CN106238109A - 一种用于拉曼检测头发中冰毒的微流控芯片及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于拉曼检测头发中冰毒的微流控芯片，包括一基片A以及一盖片B，其特征在于：基片A上包括：用于装免疫金溶胶的标记液池(1)，用于装缓冲液的洗液池(2)，用于样品反应和拉曼检测区(4)，用于装终止液的废液池(5)，用于装免疫磁抗体的第一检测液池(6)，用于装毛发提取的待测液的第二检测液池(7)，其中：废液池(5)通过第四通道(4‑1)与检测区(4)连接，检测区(4)的背面处放有磁铁，洗液池(2)通过第三通道(2‑1)和检测区(4)连接，检测区(4)与洗液池(2)之间设有第三通道(2‑1),第三通道(2‑1)上设有阀门(3)。本发明可实现低浓度的检测，与实际人毛发中冰毒的低含量一致。

Description

一种用于拉曼检测头发中冰毒的微流控芯片及其使用方法
技术领域
本发明涉及的领域为微流控芯片及其应用领域。特别是涉及一种头发中冰毒的前处理、冰毒快速拉曼检测的微流控装置及其使用方法。
背景技术
毒品的滥用成瘾与流行，已成为当今世界日益严峻的问题，如甲基苯丙胺(MAMP，俗称“冰毒”)。当长期过量服用冰毒会导致精神混乱、出现幻觉、整个人精神萎靡，严重的可导致神经生物学变化，损坏认知功能，并可能引发精神障碍。现有检测冰毒残留的技术主要有液相色谱法、气-质联用法色谱、薄层色谱法等，这些方法虽然检测准确，但需要昂贵的大型仪器、耗时、前处理繁琐，无法实现现场检测。因此快速、准确的检测出冰毒是一项十分有意义的工作。
微流控芯片技术室把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析的全过程。该技术室当前微全分析系统发展的热点领域。其具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度极快等优点，可以在几分钟甚至更短的时间内对不同样品同时进行分析。因此，微流控芯片在分析检测领域应用具有广泛的前景。
传统的冰毒检测方法是尿液分析方法，但其存在检测时限短和易出现假阳性的缺点，近年来毛发验毒的发展成为了检验瘾君子的有效手段，它能挖掘出吸毒者的用药程度，因此检测毛发中是否含有冰毒受到了毒物分析工作者的极高重视。与体液相比，毛发具有易获取、稳定、易保存且不易作假等优点。开发快速、简便、新型的毛发检测技术成为了必要。因微流控芯片技术在分析检测中，具有高集成化、制作成本低、试剂耗量少、反应时间短，能将生物化学等实验室的基本功能微缩到一个几平方米芯片上。表面增强拉曼光谱，简称SERS，具有检测灵敏度高、分析速度快等优点，是一种颇具潜力的痕量分析技术和指纹图谱。结合SERS技术快速检测毛发中冰毒在毒品安全分析检测领域应用有着广泛的应用前景。因此，开发一种快速、便携、成本低廉的检测冰毒芯片装置用于检测毛发中的冰毒对人类具有潜在的巨大意义。
发明内容
本发明旨在提供一种快速、便携高集成的微流控芯片装置，通过玻璃微通道上竞争性免疫反应和富集复合纳米粒子，检测出毛发中的冰毒含量。本发明能简单快速分离纯化毛发中的冰毒，结合SERS指纹图谱的高识别分子能力，从而大大缩短反应时间和排除其他物质的干扰，提高检测的准确度。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测头发中冰毒的微流控芯片，包括一基片A以及一盖片B，其特征在于：基片A上包括：用于装免疫金溶胶的标记液池(1)，用于装缓冲液的洗液池(2)，用于样品反应和拉曼检测区(4)，用于装终止液的废液池(5)，用于装免疫磁抗体的第一检测液池(6)，用于装毛发提取的待测液的第二检测液池(7)，其中：
废液池(5)通过第四通道(4-1)与检测区(4)连接，检测区(4)的背面处放有磁铁，洗液池(2)通过第三通道(2-1)和检测区(4)连接，检测区(4)与洗液池(2)之间设有第三通道(2-1),第三通道(2-1)上设有阀门(3)；
