CN111592971A - 一种用于核酸检测的微流控芯片及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于核酸检测的微流控芯片及方法。一种用于核酸检测的微流控芯片，包括：提取纯化单元，其用于对生物样本中的核酸分子进行提取和纯化；第一扩增区，其用于对核酸分子进行第一轮扩增，所述第一扩增区能够和所述提取纯化单元连通；多个第二扩增区，其用于对第一轮扩增后的核酸分子进行巢式扩增，各所述第二扩增区能够和所述第一扩增区连通；及定量分配装置，其用于将所述第一扩增区中的微流体定量划分并分配给各所述第二扩增区。本发明实现了生物样本的高通量核酸分析检测。

Description

一种用于核酸检测的微流控芯片及方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种用于核酸检测的微流控芯片及方法。

背景技术

在实验室环境下进行核酸分析检测，存在检测时间长、需要专业人员操作等问题，难以满足对生物样本中的核酸分子进行现场、快速、便携化的检测需要。近几年发展起来的微流控芯片技术，不仅能够极大地缩短检测时间，同时还具有检测通量大、自动化程度高、非专业人员使用等优点，有望在核酸分析检测领域获得广泛的应用。

将微流控芯片技术与核酸检测技术结合起来，开发用于生物样本高通量、全自动核酸分析检测的微流控芯片，为快速确诊病原微生物提供一种简单、快速、有效的解决方案，对于疾病的治疗和预后具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于核酸检测的微流控芯片及方法，实现了生物样本的高通量核酸分析检测。

本发明一方面提供一种用于核酸检测的微流控芯片，包括：

提取纯化单元，其用于对生物样本中的核酸分子进行提取和纯化；

第一扩增区，其用于对核酸分子进行第一轮扩增，所述第一扩增区能够和所述提取纯化单元连通；

多个第二扩增区，其用于对第一轮扩增后的核酸分子进行巢式扩增，各所述第二扩增区能够和所述第一扩增区连通；及

定量分配装置，其用于将所述第一扩增区中的微流体定量划分并分配给各所述第二扩增区。

根据本发明的一个优选方面，所述定量分配装置设置于用于连通所述第一扩增区和所述第二扩增区的微通道中。

根据本发明的一个优选方面，所述定量分配装置包括多个定量分配单元，每个定量分配单元对应一个所述第二扩增区。

更优选地，第一个定量分配单元包括活动设置的第一定量盘，所述第一定量盘具有内腔及分别与所述内腔连通的进液口和出液口，所述第一扩增区和所述第一个定量分配单元之间设置有第一微通道，所述第一个定量分配单元和第二个定量分配单元之间设置有第二微通道，所述第一定量盘具有第一位置和第二位置，当所述第一定量盘在第一位置时，所述第一定量盘的所述进液口和所述第一微通道连通，所述出液口和所述第二微通道连通；当所述第一定量盘在第二位置时，所述第一定量盘的所述进液口脱离所述第一微通道，所述出液口和第一个第二扩增区连通。

进一步地，第n个定量分配单元包括活动设置的第n定量盘，n为大于1且小于N的正整数，N为所述定量分配单元的总数且等于所述第二扩增区的总数，所述第n定量盘具有内腔、及分别与所述内腔连通的进液口和出液口，第n个定量分配单元和第n-1个定量分配单元之间设置有第n微通道，第n个定量分配单元和第n+1个定量分配单元之间设置有第n+1微通道，第n定量盘具有第一位置和第二位置，当第n定量盘在第一位置时，第n定量盘的所述进液口和所述第n微通道连通，所述出液口和所述第n+1微通道连通；当第n定量盘在第二位置时，第n定量盘的所述进液口脱离所述第n微通道，所述出液口和第n个第二扩增区连通。

更进一步地，第N个定量分配单元包括活动设置的第N定量盘，所述第N定量盘具有内腔、及分别与所述内腔连通的进液口和出液口；所述定量分配装置还包括指示区，所述第N个定量分配单元和所述指示区之间设置有指示区微通道；所述第N定量盘具有第一位置和第二位置，当所述第N定量盘在第一位置时，所述第N定量盘的所述进液口和第N微通道连通，所述出液口和所述指示区微通道连通；当所述第N定量盘在第二位置时，所述第N定量盘的所述进液口脱离所述第N微通道，所述出液口和第N个第二扩增区连通。

可选地，所述微流控芯片包括通道层，定量盘能够转动地设置于通道层中。

可选地，所述定量盘具有多次折弯形成的盘管，所述内腔由所述盘管的管腔形成。

进一步地，每个所述定量分配单元包括气压阀，当定量盘在第二位置时，所述进液口和相应的所述气压阀连通。

进一步地，各定量盘同步处于第一位置或同步处于第二位置。

根据本发明的一个优选方面，所述第二扩增区中存储有引物，不同的所述第二扩增区中的所述引物相同或不同；所述第二扩增区中存储有扩增试剂，或所述微流控芯片还包括和所述第二扩增区连通的用于向所述第二扩增区中加入扩增试剂的补液孔。

