CN220618892U - 一种微流控芯片、试剂盒以及处理装置 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种微流控芯片、试剂盒及处理装置，该微流控芯片包括基片，所述基片上设有核酸RNA提取区、反转录区以及文库构建区，核酸RNA提取区通过反转录区和文库构建区相连通；核酸RNA提取区包括第一反应池、第一储液池、第一微通道、第二微通道和电磁微阀；反转录区包括第二反应池、第二储液池、第三微通道和气动微阀；文库构建区包括第一反应池、第二反应池、第一储液池、第二储液池、第一微通道、第二微通道、第三微通道、电磁微阀和气动微阀。本实用新型的微流控芯片可以实现全血样本的核酸提取及建库，核酸RNA提取和建库在同一张芯片上并同时进行，解决了基于微流控技术的肿瘤血液样本提取和建库所需仪器大型化的问题。
Description
技术领域
本实用新型涉及微流控技术领域及医学检验的技术领域，特别是涉及一种微流控芯片、试剂盒以及处理装置。
背景技术
白血病(leukemia)是起源于造血干、祖细胞的造血系统恶性肿瘤。根据白血病细胞的分化程度和自然病程，将白血病分为急性和慢性两大类。按照主要受累的细胞系列可将急性白血病分为急性淋巴细胞白血病(acute lym-phoblastic leukemia，ALL)和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)。慢性白血病则分为慢性髓性白血病，常称为慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)、慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphocytic leukemia，CLL)及少见类型的白血病。
白血病年发病率2.71/10万，标化率为2.62/10万[95％CI 2.85～2.84/10万]。其中AML发病率为1.62/10万，ALL为0.69/10万(ph+ALL和ph样ALL占比20～30％，约0.21/10万，CML为0.36/10万，CLL为0.05/10万，特殊类型白血病为0.03/10万。Ph+ALL和CML年发病人数约＜1万人，10年存量患者＞10万人。
费城染色体指9号染色体长臂(9q34)上的原癌基因abl转位至22号染色体(22q11)上的bcr(B-cell receptor)基因重新组合成融合基因(BCR-ABL1)。在几乎全部CML，部分ALL及极少数AML中可见。
基因层面，BCR-ABL1分为3种：P190(e1a2)，P210(b2a2,b3a2),P230(e19a2)；P190存在于3％的非典型CML患者(CMML患者)和2/3ph+ALL患者，P210存在于90～95％以上的CML患者；1/3ph+ALL患者；P230存在与～1％的CML患者。
ABL1激酶区突变分析是临床选择用药和治疗方式选择的重要手段；ABL1激酶区突变目前已发现了100余种，其中T315I是比较明确的热点突变(耐药患者突变频率10～30％)。另外指南明确提及的位点包括：V299L，T315A，F317L/V/I/C，Y253H，E255K/V和F359C/V/I。
当前基于NGS技术的建库方法仍然以手工建库为主，自动化建库为辅，并且绝大部分为手工占据相当部分的半自动化建库，例如，仅仅开发自动化纯化系统或者自动化加样系统。诚然，基于微流控技术的自动化建库已经有部分单位进行了研究，不过均局限于病原微生物建库和检测；例如金匙医学的《一种基于微流控技术的mNGS建库方法》，适配的方法是基于连接法的mNGS建库方法；杰毅基因的《一种流水线核酸提取及文库制备仪器》，原理是比较大型的微流控装置，适配的方法是集成了提取后基于连接法的mNGS建库方法。然而，现在并没有适合肿瘤血液样本NGS文库构建的微流控芯片和处理装置。
目前NGS有两种主流的建库方式：一种是基于末端修复加A后连接法的建库方式，通常应用于mNGS，PCR-free或捕获建库；另一种是基于多重引物扩增的建库方式，只应用于扩增子建库。两种建库应用场景不同，适用文库类型不同；其步骤也差异很大。连接法建库主要历经1)末端修复加A；2)接头连接；3)连接产物纯化，4)文库富集以及PCR产物纯化从而获得完整文库；扩增子建库需要历经1)一轮PCR，2)PCR产物纯化，3)二轮PCR，4)文库纯化。
肿瘤全血样本与病原微生物来源的样本类型不同，样本处理方式也大相径庭：1)病原样本由于真菌的存在需要经破壁等机械或化学处理，而肿瘤全血样本并不需要经过剧烈的物理或化学方法；2)全血样本提取RNA时需要经过红细胞裂解处理，防止红细胞里含有的RNase酶降解人源RNA；而非血液来源的RNA病毒提取并不需要红细胞裂解处理；3)肿瘤全血样本背景非常干净不需要预处理即可进行提取，而痰液来源的病原微生物样本需要经NaOH等进行化痰处理等等。
因此，有必要对现有技术予以改良以克服现有技术中的所述缺陷。