阀门3与检测区(4)之间的第三通道2-1上设有两条支路，其中一条支路为第二通道(1-2)，另一条为第六通道(6-1)；该第二通道(1-2)的末端再分为第一通道(1-1)和第七通道(7-1)两条支路；标记液池(1)位于第一通道(1-1)的末端，第二检测液池(7)位于第七通道(7-1)的末端；第一检测液池(6)通过第六通道(6-1)与第三通道(2-1)连接；
在盖片B上，标记液池(1)、废液池(5)、两个检测液池(6)和(7)分别设有进液口(1’、2’、6’、7’)，同时废液池(5)上方设有通气口(5’)。
在本发明的较佳实施例中，标记液池(1)、第二检测液池(7)的液体容量分别在50μl以上，第一检测液池(6)的液体容量在100μl以上，缓冲液池(2)的液体容量300μl以上，检测区(3)的液体容量50μl以上，废液池(4)的液体容量500μl以上。
在本发明的较佳实施例中，标记液池(1)中的溶液为Au-MBA-冰毒抗原，浓度范围为1X10-10-1X10-8M(标记分子对巯基苯甲酸的浓度,英文简称MBA)。
在本发明的较佳实施例中，洗液池(2)中的溶液为Na2HCO3-NaH2CO3缓冲液，浓度为0.5-2mol/L。
在本发明的较佳实施例中，第一检测液池(6)中的溶液为Fe3O4@Au-冰毒抗体，浓度范围为0.5-0.8mM。
在本发明的较佳实施例中，第二检测液池(7)中的溶液为毛发消解液，浓度范围为0.2-0.5g/L。
一种用于检测头发中冰毒的方法，包括如下步骤：
1)毛发提取过程：取人头发，用甲醇和超纯水超声清洗各两次，拿剪刀将头发剪碎成小碎片，放于含1mol/L NaOH溶液的50ml离心管，液固比范围为1:40-60,在水浴条件下煮，50-90℃、10-60min，离心和过滤去掉杂质，用1mol/L HCl溶液调制pH8.5-9.5；
2)加标溶液的配制：加入不同浓度的加标冰毒，配制不同数量级的溶液待用；
3)制作前述的微流控芯片，并且将免疫磁纳米粒子溶液、标记免疫金溶液、检测液及相应的缓冲试剂分别封装进入芯片的不同储藏池中；
4)驱动装置，使标记液池(1)、检测液池(7)、检测液池(6)里的液体流入反应区充分混合，通过磁铁对磁性复合纳米粒子进行富集；
5)打开芯片上的阀门，用抽泵在废液池上端的出气口处驱动装置，使缓冲液池(2)的液体冲洗反应区，最终缓冲液进入废液池(5)；
6)利用拉曼光谱仪对反应区上富集的磁性复合纳米粒子进行检测，通过峰位和峰强，得出最终结果。
进一步，步骤(2)在检测实际样品时，与加标样品区别在于：有可能吸食冰毒人毛发作为检材、不加入加标冰毒。
进一步，所述步骤(3)免疫磁粒子Fe3O4-抗体的制备:Fe3O4溶液通过氨基化修饰、种子还原法、摇床温育连接上冰毒抗体、用牛血清白蛋白(BSA)封闭表面未结合的位点。
进一步，所述步骤(4)免疫金的制备：35nm Au溶胶摇床温育连接上MBA、冰毒抗原，用BSA封闭表面未结合的位点。
本发明的毛发中冰毒的SERS检测方法是针对毛发中常见毒品冰毒的快速分离纯化、竞争性反应以及检测出毛发中是否含有冰毒和其浓度。该检测过程是在玻璃芯片上进行操作的，具有操作简单、省时、耗材少、检测结果可靠的优点。
本发明的优点在于：
1)与传统的尿液、唾液、血液相比本发明以毛发作为检材，具有易获取、稳定、易保存且不易作假等优点。
2)反应仪器为简单的玻璃芯片、方便携带使用，这种微流控芯片具有耗量少、反应充分，而且该芯片具有反应、浓缩富集的功能，可以将检测区域集中在几微米大小的圆形地方。
3)本发明利用SERS检测人毛发中的冰毒实现对冰毒高灵敏度的检测.SERS具有高分辨的指纹图谱，可鉴定分子的结构，结合抗体的选择性识别，可最大程度减少复杂成分对信号的干扰，从而大大提高了检测的准确性。
