DE2923970C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung stellt eine Weiterentwicklung der ursprüng­ lichen Strömungs-Injektions-Analyse der Anmelderin dar, d. h. einer Analyse mit Injektion einer Probe in eine kontinuierlich strömende, kontinuierliche Trägerlösung.

Das kontinuierliche Analyseverfahren der Anmelderin wird durch eine Anzahl von Patenten und Patentanmeldungen in verschiedenen Ländern geschützt und die Grundsätze des Verfahrens werden ausführlich in der US-PS 40 22 575 der An­ melderin beschrieben

Eine solche Strömungs-Injektions-Analyse basiert darauf, daß die Analyse derart ausgestaltet ist, daß ein reproduzierbarer Gradient der Probe in einer reagierenden Strömung erzeugt wird, und daß Messungen der gebildeten Gradientenkurve, bei­ spielsweise spektralphotometrische oder potentiometrische Messungen, durchgeführt werden.

Jedoch kann man bei kinetischen Reaktionen durch Untersuchung der Reaktionsgeschwindigkeit eine bessere Selektivität und Empfindlichkeit bei einer Probe erhalten. Derartige Geschwindig­ keitsmessungen sind erforderlich, wenn Enzymaktivität und katalytische Aktivität gemessen werden. Die Grundlage für die vorliegende Erfindung ist die Messung der chemischen Reaktions­ geschwindigkeit. Zur Bestimmung des linearen Teils der Reaktions- Empfindlichkeitskurve zwecks Messung der Ableitung oder Steigung derselben, d. h. der Reaktionsgeschwindigkeit, mit Sicherheit, ist es erwünscht, soviele Meßpunkte wie möglich für jede einzelne Analyse zu erhalten. Dies ist bei der gegenwärtigen kontinuierlichen Strömungsanalyse schwierig zu erreichen, da das einzig mögliche Analyseverfahren darin bestand, mehrere Meßzellen oder Detektoren in Folge in der gleichen Strömung anzuordnen. Dies ist sehr schwerfällig, und diskrete Analysen, insbesondere in ihrer fortschrittlichsten Ausbildung mit Zentrifugal-Analysegeräten, haben eine Schlüsselposition für Enzymanalysen, da daß Signal durch diese Geräte kontinuierlich erfaßt werden kann, sobald Reaktionsmittel und Probe miteinander vermischt wurden.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe liegt darin, eine Analyse bei langsamen Reaktionen in einfacherer und gleich­ zeitig erheblich gründlicherer Weise durchzuführen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine Probe in eine kontinuierlich strömende Trägerlösung injiziert wird, die vorausgehend mit einem Reagens versehen wurde, um reproduzierbare Konzentrationsgradienten zu bilden, und daß die gebildete Probenzone in eine Meßzelle überführt wird, und die Strömung dort angehalten wird, so daß die Reaktion in der Meßzelle erfolgt, während eine für die Reaktion charakteristische Größe aufgezeichnet wird.

Beim erfindungsgemäßen, sogenannten Strömungsstopverfahren wird ein einzelnes Meßinstrument, wie beispielsweise ein Spektral­ photometer oder ein Potentiometer verwendet, um die gewünschte Größe zu ermitteln, wobei die Strömung durch die Meßzelle zu einem geeigneten Zeitpunkt angehalten wird. Die Strömung kann dabei auf unterschiedliche Weise angehalten werden; beispiels­ weise kann die Pumpe für die Trägerlösung angehalten werden, oder die Strömung kann mittels eines vor der Meßzelle liegenden Ventils gesperrt werden. Jedoch ist es ferner möglich, die Strömung ohne Unterbrechung fortzuführen, indem sie mittels eines Nebenschlusses an der Meßzelle vorbeigeführt wird.

Die kontinuierliche Strömungs-Injektions-Analyse gestattet es, durch ihre Ausgestaltung verschiedene Vorrichtungen zur Durch­ führung der eigentlichen Analyse zu verwenden. Dies ist etwas völlig Neues bei dem in Frage stehenden Verfahren.

Bei normalen kinetischen Messungen können zwei reagierende Lösungen durch eine Mischkammer geführt werden, um eine voll­ ständige und unverzügliche Mischung der Reaktionslösung mit­ einander zu erzielen, so daß die chemische Reaktion in der augenblicklich homogenisierten Mischung innerhalb weniger Millisekunden erstmals ermittelt werden kann.