实用新型内容
本实用新型主要解决的技术问题是提供一种微流控芯片、试剂盒以及处理装置，解决肿瘤全血样本RNA提取和建库不能同时进行的问题。
为解决上述技术问题，本实用新型采用的一个技术方案是：提供了一种微流控芯片，可供肿瘤血液样本RNA提取建库，其特征在于，包括基片，所述基片上设有核酸RNA提取区、反转录区以及文库构建区，所述核酸RNA提取区通过所述反转录区和所述文库构建区相连通；
所述核酸RNA提取区包括第一反应池、第一储液池、第一微通道、第二微通道和电磁微阀，所述第一反应池呈单行多列布局，多个所述第一反应池之间通过所述第一微通道连通设置，所述第一储液池分别通过所述第二微通道连通设置在所述第一反应池的一侧或相对的两侧，所述电磁微阀分别设于所述第二微通道上；
所述反转录区包括第二反应池、第二储液池、第三微通道和气动微阀，所述第二储液池通过所述第三微通道连通设置在所述第二反应池的相邻两侧，所述气动微阀分别设于所述第三微通道上；
所述文库构建区包括第一反应池、第二反应池、第一储液池、第二储液池、第一微通道、第二微通道、第三微通道、电磁微阀和气动微阀，所述第一反应池和所述第二反应池间隔相邻设置并形成单行多列布局，所述第一反应池与所述第二反应池之间通过所述第一微通道连通设置，所述第一储液池通过所述第二微通道连通设置在所述第一反应池相对的两侧，所述电磁微阀分别设于所述第二微通道上，所述第二储液池通过所述第三微通道连通设置在所述第二反应池的一侧，所述气动微阀分别设于所述第一微通道和所述第三微通道上；
其中，所述核酸RNA提取区尾端的第一反应池通过所述第二微通道与所述反转录区的第二反应池连通设置；所述反转录区的第二反应池通过所述第一微通道与所述文库构建区尾端的第二反应池连通设置。
可选的，所述核酸RNA提取区和/或所述反转录区与所述文库构建区联合工作。
可选的，所述文库构建区采用磁性微球的纯化方式。
可选的，所述微流控芯片还包括盖片和薄膜，所述盖片安装在所述基片的上端，所述薄膜位于所述盖片和所述基片之间。
可选的，所述基片、所述盖片和所述薄膜的截面形状相同，且面积尺寸相等。
可选的，所述第二反应池为PCR反应池。
可选的，所述第二反应池内安装有升降温装置。
为解决上述技术问题，本实用新型采用的另一个技术方案是：一种试剂盒，包括如上述所述的微流控芯片。
为解决上述技术问题，本实用新型采用的另一个技术方案是：一种处理装置，包括上述所述的微流控芯片。
可选的，还包括壳体以及设置在壳体内部的移液装置、电磁控制装置、气动控制装置以及升降温控制装置，所述移液装置安装在所述壳体的内顶面，所述电磁控制装置安装在所述壳体的内底面，所述气动控制装置和升降温度控制装置连接设于所述电磁控制装置的上端，所述微流控制芯片连接设于所述气动控制装置和升降温度控制装置的上端并位于所述移液装置的下方。
本实用新型的有益效果是：本实用新型提供的微流控芯片，可以实现全血样本的核酸提取及建库，基片上设有核酸RNA提取区、反转录区以及文库构建区，实现肿瘤血液样本的RNA提取和建库在同一张芯片上进行，解决提取和建库不能同时进行的问题，使RNA提取和建库同时进行，解决了目前基于微流控技术的肿瘤血液样本提取和建库所需仪器大型化的问题。
附图说明
图1是本实用新型微流控芯片的基片的结构示意图；
图2是图1中电磁微阀和气动微阀的排布示意图；
图3是本实用新型微流控芯片的剖视图；
图4是本实用新型中处理装置的剖视图；
图5是本实用新型中微流控芯片的基片实施例一的结构示意图；
附图中各部件的标记如下：100、微流控芯片；101、基片；102、盖片；103、薄膜；104、第一反应池105、第一储液池106、第一微通道107、第二微通道108、电磁微阀；109、第二反应池；110、第二储液池；111、第三微通道；112气动微阀；1011、核酸RNA提取区；1012反转录区；1013、文库构建区；
200、壳体；300、移液装置；400、电磁控制装置；500、气动控制装置；600、升降温控制装置。
具体实施方式
下面结合附图对本实用新型的较佳实施例进行详细阐述，以使本实用新型的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本实用新型的保护范围做出更为清楚明确的界定。
请参阅图1，本实施例包括：
一种微流控芯片100，可供肿瘤血液样本RNA提取建库，包括基片101，基片101上设有核酸RNA提取区1011、反转录区1012以及文库构建区1013，核酸RNA提取区1011通过反转录区1012和文库构建区1013相连通。
通过微流控芯片100可以实现全血样本的核酸提取及建库，基片101上设有核酸RNA提取区、反转录区以及文库构建区，实现肿瘤血液样本的RNA提取和建库在同一张芯片上进行，解决提取和建库不能同时进行的问题，使RNA提取和建库同时进行，解决了目前基于微流控技术的肿瘤血液样本提取和建库所需仪器大型化的问题。
