CN111500408B - 在全封闭条件下进行核酸分析的试剂盒、装置及分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能在全封闭条件下进行核酸分析的试剂盒，包括：设有进样口和密封盖的盒体；与盒体密封对接形成密封腔的柔性上盖，所述进样口位于密封腔外部；取样端置于所述密封腔内的一个或多个探针，且该探针周侧与所述柔性上盖密封连接；设置在盒体内的一个或多个功能容器，且至少一个功能容器与所述进样口连通；其中一个或多个容器中盛放有对应的功能试剂。本发明还提供了利用上述试剂盒进行核酸分析的装置和方法。本发明将核酸提取探针、分析试剂及对应功能容器等密闭在独立的空间内，可有效地避免样品前处理、转移、扩增反应等过程中的交叉污染问题，适于疾病诊断、水质检测、空气监测、基因分析、微生物研究、病原体检测等多个应用领域。

Description

在全封闭条件下进行核酸分析的试剂盒、装置及分析方法

技术领域

本发明涉及微流控分析领域，特别涉及一种在全封闭条件下采用微流控技术进行核酸分析的装置及其分析方法。

背景技术

核酸分析技术，作为一种强有力的分子诊断技术，在病原体诊断、传染病预防、疾病监测治疗等方面具有重要的应用。相对于常规的免疫学诊断方法，核酸分析具有高特异性、高灵敏度等突出优势。由于大多数目标基因的浓度低，难以直接分析检测，所以基于核酸扩增原理的PCR、LAMP等核酸分析方法成为了当前核酸分析的主要手段。其完整过程通常包括核酸提取、核酸扩增以及核酸检测三大环节。但传统的核酸分析存在耗时长、成本高、工作量大、设备体积大、需要专门的实验环境和人员等缺点，并且由于核酸扩增的超高灵敏度，在普通实验室开放环境下核酸的扩增过程中，阳性样本的气溶胶交叉污染很容易造成后续样品的核酸检测假阳性。因此对样品在全密闭条件下，进行无交叉污染的自动化核酸扩增分析具有十分重要的应用价值。

微流控技术是研究操纵微量体积流体的一门科学和技术。为实现复杂核酸分析流程的全部步骤的自动化以及所需元件的集成化提供了一个很好的技术手段。目前，已经有部分基于微流控技术的核酸分析仪器被报道，如丹纳赫的GeneXpert和法国生物梅里埃的FilmArray核酸分析系统，这些系统利用不同的微流控技术完成了全封闭条件下的核酸提取纯化和扩增检测等核酸分析整个流程。但是这些产品仍然存在一次性试剂试剂盒结构复杂，工艺要求高，价格昂贵的问题，这些原因大大限制了他们在中小型和基层医疗机构及现场分析领域的推广和应用。

发明内容

本发明提供了一种能在全封闭条件下进行核酸分析的试剂盒，利用该试剂盒能够快速、准确、且无交叉污染的实现对核酸进行检测。

本发明还提供一种能在全封闭条件下进行核酸分析的装置和方法，该方法通过采用柔性材料腔壁的方法将核酸提取探针、试剂等密闭在一个独立的密封腔内中进行核酸的扩增分析，在实现核酸分析自动化的同时，可完全消除在核酸样品前处理、转移、扩增反应等过程中存在的交叉污染问题。

本发明的装置和方法适用于疾病诊断、食品安全、水质检测、空气监测、基因分析、微生物研究、病原体检测等多个核酸分析应用领域。

本发明的具体技术方案如下：

一种能在全封闭条件下进行核酸分析的试剂盒，包括：

设有进样口的盒体，该进样口处设有配套的密封盖；

与盒体密封对接形成密封腔的柔性上盖，所述进样口位于密封腔外部；

取样端置于所述密封腔内的一个或多个探针，且该探针周侧与所述柔性上盖密封连接；

设置在盒体内的一个或多个功能容器，且至少一个功能容器与所述进样口连通；其中一个或多个容器中盛放有对应的功能试剂。

作为可选择的方案，所述的探针(或核酸提取探针)的直径或边长范围为1微米至30厘米，长度范围为1毫米至30厘米。作为优选，核酸提取探针的直径或边长范围10微米至5厘米，长度为1厘米至10厘米。

作为可选择的方案，本发明的所述的核酸提取探针、功能容器、盒体等部件的材质为金属材料(如不锈钢)，或无机非金属材料(包括但不限于玻璃、石英、硅片、陶瓷等)，或有机高分子材料(包括但不限于：塑料、橡胶、纤维、高分子胶粘剂、高分子涂料、高分子基复合材料和功能高分子材料等，如甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酰胺、环氧树脂、尼龙、聚二甲基硅氧烷等)，或由上述材料构成的复合材料。

本发明的柔性上盖由可伸缩，或可弯曲，或可扭转，或可变形的柔性材料构成。根据本发明，所述的密闭腔的腔壁，主要由可相互相对运动又能保持密闭腔密封状态的盒体部分和柔性上盖两部分组成。构成腔壁(柔性上盖以及盒体)的材料需满足不透过固体和液体的要求。作为优选，腔壁材料具有较低的气体透过率。作为优选，所述的柔性材料采用有机高分子材料，包括但不限于聚丙烯、聚乙烯、聚酯、尼龙、聚氯乙烯、聚苯乙烯以及其他树脂等制成的膜材或片材，乳胶或橡胶膜材或片材，或者上述材料的复合材料；或者采用金属-有机高分子复合材料，如镀铝薄膜等。核酸提取探针上的密闭腔结合部与该柔性上盖预先相结合并密闭；功能容器外壁或底部与盒体预先相结合并密闭。柔性材料密闭腔壁的使用，保证在进行核酸提取探针与功能容器之间的相对运动时，始终保持密闭腔的密闭性。