Jedoch ist eine so rasche Mischung in vielen Fällen, beispiels­ weise bei Enzymanalysen, nicht erwünscht, bei welchen häufig eine verzögerte Phase der in Frage stehenden Größe von mehreren Sekunden auftritt. Bei der Strömungs-Injektions-Analyse wird die Probenzone während des Durchtritts durch ein Rohr oder eine Rohrschlange zuerst einer gesteuerten Dispersion in der Trägerlösung unterzogen, die vorausgehend mit einem Reagens (der Enzymlösung) vermischt worden war, worauf die Strömung in der Meßzelle angehalten und die chemische Reaktion kontinuierlich auf der Grundlage des reproduzierbaren, in der Strömung gebildeten Probengradienten ermittelt wird. In vielen Fällen werden bessere Ergebnisse erhalten, wenn von den Konzentrationsgradienten ausgegangen wird, die während der langsamen Dispersion der Probenzone gebildet werden, statt einer Beschränkung auf Messungen einer homogenen Lösung, die durch eine rasche und effektive Mischung erhalten wurde.

Die Erfindung wird anschließend anhand eines Ausführungsbei­ spiels in Verbindung mit den Zeichnungen beschrieben; es zeigen:

Fig. 1 eine erfindungsgemäße Analysevorrichtung,

Fig. 2 und 3 charakteristische Reaktionskurven, wie sie mit der Analysevorrichtung erhalten werden, welche die Absorption A (dimensionslos) darstellen.

Fig. 4 eine Eichkurve für praktischen Einsatz und

Fig. 5 eine weitere erfindungsgemäße Analysevorrichtung.

Die spezifische Reaktion zwischen Glucosedehydrogenase und b-D-Glukose wird zur kinetischen Bestimmung der Glucose zur Untersuchung und Überprüfung des Prinzips der Strömungs-Stop- Injektion verwendet.

Es wurde ein im Handel erhältliches Glucose-Enzym-System von Merck verwendet, wobei das Coenzym Nicotinamidadenin­ dinucleotid, NADH, als chromophorer Indikator dient, der spektralphotometrisch bei 340 nm gemessen werden kann. Analytical Chimica Acta, 89, (1979), Seiten 241-244 liefert die zugrunde liegenden chemischen Zusammenhänge und Reagens- Zusammensetzungen, sowie Prüfungen mit kinetischen Messungen an einer Stelle und an zwei Stellen.

Die Anordnung der Vorrichtung für die vorliegenden Unter­ suchungen ist in Fig. 1 dargestellt. Die Enzym- und Träger­ lösung wird mittels einer peristaltischen Pumpe 2 kontinuierlich durch eine Rohrleitung 1 in einem kontinuierlichen Strom von 2,5 ml/min zu einem Thermostaten 3 geführt, der auf 37°C eingestellt ist, wobei die Trägerströmung in einer ersten Rohrschlange 4 mit einem Durchmesser von 0,75 mm und einer Länge von 450 mm gemäß dem dargestellten Ausführungsbeispiel auf konstanter Temperatur gehalten wird. Nach Durchtritt durch die Rohrschlange 4 wird die Probe zu einer Probenzuführein­ richtung 5 geführt, die beispielsweise gemäß der schwedischen Patentschrift (Patentanmeldung 76 10 110-4) ausge­ bildet sein kann, wobei das Gemisch aus Trägerlösung, Enzym und Probe kontinuierlich durch eine zweite Rohrschlange 6 fließt, die einen Durchmesser von 0,50 mm und eine Länge von 300 mm aufweist, und zwar zu einem Spektralphotometer 7, wo die Messung bei 340 nm stattfindet. Die Lösung wird vom Spektralphotometer 7 durch eine Rohrleitung 8 abgeführt. Wie die Rohrschlange 7 befinden sich die Rohrschlange 6 und das Spektralphotometer 7 innerhalb des Thermostaten 3, der auf 37°C eingestellt ist.

Die erste Prüfserie wurde derart durchgeführt, daß die Glucose­ konzentration in der injizierten Probe von 30 Mikrolitern von 1 auf 20 Millimol/Liter erhöht wurde und die Probenzone wurde in der Meßzelle angehalten, sobald die aufgezeichnete Kurve ihr Maximum erreichte. Beim Unterbrechen der Strömung während 9 Sekunden wurde ein Meßzyklus erhalten, der aus drei Teilen besteht; (a) Probeninjektion, Dispersion und Zuführung in die Meßzelle, 4,5 Sekunden; (b) Meßperiode bei angehaltener Strömung, 9 Sekunden, und (c) Waschperiode, 10 Sekunden, wonach unmittelbar die nächste Probe injiziert wurde. Fig. 2 zeigt die Zuführung der Probe zum Zeitpunkt O, wobei die Strömung bei 4,5 Sekunden angehalten und bei 13,5 Sekunden erneut in Gang gesetzt wird. Dieses Verfahren gestattet eine kinetische Mehrpunktbestimmung mit einer Arbeitsgeschwindigkeit von 150 Proben je Stunde.

