CN104502594A - 一种血液乙肝、丙肝和梅毒快检离心式芯片及检测方法 - Google Patents

一种血液乙肝、丙肝和梅毒快检离心式芯片及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血液乙肝、丙肝和梅毒快检离心式芯片及检测方法，其特征在于：主体为光盘形状，每个主体上面均匀分布至少四个微流控单元模块；每个微流控单元模块包括：第一洗液池(1)、第二洗液池(2)、反应池(3)、酶液池(5)、废液池(8)、两个检测液池(6)和一个终止液池(7)。检测时在各单元模块事先注入检测液，然后加入样品，并进行各级离心即可。本发明能够快速提高检测效率。

Description

一种血液乙肝、丙肝和梅毒快检离心式芯片及检测方法
技术领域
本发明涉及的领域为微流控芯片及其应用领域。特别是涉及一种基于离心力驱动的用于血液中乙肝、丙肝和梅毒快速检测的微流控芯片装置及其使用方法。
背景技术
血液安全关系着人类的健康,对血液的检测有着很重要的意义。传统的血液检测是基于抗原-抗体特异性结合的一种分析方法，具有极高灵敏度和特异性，但常规免疫分析孵化时间较长，无法快速实时检测，同时操作过程烦琐，消耗大量试剂和样本，并且检测设备较大，对实验场地要求较高，难以满足现场检验的要求。因此，开发一种快速、便携、成本低廉的血液检测装置具有重大的意义。
微流控芯片技术自上个世纪90年代初出现后，由于其具备集成度高、制作成本低、试剂用量小、反应时间短等优势，引起了广泛的关注。近年来发展起来的微流控芯片可集成进样、过滤、浓缩、混合、反应、分离及检测等单元操作，具有针对复杂体系的处理和分析能力。但其需要借助大量复杂的阀泵结构设计和外界注射泵等以实现流体的驱动，微流控芯片的产业化发展受到了极大的局限。目前常用的微流控芯片流体驱动方式主要包括：压力驱动、电渗流驱动、表面张力驱动、离心力驱动等。其中基于离心力驱动的微流控芯片具备：①驱动设备简单，无需多个驱动源，仅通过单一的离心力驱动源，即可同时驱动多个微流通道，能很好的满足分析检测中的多通道多重复性平行检测。②流速稳定可控且易于调节，仅对转速进行控制就能实现流体在微通道中的不同流速的稳定流动。③离心力驱动对于流体的物理化学性质要求不高，其驱动能力不受流体的pH、离子强度等的影响，具有很好的相容性。
与传统微孔板免疫分析相比，微流控芯片免疫分析具有以下优势：①操作简便，仪器微型化。②免疫反应在微通道中进行，比表面积大，扩散距离显著缩短，加快了抗原抗体反应，缩短了反应时间。③体积小，节约试剂和样本。④可多样本、多指标同时检测。因此，离心力式微流控芯片免疫分析在血液安全分析检测领域应用有着广泛的应用前景。
发明内容
本发明旨在提供一种快速、便携、高集成的离心力驱动微流控芯片装置，并实现对乙肝、丙肝、梅毒以及空白对照的四项指标的平行检测。
本发明的技术方案如下：
一种用于血液乙肝、丙肝和梅毒快速检测的微流控芯片，其特征在于：主体为光盘形状，每个主体上面均匀分布至少四个微流控单元模块(优选为四个，盘面每隔90度分布一个)；每个微流控单元模块包括：用于装缓冲液的第一洗液池(1)和第二洗液池(2)、用于样品反应的反应池(3)、用于装酶标试剂的酶液池(5)、分别用于装RLISA反应的A、B液的两个检测液池(6)，用于装终止液的一个终止液池(7)，以及一个废液池(8)其中：
废液池(8)设于光盘的近边缘处，反应池(3)和废液池(8)之间设有第三通道(3-1)，第三通道(3-1)上设有阀门(4)；第一洗液池(1)、第二洗液池(2)、酶液池(5)、检测液储存池(6)和(7)分别位于反应池(3)靠近光盘圆心的一侧，并分别通过一通道和反应池(3)连接，其中第二洗液池(2)和反应池(3)之间设第二通道(2-1)，第一洗液池(1)和反应池(3)之间设第一通道(1-1)，酶液池(5)和反应池(3)之间设第五通道(5-1)，终止液池(7)和反应池(3)之间设第七通道(7-1)，检测液池(6)和反应池(3)之间设第六通道(6-1)，其中；
