CN113817600A - 样品处理及检测装置及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种样品处理及检测装置,可在短时间高效完成样品例如病原体核酸的提取和扩增的全流程检测,且具有良好的安全性和便利性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,尤其是一种样品处理及检测装置。
背景技术
传染性疾病是由传染性病原感染人体引起的疾病,由于病原具有可传染性,部分传染性疾病可引发严重的后果(较高的病死率、较严重的并发症等),比如此次的新型冠状病毒感染所导致的新冠疫情,早期诊断尤为重要。由于传染性病原感染的早期多无特异性症状,传染病的早期诊断主要依靠对病原体的检测。
病原体主要包括病毒、细菌、支原体等,它们主要由核酸分子和蛋白分子(抗原)组成,这两大类分子就是病原快速检测的目标分子。其中病原的核酸分子是核酸检测的目标分子,不同病原的核酸分子并不相同,通过设计特异性的核酸片段,与病原分子进行特异性结合,通过PCR、RT-PCR、LAMP、核酸杂交等多种方式可以对病原体核酸分子进行检测。分子检测在传染病诊断、遗传疾病诊断、癌症诊断、生化指标检测以及科研服务方面具有重要作用。常规的实验室检测方法一般耗时长,步骤多,一般需要样品预处理、检测反应、结果判定等多个步骤。这些步骤需要复杂的仪器、合乎规范的实验空间以及富有经验的操作人员才能得以进行。在很多场合需要快速对目标分子进行检测,如心血管疾病的急门诊需要快速对心脏标志物进行检测;发热门诊需要快速对引起疾病的病原微生物进行鉴别。这些场合缺乏必须的设备和工作人员,难以进行复杂的实验操作。因此,急需操作简单、具有样品处理、检测及结果判读等多步骤整合的一体化解决方案。
目前病原快速鉴定的方式主要包括核酸检测和免疫学检测(抗原和/或抗体),其中核酸检测一般包括样品前处理、核酸扩增以及结果判断等步骤,而样本前处理又包括裂解病原体、把核酸吸附到固相上、洗涤杂质和从吸附固相上将核酸洗脱四个主要步骤。核酸检测全过程,这些步骤的完成不仅需要一系类试剂(离液盐、pH值缓冲液、无机盐、乙醇等核酸提取试剂、扩增试剂)和配套设备(离心机、PCR仪、自动化工作站等),而且考虑到核酸污染的可能,检测还需要特定的实验环境(严格三分区的核酸扩增实验室比如专门设计的PCR操作间)进行。另外,由于病原体的可感染性,还要考虑到生物安全问题(操作人员的安全防护和对环境可能造成的危害)。此外,一个以PCR/RT-PCR为基础的完整核酸检测所需时间一般大于1h。
为提高检测效率,发展出了一体化检测方案。常用的一体化解决方案是在联排的小试管中加入不同的液体(核酸扩增为例:样品裂解液、磁珠、洗涤液、洗脱液、扩增反应溶液)。用电磁棒在不同试管中移动,达到纯化核酸,最终进行扩增的目的。这种方法是开放系统(管盖是打开的),容易造成污染。同时由于仪器体积大,需要生物安全实验室等条件,很难实现急门诊的快速现场检测。
生物微流控芯片是在玻璃片或者有机玻璃片等材料上,通过蚀刻技术产生可供液体流动和储存的通道和样品池,通过机械力、磁力或者电压等方法使液体在微小尺寸的通道中流动,实现核酸扩增、细胞培养、乃至化学合成等功能。生物微流控芯片具有高度集成、体积小等优点,适合解决现场快速检测的难题。
但是生物微流控芯片的缺点是在微小的管道内(mm甚至更小的尺寸)液体流动受到表面张力的较大影响而难以操控。另外,微流控芯片也需要外部的泵提供动力,因此仍然是开放系统。如果想做成一体化装置又要考虑到驱动装置,很难做到小型化。
2004年,Iquum公司申请了使用软管进行PCR的专利(US6,780,617B2)。该专利用机械挤压管子的不同部位,移动管子内部液体,是液体在不同温度模块间移动,从而进行核酸扩增。随后,Iquum公司又申请了一系列与之相关的专利,均是利用可压缩膜,在外力的作用下,在不同的功能区块间移动液体。其核心为:1个可压缩的软管,分为几个区段,每个区段中含有不同的溶液。用热黏连的作用是每个区段隔开。使用机械力压缩区段,达到移动液体流动的目的。该技术的缺点:一个管子只能进行4-5种PCR,如果需要做多重荧光定量检测,只能增加管子的数量,或者增加管子的分支。
如何简化病原体核酸检测的实验操作步骤、减少检测时间和减低生物安全风险,实现“样品进、结果出”仍然是本领域技术人员目前需要解决的技术问题,也是本发明解决考虑的核心问题。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种样品处理及检测装置。
在本发明的一些实施方案中,所述装置为一种核酸提取及检测装置,所述装置包括核酸提取单元和核酸扩增单元,其中所述核酸提取单元包含微管道结构,通过活塞推动所述微管道内的液体流动。
在本发明的一些实施例中,所述溶液包括裂解液、洗涤液和洗脱液,所述不同溶液分别位于不同溶液瓶内。
在本发明的一些实施例中,所述核酸扩增单元包含PCR反应孔,所述PCR反应孔中放置有PCR反应成分,优选地,所述PCR反应成分为粉末。
在本发明的一些实施例中,所述温度控制模块包含一个或多于一个温度模块,用于不同温度的设置以实现PCR的热循环过程。
