CN209669228U - 一种犬科病毒多重荧光定量pcr检测微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及一种犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片，由基板、上盖板与下盖板组成；基板上设置有进样孔A，微流道，DNA分离室，三角阀，废液室，进样孔B，PCR反应室；上盖板留出对应进样孔A、进样孔B和三角阀的位置，对应废液室位置设置凸起的开放腔室，键合于基板之上表面；下盖板键合于基板之下表面，将基板下表面封闭。本实用新型可以在一张芯片上实现DNA分离和多重荧光定量PCR检测，方便使用者针对多种病毒同步快速检测；本实用新型既可适用于大型自动化检测仪器，也可适用小型设备进行手动操作，操作过程简便快捷，灵活性强。
Description
技术领域
本实用新型涉及动物疫病检测技术领域，具体涉及一种犬科病毒多重荧光定量PCR检测的微流控芯片。
背景技术
病毒与其他微生物相比，在结构、化学组成、繁殖方式及对药物敏感性方面均有显著区别。动物病毒病具有传染性强、流行广泛、危害严重和发病率高的特点，尤其是宠物病毒病，还可能对宠物饲养者造成影响。因此如何快速诊断、定量诊断成了控制和治疗这些动物病毒病的关键因素。
目前，检测宠物病毒感染的技术主要有免疫层析(IC)测试、血凝试验(HA)、病毒分离(VI)实验、普通PCR等：(1)免疫层析(IC)测试与分子技术进行比较，测试的相对灵敏度不超过50％，而特异性为100％；(2)HA试验结果的准确性受红细胞的质量、红细胞沉降系数的影响，具有不稳定性；(3)病毒分离(VI)仅可在实验室细胞上进行，需要一定专业技术和细胞培养能力的实验人员，需要长达5-10天并需要进行免疫荧光来检测病毒抗原；(4) PCR是比较常见的技术，但其缺陷在于耗时、敏感性不显著、且不能定量检测。以上这些缺点限制了上述方法在临床诊断中的应用。
实用新型内容
本实用新型所要解决的技术问题是：如何快速且定量的检测犬科动物病毒，并同时实现 DNA提取和多重荧光定量PCR在一张芯片上完成，实现多种病毒同步检测。
为解决上述问题，基于DNA提取和多重荧光定量PCR原理，结合微流控技术，本实用新型提供了一种犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由基板、上盖板与下盖板组成；
基板上设置有进样孔A，微流道，DNA分离室，三角阀，废液室，进样孔B，PCR反应室；
上盖板留出对应进样孔A、进样孔B和三角阀的位置，对应废液室位置设置凸起的开放腔室，上盖板键合于基板之上表面；下盖板键合于基板之下表面，将基板下表面全部封闭；基板、上盖板与下盖板共同构成DNA分离室、废液室、微流道和PCR反应室；
DNA分离室通过位于基板底部的微流道分别与进样孔A、三角阀相连通；废液室通过微流道与三角阀相连通；PCR反应室通过微流道与进样孔B、三角阀相连通；
通过三角阀的转动，能够将DNA分离室在三角阀内的微流道出口与三角阀通向废液室或PCR反应室的微流道出口接通，从而控制废液或DNA洗脱液的流向。
所述基板、上盖板和下盖板的材质可选自玻璃、PMMA、PC、COC或COP。上盖板或下盖板的厚度为0.1-0.5mm。反应室底面、微流道内表面可进行亲水或疏水处理。
连通进样孔、腔室和三角阀的微流道的宽度和/或深度为50-300μm；PCR反应区的微流道宽度和/或深度为50-100μm。
所述DNA分离室的容积为50-500μl；所述废液室的容积为200-500μl；所述PCR反应室的容积为20-50μl；所述微流控芯片可包含1-6个PCR反应室；还可以在PCR反应室内预置磁力转子，便于使用磁力搅拌仪对反应试剂进行充分混合。
所述的犬科病毒快速定量检测微流控芯片，还包括封闭进样孔的鲁尔塞或堵头。
所述的犬科病毒快速定量检测微流控芯片，可以在DNA分离室内预置DNA分离磁珠；还可以在反应室内预置磁力转子，便于使用磁力搅拌仪对反应试剂进行充分混合或DNA分离。
本实用新型所述犬科病毒可选自犬瘟热病毒、犬细小病毒、狂犬病毒、犬冠状病毒、犬脑心肌炎病毒、犬副流感病毒或犬腺病毒。
本实用新型与现有技术相比具有下述优点：
1、本实用新型能够在一张芯片上实现DNA分离和多重荧光定量PCR反应，可针对微量样本进行检测，方便使用者对多种病原同步检测，实现对犬科病毒的高灵敏度、快速、定量检测。
2、本实用新型自身设置封闭废液池，更加便利于机械手自动化操作，避免对仪器的污染。
3、本实用新型既可适用于大型自动化检测仪器，也可适用小型设备进行手动操作，操作过程简便快捷，灵活性强。
附图说明
图1.本实用新型犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片的正面结构示意图之一，图中标记：11-进样孔A，12-微流道，13-DNA分离室，14-三角阀，15-废液室，16-进样孔B，17-PCR反应室，18-对应PCR仪器的加热模块(虚线框)。