通道的设计为：使液体通过第二通道(2-1)的第二离心力，第一通道(2-1)的第一离心力，第五通道(5-1)的第五第一离心力，第六通道(6-1)的第六离心力，第七通道(7-1)的第七离心力依次增高，每一级增加200-3000rpm；液体通过第三通道(3-1)的第三离心力小于第二通道(2-1)的第二离心力。
在较佳的实施例中，通道的设计为：第二离心力对应400-600rpm，第一离心力对应800-1200rpm，第五离心力对应1600-2000rpm，第六离心力对应2400-3000rpm，第七离心力对应4000-6000rpm。
在较佳的实施例中，第三离心力100-250rpm。
在较佳的实施例中，第一洗液池(1)、第二洗液池(2)、酶液池(5)、检测液储存池(6)和(7)分别位于反应池(3)靠近光盘圆心的一侧，并分别通过一通道和反应池(3)连接；其中，第二通道(2-1)的孔径为500μm，第一通道(2-1)的孔径为200μm，第五通道(5-1)的孔径为300μm，第七通道(7-1)的孔径为50μm，第六通道(6-1)孔径为100μm。
一种血液中乙肝、丙肝和梅毒快速检测方法，包括如下步骤：
1)制作前述血液快速检测的微流控芯片,并且将分别包被了乙肝、丙肝和梅毒抗体的微珠及相应的试剂分别封装进芯片的不同微流控单元模块中；该微流控芯片设有四个微流控单元模块，其中三个分别用于检测乙肝、丙肝和梅毒，另一个用于空白对照
2)将制作好的芯片置于离心力驱动装置中；
3)通过每个微流控单元模块的反应池的进液口注入血液，血液进入反应池后，充分孵化；
4)启动离心力驱动装置，以第三离心力的离心速度离心，使反应池(3)中的血液流入废液池；
5)第二离心力的离心速度离心，使洗液池(2)的PBST缓冲液进入并通过反应池，冲洗微珠及反应池，最终缓冲液进入废液池(8)；
6)关闭芯片上的阀门，以第五离心力的离心速度离心，使酶液池(5)的酶标试剂进入反应池与微珠进行反应；
7)打开阀门(4)，以第三离心力的离心速度离心，使反应池(3)中的酶标试剂流入废液池(8)；
8)以第一离心力的离心速度离心，使洗液池(1)的PBST缓冲液进入并通过反应池，冲洗微珠及反应池，最终缓冲液进入废液池；
9)关闭阀门(4)，以第六离心力的离心速度离心，使检测液池(6)中的液体进入反应池进行显色反应；
10)以第七离心力的离心速度离心，使终止液池(7)中的终止液进入反应池终止反应，肉眼观察初步检测结果。
在较佳的实施例中，还包括步骤12)用酶标仪对反应池(3)中的试剂进行吸光度检测，得出最终结果。
在较佳的实施例中，具体步骤如下：
1)制作前述血液快速检测的微流控芯片,并且将包被了相应抗体的微珠及相应的试剂封装进芯片中；
2)将制作好的芯片置于离心力驱动装置中；
3)通过反应池的进液口注入血液，血液进入反应池后，充分孵化10分钟；
4)启动离心力驱动装置，以500rpm的离心速度离心，使反应池中的血液流入废液池；
5)以1000rpm的离心速度离心，使洗液池2的PBST缓冲液进入并通过反应池，冲洗微珠及反应池，最终缓冲液进入废液池；
6)关闭芯片上的阀门，以2000rpm的离心速度离心，使酶液池的酶标试剂进入反应池与微珠进行反应；
7)打开阀门，以500rpm的离心速度离心，使反应池中的酶标试剂流入废液池；
8)以3000rpm的离心速度离心，使洗液池1的PBST缓冲液进入并通过反应池，冲洗微珠及反应池，最终缓冲液进入废液池；
9)关闭阀门，通过A、B液池及终止液池上方的进液口分别加入50ul的A液、B液和终止液；