本发明中，所述的盒体上加工有进样口可与外界相连通，在样品引入之前和样品引入之后，该进样口均通过密封盖进行封闭。只有将外界样品引入密闭腔时，才会将该进样口密封盖打开，在后续的样品预处理和最终的检测过程中盒体的密闭腔均保持密封状态。本发明采用至少一个功能容器与所述进样口连通，作为优选，所述进样口与样品引入-提取容器(或样品引入和提取容器)加工成连通器式结构，以进一步降低在打开进样口进行样品引入时有可能带来的交叉污染风险。

本发明的一个或多个功能容器可以是单独加工的容器结构，然后通过现有的固定的方式固定在所述盒体内；也可以是直接加工在盒体内的容器结构。功能容器上均设有开口(或者探针入口)，该开口处一般设置有密封膜，用于对功能容器的密封。

作为优选，所述的功能容器包括预装载有试剂的样品预处理容器和反应容器。样品预处理容器和反应容器又可分别包括多个不同的功能容器。这些功能容器内预先装载有样品预处理和反应所需的试剂。根据本发明，这些功能容器的容积范围为1皮升至100毫升。作为优选，功能容器的容积范围为1纳升至10毫升。

设有所述进样口的功能容器一般作为样品预处理容器或者样品引入和提取容器使用。该功能容器结构上具有两个独立的开口，一个为进样口，用于样品引入，由密封盖密封；另一个为探针的入口，即探针入口，位于密封腔内。两开口之间连通成一个容器，容器内预先装载有样品溶解试剂、样品裂解试剂、核酸提取试剂等试剂，装载了试剂后容器密封腔内的开口由密封膜密封。

作为一种方案，所述的样品预处理容器包括但不限于样品引入容器、样品裂解容器、核酸提取容器、核酸清洗容器、核酸洗脱容器等多种功能容器，这些功能容器内分别预先装载一个或若干样品溶解试剂、样品裂解试剂、核酸提取试剂、核酸清洗试剂、核酸洗脱试剂等。作为优选，不同的功能容器可以合并为一个功能容器，如样品引入容器、样品裂解容器、核酸提取容器可以合并为一个样品引入和提取容器，同时装载样品溶解试剂、样品裂解试剂、核酸提取试剂，在一个容器内完成样品溶解、样品裂解、核酸提取的操作。作为优选，所述的样品预处理容器包括核酸清洗容器，其探针入口设置在密封腔内，预装载有核酸清洗试剂，开口由密封膜密封。

作为可选择的方案，所述的反应容器包括但不限于RNA反转录容器、核酸预扩增容器、核酸扩增容器、检测容器等功能容器，这些功能容器内分别预先装载一个或若干RNA反转录试剂、核酸预扩增试剂、核酸扩增试剂、检测试剂(比如核酸扩增荧光探针等)等。作为优选，不同的功能容器可以合并为一个功能容器，如RNA反转录容器、核酸预扩增容器、核酸扩增容器、检测容器等功能容器可以部分或全部合并为一个容器，同时装载部分或全部RNA反转录试剂、核酸预扩增试剂、核酸扩增试剂、检测试剂等，在一个容器内完成RNA反转录、核酸预扩增、核酸扩增、扩增过程或结果的检测的操作，其探针入口设置在密封腔内，在进行反应前，始终保持密封状态；当该功能容器采用多个隔室的结构时，多个隔室在竖直方向设置，利用密封隔膜分割成独立的隔室，用于间隔不适用于混合储存的反应试剂。

作为可选择的方案，样品预处理容器与反应容器内的部分功能容器可以合并为一个功能容器，如核酸洗脱容器、RNA反转录容器、核酸预扩增容器、核酸扩增容器、检测容器等功能容器可以合并为一个容器，同时装载样品洗脱试剂、RNA反转录试剂、核酸预扩增试剂、核酸扩增试剂、检测试剂等，在一个容器内完成样品洗脱、RNA反转录、核酸预扩增、核酸扩增、扩增产物的检测等的操作。

作为一种实施方案，在省略样品提取处理的操作模式下，将样品预处理容器与反应容器内的全部功能容器合并为一个功能容器，即将样品引入容器、样品裂解容器、RNA反转录容器、核酸预扩增容器、核酸扩增容器、检测容器等功能容器合并为一个容器；即作为优选，所述功能容器只有一个，利用该容器实现样品的引入和核酸的扩增反应。此时可在容器内预先装载样品溶解试剂(或样品引入试剂)、样品裂解试剂、RNA反转录试剂、核酸预扩增试剂、核酸扩增试剂、检测试剂等，在一个容器内完成样品引入、样品裂解、RNA反转录、核酸预扩增、核酸扩增、扩增产物的检测的操作。上述试剂可混合为一个溶液进行存储，或者利用密封膜(或者密封隔膜)分别或部分组合储存于一个容器内的不同试剂隔室内。如对样品中DNA进行直接分析，那么上述RNA反转录试剂可以省略。在选择上述方案中，核酸提取探针只起到利用其上的密封膜破拆部逐次打开功能容器的密封膜使得试剂被逐次释放出来的作用。

作为另一种实施方案，所述功能容器包括至少一个实现样品引入和核酸提取的样品引入-提取容器，该容器具有位于所述密封腔内的探针入口以及所述进样口；在该样品引入-提取容器中预先装载样品溶解试剂、样品裂解试剂、样品提取试剂。所述功能容器包括至少一个进行核酸洗脱以及(DNA)扩增反应(或者RNA的反转录和DNA的扩增反应)的核酸洗脱-扩增容器(称作：核酸洗脱-扩增容器)；在该核酸洗脱-扩增容器中预先装载RNA反转录试剂、核酸预扩增试剂、核酸扩增试剂、检测试剂等。上述试剂可混合为一个溶液进行存储，或者利用密封膜分别储存于容器内的不同试剂隔室内。如对样品中DNA进行直接分析，那么上述RNA反转录试剂可以省略。