图2.本实用新型犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片的正面结构示意图之二，图中标记：11-进样孔A，12-微流道，13-DNA分离室，14-三角阀，15-废液室，16-进样孔B，17-PCR反应室，18-对应PCR仪器的加热模块(虚线框)。
图3.本实用新型犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片的上盖板结构示意图，图中标记：20-上盖板。
图4.本实用新型犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片废液室一侧的纵剖面结构示意图，图中标记：上图：沿a线纵剖；下图：10-基板，20-上盖板，30-下盖板，11-进样孔A， 12-微流道，13-DNA分离室，14-三角阀，15-废液室。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本实用新型作进一步描述。应当注意，实施例中未详细说明的常规条件和方法，均按照所属领域人员常规采用的实验条件和方法进行。
实施例1：
如图1、图3、图4所示，一种犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片，所述微流控芯片由基板、上盖板与下盖板键合而成；基板上设置有进样孔A，微流道，DNA分离室，三角阀，废液室，进样孔B，PCR反应室；上盖板留出对应进样孔A、进样孔B和三角阀的位置，对应废液室位置设置凸起的开放腔室，上盖板键合于基板之上表面；下盖板键合于基板之下表面，将基板下表面全部封闭；基板、上盖板与下盖板共同构成DNA分离室、废液室、PCR 反应室的容纳空间和微流道。
DNA分离室通过位于基板底部的微流道分别与进样孔A、三角阀相连通；废液室通过微流道与三角阀相连通；PCR反应室通过微流道与进样孔B、三角阀相连通；通过三角阀的转动，能够将DNA分离室在三角阀内的微流道出口与三角阀通向废液室或PCR反应室的微流道出口接通，从而控制废液或DNA洗脱液的流向。
所述基板、上盖板和下盖板的材质可选自玻璃、PMMA、PC、COC或COP；优选COC或COP；上盖板厚度为0.2mm，下盖板的厚度为0.1-0.5mm。
连接各个腔室和进样孔的微流道的宽度和/或深度为50-80μm。
DNA分离室的容积为50μl；废液室的容积为200μl；PCR反应室的容积为100μl。
所述的犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片适用于犬瘟热病毒、犬细小病毒、狂犬病毒、犬冠状病毒、犬脑心肌炎病毒、犬副流感病毒和/或犬腺病毒的定量检测。
实施例2：
如图2、图3、图4所示，一种犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片，所述微流控芯片由基板、上盖板与下盖板键合而成；基板上设置有进样孔A，微流道，DNA分离室，三角阀，废液室，进样孔B，PCR反应室；上盖板留出对应进样孔A、进样孔B和三角阀的位置，对应废液室位置设置凸起的开放腔室，上盖板键合于基板之上表面；下盖板键合于基板之下表面，将基板下表面全部封闭；基板、上盖板与下盖板共同构成DNA分离室、废液室、PCR 反应室的容纳空间和微流道。
DNA分离室通过位于基板底部的微流道分别与进样孔A、三角阀相连通；废液室通过微流道与三角阀相连通；PCR反应室通过微流道与进样孔B、三角阀相连通；通过三角阀的转动，能够将DNA分离室在三角阀内的微流道出口与三角阀通向废液室或PCR反应室的微流道出口接通，从而控制废液或DNA洗脱液的流向。
所述基板、上盖板和下盖板的材质可选自玻璃、PMMA、PC、COC或COP；优选COC或COP；上盖板厚度为0.2mm，下盖板的厚度为0.1-0.5mm。
连接各个腔室和进样孔的微流道的宽度和/或深度为50-80μm。
DNA分离室的容积为50μl；废液室的容积为200μl；PCR反应室的容积为100μl，微流控芯片包含5个PCR反应室，PCR反应室之间通过微流道连通。
所述的犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片适用于犬瘟热病毒、犬细小病毒、狂犬病毒、犬冠状病毒、犬脑心肌炎病毒、犬副流感病毒和/或犬腺病毒的定量检测。
本实用新型所述犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片的使用方法：
(一)单个PCR反应室的微流控芯片
1、撕开进样孔A处的保护膜，将DNA分离磁珠2-5μl注入DNA分离室；
