CN105021578B - 流体荧光定量检测装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种流体荧光定量检测装置，包括液体流动系统、光路系统和数据处理系统，液体流动系统包括吸液装置、石英管、微球约束腔和连接管；微球约束腔用于使微球并列进入石英管；光路系统包括激发光产生装置、检测窗口、带通滤光片及光电转换器；数据处理系统包括数据处理器和用户操作界面。本发明还公开了基于上述装置的流体荧光定量检测方法。该方法采用微米级微球作包被载体，在微球约束腔和吸力作用下，载体微球有序通过检测窗口，连续采集流体中的微球荧光信号，通过归一化处理，获得被测物浓度。该方法不需要清洗分离游离荧光标记微球，也不需要比对同步检测标准品的荧光曲线，适合于核酸、细胞等生物特性的快速、高通量定量检测。

Description

流体荧光定量检测装置及方法

技术领域

本发明涉及流体标记物检测技术领域，特别是涉及流体荧光定量检测装置，及应用该装置定量测定流体中目标检测物含量的方法。

背景技术

标记物检测技术的原理是：标记物通过免疫反应法、化学反应法、生化反应法、链霉亲和素和生物素等包被技术，制作成探针；探针通过相应的反应与目标物质结合；检测仪器通过对标记物的检测，测定出目标物质的浓度。目前，标记物检测技术已经广泛用于医疗检测、微生物检测、微量元素测定等领域，例如电化学荧光标记分析（ECLI）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、荧光免疫分析（FIA）、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）等荧光免疫分析技术。

标记荧光的免疫分析方法，近年发展迅速，比较具有代表性的是罗氏Elecsys2010电化学荧光标记分析方法（ECLI）。该方法采用链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）包被技术，将抗原（或抗体）包被在直径2.8μm的聚苯乙烯磁性微球上，荧光标记物采用具有电激发化学光特性的三联吡啶钌。当磁性微球、荧光标记物与样品中的检测目标物质反应后，目标物质会携带荧光标记物聚集在磁性微球表面。Elecsys利用磁性微球的磁性特征，将磁性微球固定在电磁铁周围，然后进行冲洗，清除游离的荧光标记物。清洗后的微球放置在检测区域，施加电场，使电化学发光的荧光标记物质被激发出波长620nm的荧光，通过检测高特异性的荧光强度，参考标准曲线，实现目标物质的定量测定。

酶标法（ELISA），将抗原或抗体与酶用胶联剂结合成为酶标抗原或抗体，将样品池内壁包被同样的抗原或抗体。加入样品和酶标抗原或抗体，样品中的目标检测物抗体或抗原使酶标抗原或抗体可与内壁上的抗原或抗体发生特异反应，并牢固地结合，形成仍保持活性的免疫复合物。然后，加入相应底物将免疫复合物显色，通过参考标准曲线或对比颜色标准板，根据颜色深浅，定量检测目标检测物含量。为检测颜色深浅，需对样品池中游离在溶液中的酶标、杂质和底物进行清洗和参考标准样品。

时间分辨荧光免疫法（TRFIA），在样品反应、清洗等与荧光免疫法（FIA）基本类似，只是检测的是更高特性的时间分辨荧光，而非普通FIA检测光激发的瞬时荧光。TRFIA要求在关掉激发光源后100μs-1ms的时间段内检测荧光，虽然荧光具有高特异性，但由于荧光本身具有衰减周期，导致激发光源强度、以及检测计时误差会引起检测误差，因此对检测仪器的一致性要求更高，一般需要仪器在检测样品同时，检测标准样品池，以保证标准曲线的有效性。