其中，核酸RNA提取区1011包括第一反应池104、第一储液池105、第一微通道106、第二微通道107和电磁微阀108，第一反应池104呈单行多列布局，多个第一反应池104之间通过第一微通道106连通设置，第一储液池105分别通过第二微通道107连通设置在第一反应池104的一侧或相对的两侧，电磁微阀108分别设于第二微通道107上。
反转录区1012包括第二反应池109、第二储液池110、第三微通道111和气动微阀112，第二储液池110通过第三微通道111连通设置在第二反应池109的相邻两侧，气动微阀112分别设于第三微通道111上。
文库构建区1013包括第一反应池104、第二反应池109、第一储液池105、第二储液池110、第一微通道106、第二微通道107、第三微通道111、电磁微阀108和气动微阀112，第一反应池104和第二反应池109间隔相邻设置并形成单行多列布局，第一反应池104与第二反应池109之间通过第一微通道106连通设置，第一储液池105通过第二微通道107连通设置在第一反应池104相对的两侧，电磁微阀108分别设于第二微通道107上，第二储液池110通过第三微通道111连通设置在第二反应池109的一侧，气动微阀112分别设于第一微通道106和第三微通道111上。
其中，核酸RNA提取区1011尾端的第一反应池104通过第二微通道107与反转录区1012的第二反应池109连通设置；反转录区1012的第二反应池109通过第一微通道106与文库构建区1013尾端的第二反应池109连通设置。
核酸RNA提取区1011和/或反转录区1012与文库构建区1013联合工作，可以理解的是，核酸RNA提取区1011和反转录区1012可以单独或共同与文库构建区1013整合工作。
进一步的，文库构建区1013采用磁性微球的纯化方式，优选地，微球为Xp磁珠和/或magbio等商业化磁珠。
本实施例中，如图2所示，为本实施例中电磁微阀108和气动微阀109排布的示意图；如图3所示，微流控芯片100还包括盖片102和薄膜103，盖片102安装在基片101的上端，薄膜103位于盖片102和基片101之间。其中，基片101、盖片102和薄膜103的截面形状相同，且面积尺寸相等。薄膜103与基片101和盖片102之间相互键合，连接牢固。
上述中，第二反应池109为PCR反应池，其内安装有升降温装置(图未视)，可以有效控制反应池使用时的温度。
本实用新型还提出了一种试剂盒，包括如上述所述的微流控芯片100。还包括铝箔袋和/或滴管。该试剂盒里预装了建库所需的全部试剂。
如图4所示，本实用新型还提出了一种处理装置，包括上述所述的微流控芯片100，还包括壳体200以及设置在壳体200内部的移液装置300、电磁控制装置400、气动控制装置500以及升降温控制装置600，移液装置500安装在壳体200的内顶面，电磁控制装置400安装在壳体200的内底面，气动控制装置500和升降温度控制装置600连接设于电磁控制装置400的上端，微流控制芯片100连接设于气动控制装置500和升降温度控制装置600的上端并位于移液装置300的下方。通过该处理装置可以实现微流控芯片100的操作和产物的处理，可以实现基于Ringcap技术的肿瘤全血样本适配NGS检测的前处理(包括提取和建库)，构建完成的文库适配测序平台包括MGI和illumina。
实施例一：
参考图1，一种微流控芯片100，设有设有核酸RNA提取区1011、反转录区1012以及文库构建区1013，核酸RNA提取区1011通过反转录区1012和文库构建区1013相连通。
如图5所示，核酸RNA提取区1011包括反应池A,B,C,D,E,F；包括储液池1，3，5，7，8，10以及储液池2，4，6，9；反转录区1012包括储液池11，12和反应池I；文库构建区1013包括储液池15，16，18和反应池II,III。
微流控芯片100的工作原理：
核酸RNA提取区1011的核酸提取反应阶段：①全血样本自移液装置加样至储液池1，储液池1预装裂解液，利用气控装置驱动样本与裂解液混合并流入反应池A中，同时储液池2中的助沉剂和预装磁珠在气控装置的驱动下流入反应池A中；样本在反应池A中进行裂解和磁珠吸附反应；②储液池3预装洗涤液I，在反应池B中对吸附有RNA的磁珠进行一次洗涤，废液流往储液池6；储液池4中有无核酸酶水，第一次洗涤结束后，无核酸酶水携带核酸磁珠混合液由气控装置驱动至反应池C；储液池5预装洗涤液II，对反应池B中吸附有RNA的磁珠进行第二次洗涤，废液流往储液池6；③储液池7预分装有100ulDNaseI反应液，与上一步骤的核酸磁珠混合液在反应孔D进行反应；④储液池8预分装有洗涤液II，对上一步骤的核酸磁珠混合液在反应孔E进行洗涤，洗涤后废液流往储液池10；⑤储液池9预分装无核酸酶水，对核酸磁珠混合液进行洗涤获得RNA。电磁控制装置控制阀门开关，从而起到开关储液的目的。
反转录区1012的核酸反转录阶段：RNA样本流入PCR反应池I，储液池11预分装无核酸酶水，储液池12预分装RTbuffer和RTreagent(含生物素标记的反转录引物以及链霉亲和素磁珠)，两个储液池的反应液体与RNA样本在反应池1中发生反应，生成cDNA。电磁控制装置控制阀门开关，从而起到开关储液的目的。