在本发明的一些实施例中,所述装置还包括检测单元,所述检测单元可对所述核酸扩增单元中的信号进行采集,优选地,所述检测单元包含荧光激发和采集装置。
在本发明的一些实施例中,所述检测单元还包含数据处理模块,可对采集到的数据进行处理后通过显示屏直接显示出来。
本发明还提供一种使用所述装置检测核酸的方法,包括:
将含有核酸的样品加入有裂解液的溶液瓶内;
吸附核酸于基质上;
用洗涤液洗涤被吸附于基质上的核酸;
用洗脱液洗脱被吸附于基质上的核酸,并导入PCR反应孔;和
将所述PCR反应孔与温度模块直接接触,进行PCR反应。
在本发明的一些实施例中,所述的方法还包括检测所述PCR反应孔的信号,并分析所述信号;优选地,所述信号为荧光信号。
[27]在本发明的一些实施例中,所述含有核酸的样品为含有病原体的样品,优选为含有病毒、衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体和真菌的样品。
在本发明的一些实施例中,所述基质为可吸附核酸的膜,优选为硅胶膜或玻璃纤维膜。
在本发明的另一些实施方案中,所述装置主要包含2部分结构:样品处理单元和检测单元,所述样品处理单元与检测单元可以是一体化结构,也可以是可操作连接的结构。
在本发明的另一些实施方案中,
所述装置用于处理免疫学检测样品,样品处理液是稀释标本,并提供免疫反应条件的溶液;缓冲液为清洗液、标记缓冲液底物反应物等。目的是清洗液和是洗涤靶标分子吸附材料如免疫磁珠上的杂质。经过清洗后的免疫磁珠在液体推动下进入检测单元。
核酸检测以及免疫学检测使用磁珠时,均可以将磁珠放置在样品处理液中。
本发明的装置还可以包含信号收集处理单元,按照预定的程序由检测模块进行信号采集,采集到的数据可通过无线(wireless)方式上传。所述信号检测单元可包含数据处理模块,对采集到的数据进行处理后通过显示屏直接显示出来。
核酸吸附材料可以是任何可以吸附核酸的材料,例如是大孔径硅胶滤膜/滤芯,或者是玻璃纤维膜,也可以是含有二氧化硅的颗粒。
核酸检测可以采样任何常规方式,例如扩增反应,可以是等温扩增,也可以是PCR或荧光定量PCR。
检测可以是单通道的,也可以是多靶标,多通道同时检测。
核酸纯化方式与扩增方式可以任意组合。
在本发明的另一些实施方案中,所述样品处理单元包括注射器(1)和主体(2);
所述主体(2)设置有一个或更多个轮状排列的溶液仓(21),所述溶液仓(21)包围形成注射器运动空腔(25),所述溶液仓(21)底部有通道(22),所述通道(22)与所述注射器运动空腔(25)的接触面设置有硅胶密封塞(23),所述通道(22)以主体底部中心为向心呈放射状排列;
所述注射器(1)朝向所述注射器运动空腔(25)的一端设置有穿刺针(16),另一端设置有推拉杆(11),所述注射器(1)还包括外壳(12);
所述注射器(1)位于所述主体(2)的中心轴线处,可相对所述主体(2)旋转;所述穿刺针(16)不位于所述注射器底面几何中心。
在本发明的另一些实施例中,所述主体(2)的底部设置有加样通道(26),与所述检测单元相连。
在本发明的另一些实施例中,所述注射器(1)靠近穿刺针(16)的针管处固定有靶标吸附材料(15),所述靶标吸附材料(15)在压力条件下允许液体通过,且所述靶标吸附材料(15)与注射器腔(17)之间无空隙,液体不能自由流通;
当有外力施加在所述推拉杆(11)底部时,所述注射器(1)向主体(2)底部运动,所述穿刺针(16)刺穿所述硅胶密封塞(23);推拉所述推拉杆(11),所述溶液仓(21)内的溶液通过所述靶标吸附材料(15),根据推拉的方向,溶液可双向通过;
向远离主体(2)方向拉所述注射器(1),使所述穿刺针(16)离开所述硅胶密封塞(23);旋转所述注射器(1),使所述穿刺针(16)移动到对应目的硅胶密封塞(23)位置,重复操作。
在本发明的另一些实施例中,所述溶液仓(21)为一个或更多个,优选为1-20个,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。所述溶液仓(21)用于容纳相同或不同的溶液。
在本发明的另一些实施例中,所述溶液仓(21)顶部设置有硅橡胶塞(24),优选地,如果存在多于一个硅橡胶塞(24),所述多于一个硅橡胶塞(24)可设置于一个硅橡胶帽(29)上,所述硅橡胶帽(29)为多于一个硅橡胶塞环状排列在一个硅胶平面上。
在本发明的另一些实施例中,所述注射器(1)还包括复位弹簧(13)和密封圈(14)。
在本发明的另一些实施例中,所述靶标吸附材料(15)为可吸附核酸的材料,优选为硅胶膜或玻璃纤维膜。
在本发明的另一些实施例中,所述靶标吸附材料(15)为可吸附蛋白的材料。
在本发明的另一些实施例中,所述靶标吸附材料(15)为滤芯形式或颗粒形式。
在本发明的另一些实施例中,所述所述靶标吸附材料(15)为颗粒形式,所述注射器(1)靠近所述穿刺针(16)处设置有滤网(18),所述滤网(18)可阻挡颗粒吸附材料进入所述穿刺针(16)。
在本发明的另一些实施例中,所述所述检测单元包括反应管(3),所述样品处理单元与所述反应管(3)之间由通道相连。
