DE3907164C2

DE3907164C2 -

Info

Publication number: DE3907164C2
Application number: DE19893907164
Authority: DE
Inventors: Diethelm Prof. Dr. Kleiner; Kassem Dr. 8580 Bayreuth De Alef
Original assignee: KLEINER D DR 8580 BAYREUTH DE
Current assignee: KLEINER D DR 8580 BAYREUTH DE
Priority date: 1988-11-03
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 1991-01-10
Also published as: DE3907164A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Bestimmung von mikrobiologischen Aktivitäten in Boden- und Wasserproben.

Es sind eine Reihe von Verfahren zur Messung mikrobieller Aktivitäten bekannt. Mikrobiologische Aktivitäten können beispielsweise ermittelt werden durch Bestimmung von ATP, Bestimmung mikrobieller Zellbestandteile, Bestimmung der Zellmasse durch Fumigation, über die Gesamtkeimzahl, über die Wärmeentwicklung lebender Zellen, durch Ermittlung der Atmungsraten oder der Mineralisationsraten und über die Aktivitäten freigesetzter Enzyme.

Typische Beispiele solcher Verfahren sind in den folgenden Publikationen gezeigt: Sparling GP, Eiland F (1983) Soil Biol. Chem. 15 : 227 (ATP-Bestimmung); Anderson JPE, Domsch KH (1978) Soil Biol. Biochem. 10 : 215 (Atmung); Tate KR, Ross DJ, Feltham CW (1988) Soil Biol. Biochem. 20 : 329 (Fumigation); Beck T (1983) Z. Pflanzenernähr. Bodenkd. 146 : 243 (Enzymaktivitäten, Mineralisation); Alef K, Beck T, Zelles L, Kleiner D (1988) Soil Biol. Biochem. 25 : 1054 (Mineralisation, Enzymaktivitäten, Wärmeentwicklung, ATP-Bestimmung); Babiuk LA, Paul EA (1970) Canad. J. Microbiol. 16 : 57 (Gesamtkeimzahl); Swift MJ (1973) Bull. Ecol. Res. Commun. 17 : 53 (Zellbestand teile).

Die bekannten Verfahren weisen Nachteile auf, so daß ihr Anwendungsbereich eingeschränkt ist. Über die Bestimmung der Atmungsraten und Mineralisationsraten ist die Erfassung nur eines Teils der mikrobiellen Population möglich. Bei der Bestimmung der mikrobiellen Zellbestandteile, der Bestimmung der Zellmasse durch Fumigation, der Bestimmung der Gesamtkeimzahl und der Ermittlung der Aktivitäten freigesetzter Enzyme ergibt sich eine ungenügende Korrelation zwischen den gemessenen Parametern und der mikrobiellen Aktivität. Bei den Verfahren, bei welchen ATP, die mikrobiellen Zellbestandteile, die Zellmasse durch Fumigation oder die Aktivität freigesetzter Enzyme bestimmt wird, ergibt sich ein unvertretbarer hoher Zeitaufwand. Ein hoher apparativer und finanzieller Aufwand ergibt sich bei den Verfahren zur Bestimmung von ATP, der Bestimmung der mikrobiellen Zellbestandteile und der Wärmeentwicklung lebender Zellen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von mikrobiologischen Aktivitäten in Boden- und Wasserproben zu schaffen, welches schnell und ohne großen Aufwand gut reproduzierbar durchgeführt werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine in einem geschlossenen Behälter aufgenommene Probe unter anaeroben Bedingungen mit Dimethylsulfoxid (DMSO) versetzt und die sich über der Probe einstellende Gasphase auf ihren Gehalt an Dimethylsulfid (DMS) gaschromatographisch untersucht wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren bedient sich der quantitativen Erfassung der Reduktionsgeschwindigkeit von Dimethylsulfoxid zu Dimethylsulfid in Boden- und Wasserproben. Nur lebende Zellen sind in der Lage, Dimethylsulfoxid (DMSO) zu Dimethylsulfid (DMS) zu reduzieren. Diese Reaktion wird von der Mehrzahl der Mikroorganismen in Böden und Gewässern durchgeführt. Gaschromatographisch quantitativ erfaßbare Mengen von DMS werden schon in kleinen Proben in kurzer Zeit gebildet, wobei die Geschwindigkeit abhängig von der Anzahl und der Aktivität der Mikroorganismen in der Probe ist.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß aufgrund des geringen zeitlichen und apparativen Aufwandes und der Universalität der Reaktion die Freisetzung von DMS aus DMSO zur Routinebestimmung mikrobieller Aktivitäten in festen und flüssigen Proben verwendet werden kann. DMSO-Reduktion ist nur an lebende Zellen gebunden; somit entfallen mögliche hohe Blindwerte.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden 0,1 bis 2 g Boden oder Wasser in einem Probebehälter mit 0,125 ml 6,6%iger Lösung von Dimethylsulfoxid in Wasser versetzt, der Behälter wird verschlossen, der Behälter wird zweimal evakuiert und mit Stickstoff begast, die Probe in dem Behälter wird auf 30°C gehalten und 0,1 bis 0,5 ml der Gasphase werden aus dem Behälter entnommen und dem Gaschromatographen eingegeben.