作为第三种优选方案，所述功能容器包括至少一个实现样品引入和核酸提取的样品引入-提取容器，该容器具有位于所述密封腔内的探针入口以及所述进样口；在该样品引入-提取容器中，预先装载样品溶解试剂、样品裂解试剂、样品提取试剂。上述试剂可混合为一个溶液进行存储，或者利用密封膜分别储存于容器内的不同试剂隔室内。所述功能容器包括至少一个用于对提取的核酸进行清洗的核酸清洗容器；该核酸清洗容器内预先装载核酸清洗液，核酸清洗容器的数目可为一个或多个。所述功能容器包括至少一个进行核酸洗脱以及扩增反应(或者RNA的反转录和DNA的扩增反应)的核酸洗脱-扩增容器。核酸洗脱-扩增容器内，预先装载RNA反转录试剂、核酸预扩增试剂、核酸扩增试剂、检测试剂等；上述试剂可混合为一个溶液进行存储，或者利用密封膜分别或部分组合储存于一个容器的不同试剂隔室内。

当需要在一个功能容器内预先装载多个试剂且这些试剂不能混合装载时，采用在一个功能容器内加工多个试剂封存单元的方法，实现多个试剂的预先装载。在使用时，利用核酸提取探针上的密封膜破拆部逐次打开试剂封存单元使得试剂被逐次释放出来。作为一种优选的方案，所述功能容器中一个或多个容器中设有一个或多个可被破拆的隔膜，利用该隔膜将该容器分为自上而下的依次两个或多个独立的隔室。每个隔室可以装载一种或者多种试剂的混合物，实现一种或者多种试剂混合物的封存。采用这种排布方式后，利用核酸提取探针的简单的由上向下的移动，即可逐次刺破或破坏试剂封存单元的隔膜，使得试剂被逐次释放出来。

为了避免试剂外洒或者泄露或者相互间的干扰，作为一种优选方案，所述功能容器中一个或多个的开口还设有密封膜。利用密封膜实现对功能容器内功能试剂的密封。检测时，利用探针可以将所述密封膜进行破拆。当然也可以采用其他方法破拆所述的密封膜。所述的试剂封存用的密封膜、或其他完成类似功能的组件，其采用的材料的材质需满足长时间密封储存试剂的要求，同时还要满足其能够被核酸提取探针上的密封膜破拆部所刺破或破坏的要求。作为优选，所述的试剂封存用的密封膜、或其他完成类似功能的组件采用有机高分子材料，包括但不限于聚丙烯、聚乙烯、聚酯、尼龙、聚氯乙烯、聚苯乙烯以及其他树脂等制成的膜材或片材，乳胶或橡胶膜材或片材，或者上述材料的复合材料；或者采用金属-有机高分子复合材料，如镀铝薄膜等。

所述的功能试剂(样品预处理和反应试剂)可以多种形式预先装载在功能容器内，包括但不限于液体、冷冻的液体、固体、冻干粉、或者结合或吸附于固体表面的形态。根据需要，预先装载在功能容器内的试剂，可以单独或若干试剂混合封存于相应的功能容器内。试剂封存是采用密封膜、或其他完成类似功能的组件将试剂封闭储存于功能容器内。封存于功能容器内的试剂，在使用前在密闭腔内被一次性打开使得试剂释放出来，或者在使用中利用核酸提取探针逐次打开功能容器的密封膜使得试剂被逐次释放出来。

作为一种优选的方案，所述探针包括：

用于与所述柔性上盖实现密封的密闭腔结合部；

位于密封腔内的核酸结合部；

用于对所述探针施加作用力的定位部。

作为进一步优选，所述功能容器中一个或多个的开口还设有密封膜；所述探针上还设有在测试时用于破拆所述密封膜的破拆部。

作为一种实施方案，所述的核酸提取探针包括五个结构功能结构，即探针骨架部分、设置在骨架部分的核酸结合部、破拆部、密闭腔结合部、定位部。所述的探针骨架部分构成基本的探针结构。探针骨架部分的构型为针状构型、或棒状构型、或片状构型、或条状构型或管状构型、或者在探针与液体接触的部分加工有微结构的构型、或其他构型，或者上述构型的复合构型。作为优选，探针骨架部分采用刚性较强的材料加工。

核酸结合部用于结合样品中的核酸。所述的核酸结合部是在探针骨架部分加工或结合能与所提取的样品中的核酸(RNA或DNA)发生结合的材料。所述的与核酸结合的材料包括但不限于磁珠，或多孔或实心微米级微球(微粒)或纳米级微球(微粒)，或纤维，或膜材料，或带有微孔、光滑的或带有微坑、微柱或其他微结构的固体表面，或者其他能与核酸结合的材料、或者探针骨架单元的材料本身具有能与核酸结合的能力。根据本发明，所述的与核酸结合的材料预先固定于核酸提取探针上，或者在进行核酸提取操作过程中受控结合于核酸提取探针。所述的控制与核酸结合的材料和核酸提取探针结合的作用力包括但不限于磁力、电场力、电磁力等。作为优选方案，所述核酸结合部为磁性材料或者在外部条件激励下具有磁性；所述带有所述进样口的容器中装载有能与核酸结合的磁性材料；或者所述核酸结合部为能与核酸结合的表面结构或其他材料。

试剂密封膜破拆部设置于探针下端，用于破拆各试剂预储存容器上的密封膜。进一步讲，所述的试剂密封膜破拆部是在探针骨架部分加工能刺破或破拆功能容器(样品预处理容器和反应容器)探针入口处密封膜的装置，或者探针骨架部分本身即具有能刺破或破拆样品预处理容器和反应容器上的密封膜的功能。

密闭腔结合部用于探针与柔性上盖的密闭结合。进一步讲，所述的密闭腔结合部是指是在探针骨架部分加工能实现探针与柔性上盖结合的结构。

移动台结合单元用于与移动台的结合，使得移动台能带动整体核酸提取探针在密封腔内独立运动，实现从探针储存容器到各样品预处理容器和反应容器的相对移动和定位。进一步讲，所述的定位部是在探针骨架单元上加工能实现探针与移动台(或者其他移动机构)结合的结构，并能由移动台(或者其他移动机构)带动整体核酸提取探针移动。