文库构建区1013的文库构建阶段：①储液池13预分装多重PCR建库的引物和PCRbuffer扩增酶等mix流入PCR反应池II，与上一步骤得到的cDNA在PCR反应池II进行多重PCR扩增反应(第一轮扩增)，PCR反应池经升降温装置进行温度控制；②储液池15预分装磁珠混合液与多重PCR扩增产物进行反应，结合结束后，储液池14预分装75％乙醇对磁珠进行洗涤，洗涤后经37摄氏度干燥，废液流往储液池13，干燥后的磁珠由无核酸酶水溶解后流往反应池III；③储液池16预分装index引物和多重PCR反应mix，与携带有第一轮PCR反应产物的磁珠在反应池III进行indexPCR扩增(第二轮扩增)，PCR反应池经升降温装置进行温度控制，扩增结束后第二轮扩增产物流往反应池H；④储液池17预分装75％的无水乙醇，洗涤携带完整文库的磁珠，废液流往储液池16，经自然晾干；自然晾干后，储液池11的无核酸酶水对文库DNA分子进行洗脱，洗脱后的文库流往储液池18为最终文库。电磁控制装置控制阀门开关，从而起到开关储液和密封PCR反应池的目的。
实施例二：
参考图4，一种处理装置，包括实施例一中的微流控芯片100，还包括壳体200以及设置在壳体200内部的移液装置300、电磁控制装置400、气动控制装置500以及升降温控制装置600。
1、样本核酸提取：
样本来源：经临床确诊为BCR-ABL1(p230)型别的白血病人，并且ABL1激酶区变异的外周血血液样本10例。
取500ul样本通过移液装置加入芯片加样孔，通过电磁微阀控制和气控装置控制；样本经过反应池A进行裂解反应，经过反应池B进行结合反应，经过反应池C进行洗涤步骤；经过反应池D进行DNaseI处理；经过反应池E进行洗涤步骤，经过反应池F进行洗脱步骤；最终获得10ulRNA样本。
2、反转录与BCR-ABL1cDNA合成
10ulRNA样本经过反应池I用含生物素标记的引物进行反转录反应，经链霉亲和素磁珠特异性结合，最终获得20ulBCR-ABL1cDNA样本。
反转录程序，如下表所示：
| 温度 | 时间 |
| 25℃ | 5min |
| 42℃ | 60min |
| 70℃ | 15min |
| 4℃ | 保持 |
。
3、文库构建
20ul cDNA样本经过反应池II进行第一轮PCR反应，
第一轮PCR反应程序：
后经过反应池G进行纯化；经过反应池III进行第二轮PCR反应，
构建完整的文库，后经过反应池H获得20ul最终文库。文库经pooling后进行上机测序。
4、测序数据分析
| 样本编号 | Total reads | Mutant reads | 突变位点(氨基酸形式) |
| SABL001 | 127500 | 22500 | ABL1(F317L) |
| SABL002 | 150000 | 23701 | ABL1(T315I) |
| SABL003 | 143000 | 2560 | ABL1(Y253H) |
| SABL004 | 100000 | 234 | ABL1(E255K) |
| SABL005 | 110000 | 21 | ABL1(Y253H) |
| SABL006 | 130000 | 1003 | ABL1(F359V) |
| SABL007 | 160000 | 15230 | ABL1(T315I) |
| SABL008 | 200000 | 1260 | ABL1(Y253H) |
| SABL009 | 180000 | 17 | ABL1(E255K) |
| SABL010 | 135600 | 3500 | ABL1(T315I) |
。
本申请所涉及的样本为全血样本，所涉及的核酸为RNA。Ringcap技术所涉及的实验步骤包括4个：1)文库富集反应，2)富集产物纯化，3)文库制备反应，4)文库产物纯化。
本实用新型与现有技术相比至少具有以下优点：
1、解决扩增子建库技术没有自动化建库的微流控芯片和控制装置的问题；
2.为血液肿瘤全血样本的RNA提取和建库提供一种简单可行的微流控芯片和控制装置。
以上所述仅为本实用新型的实施例，并非因此限制本实用新型的专利范围，凡是利用本实用新型说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直线或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本实用新型的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种微流控芯片，可供肿瘤血液样本RNA提取建库，其特征在于，包括基片，所述基片上设有核酸RNA提取区、反转录区以及文库构建区，所述核酸RNA提取区通过所述反转录区和所述文库构建区相连通；