10)以4000rpm的离心速度离心，使A、B液进入反应池进行显色反应；
11)以6000rpm的离心速度离心，使终止液进入反应池终止反应，肉眼可见初步检测结果；
12)用酶标仪对反应池中的试剂进行吸光度检测，得出最终结果。
与现有方法和装置相比，本发明的优点在于：
1)本发明方法采用离心力作为芯片驱动力，与传统驱动方式相比，其芯片及其驱动装置大大简化。同时，通过单一驱动源即可实现多条通道的同时流体驱动，能够同时平行的进行样品的乙肝、丙肝和梅毒分析检测。
2)本发明的酶联免疫反应过程主要发生在被抗体包被的微珠上，这使得反应的比表面积增大，扩散距离缩短，加快了抗原抗体反应，缩短了反应时间。
3)本发明所述的离心式微流控芯片及其检测方法具有结构简单、试样消耗量小、检测成本低、检测速度快等优点。
4)本发明的操作简单，除了需要一次手动关闭阀门(4)之外，其余只需要变化离心转速即可，可以检测乙肝、丙肝、梅毒的一次性实时、便携检测。
附图说明
图1和图2是根据本发明所述的用于血液快速检测的离心式微流控芯片单元结构图。
图1为平面图，用以展现芯片的内部结构。
其中，1、2为洗液池、3为反应池、4为阀门、5为酶液池、6为A、B液池、7为终止液池、8为废液池。
图2为立体图，可以看清芯片的三层结构。
图3是根据本发明所述的离心式微流控芯片的整体模型图。
图4是根据本发明的芯片所测得的不同浓度的乙肝抗原标准品的结果。
图5、图6和图7分别为乙肝、丙肝和梅毒在芯片中以不同的浓度多次重复试验所得出的浓度-吸光度的线性关系以及相关系数。
具体实施方式
实施例1
参见图1至图3，本发明的装置结构如下：
主体为光盘形状(图1和图2中仅显示1/4)，每个光盘上面均匀分别4个的扇形的微流控单元模块。其中微流控模块为三层结构，包括一底片A、一基片B以及一盖片C，三层之间可实现密封的对准键合。
通道结构参见图1，每个微流控单元模块包括：第一洗液池1、第二洗液池2、反应池3、一个酶液池5、一个废液池8、两个检测液池6和一个终止液池7。其中：
废液池8设于光盘的近边缘处，反应池3和废液池8之间设有孔径为800μm的第三通道3-1，通道3-1设于反应池3远离圆心的一侧，方向为光盘的孔径方向，通道3-1上设有阀门4。
第一洗液池1、第二洗液池2、酶液池5、检测液储存池6和7分别位于反应池3靠近光盘圆心的一侧，并分别通过一通道和反应池3连接。其中，第二洗液池2和反应池3之间的第二通道2-1的孔径为500μm，第一洗液池1和反应池3之间的第一通道1-1的孔径为200μm，酶液池5和反应池3之间的第五通道5-1的孔径为300μm，终止液池7和反应池3之间的第七通道7-1的孔径为50μm，检测液池6和反应池3之间的第六通道6-1孔径为100μm(Y形通道，各处都为100μm)。
在盖片C上，对应反应池3、两个检测液池6以及终止液池7的位置均设有进液口，同时废液池上方还设有通气孔。
底片A、基片B以及盖片C材料可以是石英、玻璃，也可以是聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)或聚碳酸酯(PC)等高分子聚合物材料。芯片厚度为6mm。微流控通道单元可通过现有成型微芯片加工技术加工而成。
基片加工时芯片通道需要加工成不同的尺寸，并且需要经过疏水处理才能实现转速的可控流动。同时对反应池3区域修饰牛血清蛋白(BSA)。
离心力驱动装置可利用现有商品化离心机改装而成，离心机可提供100-10000rpm的离心转速，可精确控制离心时间10s-600s，也可利用其他自制或特制可控离心力驱动装置进行离心力操控。
储液池的形状大小可根据需要，需保证储液池5、6、7、8的溶液容量50ul以上，反应池3的溶液容量200ul以上，洗液池1、2的溶液容量需要250ul以上，废液池8的溶液容量为800ul以上。