2、将动物血清、唾液、尿液等待测样品50-100μl自进样孔A注入DNA分离室，反应室内空气自三角阀测通孔排出，尽量避免在反应室内吹出气泡，使用鲁尔塞或堵头封闭进样孔，控制三角阀将连接DNA分离室的通孔关闭；
3、将微流控芯片置于磁力混匀仪上，开启开关，通过磁力带动DNA分离磁珠在样品中反复流动，将DNA吸附于磁珠上，此步骤约5-10分钟；
4、控制三角阀将DNA分离室与废液室连通，将缓冲液自进样孔A注入，将剩余样品排入废液室，关闭三角阀内连接DNA分离室的通孔(此过程中磁力混匀仪始终开启，保证吸附DNA的磁珠不会被冲走)；
5、使用缓冲液冲洗磁珠30-60s，控制三角阀将DNA分离室与废液室连通，将废液排入废液室；重复此冲洗过程1-3次，使用气泵将废液全部排出；
6、自进样孔A注入DNA洗脱液，与上述冲洗步骤相同，将DNA洗脱；
7、控制三角阀将DNA分离室与PCR反应室连通，使用气泵将洗脱的DNA注入PCR反应室内，将PCR反应试剂混合物自进样孔B注入PCR反应室，可手动晃动混合，也可芯片内预置磁力转子，使用磁力混匀仪混匀；
8、设定PCR程序，控制PCR仪加热模块对应PCR反应过程需求。
9、通过PCR反应室顺序监测多重或单个荧光，仪器读数，根据标准曲线计算病毒数量。
(二)多个PCR反应室的微流控芯片
步骤1-6与(一)相同。
7、控制三角阀将DNA分离室与外界隔断，自进样孔A将DNA洗脱液吸出；
8、控制三角阀将PCR反应室在三角阀内的通孔与外界连通，在芯片外部将DNA洗脱液与PCR反应试剂混合物混匀后，自进样孔B，将PCR反应体系注入各个PCR反应室；
9、设定PCR程序，控制PCR仪加热模块对应PCR反应过程需求。
10、各个PCR反应室上方均设置荧光检测探头，分别通过PCR反应室同时监测多重荧光，仪器读数，根据标准曲线计算病毒数量。
以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由基板(10)、上盖板(20)与下盖板(30)组成；
基板(10)上设置有进样孔A(11)，微流道(12)，DNA分离室(13)，三角阀(14)，废液室(15)，进样孔B(16)，PCR反应室(17)；上盖板(20)留出对应进样孔A(11)、进样孔B(16)和三角阀(14)的位置，对应废液室(15)位置设置凸起的开放腔室，上盖板(20)键合于基板(10)之上表面；下盖板(30)键合于基板(10)之下表面，将基板(10)下表面全部封闭；基板(10)、上盖板(20)与下盖板(30)共同构成DNA分离室(13)、废液室(15)、PCR反应室(17)的容纳空间和微流道(12)；
DNA分离室(13)通过位于基板底部的微流道(12)分别与进样孔A(11)、三角阀(14)相连通；废液室(15)通过微流道(12)与三角阀(14)相连通；PCR反应室(17)通过微流道(12)与进样孔B(16)、三角阀(14)相连通；
通过三角阀(14)的转动，能够将DNA分离室(13)在三角阀(14)内的微流道出口与三角阀(14)通向废液室(15)或PCR反应室(17)的微流道出口接通，从而控制废液或DNA洗脱液的流向。
2.根据权利要求1所述的犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片，其特征在于，所述基板(10)、上盖板(20)和下盖板(30)的材质可选自玻璃、PMMA、PC、COC或COP；上盖板(20)或下盖板(30)的厚度为0.1-0.5mm。
3.根据权利要求1所述的犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片，其特征在于，微流道(12)的宽度和/或深度为50-300μm；PCR反应区(18)的微流道宽度和/或深度为50-100μm。
4.根据权利要求1所述的犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片，其特征在于，DNA分离室(13)的容积为50-500μl。
5.根据权利要求1所述的犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片，其特征在于，废液室(15)的容积为200-500μl。
6.根据权利要求1所述的犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片，其特征在于，PCR反应室(17)的容积为20-50μl。
7.根据权利要求1所述的犬科病毒多重荧光定量PCR检测微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包含1-6个PCR反应室(17)。
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