4)本发明采用竞争性免疫法，即冰毒的浓度与拉曼信号强弱成负相关，可实现低浓度的检测，与实际人毛发中冰毒的低含量一致。
5)本发明对人毛发中冰毒实现的SERS检测为监管司法和刑事案件提供了一种有效检测冰毒的手段。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明
图1为本发明的平面结构示意图。
图2为本发明立体结构示意图。
图3是根据本发明的芯片所测得MBA的SERS强度随人毛发中不同加标浓度冰毒变化关系的拉曼谱图结果。
图4为加标冰毒在芯片中以不同浓度多次重复试验所测得出的拉曼信号MBA在1073cm-1处的峰强与加标冰毒浓度对应关系。
图5为在芯片中测得人毛发提取液的拉曼谱图。
具体实施方式
实施例1
参见图1、图2，本发明的装置结构如下：
主体为长方体形状(长X宽：31.5X15.75mm)，分为上、下两层结构，包括一基片A以及一盖片B，两层之间可实现密封的对准键合。
基片A上包括：用于装免疫金溶胶的标记液池1，用于装缓冲液的洗液池2，用于样品反应和拉曼检测区4，用于装终止液的废液池5，用于装免疫磁抗体的检测液池6，用于装毛发提取的待测液的检测液池7，其中：
废液池5设于芯片最右端处，通过第四通道4-1与其左侧的检测区4连接，检测区(4)的背面处放有磁铁，洗液池2位于芯片的最左端处，通过第三通道2-1和检测区4连接，检测区4与洗液池2之间设有第三通道2-1,第三通道2-1上设有阀门3；
标记液池1、检测液池7、检测液池6分别位于通道2-1上方。阀门3的右侧，第三通道2-1依次设有两条支路，其中一条支路为第二通道1-2，另一条为第六通道6-1；该第二通道1-2的末端再分为第一通道1-1和第七通道7-1两条支路，
标记液池1通过第一通道1-1、第二通道1-2与第三通道2-1连接，检测液池7通过第七通道7-1、第二通道1-2与第三通道2-1连接，检测液池6通过第六通道6-1与第三通道2-1连接。
所有通道的孔径为200μm。在盖片B上，标记液池1、废液池5、两个检测液池6和7分别设有进液口1’、2’、6’、7’，同时废液池上方设有通气口5’。
基片A和盖片B是玻璃材料，芯片厚度为6mm。微流控通道单元可通过现有成型微芯片技术加工而成。
各储液池的形状大小可根据需要，需保证标记液池1、检测液池7的液体容量50μl以上，检测液池6的液体容量在100μl以上，缓冲液池2的液体容量300μl以上，检测区3的液体容量50μl以上，废液池4的液体容量500μl以上。
实施例2
标记免疫金的纳米粒子制备过程为；
取49.5ml超纯水+0.5ml HAuCl3搅拌分散均匀，加热冷凝回流，一次性加入0.5mlNa3Cit(柠檬酸三钠)，颜色先变黑、紫黑、最后紫红色，再冷凝回流15min，得到粒径约为35nm Au溶胶；取1ml Au溶胶+2.5μl 1mM MBA温育1.5h，离心分散；加2μl 5μg/ml冰毒抗原温育3.5h，离心分散,重悬浮于1ml磷酸缓冲液；加10μl 10％BSA温育1h,离心分散1ml磷酸缓冲液。
免疫磁纳米粒子溶液的制备过程为:
取0.68g FeCl3+0.2g Na3Cit+20ml EG(乙二醇)超声溶解，加入1.2g CH3COONa搅拌混匀，在200℃下，10h水热反应，磁洗分散于20ml超纯水中，得到粒径约为200nm Fe3O4粒子，取1ml Fe3O4水溶液+50ml乙醇+110μl三氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)超声分散，搅拌12h，冷凝回流2h，磁洗分散于15ml乙醇中，加入25ml 2nm Au混匀，搅拌24h，磁洗分散15ml于超纯水中；取2ml Fe3O4-2nm Au溶液+16ml金生长液+2ml甲醛稀释液机械搅拌2h，磁洗分散4ml磷酸缓冲液中，加入2μl 5μg/ml冰毒抗原温育4h，磁吸分散，加入10μl 10％BSA温育1h，磁洗分散4ml磷酸缓冲液中.