Luminex200流式荧光检测仪是液相荧光检测仪的代表产品，其检测方法是采用直径5.6μm的聚乙烯微球作为标识微球，标识微球能在635nm光照射时激发两个波长荧光并且强度对比值不同，根据强度比值进行100种编码，分别代表100种标识微球。荧光标记物是在532nm光照射时能激发575nm波长荧光的物质。当溶液中存在目标检测物时，荧光标记物将附着在相应的标识微球周围。检测时，仪器通过检测635nm识别标识微球编码，然后根据575nm不同编码微球上的标记荧光强度，参考标准曲线，得到标识微球所结合的目标检测物含量。Luminex200通过流式检测溶液在细小石英管内对依次通过的微球进行逐粒检测，因此它是一种液相荧光标记逐粒检测方法。逐粒检测技术的关键是要求每个微球保持距离，不能相互干扰，否则会造成检测结果假阳性。为了让5.6μm的微球在500μm×500μm内径的石英管内依次通过，Luminex200流式荧光检测仪采用了两个关键技术避免微球层叠：一个是通过使用流式技术将标识微球在石英管内依次排列；另一个是通过检测微球散射光，识别确认微球是否层叠。流式技术就是利用流动的鞘液的流体力学原理，使微球在液柱中心排列通过。但流式技术不能保证微球一定会依次排列通过检测窗口，因此，作为辨别，Luminex200引入了微球散射光检测，当发现散射光异常变化时，系统自动舍弃该微球的标记荧光检测结果，不纳入检测统计结果。由于luminex200使用鞘液，导致了溶液成分改变，因此必须将得到的标记荧光强度，比对参考标准曲线，才能得到检测结果。

综上，目前常规的荧光标记检测技术，都存在以下无法克服的问题：

1.为准确获得结合了目标检测物的标记荧光强度，需要清洗和分离，避免样品溶液中的杂质和溶液中游离的标记物所产生的特异性荧光叠加在荧光背景上，影响检测结果。

2.检测的目标物荧光强度，与目标物含量，需要参考标准曲线才能关联。

3.由于检测结果要依赖于参考标准曲线，因此检测实验需要完全模拟标准品的参考曲线测定场景，如：样品及试剂投放量，清洗、分离步骤，检测仪器量程定标，荧光物质发光能力定标，环境温度等等，都需要与标准品的测定场景一致。苛刻的试验条件要求，反而可能导致极低的可重复性。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种流体荧光定量检测装置，它能准确检测流动液体中的荧光标记物的荧光强度，且具有使用方便、抗干扰能力强、检测效率和灵敏度高的优点。

为解决上述技术问题，本发明的流体荧光定量检测装置，包括液体流动系统、光路系统和数据处理系统，其中：

液体流动系统包括吸液装置、石英管、微球约束腔和连接管；所述吸液装置用于抽吸溶液；所述石英管上端连接吸液装置，下端连接微球约束腔，中部开有检测窗口；所述微球约束腔用于使微球并列进入石英管，该微球约束腔包括有入口腔、限流口和出口腔，入口腔与连接管上端连接，出口腔与石英管下端连接，限流口为狭缝通孔，狭缝宽度小于微球在溶液中的最小自由距离；所述连接管下端浸入溶液中，用于作为液体流通的管路；

光路系统包括激发光产生装置、检测窗口、带通滤光片及光电转换器；所述激发光产生装置用于激发荧光标记物产生荧光；所述检测窗口为透光狭缝，狭缝开口与石英管垂直，并与约束腔限流口开口方向平行；所述带通滤光片用于选择性透过所需波段的光；所述光电转换器用于将透过带通滤光片的光转换成电信号；

数据处理系统包括数据处理器和用户操作界面；所述数据处理器用于控制吸液装置和激发光产生装置，采集并处理光电转换器的光电数据；所述用户操作界面用于用户操作信息交互及输出检测结果。

本发明要解决的技术问题之二是提供应用上述流体荧光定量检测装置定量检测流体中目标物浓度的方法，该方法包括以下步骤：

1）将标定了可结合目标检测物总量和结合系数的荧光标记物与聚集在标识微球表面的目标检测物进行结合反应；

2）抽取步骤1）得到的混合溶液，流经微球约束腔，使标识微球在石英管内并列且匀速地通过石英管；

3）连续采集流动溶液的标记荧光信号；

4）分辨标识微球表面所聚集的标记物荧光信号；

5）在连续的检测时间段内，计算标识微球的标记荧光强度和，以及溶液的全部标记荧光强度和，根据荧光标记物所标定的可结合目标检测物总量和结合系数，利用多元线性回归公式计算出目标检测物的含量。