在所述的核酸提取探针上加工一个或多个核酸结合部或试剂容器密封膜破拆部，用于进行同一样品中不同核酸指标的同时分析，或者用于不同样品的同时并行分析。通过设置多个探针，可以进行不同样品的检测。

作为进一步优选，所述探针上设有用于密封一个或多个功能容器的密封盖。此时可以省去在功能容器的探针入口处设置所述密封膜。密封盖可以通过现有的连接方式与所述探针固定，也可以是与探针一体的结构，加工时可以一次成型。

作为优选，所述探针上设有可用于密封所述功能容器的密封部，或者所述功能容器内设有密封对应试剂的密封油。用于封闭部分功能容器(如反应容器)或全部功能容器。密封部的设置，可以在探针深入功能容器探针入口后，将探针入口密封，避免外界环境对功能容器内的影响。

本发明的试剂盒适于一次性使用，所述的供一次性使用的试剂盒的大小范围为5毫米×5毫米×5毫米至50厘米×50厘米×50厘米。作为优选，试剂盒的大小范围为1厘米×1厘米×1厘米至20厘米×20厘米×20厘米。

本发明中，为了便于检测，所述进行核酸洗脱以及扩增反应的核酸洗脱-扩增容器底部或侧壁对应的盒体部分设有检测窗，容器对应的部分为透过检测光的材质。

一种在全封闭条件下进行核酸分析的装置，包括：

上述任一项技术方案所述的试剂盒；

控温单元，用于对试剂盒扩增容器进行温度控制；

移动机构，用于所述探针相对盒体之间的运动动作和位置控制；

检测单元，用于实现对试剂盒反应过程或者结果进行检测；

控制单元，用于所有电子部件的控制和接收所述检测单元的检测结果，并进行记录。

一种在全封闭条件下进行核酸分析的装置，包括盒体、柔性上盖、核酸提取探针、预装载有试剂的样品预处理容器和反应容器组成的试剂盒、控温单元、移动机构、检测单元、控制单元等部分组成。所述的核酸提取探针上与液体接触的部分(但不限于该部分)，以及预装载有试剂的样品预处理容器和反应容器均在使用前被预先密封于密闭腔内，核酸提取探针、预装载有试剂的样品预处理容器和反应容器、密闭腔共同构成一个供一次性使用的试剂盒。各功能容器、探针取样部分、探针储存容器等被密封在独立的空间内。

所述移动机构可以采用移动台以及配套的驱动机构结构或者机械手臂结构等，或者也可选择其他二维或者三维驱动机构。目前是实现探针与盒体之间的相对运动和相对位置的调整，以实现各种功能操作。

根据本发明，在进行核酸提取操作中，需要在密闭腔内进行核酸提取探针与功能容器(包括预装载有试剂的样品预处理容器和反应容器)之间的相对运动。为实现上述相对运动，可采用三种固定方式：(1)核酸提取探针固定于移动台上并可随移动台进行移动，而盒体部分保持不动；(2)盒体固定于移动台上并可随移动台进行移动，而核酸提取探针部分保持不动；(3)核酸提取探针和盒体分别固定于不同的移动台上并可随各自的移动台进行移动。与探针固定时，所述移动机构与所述探针定位部相互固定，实现对探针的移动。

根据本发明，根据上述实现相对运动的固定方式，盒体、探针和柔性上盖预先相结合并密闭；功能容器与盒体预先相结合并密闭，当然功能容器也可以是直接加工在盒体上的结构。

上述固定和结合方式所要达到的目的是，在进行上述核酸提取探针与功能容器之间的相对运动时，密闭腔的柔性材料腔壁(即柔性上盖)的使用，保证核酸提取探针与功能容器之间在进行相对运动时，可以一直保持密闭腔的密闭性。

作为一种优选方案，当探针设置多个时，或者加工具有多个核酸结合部的核酸提取探针；可以实现对同一样品的不同核酸检测指标的检测，用于进行同一样品中不同核酸指标的同时分析。多个探针时，可以单独设置多个探针，可以将多个探针组合在一起，作为模块结构使用，此时需要设置配套的功能容器，以实现同步检测。

作为另外一种优选方案，可采用多个试剂盒进行顺序的或者并行的多样品分析。在进行并行的多样品分析时，一种简化方法是将多个试剂盒上的核酸提取探针或功能容器模块固定与同一移动台上，同时移动，进行不同样品的同时并行操作，完成分析任务。

所述的控温单元的功能是为核酸扩增提供所需的单一稳定温度或在多个不同温度变化的温区。所述的控温单元包括NTC热敏电阻加热元件、金属加热丝、陶瓷加热器、帕尔贴半导体制冷片、风扇等温度控制元件的中的一种或者多种组合。

作为优选，分析装置中至少设有一个核酸扩增功能容器，这些容器预先装载各种试剂后上口由密封膜进行密封储存。核酸扩增反应容器的下部或周围设置有所述控温单元和检测单元。

根据本发明，所述的检测单元功能为监测核酸扩增反应体系在扩增过程中的光学性质变化过程，将扩增体系的光学信号转变为模拟电学信号。检测系统包括且不限于荧光检测系统、光吸收(如浊度)检测系统等。

根据本发明，所述的控制单元主要实现运动部件的运动和时序控制和核酸扩增过程光学信号的读取，控制系统可由嵌入式微控制器、可编程逻辑控制器、通用计算机等核心控制系统配合运动控制卡、数据采集卡等功能电路构成。

