CN110614125A - 一种全血核酸检测的微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸提取、检测技术领域，尤其涉及一种全血核酸提取、扩增和检测的多腔室、多通道的微流控芯片。该芯片可实现全血样品核酸的自动化提取、扩增和检测过程。该芯片由外功能区和内功能区组成，外功能区包括纯化试剂存储单元、废液单元和扩增检测单元；内功能区包括核酸提取单元，外功能区和内功能区之间有密封圈，密封圈上的凸起式微通道可实现外功能区和内功能区的连通或封闭。芯片内部预装核酸纯化、扩增和检测试剂，可常温保存，封闭式操作，避免了样本交叉污染和扩增产物气溶胶污染。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取、检测技术领域，尤其涉及一种全血核酸提取、扩增和检测的多腔室、多通道的微流控芯片。
背景技术
全血是指未经离心、分离处理的完整血液成分，是临床检测和现场级检测的重要样本来源之一。因其成分复杂常常会对核酸纯化、检测方法产生干扰，因此针对全血样品的成分特性开发快速、高效的核酸提取、纯化试剂体系具有重要意义。常用的核酸提取、纯化方法包括酚氯仿抽提法、离心柱法、磁珠法。提取过程复杂，操作繁琐，耗时长，还可能使用有毒试剂，降低了纯化核酸的得率、纯度及操作的安全性、一致性和重复性。
微流控芯片技术是在微尺度空间下，利用高度集成的功能单元实现多步骤的生化反应过程，减少人工操作，实现样品入-结果出（Sample in- Answer out），为生物医学诊断、分析化学、生命科学等领域提供自动化解决方案。微流控芯片的优势在于减小反应体系和所需试剂用量，大幅缩短样品处理时间，全封闭的芯片-试剂体系避免交叉污染，自动化控制减少人工操作过程，提高操作的一致性。利用微流控芯片集成核酸样本提取和检测分析等过程是近年来研究的热点。目前市场上缺少集成核酸纯化、扩增检测的微流控芯片产品，现有的微流控芯片研究主要集中在科研领域，集成度较高，芯片上设计大量微阀或精密结构，加大了芯片制作工艺的复杂度，批量生产困难，成本偏高，且外部控制系统复杂。
核酸扩增分析是核酸纯化后的主要检测技术之一，包括变温扩增和等温扩增。变温扩增又称聚合酶链式反应（PCR），是最早的核酸扩增技术，通过温度循环实现特异性引物探针与模版DNA之间的变性-复性而得到指数扩增的DNA片段。等温扩增技术可以在恒定温度下实现DNA分子的指数级扩增，摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了良好的应用前景。但是，由于核酸提取过程的复杂性和扩增检测技术的灵敏性，容易产生交叉污染，尤其是气溶胶污染，导致假阳性结果。
发明内容
为了解决上述技术中的问题，本发明提供了一种全血核酸检测的微流控芯片。
该芯片由外功能区和内功能区两部分组成。
其中，外功能区包含纯化试剂存储单元、废液单元和扩增检测单元，外功能区含有限位槽，可用于固定功能。内功能区为圆形包含核酸提取单元和限位槽，核酸提取单元包含一个入口、一个出口、一个纯化室和一个U型连通管。当内功能区和外功能区发生相对转动时，纯化室的入口每次只可以连通纯化试剂存储单元的一个试剂室，纯化室的出口则与废液室相连，液体可以依次通过纯化室和废液室，U型连通管的功能是连通扩增室和废液室，在特定位置可以实现扩增室进液，旋转后可实现扩增室密封；内功能区的限位槽可以固定芯片外部辅助结构用于驱动内功能区转动。
外功能区和内功能区之间有密封圈，密封圈材质为具有弹性的硅胶或者橡胶，具有特殊的凸起结构设计，在自然状态下为开通状态，发生挤压变形时则为封闭状态。
纯化试剂存储单元包含预处理液室、样品室、洗涤液I室、洗涤液II室、脱醇液室和洗脱液室。
废液单元包括废液室，其内含有吸水材料。
扩增检测单元包含冻干试剂室、干燥剂室、扩增反应室和连通管道，冻干试剂室含有扩增反应冻干试剂，该扩增反应冻干试剂可室温长期保存，因含有探针，需要避光；冻干试剂室附近的干燥剂室含有干燥剂，用于避免扩增反应冻干试剂受潮失活。
外功能区和内功能区可以发生相对转动，转动方式包括外功能区固定，内功能区旋转、内功能区固定，外功能区旋转、二者反向同时旋转。
进一步的，芯片表面平滑，制作材料选用玻璃、硅、PMMA、环氧树脂、PTFE、PS、PC、COC、COP或PDMS的一种或多种组合。