在本发明的另一些实施例中,所述所述反应管(3)预装有反应试剂,优选地,所述反应试剂包含可以用于PCR反应或等温反应的试剂。
在本发明的另一些实施例中,所述所述检测单元还包括信号采集部分。
在本发明的另一些实施例中,所述所述检测单元还包括数据处理部分,可对所述信号采集部分获得的数据进行处理后通过显示屏显示出来。
本发明的装置的特点:
利用活塞式液体瓶实现试剂的储存和在管道内移动;
利用活塞加压下中空刺针刺穿液体瓶瓶口实现液体瓶和管道联通;
使用管道内特定位置预置的膜或磁珠实现核酸的吸附、洗涤和洗脱以及免疫学反应;
通过推挤溶液实现反应溶液在不同温度区间的移动。
此外,可以通过改变液体管的排列方式,如采用左轮枪弹仓式,将液体仓(样品、洗液1、洗液2、洗脱液等)在一个圆筒中排列,将磁珠单元放到枪管的位置,通过转动样品仓实现不同液体流路的切换。一种方案是将活塞放置到盛放试剂的圆筒中间,活塞为上下移动方式,产生正负压力,可以实现液体在中心活塞和试剂圆筒之间的单向或双向流动。
本发明的装置的优点:1、利用含有活塞结构的液体瓶,解决了核酸提取试剂的储存和在管道内移动的问题。2、利用蚀刻管道来实现液体移动,解决了长距离微小通道液体流动困难的问题。3、通过管道通路上预设阀门实现液流控制,可以将洗脱的核酸溶液分配到不同的反应孔中,从而实现多个PCR反应单元的集成。4、一体化装置的配套卡盒采用聚合物材质或者金属材质,以及硅胶材质,易于加工。5、设计双温控区,扩增混合液通过在两个温控区来回移动完成扩增反应,比传统的单温控升降温方式减少扩增时间。6、信号采集装置例如荧光采集装置可以贴近PCR反应区间,充分利用荧光强度。
通过以上设计一方面实现了核酸提取的全封闭自动化,另一方面优化了核酸扩增步骤,一定程度上减少了扩增时间,并增加了可检测的信号通道,从而增加了可检测的样本数量。从整体上实现了核酸提取和扩增一体化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些内容获得其他的实施例。
图1为本发明提供的又一种样品处理和检测装置示意图。
图2为本发明提供的一种卡盒主体底面内部俯视图。
图3为本发明提供的一种卡盒主体底面仰视图示意图。
图4为本发明提供的一种硅胶平面图(A)和侧面图(B)。
图5为本发明提供的一种样品处理和检测装置的半剖面示意图。
图6为穿刺针刺入通道,使注射器腔与溶液仓通道相连通的示意图。
图7为使用磁珠形式的靶标吸附材料时,注射器头部的机构示意图。
图1至图7中的图注如下:
1:注射器
11:推拉杆
12:注射器外壳
13:复位弹簧
14:密封圈
15:靶标吸附材料
16:穿刺针
17:注射器腔
18:滤网
19:颗粒状吸附材料
2:卡盒主体
21:溶液仓
211:溶液仓底面
212:圆孔
22:通道
23:硅橡胶密封塞
24:硅橡胶塞
25:注射器运动空腔
26:加样通道
27,28:固定件
29:硅橡胶帽
3:反应管
具体实施方式
术语
除非另外说明,本文所用术语具有所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。对于本文中明确定义的术语,则该术语的含义以所述定义为准。
病原体:指能引起疾病的微生物和寄生虫的统称。其中微生物包括病毒、衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体和真菌等。本文中主要指引起人类疾病的病原体。
核酸:是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称,它是一类生物聚合物,是所有生物分子中最重要的物质,广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。
核酸提取:本专利中是指利用试剂和相应设备,通过不同方法从病原体中提取核酸的过程。
核酸扩增:是指通过酶的作用对特定的核酸序列进行扩增。
引物:是人工合成的两小段核苷酸序列,该序列可以和待扩增的目的核酸片段单链进行特异性结合。在PCR反应中,可以根据已知一段目的基因的核苷酸序列设计并合成引物,在PCR扩增过程中,目的核酸片段受热变性后解链为单链,降温后引物与单链相应互补序列结合,然后在聚合酶作用下进行延伸,如此重复循环。
靶标吸附材料,指能特异性吸附靶标的基质。所述靶标可以是例如核酸、蛋白等;所述基质可以是膜、磁珠、胶体等形式。
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
在本发明的另一些实施方案中,所述样品处理和检测装置为轮状结构。
图1示本发明的一个实施例的样品处理和检测装置,所述装置为一种卡盒,包括样品处理单元和检测单元,可用于核酸的提取及PCR检测。在本实施例中,所述卡盒(I)包括作为样品处理单元的核酸提取部分(II),作为检测单元的反应部分(III),可用于核酸的纯化和扩增。
所述核酸提取部分(II)由注射器(1)、带有一个或更多个轮状排列的溶液仓(21)和通道(22)的主体(2)、用于密封通道(22)与注射器运动空腔(25)接触面的硅胶密封塞(23)、用于密封溶液仓(21)顶部的硅橡胶塞(24)、加样通道(26)反应管(3)等部分组成。