所述目标检测物包括甲状腺、性激素、骨代谢、心肌梗塞、肿瘤标志物、传染病抗原抗体和核酸分子等。

所述标识微球为单分散微球，可以使用聚苯乙烯微球、硅胶微球以及聚吲哚类杂环化合物、聚苯胺等导电高分子微球。标识微球的体积越大，聚集目标检测物的能力越强，其激发出的标记荧光强度与游离溶液中的标记荧光强度的差异也会越大，因此，为了提高检测灵敏度，宜选用粒径比较大的乳胶微粒（粒径为5-500微米）。

荧光标记物激发出荧光的能力与其包含的荧光物质的多少有关，因此，为了提高检测的灵敏度，宜选用粒径在10nm到300nm之间的聚苯乙烯胶或硅烷等荧光乳胶微粒。

所述步骤4），可以通过参考荧光信号的波峰和波谷，或参考微球的散射光信号，或参考磁性微球的磁性特征，来分辨标识微球表面所聚集的标记物荧光信号。

本发明通过使用独创的微球约束腔，并采用单分散微球作为载体，避免了因微球之间互相遮挡而影响荧光检测结果。该检测方法不需要分离检测样品中游离的荧光标记物，也无需参考标准曲线，只要根据标记物荧光强度与目标检测物含量之间的特征参数，即可实现直接地定量检测目标物的浓度，从而不仅免去了样品清洗、分离等繁琐步骤，而且简化了仪器的定标、检测，在简化操作的同时提高了检测的快速性、可重复性和准确性。

附图说明

图1是本发明的流体荧光定量检测装置的结构示意图。

图2是图1装置的微球约束腔结构示意图。其中，（A）为剖面图；（B）为俯视图。

图3是微球荧光和溶液全荧光检测原理。其中，（A）流体中含有目标检测物；（B）流体中不含目标检测物。

图4是实施例1的多元线性回归曲线。

图5是实施例2的多元线性回归曲线。

图6是简易微球约束腔的结构示意图。其中，（A）为剖面图；（B）为俯视图。

图7是可用于时间分辨荧光检测的流体荧光定量检测装置的结构示意图。

图8是可用于电致荧光检测的流体荧光定量检测装置的结构示意图。

图9是可用于散射光检测的流体荧光定量检测装置的结构示意图。

图10是参考散射光信号分辨微球荧光的波形图。

图中附图标记说明如下：

1：散射光检测窗口

2：激发光源

3：样品和试剂的混合溶液

4：吸液泵

5：散射光带通滤光片

6：带通滤光片

7：散射光光电转换器

8：光电转换器

9：数据处理器(DSP)