缓冲试剂为Na2HCO3-NaH2CO3缓冲液，其pH为9，浓度1mol/L。
待测液：
取待测人头发，用甲醇和超纯水超声清洗各两次，拿剪刀将头发剪碎成小碎片，放于含1mol/L NaOH溶液的50ml离心管，在水浴条件(70℃、30min)煮，离心和过滤去掉杂质，用1mol/L HCl溶液调制pH＝9左右。
取未吸食过冰毒人头发，用甲醇和超纯水超声清洗各两次，拿剪刀将头发剪碎成小碎片，放于含1M NaOH溶液的50ml离心管，在水浴条件(70℃、30min)煮，离心和过滤去掉杂质，用1M HCl溶液调制PH＝9左右，加入不同浓度的加标冰毒，配制10fg/ml、100fg/ml、1pg/ml、10pg/ml、100pg/ml 10ng/ml的溶液待用；
芯片加工好后，需要将以上制备的50μl标记免疫金封装进入标记液池，将300μl磷酸缓冲液封装进入缓冲液池，将100μl免疫磁粒子封装进入检测液池，将50μl待测液封装进入检测液池。
使用实施例1制备的芯片，关闭芯片上的阀门3，利用抽泵在废液池上方盖片B通气口5’处进行吸收气体，使标记液池1、两个检测液池6和7的液体缓慢进入废液池4中。在这个过程中，磁纳米粒子会被反应区4的磁铁吸住固定在反应区，而标记液中的抗原与待测液中冰毒标准品会和磁纳米粒子中的冰毒抗体竞争结合形成复合粒子。10min后，打开阀门3，让缓冲液池的液体清洗未结合的标记物。5min后，然用拉曼光谱仪对反应区进行检测，得到图3、图4。如图3和4所示：图3说明随着加标冰毒浓度的提高，在拉曼信号MBA 1073cm-1处的SERS强度随浓度的提高而减弱；同时图4给出了SERS强度随着冰毒浓度的变化对应数值，例如当SERS强度为700cps时，此时检测样品不含冰毒。
将样品寄给厦门鉴科检测技术有限公司，采用传统标准方法的液相质谱联用检测，结果为：正常人头发不含冰毒，而六年、长期人的头发分别含有冰毒含量为2.0、2.6ppm。操作过程同上.如图5所示：正常人、六年、长期的头发提取液在1073cm-1处的SERS强度分别为700、200、170cps，由于在液相质谱检测中，将样品浓缩100倍和拉曼检测分析时大致稀释50倍，检测样品的冰毒浓度大致为：0、400pg/ml、520pg/ml，对照图三，当SERS强度为700、200、170cps时，所对应的浓度为0、200、500pg/ml这与标准方法测出的数据0、400、520pg/ml在数量级上相同，大小也极为接近。

Claims (7)

1.一种用于拉曼检测头发中冰毒的微流控芯片，包括一基片A以及一盖片B，其特征在于：基片A上包括：用于装免疫金溶胶的标记液池(1)，用于装缓冲液的洗液池(2)，用于样品反应和拉曼检测区(4)，用于装终止液的废液池(5)，用于装免疫磁抗体的第一检测液池(6)，用于装毛发提取的待测液的第二检测液池(7)，其中：
废液池(5)通过第四通道(4-1)与检测区(4)连接，检测区(4)的背面处放有磁铁，洗液池(2)通过第三通道(2-1)和检测区(4)连接，检测区(4)与洗液池(2)之间设有第三通道(2-1),第三通道(2-1)上设有阀门(3)；