根据本发明的一个优选方面，所述提取纯化单元包括：

样本区，其用于加入样本；

多个试剂储存区，其用于存放提取纯化用的试剂，每个所述试剂储存区和所述样本区之间分别设置有一个试剂微通道；及

微通道开关，其用于切换各所述试剂微通道的开闭。

更优选地，所述微通道开关包括能够上下移动的开关活塞，所述开关活塞包括活塞本体及设置于所述活塞本体上的多个通孔，每个通孔对应一个所述试剂微通道，所述多个通孔的高度不相同，每个所述试剂微通道具有用于与相应的所述通孔对齐相接的微通道出口，当一个或若干个所述试剂微通道的所述微通道出口和相应的所述通孔相接时，其余的所述试剂微通道的所述微通道出口被所述活塞本体阻断。

更优选地，所述多个试剂储存区包括裂解试剂储存区、漂洗试剂A储存区、漂洗试剂B储存区及洗脱试剂储存区。

更优选地，每个所述试剂储存区中设置有加液活塞。

更优选地，所述提取纯化单元还包括设置于所述样本区中的能够吸附核酸物质的磁珠及用于控制所述磁珠的磁性组件。

根据本发明的一个优选方面，所述第一扩增区中存储有第一轮核酸扩增所需的扩增试剂，或所述微流控芯片还包括和所述第一扩增区连通的用于向所述第一扩增区中加入扩增试剂的补液孔。

根据本发明的一个优选方面，所述微流控芯片还包括设置于所述第一扩增区和所述第二扩增区之间的试剂缓冲区。

更优选地，所述微流控芯片还包括和所述试剂缓冲区连通的用于向所述试剂缓冲区中加入扩增试剂的补液孔。

根据本发明的一个优选方面，所述微流控芯片还包括用于接收所述提取纯化单元排出的废液的废液区。

更优选地，所述废液区中设置有负压接口；和/或，所述废液区和所述提取纯化单元之间设置有废液转移通道，所述废液转移通道上设置有控制开闭的废液转移开关。

根据本发明的一个优选方面，所述提取纯化单元和所述第一扩增区之间设置有液流通道，所述液流通道上设置有控制开闭的核酸转移开关。

根据本发明的一个优选方面，所述微流控芯片包括通道层及固定于所述通道层上方的盖板层，所述第一扩增区和所述第二扩增区分别为设于所述通道层中的腔室。

更优选地，所述通道层中还设置有加样区和试剂储存区；和/或，所述盖板层中设置有能够上下移动的加液活塞、开关活塞或气压阀。

更优选地，所述通道层及所述盖板层的厚度分别为1～20mm。

本发明第二个方面提供一种用于核酸检测的方法，采用如上所述的微流控芯片，所述方法包括如下步骤：

A、向提取纯化单元的样本区中加入生物样本，依次加入提取纯化试剂，对生物样本中的核酸分子进行提取纯化；

B、将提取纯化单元中的核酸分子转移至第一扩增区，与第一扩增区预存的扩增试剂或向第一扩增区加入扩增试剂进行反应以进行第一轮扩增；

C、使第一扩增区的微流体通过定量分配装置而均匀或非均匀地定量分配至多个第二扩增区中，分别与各第二扩增区中预存的扩增试剂或向各第二扩增区中加入扩增试剂进行巢式扩增，读取第二扩增区中的荧光信号进行检测。

本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：

本发明的微流控芯片是一种集成化的多通道微流控芯片，芯片上不仅集成了核酸提取、纯化、扩增等一系列功能，还实现多通道的检测需求，同时还具有操作过程简单、试剂消耗量低、分析速度快等特点，特别适合于生物样本的高通量、全自动核酸分析检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是根据本发明实施例的一种微流控芯片的正面示意图；

图2是根据本发明实施例的一种开关活塞的结构示意图；

图3是根据本发明实施例的一种定量盘的结构示意图；

图4是根据本发明实施例的定量划分溶液的示意图；

图5是根据本发明实施例的第二扩增区进样示意图。

其中，

1、提取纯化单元；11、样本区；12、试剂储存区；12a、裂解试剂储存区；12b、漂洗试剂A储存区；12c、漂洗试剂B储存区；12d、洗脱试剂储存区；13、试剂微通道；14、加液活塞；15、开关活塞；151、活塞本体；152、通孔；