10：用户操作界面

11：微球约束腔

113：限流口

114：标识微球

115：出口腔

116：入口腔

12：石英管

13：连接管

14：荧光检测窗口

15：激发光源照射窗口

16：激发电致化学发光电极负极

17：激发电致化学发光电极正极

T：连续检测时间段

e：T时间内标识微球表面聚集的标记物荧光总量

E：T时间内溶液中全部标记物荧光总量

g：T时间内有标识微球时段的荧光总量

G：T时间内无标识微球时段的背景荧光总量

具体实施方式

为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图，对本发明详述如下：

如图1所示，本发明的流体荧光定量检测装置，主要由液体流动系统、光路系统以及数据处理系统三部分构成。其中：

液体流动系统包括吸液泵4、连接管13、石英管12和微球约束腔11。吸液泵4与石英管12的上端口连接，并与数据处理器9电性连接，由数据处理器9控制吸液泵4的启动、停止以及吸液的速度。微球约束腔11位于连接管13和石英管12之间，用于加大微球间的自由距离，使微球均匀、有序地排列。微球约束腔11的材料可以使用塑料或硅橡胶，腔体结构如图2所示，包括入口腔116、限流口113和出口腔115。入口腔116与连接管13相连，内径为5mm。粗且陡峭的入口腔116，能让液体比微球更容易进入限流口113，延迟标识微球114进入限流口113。限流口113为狭缝开口，狭缝宽0.1mm，长2mm，限流口113的厚度为1.5mm。根据标识微球的直径选配不同限流口宽度的微球约束腔，使限流口113宽度小于标识微球在溶液中的微球在溶液中的最小自由距离0.2mm，以保证当一个微球到达限流口113时，相邻的微球一定在最小自由距离之外。通过使用约束腔，可以迫使微球114沿着限流口113狭缝方向并排通过石英管12，避免垂直于开口并列进入限流口113。使用狭缝约束腔可大大降低限流口113被堵塞的风险，相比使用内径开口扁长的石英管，更具有实用性。出口腔115连接过渡到石英管12内壁，平缓的出口可以避免流动溶液在出口周围产生漩涡，以避免微球回流或停顿。连接管13可以使用医用硅胶管。连接管13下端浸入样品和试剂的混合溶液3中，上端与微球约束腔11连接。石英管12为圆形或方形的中空石英玻璃管，本发明采用的是外径为3mm×3mm的方形，内径为2mm×0.5mm的扁口管。石英管12上端与吸液泵4连接，下端与微球约束腔11连接。

光路系统包括激发光源2、照射窗口15、荧光检测窗口14、带通滤光片6及光电转换器8（也可以使用光电倍增管）。激发光源2与数据处理器9电性连接，由数据处理器9控制激发光源2的开关。激发光源2可采用390nm波长大功率LED光源，用于激发荧光标记物产生荧光。激发光源2垂直照射在石英管12中部，形成激发光照射窗口15。照射窗口15的侧向开有荧光检测窗口14。荧光检测窗口14为狭缝透光口，狭缝高度约0.1mm，开口与石英管12垂直，与微球约束腔11的开口平行。经过照射窗口15的荧光标记物会受激产生610nm波长的荧光，标记物的特异性荧光会从照射窗口15侧向的荧光检测窗口14射出。带通滤光片6用于过滤610nm波长以外的光，收集特异性标记荧光信号。光电转换器8用于将带通滤光片6过滤收集到的标记物荧光转换成电信号。

数据处理系统包括数据处理器9和用户操作界面10。数据处理器9用于控制吸液泵4和激发光源2，以及处理光电转换器8的光电数据。用户操作界面10用于用户操作信息交互及输出检测结果。

以下通过两个实施例，对应用上述流体荧光定量检测装置定量测定样品溶液中目标检测物含量的方法进行详细的说明。

实施例1双抗体夹心法定量检测TSH(促甲状腺激素)

1、制备标识微球试剂

将20mg粒径50μm表面带羧基的聚苯乙烯乳胶微粒（购自Thermo Scientific公司）离心除去缓冲液中的叠氮钠，用0.1M MES缓冲液（pH6.8～7.2）悬浮，稀释到5ml；在搅拌下加入5mg碳二亚胺（EDC）和5mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，搅拌溶解，室温反应25分钟；离心除去多余的EDC和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐。用50mM硼酸缓冲液（pH8.2～9）清洗，之后用硼酸缓冲液悬浮到3毫升。

加入1mg用50mM硼酸缓冲液（pH8.2～9）透析过的TSH抗体包被抗体两株，搅拌均匀，室温反应16到24小时；反应结束后离心，加封闭液(含有5g/L的BSA（牛血清白蛋白）、50mM pH8.5的Tris（三羟甲基氨基甲烷醋酸盐）缓冲液封闭8小时左右，用高速离心机离心，然后用稀释液（含有5g/L的BSA、5g/L的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、0.2%叠氮钠的pH8.0的Tris缓冲液50mM）溶解沉淀，制成标识微球试剂。4℃冷藏保存。