Ein weiterer Aspekt der erfindungsgemäßen kinetischen Analyse ist in Fig. 3 dargestellt, gemäß welcher in einer zweiten Prüfreihe die Konzentration in den injizierten Proben konstant bei 15 mM gehalten wurde, jedoch die Strömung zu verschiedenen Zeitpunkten angehalten wurde. Die gestrichelten Kurven zeigen beim Anhalten die Abweichung gegenüber der voll ausgezogenen Meßkurve, die bei kontinuierlicher Strömung erhalten worden ist. Durch das Vorliegen der Konzentrations­ gradienten-Profile standen unterschiedliche Reaktionsstufen zwischen der Probe und der reagierenden Lösung für die Messung zur Verfügung. Somit erhalten die aufgezeichneten Ansprechkurven verschiedene Winkel und es ist wichtig, die kinetische Messung im gleichen Abschnitt der Meßzone durchzu­ führen, wie dies bei der ersten Untersuchungsreihe erfolgte. Für diese Art einer Analyse schafft die oben liegende Meß­ zelle eine Möglichkeit, reproduzierbar einen beliebigen Ab­ schnitt der einer Dispersion unterzogenen Meßzone nach einem maximalen Scheitelwert auszuwählen. Die erwähnte größere Flexibilität für die Auswahl des Verhältnisses Probe/Reagens liefert viele interessante Aspekte für die Analyse von Enzymen

Auf der Basis des vorausgehend erwähnten Prinzips wurde eine Anzahl von Glucose-Analysen durchgeführt. Ausgehend von der willkürlich ausgewählten Kurve nach Fig. 3 wurde eine Eich­ kurve mit einer Anzahl verschiedener Standardproben erstellt. In der Eichkurve ist die Steigung in mm/4 Sekunden als Funktion von mMol Glucose angegeben. Wie bereits erwähnt wurde, erfolgten die Messungen bei einer durch einen Thermostaten aus 37°C konstant gehaltenen Temperatur und mit NADH als Indicator und Messung bei 340 nm.

Es wurden Analysen der Proben unter Verwendung eines üblichen Autoanalysators gemäß D. Banauch, W. Brümmer, W. Ebeling, H. Metz, H. Rindfrey, H. Lang, K. Leybold und W. Rick, Z. Klin, durchgeführt, entsprechend Chem. Klin. Biochem., 13 (1975) 101, und mit dem erfindungsgemäßen neuen Verfahren unter Verwendung der Eichkurve nach Fig. 4.

Dabei wurden folgende Ergebnisse in mMol Glucose/Liter erhalten:

Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, liefert die Anwendung der Erfindung Ergebnisse, die sehr gut mit bekannten Verfahren übereinstimmen, die jedoch schneller und einfacher erhalten werden.

Da die Enzym- oder Substratlösung häufig sehr teuer ist, ist es wirtschaftlich von Vorteil, wenn man nicht immer gezwungen ist, die Lösung durch die Analysevorrichtung zu pumpen, da sie lediglich in jenem Abschnitt der Strömung vorliegen muß, der die Meßzone bildet. Diese Forderung wird durch die Vor­ richtung gemäß Fig. 5 erfüllt, in welcher zwei genau synchroni­ sierte Injektionsventile verwendet werden, wovon eines ein Volumen von 10 Mikroliter zur Probeninjektion aufweist und das andere Injektionsventil 9 ein Volumen von 30 Mikroliter zur Injektion des Enzym-Reagens. Die Trägerströmung bestand aus destilliertem Wasser. Die Rohrleitungen 11 und 12 wurden sorgfältig angepaßt, wobei jede eine Länge von 11 mm und einen Innendurchmesser von 0,5 mm aufwies, um eine genaue Synchronisierung der Meßzone und der Reaktionszone am Treffpunkt 13 zu ge­ statten. Die anderen Bezugszeichen nach Fig. 5 haben die gleiche Bedeutung wie die entsprechenden Bezugszeichen der Fig. 1.