Die optimale Probenmenge kann in Vorversuchen bestimmt werden, jedoch sind insbesondere Mengen von 0,1 bis 2 g für das Verfahren geeignet. Grenzwerte für die Probenmenge sind geringer Umsatz oder Diffusion als geschwindigkeits bestimmender Schritt. Nach Zugabe der DMSO-Lösung wird der Probenbehälter verschlossen und beispielsweise mittels einer Kanüle zweimal evakuiert und mit Stickstoff gespült. Nach Abziehen der Kanüle verbleibt die Probe unter dem Stickstoff, was sehr wichtig ist, da Sauerstoff die Messung stören würde. Nach bestimmten Zeiten, beispielsweise nach jeweils einer Stunde, werden je nach Umsatz 0,1 bis 0,5 ml der Gasphase entnommen und im Gaschromatographen analysiert. Vorzugsweise wird zur Untersuchung ein Gaschromatograph mit einer 2 m langen Säule mit Porapak R verwendet. Die Säule wird bei einer Temperatur von 170°C und mit einem Flammenionisationsdetektor betrieben. Die Analysenzeit beträgt vorzugsweise 5 min.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird aus einem Gewässer mittels einer Pumpe kontinuierlich ein konstanter Probenstrom abgezweigt, dem Probenstrom wird kontinuierlich eine konstante Menge einer Lösung von Dimethylsulfoxid (DMSO) beigemischt, das Gemisch wird in eine Reaktionskammer geleitet, um bei konstanter Temperatur einen Teil des DMSO zu Dimethylsulfid (DMS) umzusetzen, das Gemisch wird nach dem Austritt aus der Reaktionskammer zur Entfernung von DMS von einem konstanten Gasstrom durchspült und der Gasstrom wird auf seinen Gehalt an DMS analysiert. Damit ist eine kontinuierliche Bestimmung mikrobiologischer Aktivitäten in Wasserproben möglich.

Die Analyse des Gasstroms auf den Gehalt an DMS kann gemäß bevorzugten Ausführungsformen kontinuierlich durch Durchleiten des Gasstroms durch einen Detektor oder diskontinuierlich durch Entnahme von Proben aus dem Gasstrom in bestimmten Zeitabständen und gaschromatographischer Anlayse durchgeführt werden.

Als Detektor kann vorzugsweise ein Flammenionisationsdetektor zum Nachweis P- oder S-haltiger Verbindungen verwendet werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform einer Vorrichtung zur Bestimmung von mikrobiologischen Aktivitäten in Wasserproben, die insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 5 bis 9 geeignet ist, weist eine Pumpe zur kontinuierlichen Entnahme eines Probenstromes, eine Pumpe zur kontinuierlichen Zumischung einer kontanten Menge einer Lösung von Dimethylsulfoxid (DMSO), eine Reaktionskammer mit Heizung, eine Quelle eines Spülgases, eine Spülkammer und einen Detektor auf. Durch die Verknüpfung der Elemente wird eine einfache Vorrichtung geschaffen, mit welcher eine ständige Überwachung von Wasser auf mikrobiologische Aktivitäten möglich ist.

Der Detektor ist vorzugsweise ein Flammenionisationsdetektor zum Nachweis P- oder S-haltiger Verbindungen.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 Gaschromatogramme als Ergebnis der Gaschromatographie zweier Proben,

Fig. 2 Darstellungen der Kinetik der Entstehungen von Dimethylsulfid (DMS) in verschiedenen Bodenproben,

Fig. 3 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Bestimmung von mikrobiologischen Aktivitäten in Wasser und

Fig. 4 eine graphische Darstellung der mikrobiologischen Aktivitäten eines Belebtschlammes.