用纳米粒度仪检测标识微球标记抗体后的粒径均匀性。

取标识微球试剂溶液10μL滴在载玻片上，盖上盖玻片，轻压后在读数显微镜下观测，液体里微球可保持的最小自由距离L约为200μm。

2、选择微球约束腔

根据标识微球的直径及其在液体中的最小自由距离，选择使用限流口113狭缝宽度100μm的微球约束腔11，以避免微球在荧光检测窗口前后互相遮挡。狭缝限流口相比直径100μm的圆形限流口更不宜堵塞，具有更高的稳定性。

3、制备荧光标记试剂

将20mg粒径100nm表面带羧基的荧光纳米微粒（购自Thermo Scientific公司）离心除去缓冲液中的叠氮钠，用前述步骤1制备标识微球的方法，将另一株TSH抗体标记到纳米荧光微粒上，用稀释液（含有5g/L的BSA、5g/L的PVP、0.2%叠氮钠的pH8.0的Tris缓冲液50mM）溶解沉淀，制备得到荧光标记试剂，4℃冷藏保存。该荧光标记物能在390nm波长光源的激发下，发出610nm荧光。

4、免疫反应

为使免疫反应快速、彻底，标识微球试剂中的微球数量要足够多，保证TSH抗原能全部反应结合在标识微球表面；荧光标记物也要足够多，保证TSH抗原能全部结合上荧光标记物，并且还有少量未结合的荧光标记物离散在溶液中。

取步骤1制备的标识微球试剂20μl(固含量为万分之二)，加入到50μl样品溶液中，样品中的TSH抗原与标识微球的包被抗体结合，并聚集在标识微球表面，样品溶液中的抗原越多，则在标识微球表面聚集得越多。反应充分后，一般情况下在溶液中的TSH抗原应该所剩无几。

取步骤3制备的荧光标记物试剂50μl，加入到上面的反应溶液中。TSH抗原可结合2个抗体，结合了标识微球上的抗体之后，还可以结合一个荧光标记物。混合溶液中，投入的荧光标记一部分经免疫反应结合在TSH抗体包被的标识微球表面，其余部分则均匀游离在溶液中。

5、检测

开启吸液泵4，匀速抽取充分反应后的样品和试剂的混合溶液3，经过连接管13，混合溶液进入微球约束腔11，由于限流口113内径宽度小于标识微球114在溶液中的最小自由距离，因此，标识微球114只能顺着限流口113狭缝方向依次排列通过。由于限流口113的内径小于入口腔116的内径，因此，标识微球114进入限流口113后，将加速流动，这样就加大了标识微球114与后一标识微球之间的距离，进一步保证了标识微球114进入石英管检测窗口14时不会互相遮挡。

样品溶液中的荧光标记物一部分根据目标物含量多少结合在标识微球表面，另一部分则游离在溶液中。溶液中的荧光标记物在激发光照射窗口15受激发出610nm波长的特异性荧光，荧光透过荧光检测窗口14的狭缝，经过带通滤光片6后，被采集并转换为标记荧光信号。信号强度反应了荧光检测窗口14的狭缝高度所覆盖的石英管截面内的标记荧光强度，荧光可以来自微球上的荧光标记，也可能来自游离在溶液中的荧光标记。

样品中的杂质微粒，在激发光照射时，不会产生610nm波长的特异性荧光。即使个别产生610nm波长荧光，在液体流动的情况下，也只能极短的时间内影响荧光检测，基本不会干扰检测结果。

图3是液体流速恒定下连续采集到的特异性荧光的光电转换信号的波形图（标识微球偏离石英管中心会产生荧光信号强度变化，但是通过长时间连续检测，这个偏心误差可被消除）。在检测时间T内，涵盖了5个半标识微球通过荧光检测窗口所产生的信号波形。波形高度反应了采样时刻溶液中所有荧光标记物的荧光强度，波峰由标识微球聚集了高密度的荧光标记而引起分布变化所致，波峰越高说明聚集的荧光标记越多，目标检测物含量越高。

波谷高度线代表了游离在溶液中的标记物荧光强度，波谷高度线越低说明溶液中游离的荧光标记物密度较低，聚集在标识微球表面的标记物越多则游离的标记物会越少，加入稀释液越多则游离的标记物也会越少。