芯片加工好后，需要将包被了抗体的微珠封装进反应池，将250ulPBST缓冲液(磷酸盐吐温缓冲液)分别封装进洗液池1、2，将50ul的酶标试剂、A液(H2O2)、B液(TMB)、终止液(硫酸)分别封装进对应的储液池。
实施例2
设计并制作用于血液快速检测的离心式微流控芯片，采用PMMA作为芯片材料，利用激光打标机加工通道结构。同实施例1，采取了底片、基片和盖片三层结构的方式，通过对准键合，产生一定的空间用于液体和样品的储存。将微珠和试剂封装进芯片中，与盖片对准键合。将键合好的离心式微流控芯片放置于离心力驱动装置上，卡紧卡槽并旋紧转子。用微量注射器向进液口注入100ul乙肝抗原标准品，标准品浓度分别为0.2IU/ml、0.4IU/ml、2IU/ml、4IU/ml，液体进入反应池中，孵化10分钟。然后启动离心机，以200rpm转速离心，反应池3中的血液流入废液池。10s后，将转速提高至500rpm，洗液池2中的PBST缓冲液进入反应池冲洗微珠及通道。30s后，离心机停止转动，关闭阀门4。然后以1000rpm的速度离心10s，使酶液池5中的酶标试剂进入反应池反应。反应5min后，打开阀门。启动离心机，以200rpm转速离心，反应池中的酶标试剂流入废液池。10s后，将转速提高至1800rpm，洗液池1中的PBST缓冲液进入反应池冲洗微珠及通道。30s后，离心机停止转动，关闭阀门4。然后以2000rpm的速度离心10s，使A液、B液进入反应池进行显色反应。最后以3000rpm的速度离心10s，使终止液进入反应池终止反应。所得结果如图4所示。
实施例3
芯片设计加工同实施例1，操作过程同实施例2。分别加入浓度为0.2IU/ml、0.5IU/ml、2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml的乙肝抗原标准品到芯片中进行反应，反应后用酶标仪测吸光度，并重复3次，所得结果如图5所示。
实施例4
分别加入浓度为0.25NCU/ml、0.5NCU/ml、1NCU/ml、1.5NCU/ml、3NCU/ml的丙肝抗原标准品到芯片中进行反应，反应后用酶标仪测吸光度，并重复3次，所得结果如图6所示。
实施例5
分别加入浓度为3mIU/ml、6mIU/ml、12mIU/ml、21mIU/ml、40mIU/ml的梅毒抗原标准品到芯片中进行反应，反应后用酶标仪测吸光度，并重复3次，所得结果如图7所示。

Claims (7)

1.一种用于血液乙肝、丙肝和梅毒快速检测的微流控芯片，其特征在于：主体为光盘形状，每个主体上面均匀分布至少四个微流控单元模块；每个微流控单元模块包括：用于装缓冲液的第一洗液池(1)和第二洗液池(2)、用于样品反应的反应池(3)、用于装酶标试剂的酶液池(5)、分别用于装ELISA反应的A、B液的两个检测液池(6)，用于装终止液的一个终止液池(7)，以及一个废液池(8)，其中：
废液池(8)设于光盘的近边缘处，反应池(3)和废液池(8)之间设有第三通道(3-1)，第三通道(3-1)上设有阀门(4)；第一洗液池(1)、第二洗液池(2)、酶液池(5)、检测液储存池(6)和(7)分别位于反应池(3)靠近光盘圆心的一侧，并分别通过一通道和反应池(3)连接，其中第二洗液池(2)和反应池(3)之间设第二通道(2-1)，第一洗液池(1)和反应池(3)之间设第一通道(1-1)，酶液池(5)和反应池(3)之间设第五通道(5-1)，终止液池(7)和反应池(3)之间设第七通道(7-1)，检测液池(6)和反应池(3)之间设第六通道(6-1)，其中；
使液体通过第二通道(2-1)的第二离心力，第五通道(5-1)的第五离心力，第一通道(1-1)的第一离心力，第六通道(6-1)的第六离心力，第七通道(7-1)的第七离心力依次增高，每一级离心力对应增加200-3000rpm；液体通过第三通道(3-1)的第三离心力小于第二通道(2-1)的第二离心力。
