CN113088446B - 一种全自动化核酸快速检测装置及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种全自动化核酸快速检测装置及检测方法，涉及微流控技术领域。包括检测单元和离心功能托盘，检测单元包括加样池、反应池、定量池和扩增检测池；加样池与反应池连接；第一试剂池、第二试剂池、第三试剂池和第四试剂池分别与反应池连接，第五试剂池与定量池连接；定量池分别与扩增检测池和第二废液池连接。将样本液加至加样池，使样本液进入反应池，各种试剂按顺序进行释放，然后启动离心使试剂液体进入反应池，将核酸提取、纯化集成在反应池中，将核酸洗脱液离心进入定量池中，再进入扩增检测池中进行PCR扩增反应。本发明解决了样本气溶胶对标本的影响及检测人员感染的风险，同时可以节省试剂的消耗，缩短检测时间。

Description

一种全自动化核酸快速检测装置及检测方法

技术领域

本发明涉及微流控技术领域，更具体地，涉及一种全自动化核酸快速检测装置及检测方法。

背景技术

微流控技术作为一种新兴的科学技术，已经应用于化学、生物学、工程学和物理学等诸多领域，学科交叉性强，在时间、空间和分析对象的精密操控上进行了突破，能够解决生命分析的许多关键问题。微流控技术能够将原本只能在实验室才能完成的检测实验集成到一小块芯片上，不仅节约了耗材成本和时间成本，更重要的是能够集成多种检测技术于一体，提高检测效率。

微流控技术应用于核酸诊断，将核酸提取、扩增及检测过程等基本操作单元集成到一块几平方厘米的芯片上，并以微通道网络贯穿各个实验环节，从而实现对整个实验室系统的灵活操控，承载核酸检测的各项功能。微流控芯片技术将核酸检测过程全面整合，只需加入样本即可，大大简化了检测过程的操作难度，排除了不同操作者实验技能的影响。因此当前整个微流控技术的很大的一块的应用场景是微流控分子诊断。其核心目的是把分子诊断的整个样本富集，裂解，核酸提取与纯化，PCR扩增集成在一张微流控芯片上，并实现多个样本指标的同时检测。

目前大多数微流控核酸检测芯片专利设计基本只完成了前处理(CN108424850A)，或者后期核酸扩增单个功能的实现(CN 203750554U)，同时大多数集成化的微流控核酸检测芯片，需要借助蜡阀、毛细阀、虹吸阀等微细结构进行微流体控制(CN110180610A)，集成的微阀结构越多，芯片的加工难度越大，同时需要对芯片表面进行局部的亲疏水处理，极大地限制了微流控核酸快速检测芯片的发展。

发明内容

为克服上述不足，本发明的目的在于提供一种基于离心功能托盘及芯片的全自动化核酸快速检测装置，无需在芯片局部的亲疏水处理及在芯片上集成大量阀控，而是借助离心功能托盘实现磁吸分离，刺破阀控和可逆阀控等，大大简化芯片加工工艺，利于后期量产开发，从而解决现有技术中微流控核酸检测芯片无法同时完成核酸的提取、纯化、定量、扩增和检测，且需要集成大量的微阀结构，还需要对芯片表面进行亲疏水处理的技术问题。

根据本发明的第一方面，提供了一种全自动化核酸检测装置，包括检测单元和离心功能托盘，所述检测单元能随离心功能托盘旋转而转动；所述检测单元包括加样池、反应池、定量池和扩增检测池；

所述加样池通过刺破阀与反应池连接；第一试剂池、第二试剂池、第三试剂池和第四试剂池分别通过刺破阀与反应池连接，所述第一试剂池、第二试剂池、第三试剂池和第四试剂池分别用于盛装裂解液、结合液、清洗缓冲液和洗脱液；第五试剂池通过刺破阀与定量池连接，所述第五试剂池用于盛装封闭液；所述反应池通过可逆阀分别与定量池和第一废液池连接；

所述定量池分别与扩增检测池和第二废液池连接，所述定量池用于反应池中液体的分装及扩增检测池液体的定量，所述扩增检测池用于预装核酸扩增试剂并用于进行聚合酶链式反应；

所述反应池中预埋有能捕获核酸的磁珠，磁珠固定装置设置在反应池底部，所述磁珠固定装置用于实现磁珠的固定及分离。

优选地，还包括气压平衡通道，所述气压平衡通道分别与加样池、反应池、第一试剂池、第二试剂池、第三试剂池、第四试剂池、第五试剂池、第一废液池和第二废液池连通，所述气压平衡通道用于离心时检测单元内部气压的平衡。