从波形可以看出，较长时间占比的波谷有助于正确识别波谷高度，因此或许需要在检测样品前对样品加入稀释液，增加波峰与波谷的占空比。另一方面通过加入适量的稀释液，调节荧光标记物浓度，可以控制荧光波形的波谷线高低，使试剂的生化反应更稳定。

图3的荧光波形围出的总面积E，代表了在检测时间T内，流动溶液中的全部标记物的荧光总强度，单位为ΣmV。波谷高度线以上的高出的信号，为采样时刻微球聚集的荧光强度，其围出的总面积e代表标识微球表面聚集的标记荧光总量,单位为ΣmV。显然，若投入的荧光标记物可结合目标检测物最高量的标定值为C，荧光标记物与目标检测物的结合系数为K，即可得到目标检测物TSH抗原的总量，具体计算方法参见下述步骤6。

连续检测时间T可长可短，只要检测结果基本稳定不变，就说明此时抽取并检测的少量溶液已经足够代表整个溶液的成份含量。本实施例采用固定的5秒检测时间，然后重复5-10次，并将检测结果进行平均，即可获得目标检测物含量。

6、检测结果

准备1份300μl荧光标记试剂和1份150μl包被TSH抗体的标识微球试剂。准备4份100μl已知目标物TSH抗原含量分别为0.1mU/L、1mU/L、10mU/L和100mU/L的样品，分别标记为样品A、样品B、样品C和样品D。

分别取50μl样品A、样品B、样品D，各自加入20μl标识微球试剂和50μl荧光标记试剂，进行免疫反应，反应30分钟后进行检测，检测结果如表1所示：

表1TSH定量测定结果

用以下公式对表1数据进行多元线性回归（参见图4）:

Log（V）=K×Log(e/E)+Log(C)

其中，V为目标检测物含量，K为免疫反应中目标检测物与荧光标记物的结合系数，C为所使用的荧光标记试剂可结合的目标检测物的最高浓度。K和C与试剂本身的特性有关，基本不受检测仪器性能影响，多数仪器本身的校准差异通过检测的E参数消除。本实施例取K=1.1182，Log(C)=2.279。e为检测周期内实测的标识微球表面的标记物荧光强度总量（光电转换电压值的和），E为检测周期内实测的流动溶液中的全部标记物荧光强度总量（光电转换电压值的和）。

检测TSH抗原含量未知的实际样品时，只要用本发明的流体荧光定量检测装置检测样品的e和E，然后代入上述计算公式，即可确定样品中所含TSH抗原的浓度。试验证明，使用不同的仪器，由于光路和光电转换器的增益差异以及环境影响，会产生e和E在绝对值的差异，但e与E的比值不会改变，因此不会导致目标物检测浓度的差异。

上述方法无需参考标准样品或标准曲线，无需洗涤或提纯，可以直接地测定目标检测物含量。相比常规方法，不仅减少了大量操作步骤引入的积累误差，而且无需固相试剂或载体，更适合全自动、快速、高灵敏度、高精度和高通量检测。

实施例2中和抑制法检测乙肝病毒E抗体

1、制备标识微球试剂

将20mg粒径50μm表面带羧基的乳胶微粒（购自Thermo Scientific公司）离心除去缓冲液中的叠氮钠，并用0.1M pH6.8～7.2的MES缓冲液悬浮，稀释到5ml；在搅拌下加入5mg碳二亚胺（EDC）和5mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，搅拌溶解，室温反应25分钟；离心除去多余的EDC和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐。用50mM pH8.2～9的硼酸缓冲液清洗，之后用硼酸缓冲液悬浮到3毫升。

加入1mg用50mM硼酸缓冲液（pH8.2～9）透析过的乙肝E抗体包被抗体两株，搅拌均匀，室温反应16到24小时；反应结束后离心，加封闭液(（5g/L的BSA（牛血清白蛋白）、pH8.5的50mM的Tris缓冲液）封闭8小时左右，用高速离心机离心，然后用稀释液（含有5g/L的BSA、5g/L的PVP、0.2%叠氮钠的pH8.0的50mM的Tris缓冲液）溶解沉淀，检测标识微粒的粒径和单分散性后，4℃冷藏保存。