一种利用上述技术方案所述的装置全封闭条件下进行核酸分析的方法，或者一种在全封闭条件下进行核酸分析的装置的使用方法，包括：

(1)通过所述进样口加入待检测样品，完成后密封盖对所述进样口密封；

(2)利用所述探针捕获样品中释放的核酸，取出探针；

(3)对取样后的探针进行清洗；

(4)利用洗脱剂将探针捕获的核酸释放至对应的功能容器中进行核酸扩增反应，利用所述检测单元对反应过程中或者反应完成后的核酸样品进行检测；

或者所述步骤(3)省略；

或者所述步骤(3)省略，所述步骤(1)和步骤(4)在同一容器中进行。

本发明中，所述待检测样品包括固体状态或液体状态的样品，或经过富集的气体样品等，如咽拭子、血液、气溶胶吸收液等。

检测之前将由核酸提取探针、预装载有试剂的功能容器、盒体、柔性上盖共同构成的供一次性使用的试剂盒置于装置平台上固定，同时实现试剂盒内核酸提取探针与移动机构的结合和固定，或者实现试剂盒内盒体与移动机构的结合和固定；

步骤(1)中，打开试剂盒上的进样口，将外界样品通过进样口加入密闭腔的样品引入-提取容器，关闭进样口；实现样品的进样，在所述样品引入-提取容器中进一步完成核酸的提取。

步骤(2)或步骤(4)中，将试剂盒密闭腔内的功能容器上的密封膜一次性打开，或使用核酸提取探针上的密封膜破拆部逐次打开功能容器的密封膜；以实现对样品的取样和加样以及搅拌操作。当需要清洗步骤时，作为优选，可以在清洗前事先将对应的密封膜破拆。

步骤(2)中，将待检测样品加入样品引入-提取容器，样品与样品引入-提取容器内预先装载的样品溶解试剂及样品裂解试剂相混合，利用移动台(或其他移动机构)控制核酸提取探针与功能容器之间的相对运动，在密闭腔内，将核酸提取探针的核酸结合部插入样品与试剂的混合溶液，并对混合溶液进行搅拌，完成样品与试剂的充分混合、样品的裂解、样品中核酸的释放、样品中释放的核酸与核酸提取探针的核酸结合单元上的结合等操作。

步骤(3)中，利用移动台(或其他移动机构)控制核酸提取探针与功能容器之间的相对运动，在密闭腔内，使核酸提取探针脱离样品引入-提取容器，插入核酸清洗容器，对结合有样品核酸的核酸提取探针进行清洗，上述清洗操作在一个核酸清洗容器内进行一次清洗，或者依次在多个核酸清洗容器内进行多次清洗。

步骤(4)中，利用移动台(或其他移动机构)控制核酸提取探针与功能容器之间的相对运动，在密闭腔内，使核酸提取探针脱离核酸清洗容器，插入核酸洗脱-扩增容器，将结合于核酸提取探针上的样品核酸洗脱至容器内的洗脱试剂溶液内；如反应容器垂直方向上设置有密封隔膜分隔的隔室，则密封膜由探针一并破拆，储存于隔室内的RNA反转录试剂、核酸预扩增试剂、核酸扩增试剂、或检测试剂等被释放出来，与含有样品核酸的洗脱试剂溶液相混合。然后按预定操作程序对核酸洗脱-扩增容器进行控温(包括等温和变温)操作，完成RNA的反转录和DNA的扩增反应，利用检测系统完成对扩增的过程监测或扩增结果的检测。

所述的核酸提取和反应的各个操作步骤，可根据实际样品分析的要求，对上述操作步骤进行简化、合并、或拆分处理；根据操作步骤的要求，对上述功能容器进行简化、合并、或拆分处理；根据操作步骤和功能容器的要求，对上述功能容器内预先装载的试剂进行简化、合并、或拆分处理。即可根据实际样品分析的要求，灵活调整和改变操作步骤、功能容器、预先装载试剂的种类和储存方法的组合方式，以完成分析任务。

作为优选，在密闭腔内使用样品引入-提取容器、核酸清洗容器、核酸洗脱-扩增容器三个(或三种，每种容器可以设置多个)功能容器。在样品引入-提取容器内，预先装载样品溶解试剂、样品裂解试剂、样品提取试剂；上述试剂可混合为一个溶液进行存储，或者利用密封膜分别储存于容器内的不同试剂隔室内。核酸清洗容器内预先装载核酸稀释液，核酸清洗容器的数目可为一个或多个。核酸洗脱-扩增容器内，预先装载RNA反转录试剂、核酸预扩增试剂、核酸扩增试剂、检测试剂等；上述试剂可混合为一个溶液进行存储，或者利用密封膜分别或部分组合储存于一个容器的不同试剂隔室内。

作为进一步优选，省略核酸清洗步骤，在密闭腔内使用样品引入-提取容器、核酸洗脱-扩增容器两个功能容器。在样品引入-提取容器内，预先装载样品溶解试剂、样品裂解试剂、样品提取试剂。核酸洗脱-扩增容器内，预先装载RNA反转录试剂、核酸预扩增试剂、核酸扩增试剂、检测试剂等。上述试剂可混合为一个溶液进行存储，或者利用密封膜分别或部分组合储存于一个容器内的不同试剂隔室内。

作为再一步优选，省略核酸提取步骤，在密闭腔内只使用一个功能容器，样品引入-反应容器；容器内预先装载样品溶解试剂、样品裂解试剂、RNA反转录试剂、核酸预扩增试剂、核酸扩增试剂、检测试剂等。上述试剂可混合为一个溶液进行存储，或者利用密封膜分别或部分组合储存于一个容器内的不同试剂隔室内。