优选地，所述磁珠固定装置为能够移动的磁铁。

优选地，所述反应池的高度为100μm-500μm。

优选地，所述扩增检测池的数量为8-10个。

优选地，所述第五试剂池的封闭液为硅油、矿物油或石蜡油。

按照本发明的另一方面，提供了利用所述的装置进行核酸检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将样本液加入加样池中，启动离心功能托盘，加样池中的样本液、第一试剂池中的裂解液和第二试剂池中的结合液分别通过刺破阀依次释放进入反应池中，所述样本液在裂解液的作用下，释放出核酸，并在结合液的作用下，吸附在反应池中的磁珠表面；

S2：通过磁珠固定装置吸附磁珠于反应池底部进行磁珠固定，反应池中的废液在离心力的作用下通过可逆阀排入第一废液池；第三试剂池中的清洗缓冲液通过刺破阀释放进入反应池中，同时解除磁珠固定装置对磁珠的吸附使磁珠重悬，所述清洗缓冲液对重悬的磁珠进行清洗；

S3：通过磁珠固定装置吸附磁珠于反应池底部进行磁珠固定，反应池中的废液在离心力的作用下通过可逆阀排入第一废液池；第四试剂池中的洗脱液通过刺破阀释放进入反应池中，同时解除磁珠固定装置对磁珠的吸附使磁珠重悬，所述洗脱液对重悬的磁珠进行洗脱；

S4：通过磁珠固定装置吸附磁珠于反应池底部进行磁珠固定，反应池中的洗脱液通过可逆阀定量分装到定量池中，多余的洗脱液在离心力的作用下排入第二废液池中，定量池中的洗脱液在离心力作用进入扩增检测池中；然后第五试剂池中的封闭液在离心力的作用下进入定量池中，实现对扩增检测池密封；扩增检测池中的核酸与核酸扩增试剂进行聚合酶链式反应，完成对核酸的扩增。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

(1)本发明技术方案在芯片内集成了核酸提取及扩增在芯片内独立完成，芯片为一次性使用产品，有效防止气溶胶的空气污染及扩增产物对环境的污染引起假阳性的产生；

(2)本发明技术方案所采用的阀门都为机械控制的主动阀门，不需要对芯片表面进行严格的修饰，因此芯片的加工相对较简单快速，成本低；同时对流体的控制更加稳定，不受温湿度及一般试剂的影响。

(3)本发明技术方案所采用的阀门控制组件集成在离心功能托盘上，离心功能托盘为集成在仪器内的组件，因此，更进一步降低了芯片的加工技术难度、耗材的成本，大大降低了项目检测的成本。

附图说明

图1为本发明全自动化核酸快速检测装置的整体结构示意图。

图2为本发明全自动化核酸快速检测装置的检测单元结构示意图。

图3为本发明全自动化核酸快速检测装置的离心功能托盘的俯视图。

图4为本发明全自动化核酸快速检测装置的离心功能托盘侧面透视图。

图5为本发明全自动化核酸快速检测装置的刺破阀运行示意图。

图6为本发明全自动化核酸快速检测装置的可逆阀运行示意图。

图7为本发明全自动化核酸快速检测装置的磁珠固定装置示意图。

在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：1-加样池、2-反应池、3-定量池、4-扩增检测池、5-刺破阀、6-第一试剂池、7-第二试剂池、8-第三试剂池、9-第四试剂池、10-第五试剂池、11-可逆阀、12-第一废液池、13-第二废液池、14-磁珠固定装置、15-气压平衡通道。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明一种全自动化核酸快速检测装置，包括微流控核酸检测芯片及离心功能托盘，图1为本发明全自动化核酸快速检测装置的整体结构示意图。所述微流控核酸检测芯片包括至少一个检测单元，图2为本发明全自动化核酸快速检测装置的检测单元结构示意图。所述检测单元包括加样池1、反应池2、定量池3、扩增检测池4、第一试剂池6、第二试剂池7、第三试剂池8、第四试剂池9、第五试剂池10、可逆阀11、第一废液池12和第二废液池13；所述加样池1设有用于加样的加样孔；所述反应池2与所述加样池1及试剂池连通，试剂加样顺序通过阀门进行控制；试剂池与所述反应池2连通，用于预装核酸提取所需的各种试剂；所述定量池3与所述反应池2及扩增检测池4连通，所述定量池3用于反应池2中液体的分装及扩增检测池4液体的定量；所述扩增检测池4与所述定量池3连通，所述扩增检测池4用于预装核酸扩增所需要的引物、探针等冻干试剂；废液池与反应池2连通以用于收集废液。