进一步的，核酸检测方法包括PCR扩增、RT-PCR扩增、等温扩增。
进一步的，废液室与所述检测芯片外部的注射器相连，负压驱动液流。
进一步的，所述废液室内具有吸水性材料用于防止废液倒流，其材质包括海绵、吸水树脂等。
进一步的，上述芯片预置核酸纯化和扩增检测所需的反应试剂。具体试剂种类和成分如下：
1）预处理液室含有pH为6.0~7.5的预处理液，成分包括 4~6M 盐酸胍、10~100mM Tris-HCl、1~10mM EDTA、0.01~1%（v/v）Triton-X100、0.01%～0.5%（v/v）Tween20；
2）裂解液pH为6.0~7.5，成分包括 4~6M 盐酸胍、10~100mM Tris-HCl、1~10mM EDTA、0.1~1.5M 醋酸钠、0.01~1%（v/v）Triton-X100、0.01%～0.5%（v/v）Tween20；
3）洗涤液I室含有洗涤液I，成分为50%~80%（v/v）异丙醇，；
4）洗涤液II室含有洗涤液II，成分为50%~80%（v/v）乙醇；
5）脱醇液室含有pH为6.0~7.5的脱醇液，成分包括1~10mM Tris-HCl、0.1~1mM EDTA；
6）洗脱液室含有pH为8.0~9.0的洗脱液，成分包括10mM Tris-HCl、1mM EDTA；
7）冻干试剂室含有可常温保存的核酸扩增反应冻干试剂；
8）核酸提取单元的纯化室内置超顺磁磁珠。
进一步的，核酸扩增反应冻干试剂可常温保存。
进一步的，超顺磁磁珠直径为50nm～5um，且表面具有羟基修饰、羧基修饰或氨基修饰。
进一步的，纯化室内的超顺磁磁珠需要所述芯片以外的磁装置进行操作。
本发明将全血核酸的提取、扩增和检测集成在微流控芯片上。其有益效果在于：简化芯片设计，不需要复杂结构和微阀，降低了成本且易于实现大规模量产。核酸检测芯片的废液室通过废液室连通孔与外部的注射器连接，通过负压配合内功能区的旋转进行液路控制，降低外部控制系统的复杂度，易于实现自动化。芯片内部预装优化的核酸纯化、扩增和检测试剂，可常温保存，封闭式操作，避免了样本交叉污染和扩增产物气溶胶污染。
附图说明
图1为本发明一种全血核酸检测的微流控芯片密封状态结构示意图。
图2为本发明一种全血核酸检测的微流控芯片连通状态结构示意图。其中密封圈上的凸起式微通道23为连通状态，连接其余储液室的凸起式微通道均为封闭状态，例如24。
图3为本发明一种全血核酸检测的微流控芯片中密封圈的结构示意图。
图4为本发明一种全血核酸检测的微流控芯片检测结果。
其中附图标记为：1、预处理液室，2、样品室，3、洗涤液I室，4、洗涤液II室，5、脱醇液室，6、洗脱液室，7、通气孔，8、储液室管道，9、外功能区限位槽，10、废液室，11、海绵，12、废液室管道，13、扩增反应室，14、冻干试剂室，15、扩增反应室出口通道，16、废液室连通孔，17、U型连通管，18、密封圈，19、纯化室入口，20、纯化室出口，21、纯化室，22、干燥剂室，23、连通状态的凸起式微通道，24、封闭状态的凸起式微通道，25、内功能区限位槽。
具体实施方式
接下来将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是示例性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。
实施例1。
如图1所示，本发明公开的一种全血核酸检测的微流控芯片由外功能区和内功能区两部分组成。其中，外功能区为圆形，可以通过外功能区限位槽（9）进行位置固定，外功能区包含纯化试剂存储单元、废液单元和扩增检测单元。
纯化试剂存储单元依次包含预处理液室（1），样品室（2），洗涤液I室（3），洗涤液II室（4），脱醇液室（5），洗脱液室（6），每一个储液室均含有通气孔（7）用于注入试剂或与外界通气。
纯化试剂存储单元的储液室依次装有核酸纯化试剂，预处理液室（1）含有预处理液，样品室（2）用于存放含有样品的裂解液，洗涤液I室（3）含有洗涤液I，洗涤液II室（4）含有洗涤液II，脱醇液室（5）含有脱醇液，洗脱液室（6）含有洗脱液。
废液单元包含废液室（10）、废液室管道（12）和废液室连通孔（16），其中废液室（10）内含有一块海绵（11）用于吸附注入废液室的液体避免倒流。