Eine Boden- oder Wasserprobe in einer Menge von 0,1 bis 2 g wird beispielsweise in ein Serumfläschchen mit einem Inhalt von 8,5 ml eingegeben. Danach erfolgt eine Zugabe von 0,125 ml 6,6%iger Lösung von Dimethylsulfoxid in Wasser. Das Fläschchen wird mit einem Serumstopfen aus Gummi luftdicht verschlossen. Danach erfolgt ein zweimaliges Evakuieren und Begasen der Probe mit Stickstoff. Dazu wird vorzugsweise eine Stahlkanüle, die mit einem Dreiwegehahn versehen ist, durch den Serumstopfen gestochen. Zuerst wird über den Dreiwegehahn und die Stahlkanüle das Fläschchen evakuiert und anschließend nach Umstellen des Dreiwegehahns wird Stickstoff in den Raum über der Probe in das Fläschchen eingefüllt. Dieser Vorgang wird einmal wiederholt.

Die mit Stickstoff begaste Probe in dem Fläschchen wird auf einer Temperatur von 30°C gehalten. Zu vorgegebenen Zeitpunkten, beispielsweise nach einer, zwei, drei, vier, sechs und acht Stunden, erfolgt eine Entnahme von 0,1 bis 0,5 ml der Gasphase aus dem Fläschchen. Diese Gasprobe wird in einem Gaschromatographen analysiert. Die Ausstattung des Gaschromatographen ist vorzugsweise folgende:

Säulenmaterial: Porapak R
Säulenlänge: 2 m
Säulentemperatur: 170°C
Detektor: Flammenionisationsdetektor
Analysenzeit: ca. 5 min.

Fig. 1 zeigt zwei typische Gaschromatogramme. Das linke Gaschromatogramm zeigt eine Gasprobe, wobei keine Inkubation mit Dimethylsulfoxid (DMSO) erfolgt ist. Das rechte Gaschromatogramm zeigt eine Probe, die mit Dimethylsulfoxid inkubiert wurde. Die Probe wurde bei t = 0 in den Gaschromatographen eingespritzt. Es ist deutlich die Anwesenheit von Dimethylsulfid (DMS) in der Gasphase ersichtlich. Störungen durch andere Substanzen aus endogener Produktion (CO₂ usw.) sind nicht feststellbar. Das linke Gaschromatogramm wurde zur Kontrolle erstellt.

Fig. 2 zeigt die Kinetik der Bildung von DMS in Bodenproben mit verschiedener Aktivität. Die Punkte liegen jeweils auf einer Geraden, die durch den Nullpunkt gehen, d. h. die Mikroorganismen wandeln DMSO sofort um, ohne sich zu verändern, und sie behalten den gleichen stofflichen Zustand einige Zeit bei.

Fig. 3 zeigt in schematischer Darstellung eine Vorrichtung 10 zur kontinuierlichen Bestimmung mikrobiologischer Aktivitäten in Wasserproben. Mittels einer Pumpe 12 wird aus einem Probenbehälter oder einem Gewässer 14 über eine Leitung 16 ein konstanter Probenstrom abgezweigt. Über eine Leitung 18 wird der Probenstrom in eine Reaktionskammer 20 geleitet. Mittels einer Pumpe 22 wird dem Probenstrom eine konstante Menge einer Lösung aus Dimethylsulfoxid (DMSO), das in einem Behälter 24 angeordnet ist, zugemischt. Dazu ist die Leitung 18 mit einer Leitung 26 verbunden. In der Reaktionskammer 20, die mittels einer Heizung auf einer konstanten Temperatur gehalten wird, wird ein Teil des DMSO zu Dimethylsulfid (DMS) umgesetzt. Der Reaktionskammer 20 ist eine Spülkammer 28 nachgeschaltet, in welche über eine Leitung 30 das in der Reaktionskammer 20 entstehende Gasgemisch eingeleitet wird. In der Spülkammer 28 wird das Gasgemisch mittels eines Spülgases gespült, das über eine Leitung 32 aus einem Behälter oder einer Gasquelle 34 zugeführt wird. In der Spülkammer wird das DMS aus dem Gasgemisch entfernt. Der Gasstrom wird dann über eine Leitung 36 einem Detektor 38 zugeführt, der spezifisch DMS und ähnliche Verbindungen anzeigt. Der Detektor kann ein Flammenionisationsdetektor zum Nachweis P- oder S-haltiger Verbindungen sein. Mittels des Flammenionisationsdetektors 38 kann eine kontinuierliche Analyse nach DMS erfolgen. Aus der Spülkammer wird die Wasserprobe über eine Leitung 40 und aus dem Detektor das Spülgas über eine Leitung 42 abgeleitet.