本发明中的微流控核酸检测芯片具有旋转中心，反应池2相对于所述加样池1和试剂池，更远离旋转中心；定量池3相对于反应池2更远离旋转中心；扩增检测池4相对于定量池3更远离旋转中心；废液池相对于反应池2、定量池3，更远离旋转中心；反应池2与加样池1、试剂池、定量池3和废液池之间均设有阀门。

本发明中的磁珠固定装置14、刺破阀5和可逆阀11均为机械智能化控制装置，非检测芯片内部结构，极大降低了芯片加工的难度，提高了芯片检测的稳定性。本发明中的磁珠固定装置14、刺破阀5和可逆阀11为集成在随全自动化核酸快速检测芯片旋转的离心功能托盘中。

本发明中的的离心功能托盘与对应芯片为两个独立单元，但相互匹配，离心功能托盘作为仪器配件可以长期重复使用，大小及形状随磁铁固定装置14、刺破阀5及可逆阀11的结构进行设计，不限于圆形。

本发明中检测单元包括的用于释放各种试剂池液体的刺破阀5，所述刺破阀5集成在离心功能托上，用于刺破芯片内一层薄膜，用于试剂液体的释放，随后启动离心使液体进入反应池2。

本发明检测单元包括的与所述反应池2和第一废液池12及定量池3之间的可逆阀11，可逆阀11集成于离心功能托盘中，即当反应池2中废液需要排空的时候开放，反应混合时关闭，在需要定量洗脱的核酸缓冲液时开放定量池3的可逆阀11，关闭靠近第一废液池的可逆阀11，定量之后关闭所有可逆阀11。

图3为本发明全自动化核酸快速检测装置的离心功能托盘的俯视图，图4为本发明全自动化核酸快速检测装置的离心功能托盘侧面透视图。

本发明中的刺破阀5，结构示意图如图5所示，依靠配套仪器底部的顶针往上刺破薄膜，使阀门开放，进行液体的释放。

本发明中的可逆阀，如图6所示，通过在离心功能托盘上集成对应的顶针，对阀门处的弹性膜进行顶死或释放，对流体进行截流或释放。

图7为本发明全自动化核酸快速检测装置的磁珠固定装置示意图。

一些实施例中，磁珠固定装置中设计有卡槽，磁铁存放至卡槽内，磁铁靠近圆心的一段连接有弹簧，其中卡槽中固定位置设计有限位顶针，当需要进行磁吸固定时，利用外力将磁铁往离心中心推进，弹簧被压缩，磁铁被固定在限位顶针位置进行磁吸固定反应池中的磁珠；去磁吸时，将限位顶针释放，磁铁会由于弹簧的复形而回归之前位置达到去磁吸的效果。

一些实施例中，本发明中气压平衡通道15汇集于靠近离心旋转中心处，并与加样池1、反应池2、试剂池和废液池相连通，但不与外界空气连通，且气压平衡通道15位于芯片的最上层。气压平衡通道15为最上面一层相互连通的微细通道，并交汇于靠近旋转中心位置，交汇处相对于加样池1、反应池2、废液池和定量池3更靠近旋转中心。

一些实施例中，微流控核酸检测芯片大致呈圆形，包括两个绕圆心均匀分布的检测单元，可以同时检测2个样本，适用于全血、血浆、唾液等各种检测样本。在其他实施方式中，微流控核酸检测芯片还可以是其他形状，例如矩形、多边形等等。微流控检测芯片上的检测单元的数量还可以为一个、两个、三个等等。

一些实施例中，扩增检测池4的数量可以为多个，每个腔室可以检测多个指标，因此，单一样本的核酸检测指标至少可以完成32个，甚至上百个。

一些实施例中，第五试剂池10的封闭液可以是硅油、矿物油、石蜡油、缓冲液等，同时。封闭液可以预先包埋于扩增检测池4中。

一些实施例中，定量池3与扩增检测池4之间的阀为疏水阀，但也可以是石蜡阀、光敏蜡阀、虹吸阀等。

一些实施例中，微流控核酸检测芯片的加工方式包括CNC、激光雕刻、软光刻技术、3D打印及注塑形成模具等方式，但不限于此。

本发明中全自动化核酸检测装置，不仅可用于临床血清、全血、咽拭子等样本的检测，也可以用于环境、食物等各种来源样本的检测，且可检测的分子类型不局限于疾病相关分子，实际上任何核酸分子都可以用本方法检测，即其应用具有普适性。