注射器由能够进行活塞运动的推拉杆(11)、注射器外壳(12)、注射器复位弹簧(13)、注射器密封圈(14)、靶标吸附材料(15)、注射器穿刺针(16)组成。其中,穿刺针(16)并不位于注射器底面几何中心,而是位于以几何中心为原点的放射线上,当注射器相对于卡盒主体(2)旋转时,注射器穿刺针(16)会在卡盒主体的底面上做圆弧运动。卡盒主体(2)包括1个或更多个中空的圆筒状溶液仓(21),溶液仓之间轴向平行,并与卡盒长轴平行,呈轮状排列,中间中空,形成注射器运动空腔(25)。所述注射器运动空腔(25)用于插入注射器(1),注射器外套一个硅胶密封圈(14),密封圈(14)将注射器前端(包括穿刺针(16)部分)和卡盒中空结构封闭,使注射器前端与外界隔离,达到避免污染的目的。
溶液仓(21)可以是1个或更多个,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个,用于盛放裂解液、清洗液、洗脱液等用于核酸纯化以及扩增反应的溶液。溶液仓(21)底部为锥形并有通道(22),向下与横向通道相通,横向通道以卡盒底部中心为向心且呈放射状排列。通道向心方向垂直向上,在与注射器运动空腔(25)底部接触面开口,开口中心与注射器穿刺针(16)旋转轨迹重合。通道开口用硅橡胶塞(23)密封。
以有6个溶液仓的卡盒主体为例,卡盒主体底面内部俯视图参见图2。溶液仓底面(211)与试剂桶相对应的位置上有六个圆孔(212),圆孔垂直向下,与水平分布的六个呈放射状的通道相连,通道延伸至试剂桶下方时,垂直向上,与试剂桶相连。六个通道中的5个与试剂仓相连,一个与位于中心的垂直向下孔相连,此孔为连接扩增管的加样孔。
卡盒主体底面仰视图参见图3。卡盒底部有两个直径不同的短圆柱体固定件(27,28),用于将卡盒放置到一体机上定位用。在一体机卡盒固定位置,有两个不同直径的圆形坑,分别对应于卡盒上两个定位圆柱。
溶液仓(21)顶部有开口,开口处设置有硅橡胶塞(24),对应于不同溶液仓的不同硅胶密封塞可设置于一个硅橡胶帽(29)上(图4),硅胶帽为一平面加六个中空硅胶柱结构,中空柱子位置与卡盒主体底面上6个开口相对应。硅胶帽起到密封溶液仓的目的。在本发明的一个实施例中,溶液仓(21)顶部的开口可以用可过滤气溶胶的滤芯堵塞,滤芯作用是保证空气可以流通,仓内外气压一致,但是不容许气溶胶通过,以避免污染。
图5示本发明的一个实施例的样品处理和检测装置的半刨面图。注射器旋转到某一个角度时,穿刺针(16)与下方的圆孔对准,通过下压注射器,穿刺针(16)刺穿硅胶帽,注射器与试剂仓联通,通过抽拉、下压注射器活塞杆,产生负压和正压,驱动试剂仓中溶液,或者注射器中溶液在注射器和溶液仓之间流动,流动可以是单向的也可以是往复式的。
核酸提取部分是由抽吸液体的注射器以及数个盛放不同溶液成分的溶液舱室组成。注射器有筒壁、活塞、拉杆等部分组成。在注射器的底部,装配有可以吸附核酸的材料,如含有二氧化硅成分的滤膜、滤芯;或者装有可以阻挡核酸纯化用磁珠或者玻璃珠通过的滤膜。注射器可以通过转动、摆动等方式,将尖端对准溶液仓的密封盖。注射器中活塞通过上下移动实现吸取及排出液体的功能。注射器可以整体平行与注射器轴向移动,注射器尖端在不同溶液仓的密封盖进行穿刺,完成注射器与溶液仓联通,通过注射器的吸排,完成液体在注射器和溶液仓之间的来回移动,实现溶液混匀、过滤、洗涤等功能。核酸纯化过程中,注射器首先穿刺到盛放有裂解液和标本的溶液仓,通过上下移动活塞,引导溶液通过核酸吸附材料,同时完成溶液混匀。另外几个溶液仓中分别盛放有洗涤液、核酸洗脱液、以及核酸扩增所需的溶液等。溶液仓可以围绕注射器排列,也可以在一个平面上顺序排列,也可以分组排列。溶液仓围绕注射器排列时,溶液出口环形排列,出口由硅胶等材质密封。注射器安置在卡盒内部圆筒的偏心轴上,通过注射器在偏心轴上的旋转,将穿刺针(16)定位在不同溶液仓出口处;或者将注射器穿刺针(16)置于注射器底部平面圆心以外的位置,注射器在卡盒内部同轴上,旋转注射器时,实现穿刺针(16)在不同溶液仓出口处定位。
本发明装置的检测单元可以是核酸扩增部分,包括可来回推动的扩增区、温度控制模块和荧光检测模块。洗脱后的核酸分子进入扩增区,与在此区域预置的扩增干粉混合并充分溶解,然后按照预定的程序进行扩增反应,由温度控制模块提供合适的温度及反应时间,并按照预定的程序由荧光检测模块进行荧光信号采集。采集到的数据以简要的方式进行显示并可通过蓝牙方式上传。
在一个实施例中,加样通道(26)和扩增管(3)与一体化仪器温度控制模块相对应。当卡盒放置到一体化仪器上时,扩增管与温控模块充分接触。每个样品仓开口用中间开口的硅胶膜覆盖,硅胶膜上开口用可以过滤气溶胶的滤芯堵塞。滤芯左右是保证空气可以流通,样品仓内外气压一致,但是不容许气溶胶通过,以避免污染。
以上装置的优点:
1、利用注射器旋转定位,穿刺不同的溶液仓,实现不同溶液的切换,避免使用微小的流路和阀门,结构简单、可靠。
2、利用注射器抽拉产生的正负压力来实现液体移动,解决了长距离微小通道液体流动困难的问题。
3、将核酸吸附材料固定在注射器底部,使液体流动与核酸吸附、洗涤杂质等过程同步完成。设计简单,可靠。