根据本发明，如对样品中DNA进行直接分析，则可省略上述操作中RNA反转录反应的操作和相关的RNA反转录试剂。

在进行核酸提取操作时，采用磁性材料(如纳米或微米磁性颗粒)作为与核酸结合的材料，该与核酸结合的磁性材料作为核酸提取试剂预先装载于相应的功能容器内，在进行样品分析时，利用移动台控制核酸提取探针与功能容器之间的相对运动，对含有与核酸结合的磁性材料的溶液进行搅拌，增加样品核酸与磁性材料接触的机会，或者采用外置搅拌装置(如电磁搅拌器、超声搅拌器、或其他类型搅拌器等)，对含有与核酸结合的磁性材料的溶液进行搅拌；然后，再利用核酸提取探针本身带有的磁性或采用外置电磁装置控制其产生磁性，将溶液内的与样品核酸结合的磁性材料吸附于核酸提取探针上，再随核酸提取探针移动到下一功能容器内。

作为一种优选方案，一种利用上述任一技术方案所述的在全封闭条件下进行核酸分析的装置的使用方法或者进行核酸分析的方法，或者进行核酸检测的方法，步骤如下：

S1：将由核酸提取探针、预装载有试剂的功能容器、密闭腔共同构成的供一次性使用的试剂盒置于装置平台上固定，同时实现试剂盒内核酸提取探针上的移动台结合部与移动台的结合和固定，或者实现试剂盒内的容器组件与移动台的结合和固定；

S2：将试剂盒密闭腔内的功能容器上的密封膜一次性打开，或使用核酸提取探针上的密封膜破拆部逐次打开功能容器的密封膜；

S3：打开试剂盒密闭腔上的进样口，将外界样品通过进样口加入密闭腔的样品引入-提取容器，关闭进样口；

S4：将样品加入样品引入-提取容器，样品与样品引入-提取容器内预先装载的样品溶解试剂及样品裂解试剂相混合，核酸提取探针由移动台驱动将核酸结合部插入样品与试剂和混合溶液，并对混合溶液进行搅拌，完成样品与试剂的充分混合、样品的裂解、样品中核酸的释放、样品中释放的核酸与核酸提取探针的核酸结合部上的结合等操作；

S5：核酸提取探针由移动台驱动脱离样品预处理容器，插入样品预处理容器，对结合有样品核酸的核酸提取探针进行清洗，清洗操作可在一个或依次在多个预处理容器内进行清洗，或者也可省略清洗步骤；

S6：核酸提取探针由移动台驱动脱离样品预处理容器，插入核酸扩增反应容器，将结合于核酸提取探针上的样品核酸洗脱至容器内的洗脱试剂溶液内；期间，核酸扩增反应容器如果在垂直方向上设置由密封膜间隔的隔室，则该密封膜由探针一并破拆，储存于隔室内的RNA反转录试剂、核酸预扩增试剂、核酸扩增试剂、检测试剂等被释放出来，与含有样品核酸的洗脱试剂溶液相混合；

S8：按预定操作程序对核酸洗脱-扩增容器进行控温(包括等温和变温)操作，完成RNA的反转录和DNA的扩增反应，利用检测单元完成对扩增过程的监测或扩增结果的检测。

其中S2和S3可以改变顺序。

与现有技术相比，本发明的优点主要在于：

与核酸提取过程暴露在开放环境中的核酸分析方式相比，本发明在带有柔性材料腔壁的密闭腔全密封情况下进行全部核酸分析操作，可以完全消除不同样品之间的交叉污染，减小假阳性的概率，提高分析结果的可靠性和准确性。本发明将所有核酸检测过程所需的试剂在生产阶段预先定量量取并装载试剂盒的各容器内，各容器内的试剂用薄膜进行密封，由此极大简化核酸分析过程如试剂量取及移液等复杂试剂操作，降低了配套的分析装置要求。

本发明的探针上集成了试剂密封膜破拆部、核酸结合部等关键功能部件，通过单个探针的组合运动，实现了从样品试剂混合、核酸提取、提取后的核酸提纯清洗、到最终的洗脱扩增的自动化，因此具有易于自动化和通用性强的特点，此外本装置结构简单、易于生产、成本低廉的优点。

附图说明

图1为实施例1的结构示意图。

图2a为核酸提取探针一种实施方案的结构示意图。

图2b为核酸提取探针另一种实施方案的结构示意图。

图3为实施例1完整核酸分析的流程示意图。

图4为实施例2的装置结构示意图。

图5为实施例3的装置结构示意图。

图6为实施例4的装置结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。需要说明的是，术语“左”、“中”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1

如图1所示，为本发明一个较佳实施例中所设计全封闭条件下进行核酸分析的装置。盒体1、柔性上盖2、进样口密封盖3和核酸提取探针4等主要部件构成了整个密封的系统。预装载有试剂的样品引入-提取容器6、核酸清洗容器7和核酸洗脱-扩增容器8直接设置在盒体1上，盒体1、柔性上盖2之间围成密封腔，核酸提取探针、预装载有试剂的样品引入-提取容器、核酸清洗容器和核酸洗脱-扩增容器、盒体和柔性上盖共同构成一个供一次性使用的试剂盒。盒体1、核酸提取探针4材质为聚丙烯塑料，柔性上盖2采用弹性的橡胶膜或聚乙烯膜。同时在盒体内还有用于放置探针的探针储存容器。

样品引入-提取容器6、核酸清洗容器7和核酸洗脱-扩增容器8可以设置一组或者多组。本实施例中，引入-提取容器6、核酸清洗容器7和核酸洗脱-扩增容器8各设置一个。引入-提取容器6、核酸清洗容器7和核酸洗脱-扩增容器8与盒体1之间可以采用现有的方式固定(比如螺纹固定、焊接固定、卡合固定、磁吸合固定、键合固定等)。当然引入-提取容器6、核酸清洗容器7和核酸洗脱-扩增容器8也可以是直接加工在盒体上的一体成型结构。引入-提取容器6、核酸清洗容器7和核酸洗脱-扩增容器8均设有探针入口，该探针入口在探针插入前采用密封膜密封。