扩增检测单元包含冻干试剂室（14）、干燥剂室（22）、扩增反应室（13）和扩增反应室出口通道（15）。其中，扩增检测单元的冻干试剂室（14）内置可常温保存的核酸扩增反应冻干试剂和特异性引物探针冻干试剂。干燥剂室（22）装有干燥剂用于避免核酸扩增反应冻干试剂和特异性引物探针冻干试剂吸湿而降低活性。
内功能区为圆形，可通过旋转实现与外功能区相应管道和腔室的连通或封闭。内功能区主要包含核酸提取单元和限位槽（25）。
核酸提取单元包含纯化室（21）、纯化室入口（19）、纯化室出口（20）和U型连通管（17），其中U型连通管（17）的功能是在特定位置连通扩增检测单元的扩增反应室出口通道（15）和废液室管道（12），以利于扩增反应液注入扩增反应室（13）。
纯化室（21）为蛇形结构，可以降低液体表面张力，有利于液体控制。
纯化室入口（19）和纯化室出口（20）呈180度角。
芯片预置核酸纯化和扩增检测所需的反应试剂。具体试剂种类和成分如下：
1）预处理液室含有pH为6.5的预处理液，成分包括 6M 盐酸胍、10mM Tris-HCl、1mMEDTA、1%（v/v）Triton-X100、0.1%（v/v）Tween20；
2）裂解液pH为6.5，成分包括 6M 盐酸胍、10mM Tris-HCl、1mM EDTA、0.3M 醋酸钠、1%（v/v）Triton-X100、0.1%（v/v）Tween20；
3）洗涤液I室含有洗涤液I，成分为80%（v/v）异丙醇，；
4）洗涤液II室含有洗涤液II，成分为70%（v/v）乙醇；
5）脱醇液室含有pH为6.5的脱醇液，成分包括10mM Tris-HCl、1mM EDTA；
6）洗脱液室含有pH为8.5的洗脱液，成分包括10mM Tris-HCl、1mM EDTA；
7）冻干试剂室的核酸扩增反应冻干试剂来源于Takara；
8）核酸提取单元的纯化室内置200nm超顺磁磁珠。
纯化室（21）内装有200nm超顺磁磁珠。其制作方法为用0.2M海藻糖，10mM Tris，1mM EDTA，ph7.5的缓冲液洗涤200nm单分散超顺磁磁珠3次；用缓冲液回溶超顺磁磁珠至终浓度25mg/ml；取50ul磁珠液注入纯化室（21）中央；65度烘干，可室温保存。
外功能区与圆形的内功能区之间有密封圈（18），密封圈上设计有凸起式微通道（23）。密封圈（18）上设计的部分凸起式微通道（23）与纯化试剂存储单元的储液室管道（8）位置对应。
密封圈（18）采用橡胶材质，注塑而成，用环氧树脂胶固定于外功能区和内功能区之间交汇处。该密封圈（18）是实现芯片液路控制的关键，其上的凸起式微通道（23）在内功能区转动过程中因挤压变形可实现外功能区和内功能区之间的封闭或连通。
上述微流控芯片表面平滑、透明，选用COC材料，芯片制作过程如下：
通过注塑法分别制作内功能区和外功能区结构部件；
利用热压封装技术分别制成内功能区和外功能区；
将橡胶材质的密封圈（18）粘在外功能区中心内侧相应位置；
将内功能区嵌入外功能区中心位置。
核酸提取纯化后进行PCR扩增反应并进行实时荧光定量检测。
上述微流控芯片的操作方法简述如下：将等体积全血加入裂解液中，充分混匀后注入样品室。密封后将芯片放在配套设备上，可自动化操作全血核酸的提取和PCR扩增过程，结果如图4所示。
上述微流控芯片的废液室（10）通过废液室连通孔（16）与芯片外部的注射器相连，利用负压驱动液流。具体操作原理是，当内功能区旋转到特定位置，内功能区的纯化室入口（19）与纯化试剂存储单元的储液室对应，此时密封圈（18）上相应的凸起式微通道（23）处于松弛状态，管道畅通。同时纯化室出口（20）与废液室管道对应。此时抽吸注射器，利用负压将储液室的试剂抽到纯化室（21）并最终进入废液室（10）。同理，当内功能区旋转到下一个特定位置，内功能区的纯化室入口（19）与纯化试剂存储单元的储液室错位，同时纯化室出口（20）与废液室管道也发生错位，导致此时密封圈（18）上相应的凸起式微通道（23）处于变形状态，管道封闭。
实施例2。
芯片结构设计及制作方法同实施例1。
芯片预置核酸纯化和扩增检测所需的反应试剂。具体试剂种类和成分如下：
1）预处理液室含有pH为6.5的预处理液，成分包括 5M 盐酸胍、10mM Tris-HCl、1mMEDTA、1%（v/v）Triton-X100、0.1%（v/v）Tween20；