4、注射器同时可以作为移液装置,进行精确的溶液吸取和转移,也可以作为混匀装置,进行不容组份的混合和配置。
5、卡盒将溶液仓作为圆环状排列,充分利用了空间,整体体积小。
6、通过以上设计一方面实现了核酸提取的全封闭自动化,另一方面优化了核酸扩增步骤,一定程度上减少了扩增时间,并增加了可检测的荧光通道,从而增加了可检测的病原体数量。整体实现了病原体核酸提取和扩增一体化。
实施例1:荧光定量PCR
以带有6个溶液仓(21)的卡盒为例,在卡盒1-3号溶液仓中分别盛放有500微升裂解液、800微升洗液1、800微升洗液2,4号溶液仓不放任何试剂或溶液,5号溶液仓中放置200微升洗脱液。扩增管中加入含有新冠病毒荧光定量PCR反应体系。
实验过程
1)加样:将蘸有标本的鼻咽拭子插入到1号溶液仓中,搅动10秒钟,然后折断,盖好盖子。或者将鼻咽拭子取出后,丢弃到垃圾袋中,按照生物安全相关程序处理。或者加入200微升样品液,盖好盖子。
2)吸附核酸:注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准1号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),裂解液在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料;抽拉10次后,注射器(1)下压,将所有液体打回1号溶液仓。
3)洗涤杂质:注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准2号管对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),洗液1在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料;抽拉10次后,注射器(1)下压,将所有液体打回2号溶液仓。
4)洗涤杂质:注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准3号管对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),洗液2在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料;抽拉10次后,注射器(1)下压,将所有液体打回3号溶液仓。
5)干燥核酸吸附材料:注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准4号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),4号溶液仓为空管,空气在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料,目的是将残留的洗液2挥发到空气中,使核酸吸附材料干燥。
6)洗脱核酸:注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准5号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),TE溶液在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料,吸附材料上的核酸被洗脱到TE溶液中;抽拉10次后,注射器(1)不下压,所有液体保持在注射器(1)中。
7)加样:注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准6号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,下压推拉杆(11),含有核酸的TE溶液在压力驱动下,通过中心沟道,进入核酸扩增管,TE溶液与配置好的荧光PCR反应体系混合,完成加样。
8)扩增检测:控制温度模块,执行以下程序:逆转录(50摄氏度10分钟);预变性(95摄氏度60秒);扩增反应(95摄氏度10秒,65摄氏度10秒,65摄氏度采集荧光,40个循环)。
实施例2:预混合新冠病毒核酸荧光定量PCR
在卡盒1-3号溶液仓(21)中分别盛放有500微升裂解液(成分)、800微升洗液1、800微升洗液2,4号溶液仓中放置200微升洗脱液,5号溶液仓放置新冠病毒扩增反应体系冻干粉。扩增管为空管。
实验过程
1)加样,将蘸有标本的鼻咽拭子插入到1号溶液仓中,搅动10秒钟,然后折断,盖好盖子。或者将鼻咽拭子取出后,丢弃到垃圾袋中,按照生物安全相关程序处理。或者加入200微升样品液,盖好盖子。
2)吸附核酸,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准1号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),裂解液在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料;抽拉10次后,注射器(1)下压,将所有液体打回1号溶液仓。