阀门3与检测区(4)之间的第三通道2-1上设有两条支路，其中一条支路为第二通道(1-2)，另一条为第六通道(6-1)；该第二通道(1-2)的末端再分为第一通道(1-1)和第七通道(7-1)两条支路；标记液池(1)位于第一通道(1-1)的末端，第二检测液池(7)位于第七通道(7-1)的末端；第一检测液池(6)通过第六通道(6-1)与第三通道(2-1)连接；
在盖片B上，标记液池(1)、废液池(5)、两个检测液池(6)和(7)分别设有进液口(1’、2’、6’、7’)，同时废液池(5)上方设有通气口(5’)。
2.如权利要求1所述的一种用于检测头发中冰毒的微流控芯片，其特征在于：标记液池(1)、第一检测液池(6)的液体容量分别在50μl以上，第二检测液池(7)的液体容量在100μl以上，缓冲液池(2)的液体容量300μl以上，检测区(3)的液体容量50μl以上，废液池(4)的液体容量500μl以上。
3.如权利要求1所述的一种用于拉曼检测头发中冰毒的微流控芯片，其特征在于：标记液池(1)中的溶液为Au-MBA-冰毒抗原，浓度范围为1×10-10-1×10-8mol/L。
4.如权利要求1所述的一种用于拉曼检测头发中冰毒的微流控芯片，其特征在于：洗液池(2)中的溶液为Na2HCO3-NaH2CO3缓冲液，浓度0.5-2mol/L。
5.如权利要求1所述的一种用于拉曼检测头发中冰毒的微流控芯片，其特征在于：第一检测液池(6)中的溶液为Fe3O4@Au-冰毒抗体,浓度范围为0.5-0.8mM。
6.如权利要求1所述的一种用于拉曼检测头发中冰毒的微流控芯片，其特征在于：第二检测液池(7)中的溶液为毛发消解液，浓度范围为0.2-0.5g/L。
7.一种用于拉曼检测头发中冰毒的方法，包括如下步骤：
1)毛发提取过程：取人头发，用甲醇和超纯水超声清洗各两次，拿剪刀将头发剪碎成小碎片，放于含1mol/L NaOH溶液的50ml离心管，液固比范围为1:40-60，在水浴条件下煮，50-90℃、10-60min，离心和过滤去掉杂质，用1mol/L HCl溶液调制pH8.5-9.5；
2)加标溶液的配制：加入不同浓度的加标冰毒，配制不同数量级的溶液待用；
3)制作权利要求1的微流控芯片，并且将免疫磁纳米粒子溶液、标记免疫金溶液、检测液及相应的缓冲试剂分别封装进入芯片的不同储藏池中；
4)驱动装置，使标记液池(1)、检测液池(7)、检测液池(6)里的液体流入反应区充分混合，通过磁铁对磁性复合纳米粒子进行富集；
5)打开芯片上的阀门(3)，用抽泵在废液池上端的出气口处驱动装置，使缓冲液池(2)的液体冲洗反应区，最终缓冲液进入废液池(5)；
6)利用拉曼光谱仪对反应区上富集的磁性复合纳米粒子进行检测，通过峰位和峰强，得出最终结果。
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