本发明的全自动化核酸快速检测装置，通过微流控芯片及随芯片离心转动的功能化托盘组合，将复杂的阀门集成在功能托盘中，简化了芯片的加工工艺，提高了芯片检测的稳定性；在反应池2内完成核酸的提取及纯化，同时通过分装定量，可以实现单一样本的多个核酸靶标的同时检测，同时整个复杂的过程由芯片及仪器完成，不需要专业检测人员进行操作，同时结合微流控微型化的特点，节省试剂消耗，大大加快了检测速度，降低了检测成本。

实施例1

一种全自动化核酸检测装置，包括检测单元和离心功能托盘，所述检测单元能随离心功能托盘旋转而转动；所述检测单元包括加样池1、反应池2、定量池3和扩增检测池4；

所述加样池1通过刺破阀5与反应池2连接；第一试剂池6、第二试剂池7、第三试剂池8和第四试剂池9分别通过刺破阀5与反应池2连接，所述第一试剂池6、第二试剂池7、第三试剂池8和第四试剂池9分别用于盛装裂解液、结合液、清洗缓冲液和洗脱液；第五试剂池10通过刺破阀5与定量池3连接，所述第五试剂池10用于盛装封闭液；所述反应池2通过可逆阀11分别与定量池3和第一废液池12连接；

所述定量池3分别与扩增检测池4和第二废液池13连接，所述定量池3用于反应池2中液体的分装及扩增检测池4液体的定量，所述扩增检测池4用于预装核酸扩增试剂；

所述反应池2中预埋有能捕获核酸的磁珠，磁珠固定装置14设置在反应池2底部，所述磁珠固定装置14用于实现磁珠的固定及分离。

实施例2

本发明的微流控核酸快速检测装置在使用时，可将样本液从加样孔加至加样池1，将芯片密封放入配套的仪器中(含配套的离心功能托盘)，然后通过刺破阀5打开第一试剂池6和第二试剂池7的阀门，然后启动离心使样本液，裂解液和结合液同时进入反应池2，通过不断改变离心方向及幅度使液体产生来回混合震荡的效果，使细胞或病毒裂解更加充分，同时促使裂解释放的核酸充分吸附在磁珠表面。随后启动磁珠固定装置14，磁铁吸附磁珠于反应池底部，进行磁珠固定，然后开放反应池2与第一废液池12之间的可逆阀11，启动离心，将废液排入第一废液池12中。随后关闭反应池2与第一废液池12之间的可逆阀11，随后通过刺破阀5释放第三试剂池8中的清洗缓冲液，同时解除磁铁吸附固定磁珠，启动离心，将清洗缓冲溶液甩入反应池2，通过不断改变离心方向及幅度使液体产生来回混合震荡的效果，重悬磁珠进行清洗。随后启动磁铁吸附磁珠于反应池2底部，进行磁珠固定，然后开放反应池2与第一废液池12之间的可逆阀11，启动离心，将废液排入第一废液池12中。随后关闭反应池2与第一废液池12之间的可逆阀11。通过刺破阀释放第四试剂池9中的洗脱液，释放磁铁吸附固定磁珠，启动离心，将洗脱液甩入反应池2中，重悬磁珠，启动混合操作，将磁珠表面吸附的核酸进行充分的洗脱。洗脱完成，启动磁铁吸附磁珠固定，开放反应池2与定量池3之间的可逆阀11，先进行低速离心进行分装定量，多余的洗脱液会进入第二废液池13中，随后关闭反应池2与定量池3之间的可逆阀11，随后启动高速离心将分装定量好的液体离心进入扩增检测池14中。随后通过刺破阀5释放第五试剂池10的封闭液，启动离心，将封闭液甩入定量池3中，对扩增检测池4进行密封。此时对扩增检测池4中进行PCR扩增反应，并进行实时信号检测。

本发明中的检测方法的全过程均在密闭环境中完成，减少了气溶胶对环境的污染，降低了检测人员感染的风险；同时该全自动化核酸检测芯片将核酸提取、纯化、扩增及实时信号检测相结合，大大简化了人员操作的步骤，且不需要专业的人员进行操作，解决了传统核酸检测手工操作过程中，操作步骤多而繁杂，相对应的芯片较小，不限于大型实验室才能完成检测，降低了检测成本，可以实现目标现场的快速检测。而且对于多种阀门的控制，本发明设计了与芯片配套的离心功能托盘，减少了芯片内微阀的集成数量；同时相对于芯片内的微阀，借助离心功能托盘的机械性阀门控制具有更高的稳定性。同时用芯片的集成化、微型化的特点，可以节省整体的操作时间，反应时间，降低试剂的消耗。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种全自动化核酸检测装置，其特征在于，包括检测单元和离心功能托盘，所述检测单元能随离心功能托盘旋转而转动；所述检测单元包括加样池（1）、反应池（2）、定量池（3）和扩增检测池（4）；