图2a所示，为本实施例中核算提取探针的一种结构示意图。核酸提取探针4主要包括骨架部分40、移动台结合部41、密封部42、核酸结合部44和试剂密封膜破拆部45。骨架部分40为探针的主体部分，核酸结合部、试剂密封膜破拆部和移动台结合部分别设置在骨架部分上，或者核酸结合部、试剂密封膜破拆部和移动台结合部为由骨架部分直接加工而成的结构。移动台结合部41用于实现探针骨架与移动台结合，实现探针与移动台之间的相互固定，由移动台带动整体核酸提取探针运动。密封部42主要用于与柔性上盖实现密封固定。核酸结合部44上结合能和DNA结合的膜材料。试剂密封膜破拆部45为探针骨架部分本身下端锥形结构形成，用于刺破样品引入-提取容器6、核酸清洗容器7、核酸洗脱-核酸洗脱-扩增容器8上的密封膜。

在样品引入-提取容器6中预先储存了样品裂解试剂61，在核酸清洗容器7中储存了核酸清洗试剂71。在核酸洗脱-扩增容器8垂直方向上，用密封隔膜80分隔出上下两个独立的隔室，分别为：上隔室和下隔室，分别用于储存反转录和扩增过程中的生物活性试剂81和其他影响生物活性的试剂82。此外在下隔室内还预先加入了密度较试剂溶液小的不相溶矿物油83，以液体覆盖的方式密封整个反应体系。这些容器中的试剂均用密封膜5封存，密封膜5为镀铝薄膜，可满足长时间的试剂密封储存，同时还可在分析时被核酸提取探针4上的密封膜破拆部45刺破。此外在采用这种排布方式，利用核酸提取探针4的由上向下的移动，可逐次刺破试剂封存单元的密封膜，使得试剂最终释放并混合于核酸洗脱-扩增容器8的底部。

上述内容为试剂盒的结构介绍，本实施例中同时介绍一种采用上述试剂盒进行核酸检测的装置，包括用于实现对试剂盒反应过程或者结果进行检测的检测单元；协调所有电子部件工作并接收所述检测系统的检测结果，同时进行记录的控制单元；还包括能够调整所述探针相对盒体之间位置的移动机构；以及用于实现对试剂盒的温度控制的控温单元。

控温单元为基于帕尔贴半导体制冷片的加热制冷器，可以为核酸扩增提供所需的多个不同温度变化的温区。检测单元为荧光检测器，核酸洗脱-扩增容器底部设有激发和发射窗口，核酸洗脱-扩增容器内扩增体系的荧光信号通过光电倍增管转变为模拟电信号。控制单元基于嵌入式微控制器，实现移动台的运动和时序控制以及核酸扩增过程荧光信号的读取和显示及储存。

移动机构可以采用现有的三维移动机构或者二维移动机构。一般包括驱动机构和移动模块，驱动机构一般采用电机驱动。移动模块一般包括受驱动机构驱动的滑块以及配合的导轨等，滑块上设有所述的移动台。移动机构移动轨迹受控制单元的控制。移动台上可以根据需要设置抓取机构，用于实现对探针的抓取和固定，比如可以采用双向气缸驱动的夹持机构或者机械手机构。

下面介绍利用上述装置进行核酸检测或者分析的方法，实施例1的完整分析步骤主要包括试剂盒的准备、样品加入、核酸提取、核酸清洗、核酸扩增及检测5个环节，使用实现方法如下：

试剂盒准备方法如图3A所示：将试剂盒置于加热制冷器上，通过控制单元自动完成移动台和核酸提取探针的可靠结合。

样品加入方法如图3B所示：打开试剂盒1上的密封盖3，将样品通过移液枪、注射器或者毛细管等滴加入样品引入-提取容器，塞上密封盖，完成密封腔的密封。

样品裂解提取方法如图3C所示：首先控制器控制移动台带着核酸提取探针逐个完成各试剂容器上方密封膜的破拆，接着将探针插入到样品引入-提取容器，上下移动促进样品和裂解液的混合，充分混合完成病原体的裂解后，目标RNA将吸附于探针的核酸提取部上，将探针从样品引入-提取容器中抽离。

核酸样品的清洗提纯方法如图3D所示：控制器控制探针插入核酸清洗容器，实现探针核酸结合部和清洗液的接触，往复上下运动探针，完成清洗操作，然后控制探针抽离清洗液。

核酸洗脱方法如图3E所示：将清洗完毕的核酸提取探针插入到核酸洗脱-扩增容器，在探针插入过程中，探针前部的破拆部进一步刺破隔室的密封隔膜，上部隔室的聚合酶、反转录酶等生物试剂依靠重力作用进入下部的隔室，和下部隔室内的核酸洗脱试剂、核酸扩增试剂等混合，通过往复上下运动探针，使得探针核酸提取单元上的核酸洗脱进入混合溶液。

核酸扩增及检测方法如图3F所示：控制核酸提取探针离开核酸洗脱-扩增容器到探针储存容器。通过控温系统的升降温完成RNA到DNA的反转录，然后进一步进行多个周期的升降温操作，完成DNA的扩增，在每个升降温扩增的周期里由荧光检测器检测当前核酸洗脱-扩增容器体系内的荧光强度，最终由控制器采集并绘制扩增体系荧光强度随时间的变化曲线，最终获得扩增曲线。

实施例2

图2b为核酸提取探针4的一种典型结构的结构示意图，该探针包括四个结构功能模块，即骨架部分、移动台结合部41、密闭腔结合部42、容器密封部43、核酸结合部44以及试剂密封膜破拆部45。核酸结合部44上结合能和DNA结合的膜材料。试剂密封膜破拆部45为探针骨架部分本身下端锥形结构形成，用于刺破样品引入-提取容器6、核酸清洗容器7、核酸洗脱-扩增容器8上的密封膜。移动台结合部41用于实现探针骨架与移动台结合，实现探针与移动台之间的相互固定，由移动台带动整体核酸提取探针运动。密封部43用于在检测时密封对应的功能容器。

