trägerlösung wurde das
Waschen der Vorrichtungen zwischen unterschiedlichen Analysen vermieden, wobei in jedem Fall das Waschen auf ein Mindestmaß
reduziert wurde.
Zusammenfassend wird durch die Erfindung ein kontinuierliches
Verfahren zur quantitativen Bestimmung langsam reagierenden Zusammensetzung unter Verwendung einer einzigen Meßzelle
geschaffen, wobei die Probe in eine kontinuierlich fließende Trägerströmung injiziert wird, die immer ein Reagens aufweist
oder gleichzeitig mit der Probe mit Reagens versehen wird, um eine Meßzone in Form eines reprozierbaren Gradienten zu
bilden. Die Probenzone wird in eine Meßzelle geführt, worauf die Strömung durch Nebens^hliß der Träger strömung, durch Anhalten
der Pumpe oder durch ein Ventil gestoppt wird. Die Reaktion findet in der Meßzelle statt, während eine für die
Reaktion charakteristische Größe aufgezeichnet wird. Die Reaktionsgeschwindigkeit kann durch die Steigung der erhaltenen
Ansprechkurve ermittelt werden, wobei die Menge derü festzustellenden Verbindung berechnet wird. Durch Einstellung
des Anhaltens an einer bestimmten Stelle in der Konzentrationsgradientenkurve und durch Auswahl dieses Punkts
stets in der gleichen zeitlichen Entfernung vom Scheitelwert der Gradientenkurve während der Strömung wird eine vollständige
Reproduzierbarkeit der Analyse gewährleistet.
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ORIGINAL INSPECTED
Claims (5)
- PATENTANWÄLTEDR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . DIPL.-IN G. W.EITIE . DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL..ING. W. IEH NDIPl.-JNG. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) . D-8000 MO NCHEN 81 · TELEFON (08?) 911087 . TELEX 05-2961» (PATHC)32 221Bifok AB, Annelundsvagen 3, "Sollentuna, SchwedenVerfahren zur kontinuierlichen quantitativen Bestimmung unterschiedlicher, langsam reagierender Stoffe. P a te ri fan s. ρ r. ü c h e :Verfahren zur kontinuierlichen quantitativen Bestimmung unterschiedlicher, langsam reagierender Stoffe unter Verwendung einer einzelnen Meßzelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe in eine kontinuierlich fließende Trägerlösung injiziert wird, die vorausgehend mit einem Reagens versehen worden ist, damit ein reproduzierbarer Konzentrationsgradient erhalten wird, daß die gebildete Probenzone ineine Meßzelle überführt wird, und daß die Strömung angehalten wird, so daß die Reaktion in der Meßzelle stattfindet, während eine für die Reaktion charakteristische Größe aufgezeichnet wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η -"909881/0719zeichnet , daß die Steigung der aufgezeichneten Kurve, d,h. die Reaktionsgeschwindigkeit, an einer beistimmten Stelle ermittelt wird, und daß die Menge der gewünschten Verbindung aus der Steigung der Kurve an dieser Stelle berechnet wird.
- 3. Verfahren nach. Anspruch 5 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Substrat durch Anwendung des selektiven katalytischen Effeids eines Enzyms ermittelt wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische oder katalStische Aktivität durch die Verwendung eines Überschusses des Substrats gemessen wird.
- 5. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerlösung aus Wasser oder aus einer Kupferlösung besteht und daß/ die Probe und das Reagens· gleichzeitig durch zwei oder mehr Probenzuführeinrichtungen in solcher Weise zugeführt werden, daß die Probenzone und die Reagenszone sich stromabwärts als reproduzierbare Konzentrationsgradienten treffen, wobei der Verbrauch ts^jeaar Analyse chemikalien verringert wird.909881/0719ORIGINAL INSPECTED
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