2.如权利要求1所述的一种用于血液乙肝、丙肝和梅毒快速检测的微流控芯片，其特征在于：通道的设计为：第二离心力对应400-600rpm，第五离心力对应800-1200rpm，第一离心力对应1600-2000rpm，第六离心力对应2400-3000rpm，第七离心力对应4000-6000rpm。
3.如权利要求2所述的一种用于血液乙肝、丙肝和梅毒快速检测的微流控芯片，其特征在于：第三离心力对应100-250rpm。
4.如权利要求1所述的一种用于血液乙肝、丙肝和梅毒快速检测的微流控芯片，其特征在于：其中，第二通道(2-1)的孔径为500μm，第一通道(1-1)的孔径为200μm，第五通道(5-1)的孔径为300μm，第七通道(7-1)的孔径为50μm，第六通道(6-1)孔径为100μm。
5.一种血液中乙肝、丙肝和梅毒快速检测方法，包括如下步骤：
1)制作权利要求1所述血液快速检测的微流控芯片,并且将分别包被了乙肝、丙肝和梅毒抗体的微珠及相应的试剂分别封装进芯片的不同微流控单元模块中；该微流控芯片设有四个微流控单元模块，其中三个分别用于检测乙肝、丙肝和梅毒，另一个用于空白对照；
2)将制作好的芯片置于离心力驱动装置中；
3)通过每个微流控单元模块的反应池的进液口注入血液，血液进入反应池后，充分孵化；
4)启动离心力驱动装置，以第三离心力的离心速度离心，使反应池(3)中的血液流入废液池；
5)以第二离心力的离心速度离心，使洗液池(2)的PBST缓冲液进入并通过反应池，冲洗微珠及反应池，最终缓冲液进入废液池(8)；
6)关闭芯片上的阀门，以第五离心力的离心速度离心，使酶液池(5)的酶标试剂进入反应池与微珠进行反应；
7)打开阀门(4)，以第三离心力的离心速度离心，使反应池(3)中的酶标试剂流入废液池(8)；
8)以第一离心力的离心速度离心，使洗液池(1)的PBST缓冲液进入并通过反应池，冲洗微珠及反应池，最终缓冲液进入废液池；
9)关闭阀门(4)，以第六离心力的离心速度离心，使检测液池(6)中的液体进入反应池进行显色反应；
10)以第七离心力的离心速度离心，使终止液池(7)中的终止液进入反应池终止反应，肉眼观察初步检测结果。
6.如权利要求5所述的一种血液中乙肝、丙肝和梅毒快速检测方法，其特征在于：还包括步骤12)用酶标仪对反应池(3)中的试剂进行吸光度检测，得出最终结果。
7.如权利要求5所述的一种血液中乙肝、丙肝和梅毒快速检测方法，其特征在于：
1)制作权利要求1所述血液快速检测的微流控芯片,并且将包被了相应抗体的微珠及相应的试剂封装进芯片中；
2)将制作好的芯片置于离心力驱动装置中；
3)通过反应池的进液口注入血液，血液进入反应池后，充分孵化10分钟；
4)启动离心力驱动装置，以200rpm的离心速度离心，使反应池中的血液流入废液池；
5)以500rpm的离心速度离心，使洗液池2的PBST缓冲液进入并通过反应池，冲洗微珠及反应池，最终缓冲液进入废液池；
6)关闭芯片上的阀门，以1000rpm的离心速度离心，使酶液池的酶标试剂进入反应池与微珠进行反应；
7)打开阀门，以200rpm的离心速度离心，使反应池中的酶标试剂流入废液池；
8)以1800rpm的离心速度离心，使洗液池1的PBST缓冲液进入并通过反应池，冲洗微珠及反应池，最终缓冲液进入废液池；
9)关闭阀门，以3000rpm的离心速度离心，使A、B液进入反应池进行显色反应；
10)以5000rpm的离心速度离心，使终止液进入反应池终止反应，肉眼可见初步检测结果；
11)用酶标仪对反应池中的试剂进行吸光度检测，得出最终结果。
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