实施例2是实施例1在结构上进一步性能改进和优化，结构如图4所示。主要的改进为在核酸清洗容器7的基础上，进一步增加了核酸清洗容器9，由此可以对提取后的核酸更好地进行清洗提纯。此外在核酸提取探针上增加了容器密封部43，该容器密封部43用于在核酸洗脱-扩增容器8在扩增反应中对反应体系的密封(即：当探针插入核酸洗脱-扩增容器8到位后，探针4的容器密封部43与核酸洗脱-扩增容器8的探针入口的边缘紧密抵靠，实现核酸洗脱-扩增容器8的密封)，因此本实施例无需在核酸洗脱-扩增容器8中预分装低密度油相液体对核酸扩增反应液进行封闭。该实施例的使用方法同实施例1基本一致，只是增加了一个清洗步骤，最后再把核酸提取探针4插入到核酸洗脱-扩增容器8，通过容器密封部43实现核酸洗脱-扩增容器8在扩增过程中的密封。

实施例3

如图5所示，实施例3是实施例1在结构上进一步简化，主要的改进为核酸提取探针4上增加了一体化的封闭功能容器的密封盖43a，该密封盖43a包括了3个子单元，分别用于样品引入-提取容器6、核酸清洗容器7、酸洗脱-扩增容器8在试剂盒储运过程和扩增反应过程中的密封，因此本实施例中无需额外的密封膜来对容器上口进行封闭。该实施例的使用方法同实施例1基本一致，测试前探针置于探针储存容器15中。只是在核酸分析流程中省去了容器密封膜的破拆步骤，核酸洗脱-扩增容器8内的密封隔膜80仍然保留，因此探针前部的破拆部仍然需要保留。

实施例4

如图6中(a)和(b)所示，实施例4是实施例1在功能上的进一步扩展和优化，主要的扩展为核酸提取探针4上加工了三个并行的核酸提取和破拆单元，这三个并行单元在核酸提取过程和清洗过程中在同一容器中进行，且核酸洗脱和扩增过程中分别在酸洗脱-扩增容器8、酸洗脱-扩增容器81、酸洗脱-扩增容器82三个独立并行单元中进行，这三个独立容器中预先装载不同的引物和核酸扩增荧光探针，因此可用于三个不同基因的独立扩增检测。此外本实施例在试剂储存方面进行了改进，在核酸洗脱-扩增容器8、核酸洗脱-扩增容器81、核酸洗脱-扩增容器82中取消了实施例1中多个隔室的设计，将所有核酸洗脱、RNA反转录、DNA扩增等相关试剂混合在一起储存，为封闭扩增反应时的容器，保留了低密度油相液体矿物油83。本装置使用方法和实施例1相似。

Claims (6)

1.一种能在全封闭条件下进行核酸分析的试剂盒，其特征在于，包括：

设有进样口的盒体，该进样口处设有配套的密封盖；

与盒体密封对接形成密封腔的柔性上盖，所述进样口位于密封腔外部；

取样端置于所述密封腔内的一个或多个探针，且该探针周侧与所述柔性上盖密封连接；

设置在盒体内的一个或多个功能容器，且至少一个功能容器与所述进样口连通；其中一个或多个容器中盛放有对应的功能试剂；

所述探针包括：

用于与所述柔性上盖实现密封的密闭腔结合部；

位于密封腔内的核酸结合部；

用于对所述探针施加作用力的定位部；

所述核酸结合部为磁性材料或者在外部条件激励下具有磁性；所述带有所述进样口的容器中装载有能与核酸结合的磁性材料；或者所述核酸结合部为能与核酸结合的表面结构或其他材料；

所述功能容器中设有一个或多个探针入口，该探针入口处设有密封膜；所述探针上还设有在测试时用于破拆所述密封膜的破拆部；

或所述探针上设有用于密封一个或多个功能容器的密封盖；

所述柔性上盖采用弹性的聚丙烯膜、橡胶膜或聚乙烯膜。

2.根据权利要求1所述的能在全封闭条件下进行核酸分析的试剂盒，其特征在于，所述功能容器包括至少一个实现样品引入和核酸提取的样品引入-提取容器，该容器具有位于所述密封腔内的探针入口以及所述进样口；所述功能容器包括至少一个用于对提取的核酸进行清洗的核酸清洗容器；所述功能容器包括至少一个进行核酸洗脱以及扩增反应的核酸洗脱-扩增容器。

3.根据权利要求1所述的能在全封闭条件下进行核酸分析的试剂盒，其特征在于，所述功能容器中的一个或多个容器中设有一个或多个可被破拆的隔膜，利用该隔膜将该容器分为自上而下的依次两个或多个独立的隔室。

4.根据权利要求1所述的能在全封闭条件下进行核酸分析的试剂盒，其特征在于，所述探针上设有可用于密封所述功能容器的密封部，或者所述功能容器内设有密封对应试剂的密封油。

5.一种在全封闭条件下进行核酸分析的装置，其特征在于，包括：

权利要求1~4任一项所述的试剂盒；

控温单元，用于实现对试剂盒扩增容器的温度控制；

移动机构，用于实现探针相对功能容器的动作及相对位置控制；

检测单元，用于实现对试剂盒反应过程或者结果检测；

控制单元，接收所述检测单元的检测结果，并进行记录。

6.一种利用权利要求5所述装置在全封闭条件下进行核酸分析的方法，其特征在于，包括：

（1）通过所述进样口加入待检测样品，完成后，利用密封盖对所述进样口密封；

（2）利用所述探针捕获样品中释放的核酸，取出探针；

（3）对取样后的探针进行清洗；

（4）利用洗脱剂将探针捕获的核酸释放至对应的功能容器中进行核酸扩增反应，利用所述检测单元对反应过程中或者反应完成后的核酸样品进行检测；

或者所述步骤（3）省略；

或者所述步骤（3）省略，所述步骤（1）和步骤（4）在同一容器中进行。

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