2）裂解液pH为6.5，成分包括 5M 盐酸胍、10mM Tris-HCl、1mM EDTA、1M 醋酸钠、1%（v/v）Triton-X100、0.1%（v/v）Tween20；
3）洗涤液I室含有洗涤液I，成分为80%（v/v）异丙醇，；
4）洗涤液II室含有洗涤液II，成分为70%（v/v）乙醇；
5）脱醇液室含有pH为6.5的脱醇液，成分包括1mM Tris-HCl、0.1mM EDTA；
6）洗脱液室含有pH为8.5的洗脱液，成分包括10mM Tris-HCl、1mM EDTA；
7）冻干试剂室的核酸扩增反应冻干试剂来源于Takara；
8）核酸提取单元的纯化室内置500nm超顺磁磁珠。
操作方法简述如下：将等体积全血加入裂解液中，充分混匀后注入样品室。密封后将芯片放在配套设备上，可自动化操作全血核酸的提取和PCR扩增过程。
在由本发明权利要求所限定的发明实质和范围内对本发明进行细微的改变均落在本发明的保护范围内。如微流控芯片的材质、形状及尺寸，腔室的形状、尺寸，各类功能性及连接性通道的形状、尺寸等。
Claims (9)
1.一种全血核酸检测的微流控芯片，其特征在于，所述芯片由外功能区和内功能区组成；所述外功能区包含纯化试剂存储单元、废液单元和扩增检测单元；所述内功能区为圆形；所述内功能区包含核酸提取单元和限位槽；所述核酸提取单元包含一个入口、一个出口、一个纯化室和一个U型连通管；所述外功能区和内功能区之间有密封圈；所述密封圈材质为具有弹性的硅胶、橡胶；更具体的是：
所述纯化试剂存储单元包含预处理液室、样品室、洗涤液I室、洗涤液II室、脱醇液室和洗脱液室；所述废液单元包括废液室；所述废液室内含有吸水材料；
所述扩增检测单元包含冻干试剂室、干燥剂室、扩增反应室和连通管道；
所述密封圈上设计有凸起式微通道；
所述外功能区和所述内功能区可以发生相对转动；
所述相对转动包括外功能区固定，内功能区旋转、内功能区固定，外功能区旋转、二者反向同时旋转。
2.根据权利要求1所述的一种全血核酸检测的微流控芯片，其特征在于，所述芯片表面平滑，制作材料选用玻璃、硅、PMMA、环氧树脂、PTFE、PS、PC、COC、COP或PDMS的一种或多种组合。
3.根据权利要求1所述的一种全血核酸检测的微流控芯片，其特征在于，核酸检测方法包括PCR扩增、RT-PCR扩增、等温扩增。
4.根据权利要求1所述的一种全血核酸检测的微流控芯片，其特征在于，废液室与所述芯片以外的注射器相连，负压驱动液流。
5.根据权利要求1所述的一种全血核酸检测的微流控芯片，其特征在于，所述废液室内的吸水性材料包括海绵、吸水树脂。
6.根据权利要求1所述的一种全血核酸检测的微流控芯片，其特征在于，所述芯片预置核酸纯化和扩增检测所需的反应试剂；具体来说，试剂种类和成分如下：
1）所述预处理液室含有pH为6.0~7.5的预处理液，成分包括 4~6M 盐酸胍、10~100mMTris-HCl、1~10mM EDTA、0.01~1%（v/v）Triton-X100、0.01%～0.5%（v/v）Tween20；
2）裂解液pH为6.0~7.5，成分包括 4~6M 盐酸胍、10~100mM Tris-HCl、1~10mM EDTA、0.1~1.5M 醋酸钠、0.01~1%（v/v）Triton-X100、0.01%～0.5%（v/v）Tween20；
3）所述洗涤液I室含有洗涤液I，成分为50%~80%（v/v）异丙醇；
4）所述洗涤液II室含有洗涤液II，成分为50%~80%（v/v）乙醇；
5）所述脱醇液室含有pH为6.0~7.5的脱醇液，成分包括1~10mM Tris-HCl、0.1~1mMEDTA；
6）所述洗脱液室含有pH为8.0~9.0的洗脱液，成分包括10mM Tris-HCl、1mM EDTA；
7）所述冻干试剂室含有可常温保存的核酸扩增反应冻干试剂；
8）核酸提取单元的纯化室内置超顺磁磁珠。
7.根据权利要求6所述的一种全血核酸检测的微流控芯片，其特征在于，所述核酸扩增反应冻干试剂可常温保存。
8.根据权利要求6所述的一种全血核酸检测的微流控芯片，其特征在于，所述超顺磁磁珠直径为50nm～5um，且表面具有羟基修饰、羧基修饰或氨基修饰。
9.根据权利要求6所述的一种全血核酸检测的微流控芯片，其特征在于，所述的纯化室内的超顺磁磁珠需要所述芯片以外的磁装置进行操作。
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