所述核酸RNA提取区包括第一反应池、第一储液池、第一微通道、第二微通道和电磁微阀，所述第一反应池呈单行多列布局，多个所述第一反应池之间通过所述第一微通道连通设置，所述第一储液池分别通过所述第二微通道连通设置在所述第一反应池的一侧或相对的两侧，所述电磁微阀分别设于所述第二微通道上；
所述反转录区包括第二反应池、第二储液池、第三微通道和气动微阀，所述第二储液池通过所述第三微通道连通设置在所述第二反应池的相邻两侧，所述气动微阀分别设于所述第三微通道上；
所述文库构建区包括第一反应池、第二反应池、第一储液池、第二储液池、第一微通道、第二微通道、第三微通道、电磁微阀和气动微阀，所述第一反应池和所述第二反应池间隔相邻设置并形成单行多列布局，所述第一反应池与所述第二反应池之间通过所述第一微通道连通设置，所述第一储液池通过所述第二微通道连通设置在所述第一反应池相对的两侧，所述电磁微阀分别设于所述第二微通道上，所述第二储液池通过所述第三微通道连通设置在所述第二反应池的一侧，所述气动微阀分别设于所述第一微通道和所述第三微通道上；
其中，所述核酸RNA提取区尾端的第一反应池通过所述第二微通道与所述反转录区的第二反应池连通设置；所述反转录区的第二反应池通过所述第一微通道与所述文库构建区尾端的第二反应池连通设置。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述核酸RNA提取区和/或所述反转录区与所述文库构建区联合工作。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述文库构建区采用磁性微球的纯化方式。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片还包括盖片和薄膜，所述盖片安装在所述基片的上端，所述薄膜位于所述盖片和所述基片之间。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述基片、所述盖片和所述薄膜的截面形状相同，且面积尺寸相等。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第二反应池为PCR反应池。
7.根据权利要求6所述的微流控芯片，其特征在于，所述第二反应池内安装有升降温装置。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-7任一项所述的微流控芯片。
9.一种处理装置，其特征在于，包括如权利要求1-7任一项所述的微流控芯片。
10.根据权利要求9所述的处理装置，其特征在于，还包括壳体以及设置在壳体内部的移液装置、电磁控制装置、气动控制装置以及升降温控制装置，所述移液装置安装在所述壳体的内顶面，所述电磁控制装置安装在所述壳体的内底面，所述气动控制装置和升降温度控制装置连接设于所述电磁控制装置的上端，所述微流控芯片连接设于所述气动控制装置和升降温度控制装置的上端并位于所述移液装置的下方。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202322176001.9U CN220618892U (zh) | 2023-08-14 | 2023-08-14 | 一种微流控芯片、试剂盒以及处理装置 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN202322176001.9U CN220618892U (zh) | 2023-08-14 | 2023-08-14 | 一种微流控芯片、试剂盒以及处理装置 |
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| CN220618892U true CN220618892U (zh) | 2024-03-19 |
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ID=90218634
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| CN (1) | CN220618892U (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118546772A (zh) * | 2024-07-29 | 2024-08-27 | 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 | 一种全自动测序文库制备系统 |
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2023
- 2023-08-14 CN CN202322176001.9U patent/CN220618892U/zh active Active
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