2、制备荧光标记试剂

将20mg粒径100nm表面带羧基的荧光纳米微粒（购自Thermo Scientific公司）离心除去缓冲液中的叠氮钠，采用与步骤1一样的标记方法，把乙肝病毒E抗体标记到纳米荧光微粒上，用稀释液（含有5g/L的BSA、5g/L的PVP、0.2%叠氮钠的pH8.0的50mM的Tris缓冲液）溶解沉淀，检测标记荧光标记物的粒径和单分散性，4℃冷藏保存。

3、检测结果

以乙肝病毒E抗体PEI国际标准品为标准品，配制乙肝病毒E抗体含量分别为0.4NCU/ml、1NCU/ml2.5NCU/ml、7.5NCU/ml和16NCU/ml的校准品(编号依次为A、B、C、D和E)。首先在20μl的标识微粒中加入50微升校准品，同时加入20μl乙肝病毒E抗体的中和抗原，反应30分钟后，清洗，再加入50μl标记荧光标记物，反应30分钟后，使用本发明的流体荧光定量检测装置（微球约束腔同实施例1）检测免疫反应，结果如表2所示：

表2乙肝病毒E抗体定量检测结果

由于本实施例，采用中和抑制法，波形高度反应了采样时刻溶液中所有荧光标记物的荧光强度，波峰由标识微球聚集了高密度的荧光标记而引起分布变化所致，波峰越高说明聚集的荧光标记越多，目标检测物含量越低。

用以下公式对表2数据进行多元线性回归（参见图5）:

Log(V)=K₃×(Log(e/E))³+K₂×(Log(e/E))²+K₁×Log(e/E)+Log(C)

其中，V为目标检测物含量，K₁、K₂、K₃为免疫反应中目标检测物与荧光标记物的结合系数，C为所使用的荧光标记试剂可结合的目标检测物的最高浓度。本实施例取K₁=-3，1294，K₂=-1.6357，K₃=-0.3395，Log(C)=-1.5128。

检测实际样品时，用本发明的流体荧光定量检测装置检测样品的e和E值（光电转换电压值的和），然后代入上述计算公式，即可计算出检测样品中所含目标检测物乙肝病毒E抗体的浓度。

上述流体荧光定量检测装置中的微球约束腔还可以采用另一种更为简易的结构，如图6所示，石英管12采用圆形玻璃管，而微球约束腔11的限流口113采用夹扁的硅橡胶管（可用扁口夹将硅橡胶管夹扁）。

对上述流体荧光定量检测装置的结构稍加改变，还可以将该装置用于时间分辨荧光检测、电致化学发光检测和散射光检测等检测方法中。

如图7所示，将激发光源的照射窗口15向下移动，提前对石英管12内的溶液照射，经过行程的延时后，荧光标记物才能到达检测窗口14，延时时间可由行程或控制流速进行调节。该流体荧光定量检测装置可以应用于检测时间分辨荧光标记物，它可以提高荧光标记物的特异性，进一步降低杂质干扰荧光检测结果的可能性。

如图8所示，用激发电致化学发光电极16、17替代激发光源2和照射窗口15，则可以用于检测电致化学发光的标记物（如三联吡啶钌）受激产生的电致化学发光信号，同样可使用本发明方法达到检测目标检测物的效果。