Anstelle einer kontinuierlichen Bestimmung mittels eines Flammenionisationsdetektors kann eine diskontinuierliche Analyse durchgeführt werden, indem Proben aus dem Gasstrom nach Verlassen der Spülkammer in bestimmten Zeitabständen einem Gaschromatographen eingegeben werden.

Fig. 4 zeigt ein Beispiel für die Bestimmung mikrobiologischer Aktivitäten eines Belebtschlammes. Der Versuch, der zu der in Fig. 4 gezeigten graphischen Darstellung führte, wies folgende Bedingungen auf:

Größe der Reaktionskammer: 400 ml
Kammertemperatur: 30°C
Flußrate der Probe: 3 ml/min
Flußrate der DMSO-Lösung (8% in H₂O): 0,5 ml/min
Größe der Spülkammer: 60 ml
Spülgas: N₂
Analyseverfahren: diskontinuierlich.

Mit t₁ (11.30 Uhr) ist der Beginn der Zumischung von DMSO bezeichnet. Nach 8 Stunden erfolgte eine Stabilisierung. Zum Zeitpunkt t₂ (23.00 Uhr) wurde zur Abtötung der Mikroorganismen dem Belebtschlamm 0,1% Kaliumcyanid (KCN) zugegeben. Die Verringerung der mikrobiologischen Aktivität war nach ca. 2 Stunden ersichtlich.

Da der Kontrollwert ohne DMSO bei der Untersuchung von Belebtschlamm nicht vernachlässigbar ist, ist für genaue Bestimmungen ein Referenzsystem ohne DMSO-Zugabe zu empfehlen, gegen das dann abgeglichen werden kann. Dies ist besonders wichtig bei Bestimmungen mikrobiologischer Aktivitäten anaerober Wasserproben, da dabei mit vermehrtem Auftreten störender Gärungsprodukte (CH₄, H₂S) zu rechnen ist.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von mikrobiologischen Aktivitäten in Boden- und Wasserproben, dadurch gekennzeichnet, daß eine in einem geschlossenen Behälter aufgenommene Probe unter anaeroben Bedingungen mit Dimethylsulfoxid (DMSO) versetzt und die sich über der Probe einstellende Gasphase auf ihren Gehalt an Dimethylsulfid (DMS) gaschromatographisch untersucht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß 0,1 bis 2 g Boden oder Wasser in einem Probenbehälter mit 0,125 ml 6,6%iger Lösung von Dimethylsulfoxid in Wasser versetzt werden, daß der Behälter verschlossen wird, daß der Behälter zweimal evakuiert und mit Stickstoff begast wird, daß die Probe auf 30°C gehalten wird, und daß 0,1 bis 0,5 ml der Gasphase aus dem Behälter entnommen und in den Gaschromatographen eingegeben werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die erste Entnahme der Gasphase aus dem Behälter und die gaschromatographische Untersuchung nach einer Stunde erfolgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, daß zur Untersuchung ein Gaschromatograph mit einer 2 m langen Säule mit Porapak R und einem Flammenionisationsdetektor verwendet wird, daß die Säule auf einer Temperatur von 170°C gehalten wird, und daß die Analysenzeit 5 min beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß aus einem Gewässer mittels einer Pumpe kontinuierlich ein konstanter Probenstrom abgezweigt wird, daß dem Probenstrom kontinuierlich eine konstante Menge einer Lösung von Dimethylsulfoxid (DMSO) beigemischt wird, daß das Gemisch in eine Reaktionskammer geleitet wird, um bei konstanter Temperatur einen Teil des DMSO zu Dimethylsulfid (DMS) umzusetzen, daß das Gemisch nach dem Austritt aus der Reaktionskammer zur Entfernung von DMS von einem konstanten Gasstrom durchspült wird und daß der Gasstrom auf seinen Gehalt an DMS analysiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet, daß die Analyse auf den Gehalt an DMS kontinuierlich durch Durchleiten des Gasstroms durch einen Detektor durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn zeichnet, daß als Detektor ein Flammenionisationsdetektor zum Nachweis P- oder S-haltiger Verbindungen verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet, daß die Analyse durch Entnahme von Proben aus dem Gasstrom in bestimmten Zeitabschnitten und gaschromatographischer Anlayse durchgeführt wird.