3)洗涤杂质,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准2号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),洗液1在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料;抽拉10次后,注射器(1)下压,将所有液体打回2号溶液仓。
4)洗涤杂质,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准3号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),洗液2在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料;抽拉10次后,注射器(1)下压,将所有液体打回3号溶液仓。
5)干燥核酸吸附材料,提起注射器(1),将穿刺针(16)悬停在注射器(1)运动空腔(25)内,抽拉、下压推拉杆(11),空气在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料,将核酸吸附材料中残存的洗液2排到注射器(1)运动空腔(25)内的空气中,使核酸吸附材料干燥。
6)洗脱核酸,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准4号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),TE溶液在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料,吸附材料上的核酸被洗脱到TE溶液中;抽拉10次后,注射器(1)不下压,所有液体保持在注射器(1)中。
7)混匀反应体系,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准5号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,下压推拉杆(11),含有核酸的TE溶液在压力驱动下,通过溶液仓(21)流路,TE溶液与配置好的荧光PCR反应体系混合,反复抽拉推拉杆(11)杆,将TE和反应体系充分混匀。
8)加样,提起注射器(1),旋转,将穿刺针(16)对准6号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,下压推拉杆(11),含有混合好的反应体系,通过流路通道,进入核酸扩增管,完成加样。
9)扩增检测,控制温度模块,执行以下程序:逆转录(50摄氏度10分钟);预变性(95摄氏度60秒);扩增反应(95摄氏度10秒,65摄氏度10秒,65摄氏度采集荧光,40个循环)。
实施例3:预混合新冠病毒核酸等温扩增实验
在卡盒1-3号溶液仓(21)中分别盛放有500微升裂解液、800微升洗液1、800微升洗液2,4号溶液仓(21)中放置200微升洗脱液,5号溶液仓(21)放置新冠病毒等温扩增反应体系复溶液。扩增管为等温扩增体系冻干粉。
实验过程
1)加样,将蘸有标本的鼻咽拭子插入到1号溶液仓中,搅动10秒钟,然后折断,盖好盖子。或者将鼻咽拭子取出后,丢弃到垃圾袋中,按照生物安全相关程序处理。或者加入200微升样品液,盖好盖子。
2)吸附核酸,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准1号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),裂解液在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料;抽拉10次后,注射器(1)下压,将所有液体打回1号溶液仓。
3)洗涤杂质,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准2号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),洗液1在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料;抽拉10次后,注射器(1)下压,将所有液体打回2号溶液仓。
4)洗涤杂质,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准3号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),洗液2在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料;抽拉10次后,注射器(1)下压,将所有液体打回3号溶液仓。
5)干燥核酸吸附材料,提起注射器(1),将穿刺针(16)悬停在注射器(1)客体内,抽拉、下压推拉杆(11),空气在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料,将核酸吸附材料中残存的洗液2排到注射器(1)壳体内的空气中,使核酸吸附材料干燥。