Wie in Fig. 1 wird auch in Fig. 5 die Strömung zwischen der peristaltischen Pumpe 2 und den Probeneingabeventilen durch einen Thermostaten auf konstanter Temperatur gehalten. In der letztgenannten Ausführungsform nach Fig. 5 kann jedoch die Temperaturkonstanthaltung vor einer Zugabe vermieden werden, da eine Reaktion erst nach dem Treffpunkt 13 stattfindet und die Rohrleitungen 11 und 12 ausreichen, um ein Temperatur­ gleichgewicht zu gewährleisten, bevor die Reaktion anschließend nach dem Treffpunkt 13 stattfindet.

Die Bestimmung von Glucose mittels Glucosehydrogenase als Enzym auf der Grundlage der vorausgehend aufgeführten chemischen Daten liefert Ergebnisse, die jenen entsprechen, welche er­ halten wurden, wenn die Trägerströmung immer aus Glucose­ hydrogenase im Phosphatpuffer gemäß Fig. 1-4 bestand. Selbst wenn die Enzyn-Reagenslösung bei der Reaktionsinjektion konzentrierter sein muß als in einer kontinuierlich strömenden Reaktionslösung bei dispergierter Reaktionszone, wird eine beträchtliche Einsparung an Enzym-Reagens erhalten. Betrug die Pumpzeit bei der ersten Untersuchung insgesamt 15 Sekunden und die Pumpgeschwindigkeit 2,5 ml/Minute, entsprechend 0,6 ml, 1,4 kU/l, so wurden in der zweiten Prüfung nur 0,03 ml Enzym je Analyse verbraucht, 7,04 kU/l Glucosehydrogenase, womit die Enzymerzeugung auf ein Viertel verringert wurde. Durch Verwendung von Wasser als Trägerlösung wurde das Waschen der Vorrichtungen zwischen unterschiedlichen Analysen vermieden, wobei in jedem Fall das Waschen auf ein Mindest­ maß reduziert wurde.

Zusammenfassend wird durch die Erfindung ein kontinuierliches Verfahren zur quantitativen Bestimmung langsam reagierenden Zusammensetzung unter Verwendung einer einzigen Meßzelle geschaffen, wobei die Probe in eine kontinuierlich fließende Trägerströmung injiziert wird, die immer ein Reagens aufweist oder gleichzeitig mit der Probe mit Reagens versehen wird, um eine Meßzone in Form eines reproduzierbaren Gradienten zu bilden. Die Probenzone wird in eine Meßzelle geführt, worauf die Strömung durch Nebenschluß der Trägerströmung, durch An­ halten der Pumpe oder durch ein Ventil gestoppt wird. Die Reaktion findet in der Meßzelle statt, während eine für die Reaktion charakteristische Größe aufgezeichnet wird. Die Reaktionsgeschwindigkeit kann durch die Steigung der er­ haltenen Ansprechkurve ermittelt werden, wobei die Menge der festzustellenden Verbindung berechnet wird. Durch Ein­ stellung den Anhaltens an einer bestimmten Stelle in der Konzentrationsgradientenkurve und durch Auswahl dieses Punkts stets in der gleichen zeitlichen Entfernung vom Scheitelwert der Gradientenkurve während der Strömung wird eine voll­ ständige Reproduzierbarkeit der Analyse gewährleistet.

Claims (5)

1. Verfahren zur kontinuierlichen quantitativen Bestimmung unterschiedlicher, langsam reagierender Stoffe unter Verwendung einer einzelnen Meßzelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe in eine kontinuierlich fließende Trägerlösung injiziert wird, die zuvor mit einem Reagens versehen worden ist, damit ein reproduzierbarer Konzentrationsgradient erhalten wird, daß die gebildete Probenzone in eine Meßzelle überführt wird, und daß die Strömung angehalten wird, so daß die Reaktion in der Meßzelle stattfindet, während eine für die Reaktion charakteristische Größe aufgezeichnet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Steigung der aufgezeichneten Kurve, d. h. die Reaktionsgeschwindigkeit, an einer bestimmten Stelle ermittelt wird, und daß die Menge der gewünschten Verbindung aus der Steigung der Kurve an dieser Stelle berechnet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Substrat durch Anwendung des selektiven katalytischen Effekts eines Enzyms ermittelt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische oder kata­ lytische Aktivität durch die Verwendung eines Überschusses des Substrats gemessen wird.

5. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerlösung aus Wasser oder aus einer Kupferlösung besteht und daß die Probe und das Reagens gleichzeitig durch zwei oder mehr Probenzuführeinrichtungen in solcher Weise zuge­ führt werden, daß die Probenzone und die Reagenszone sich stromabwärts als reproduzierbare Konzentrationsgradienten treffen, wobei der Verbrauch teurer Analysechemikalien verringert wird.