除了通过检测标记荧光信号的波谷高度线来分辨标记微球聚集的标记荧光外，也可以通过参考其他信息进行分辨标识微球荧光信号。例如，参考微球的散射光信号，参考磁性标识微球的磁性信号，参考发光标识微球所产生另一种特异性波长的荧光信号等。如图9所示，该装置可以通过检测标识微球的散射光信号来分辨微球的荧光，区分荧光标记物的存在位置。为了获得散射光信号，需要采用外径和内径均为方形的石英管。在激发光源照射窗口15的侧向设置散射光检测窗口1，当标识微球进入到照射窗口15，会产生散射光的剧烈变化，波长为390nm的散射光通过散射光带通滤光片5后，经散射光光电转换器7转换为电信号，送至数据处理器9。连续采集T时间的散射光信号和荧光信号，如图10所示。散射光反映了微球的光特性，由于标识微球大小一致，直径较大，对比杂质颗粒，散射光信号差异明显。参考散射光信号可分辨出标识微球的是与否，进而分辨出标识微球的荧光信号和微球间隙的荧光，计算出标识微球聚集的标记荧光总量g及其占有时间T(g)、标识微球间隙的标记荧光总量G及其占用时间T(G），T(g)+T(G)=T。显然，微球聚集的标记物荧光总量e=g-G×T(g)/T(G)；溶液中的全部标记物荧光总强度E=g+G。获得e和E后，代入上述总量计算公式，即可得到目标检测物的含量。

Claims (13)

1.流体荧光定量检测装置，其特征在于，包括液体流动系统、光路系统和数据处理系统，其中：

液体流动系统包括吸液装置、石英管、微球约束腔和连接管；所述吸液装置用于抽吸溶液；所述石英管上端连接吸液装置，下端连接微球约束腔；所述微球约束腔用于使微球并列进入石英管，该微球约束腔包括有入口腔、限流口和出口腔，入口腔与连接管上端连接，出口腔与石英管下端连接，限流口为狭缝通孔，狭缝宽度小于微球在溶液中的最小自由距离；所述连接管下端浸入溶液中，用于作为液体流通的管路；

光路系统包括激发光产生装置、检测窗口、带通滤光片及光电转换器；所述激发光产生装置用于激发荧光标记物产生荧光；所述检测窗口开设在所述石英管中部，为一透光狭缝，狭缝开口方向与约束腔限流口开口方向平行；所述带通滤光片用于选择性透过所需波段的光；所述光电转换器用于将透过带通滤光片的光转换成电信号；

数据处理系统包括数据处理器和用户操作界面；所述数据处理器用于控制吸液装置和激发光产生装置，采集并处理光电转换器的光电数据；所述用户操作界面用于用户操作信息交互及输出检测结果。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述限流口的开口宽度小于石英管内径。

3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述限流口的开口宽度为20μm～2mm。

4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述检测窗口的透光狭缝宽度为0.1μm～1mm。

5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述检测窗口包括荧光检测窗口和散射光检测窗口，所述带通滤光片包括荧光带通滤光片和散射光带通滤光片，所述光电转换器包括荧光光电转换器和散射光光电转换器。

6.应用权利要求1至5任何一项所述装置定量检测流体中目标物浓度的方法，其特征在于，步骤包括：

1)将标定了可结合目标检测物总量和结合系数的荧光标记物与聚集在标识微球表面的目标检测物进行结合反应；

2)抽取步骤1)得到的混合溶液，流经微球约束腔，使标识微球在石英管内并列且匀速地通过石英管；

3)连续采集流动溶液的标记荧光信号；

4)分辨标识微球表面所聚集的标记物荧光信号；

5)在连续的检测时间段内，计算标识微球的标记荧光强度和，以及溶液的全部标记荧光强度和，根据荧光标记物所标定的可结合目标检测物总量和结合系数，利用多元线性回归公式计算出目标检测物的含量。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光标记物为粒径10nm～300nm的聚苯乙烯胶或硅烷荧光乳胶微粒。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述标识微球的直径为5～500μm。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述标识微球为单分散微球。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)，还包括连续采集流动溶液的散射光信号。

11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)，通过参考荧光信号的波峰和波谷，或参考磁性微球的磁性特征，来分辨标识微球表面所聚集的标记物荧光信号。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤4)，通过参考荧光信号的波峰和波谷，或参考磁性微球的磁性特征，或参考微球的散射光信号，来分辨标识微球表面所聚集的标记物荧光信号。

13.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤5)，标识微球的标记荧光强度和设为e，溶液的全部标记荧光强度和设为E，利用e和E的比值，消除不同仪器或检测条件下探测荧光差异引起的结果差异。