6)洗脱核酸,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准4号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),TE溶液在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料,吸附材料上的核酸被洗脱到TE溶液中;抽拉10次后,注射器(1)不下压,所有液体保持在注射器(1)中。
7)混匀反应体系,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准5号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,下压推拉杆(11),含有核酸的TE溶液在压力驱动下,通过溶液仓(21)流路,TE溶液与配置好的等温扩增反应体系复溶液混合,反复抽拉推拉杆(11)杆,将TE和复溶液充分混匀。
8)加样,提起注射器(1),旋转,将穿刺针(16)对准6号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,下压推拉杆(11),含有混合好的复溶液体系,通过流路通道,进入预装有等温扩张冻干粉的扩增管,完成加样。
9)扩增检测,控制温度模块,执行以下程序:39摄氏度10分钟,采集荧光)。
核酸吸附材料可以是大孔径硅胶滤膜/滤芯,也可以是颗粒状吸附材料(19),例如含有二氧化硅的颗粒。当使用二氧化硅颗粒时,在注射器(1)底部与穿刺针(16)连接部位使用滤网,以阻挡颗粒通过,参见图7。
实施例4使用大孔径硅胶滤膜/滤芯进行核酸纯化,新冠病毒荧光定量PCR检测
在卡盒1-3号溶液仓(21)中分别盛放有500微升裂解液、800微升洗液1、800微升洗液2,4号溶液仓(21)不放任何试剂或溶液,5号溶液仓(21)中放置200微升洗脱液。扩增管中加入含有新冠病毒荧光定量PCR反应体系。注射器(1)底部圆柱内装入直径与圆柱内径相同的大孔径硅胶滤芯或者大孔径硅胶滤膜,采用滤膜时需要在圆柱体预先装入用于固定滤膜的卡环。
试剂配方:
裂解液:4M异硫氰酸胍,0.5%NP40,50mM Tris.Cl pH5.5,10mM EDTA;
洗液1:含有乙醇或异丙醇的缓冲溶液,成分一般为10mM Tris-HCl pH 7.5,80%乙醇
洗液2:含有更高浓度的乙醇或者异丙醇,成分一般为100乙醇
不使用乙醇或者异丙醇等溶剂等洗液配方:
洗脱液:TE溶液,成分为10mM Tris,0.1mM的EDTA,pH 8.5
1)加样,将蘸有标本的鼻咽拭子插入到1号溶液仓中,搅动10秒钟,然后折断,盖好盖子。或者将鼻咽拭子取出后,丢弃到垃圾袋中,按照生物安全相关程序处理。或者加入200微升样品液,盖好盖子。
2)吸附核酸,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准1号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),裂解液在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料;抽拉10次后,注射器(1)下压,将所有液体打回1号溶液仓。
3)洗涤杂质,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准2号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),洗液1在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料;抽拉10次后,注射器(1)下压,将所有液体打回2号溶液仓。
4)洗涤杂质,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准3号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),洗液2在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料;抽拉10次后,注射器(1)下压,将所有液体打回3号溶液仓。
5)干燥核酸吸附材料,提起注射器(1),将穿刺针(16)悬停在注射器(1)运动空腔(25)内,抽拉、下压推拉杆(11),空气在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料,将核酸吸附材料中残存的洗液2排到注射器(1)运动空腔(25)内的空气中,使核酸吸附材料干燥。
6)洗脱核酸,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准4号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,抽拉、下压推拉杆(11),TE溶液在压力驱动下,反复通过固定在注射器(1)底部的核酸吸附材料,吸附材料上的核酸被洗脱到TE溶液中;抽拉10次后,注射器(1)不下压,所有液体保持在注射器(1)中。