所述加样池（1）通过刺破阀（5）与反应池（2）连接；第一试剂池（6）、第二试剂池（7）、第三试剂池（8）和第四试剂池（9）分别通过刺破阀（5）与反应池（2）连接，所述第一试剂池（6）、第二试剂池（7）、第三试剂池（8）和第四试剂池（9）分别用于盛装裂解液、结合液、清洗缓冲液和洗脱液；第五试剂池（10）通过刺破阀（5）与定量池（3）连接，所述第五试剂池（10）用于盛装封闭液；所述反应池（2）通过可逆阀（11）分别与定量池（3）和第一废液池（12）连接；

所述定量池（3）分别与扩增检测池（4）和第二废液池（13）连接，所述定量池（3）用于反应池（2）中液体的分装及扩增检测池（4）液体的定量，所述扩增检测池（4）用于预装核酸扩增试剂并用于进行聚合酶链式反应；

所述反应池（2）中预埋有能捕获核酸的磁珠，磁珠固定装置（14）设置在反应池（2）底部，所述磁珠固定装置（14）用于实现磁珠的固定及分离。

2.如权利要求1所述的全自动化核酸检测装置，其特征在于，还包括气压平衡通道（15），所述气压平衡通道（15）分别与加样池（1）、反应池（2）、第一试剂池（6）、第二试剂池（7）、第三试剂池（8）、第四试剂池（9）、第五试剂池（10）、第一废液池（12）和第二废液池（13）连通，所述气压平衡通道（15）用于离心时检测单元内部气压的平衡。

3.如权利要求1或2所述的全自动化核酸检测装置，其特征在于，所述磁珠固定装置（14）为能够移动的磁铁。

4.如权利要求1或2所述的全自动化核酸检测装置，其特征在于，所述反应池（2）的高度为100 μm-500 μm。

5.如权利要求1所述的全自动化核酸检测装置，其特征在于，所述扩增检测池（4）的数量为8-10个。

6.如权利要求1所述的全自动化核酸检测装置，其特征在于，所述第五试剂池（10）的封闭液为硅油、矿物油或石蜡油。

7.利用权利要求1-6任一所述的装置进行非疾病诊断目的的核酸检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将样本液加入加样池（1）中，启动离心功能托盘，加样池（1）中的样本液、第一试剂池（6）中的裂解液和第二试剂池（7）中的结合液分别通过刺破阀（5）依次释放进入反应池（2）中，所述样本液在裂解液的作用下，释放出核酸，并在结合液的作用下，吸附在反应池中的磁珠表面；

S2：通过磁珠固定装置（14）吸附磁珠于反应池底部进行磁珠固定，反应池（2）中的废液在离心力的作用下通过可逆阀（11）排入第一废液池（12）；第三试剂池（8）中的清洗缓冲液通过刺破阀（5）释放进入反应池（2）中，同时解除磁珠固定装置（14）对磁珠的吸附使磁珠重悬，所述清洗缓冲液对重悬的磁珠进行清洗；

S3：通过磁珠固定装置（14）吸附磁珠于反应池底部进行磁珠固定，反应池（2）中的废液在离心力的作用下通过可逆阀（11）排入第一废液池（12）；第四试剂池（9）中的洗脱液通过刺破阀（5）释放进入反应池（2）中，同时解除磁珠固定装置（14）对磁珠的吸附使磁珠重悬，所述洗脱液对重悬的磁珠进行洗脱；

S4：通过磁珠固定装置（14）吸附磁珠于反应池底部进行磁珠固定，反应池（2）中的洗脱液通过可逆阀（11）定量分装到定量池（3）中，多余的洗脱液在离心力的作用下排入第二废液池（13）中，定量池（3）中的洗脱液在离心力作用进入扩增检测池（4）中；然后第五试剂池（10）中的封闭液在离心力的作用下进入定量池（3）中，实现对扩增检测池（4）密封；扩增检测池（4）中的核酸与核酸扩增试剂进行聚合酶链式反应，完成对核酸的扩增。

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