7)混匀反应体系,注射器(1)旋转,将穿刺针(16)对准5号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,下压推拉杆(11),含有核酸的TE溶液在压力驱动下,通过溶液仓(21)流路,TE溶液与配置好的荧光PCR反应体系混合,反复抽拉推拉杆(11)杆,将TE和反应体系充分混匀。
8)加样,提起注射器(1),旋转,将穿刺针(16)对准6号溶液仓对应的硅橡胶帽,下压注射器(1),刺穿硅橡胶帽,下压推拉杆(11),含有混合好的反应体系,通过流路通道,进入核酸扩增管,完成加样。
9)扩增检测,控制温度模块,执行以下程序:逆转录(补充时间和温度);预变性(补充时间和温度);扩增反应(95摄氏度10秒,65摄氏度10秒,65摄氏度采集荧光,40个循环)。
实施例5:使用二氧化硅颗粒进行核酸纯化,新冠病毒荧光定量PCR检测
在本实施例的装置中,所述靶标吸附材料(008)为颗粒形式,所述注射器(1)(1)靠近所述穿刺针(16)处设置有滤网(18),所述滤网(18)可阻挡颗粒吸附材料进入所述穿刺针(16),参见图7。
其它实验操作类似实施例4。
以上对本发明所提供的样品处理和检测装置进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (16)
1.一种样品处理及检测装置,所述装置包括样品处理单元和检测单元,其中所述样品处理单元包含活塞结构,通过所述活塞结构推动液体流动。
2.权利要求1所述的装置,其中所述样品处理单元包括注射器(1)和主体(2);
所述主体(2)设置有一个或更多个轮状排列的溶液仓(21),所述溶液仓(21)包围形成注射器运动空腔(25),所述溶液仓(21)底部有通道(22),所述通道(22)与所述注射器运动空腔(25)的接触面设置有硅胶密封塞(23),所述通道(22)以主体底部中心为向心呈放射状排列;
所述注射器(1)朝向所述注射器运动空腔(25)的一端设置有穿刺针(16),另一端设置有推拉杆(11),所述注射器(1)还包括外壳(12);
所述注射器(1)位于所述主体(2)的中心轴线处,可相对所述主体(2)旋转;所述穿刺针(16)不位于所述注射器底面几何中心。
3.权利要求2所述的装置,其中所述主体(2)的底部设置有加样通道(26),与所述检测单元相连。
4.权利要求2或3所述的装置,其中所述注射器(1)靠近穿刺针(16)的针管处固定有靶标吸附材料(15),所述靶标吸附材料(15)在压力条件下允许液体通过,且所述靶标吸附材料(15)与注射器腔(17)之间无空隙,液体不能自由流通;
当有外力施加在所述推拉杆(11)底部时,所述注射器(1)向主体(2)底部运动,所述穿刺针(16)刺穿所述硅胶密封塞(23);推拉所述推拉杆(11),所述溶液仓(21)内的溶液通过所述靶标吸附材料(15),根据推拉的方向,溶液可双向通过;
向远离主体(2)方向拉所述注射器(1),使所述穿刺针(16)离开所述硅胶密封塞(23);旋转所述注射器(1),使所述穿刺针(16)移动到对应目的硅胶密封塞(23)位置,重复操作。
5.权利要求2至4任一项所述的装置,其中所述溶液仓(21)为一个或更多个,优选为1-20个,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。
6.权利要求2至5任一项所述的装置,其中所述溶液仓(21)用于容纳相同或不同的溶液。
7.权利要求2至6任一项所述的装置,其中所述溶液仓(21)顶部设置有硅橡胶塞(24),优选地,如果存在多于一个硅橡胶塞(24),所述多于一个硅橡胶塞(24)可设置于一个硅橡胶帽(29)上,所述硅橡胶帽(29)为多于一个硅橡胶塞环状排列在一个硅胶平面上。
8.权利要求2至6任一项所述的装置,其中所述注射器(1)还包括复位弹簧(13)和密封圈(14)。
9.权利要求2至8任一项所述的装置,其中所述靶标吸附材料(15)为可吸附核酸的材料,优选为硅胶膜或玻璃纤维膜。
10.权利要求2至9任一项所述的装置,其中所述靶标吸附材料(15)为可吸附蛋白的材料。
11.权利要求2至9任一项所述的装置,其中所述靶标吸附材料(15)为滤芯形式或颗粒形式。
12.权利要求11所述的装置,其中所述靶标吸附材料(15)为颗粒形式,所述注射器(1)靠近所述穿刺针(16)处设置有滤网(18),所述滤网(18)可阻挡颗粒吸附材料进入所述穿刺针(16)。
13.权利要求2至12任一项所述的装置,其中所述检测单元包括反应管(3),所述样品处理单元与所述反应管(3)之间由通道相连。
14.权利要求13所述的装置,其中所述反应管(3)预装有反应试剂,优选地,所述反应试剂包含可以用于PCR反应或等温反应的试剂。
15.权利要求2至14任一项所述的装置,其中所述检测单元还包括信号采集部分。
16.权利要求15所述的装置,其中所述检测单元还包括数据处理部分,可对所述信号采集部分获得的数据进行处理后通过显示屏显示出来。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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