2、废液区；21、废液转移开关；22、负压接口；

3、第一扩增区；32、第一补液孔；33、气压阀I；34、核酸转移开关；

4、试剂缓冲区；41、气压阀II；42、第二补液孔；43、气压阀III；

5、第二扩增区；51、通气孔；

6、定量分配装置；60、定量分配单元；61、定量盘；611、盘管；61a、第一定量盘；61b、第二定量盘；62a、第一微通道；62b、第二微通道；62c、第三微通道；63、指示区；64、指示区微通道；65a、气压阀IV；65b、气压阀V；65c、气压阀VI；65d、气压阀VII；65e、气压阀VIII；65f、气压阀VIIII；65g、气压阀X；

102、盖板层；103、定位孔。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。

如本说明书和权利要求书中所示，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其他的步骤或元素。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的组合。

需要说明的是，如无特殊说明，当某一特征被称为“固定”、“连接”在另一个特征，它可以直接固定、连接在另一个特征上，也可以间接地固定、连接在另一个特征上。此外，本发明中所使用的上、下、左、右等描述仅仅是相对于附图中本发明各组成部分的相互位置关系来说的。

进一步可以理解的是，本公开中“多个”是指两个或两个以上，其它量词与之类似。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。

本实施例提供一种用于核酸检测的微流控芯片。参照图1和图2所示，该微流控芯片主要包括用于对生物样本中的核酸分子进行提取和纯化的提取纯化单元1、用于对核酸分子进行第一轮扩增的第一扩增区3及用于对第一轮扩增后的核酸分子进行巢式扩增的第二扩增区5，第一扩增区3能够和提取纯化单元1连通，第二扩增区5能够和第一扩增区3连通。其中，第二扩增区5的数量为多个，各第二扩增区5均能够和第一扩增区3连通。该微流控芯片进一步包括定量分配装置6，用于将第一扩增区3中的微流体定量划分并分配给各第二扩增区5，可以均匀划分，也可以非均匀划分。本实施例中为均匀划分。

提取纯化单元1包括：

样本区11，其用于加入样本；

多个试剂储存区12，其用于存放提取纯化用的试剂，每个试剂储存区12和样本区11之间分别设置有一个试剂微通道13；及

微通道开关，其用于切换各试剂微通道13的开闭。

提取纯化单元1还包括设置于样本区11中的能够吸附核酸物质的磁珠及用于控制磁珠的磁性组件。样本区11中预先放有可吸附核酸分子的磁珠，样本区11同时也是样本与试剂几种反应的区域。样本区11上端敞口设置，如图1所示，可以加入样本和各种反应试剂。磁性组件设置于样本区11下方，磁性组件可以包括磁铁。

本实施例中，多个试剂储存区12包括裂解试剂储存区12a、漂洗试剂A储存区12b、漂洗试剂B储存区12c及洗脱试剂储存区12d。四个试剂储存区12自左至右并排设置。裂解试剂储存区12a可以预先储存裂解样本区11细胞、细菌或病毒的试剂，包括但不限于各种溶菌酶或蛋白酶，用于释放生物样本中的核酸物质；漂洗试剂A储存区12b及漂洗试剂B储存区12c可以分别预先储存漂洗核酸分子的试剂，用于纯化上一步释放的核酸分子；洗脱试剂储存区12d可以预先储存洗脱磁珠上核酸分子的试剂，用于释放纯化后的核酸物质。上述试剂以液体形式预先存于相应的试剂储存区12。

每个试剂储存区12中设置有加液活塞14。本实施例中，采用柱状活塞，其具有较好的密封性。主要用于试剂储存区12中试剂的流体定量驱动，使用时一次下压到底，即可定量驱动和控制试剂储存区12中的试剂。本实施例中，加液活塞14的高度能够调节，下压到底后可驱动的溶液体积不同，根据需要驱动的溶液体积将活塞的初始位置校正在一定高度。

该微通道开关包括能够上下移动的开关活塞15。开关活塞15的具体结构如图2所示，其包括活塞本体151，所述活塞本体151上开设有多个通孔152，每个通孔152对应一个试剂微通道13。多个通孔152的高度不相同，每个试剂微通道13具有用于与相应的通孔152对齐相接的微通道出口。当一个或若干试剂微通道13的微通道出口和相应的通孔152相接时，其余的试剂微通道13的微通道出口被活塞阻断。具体到本实施例中，开关活塞15处于样本区11和试剂储存区12之间的试剂微通道13上，具有打开或关闭微通道的功能。活塞本体151有四个不同高度的通孔152，按照高度由高到底的顺序分别标记为活塞位置Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，决定了四个个试剂储存区12中的试剂是否可以自由进入样本区11。使用时将开关活塞15下压，只有当一个试剂微通道13与特定的通孔152处于同一高度而相通时，对应试剂储存区12的试剂才可以进入样本区11；初始位置时，开关活塞15处于关闭状态，四个试剂微通道13的微通道出口均被活塞本体151阻断。

该微流控芯片还包括用于接收提取纯化单元1(具体为样本区11)排出的废液的废液区2。废液区2和提取纯化单元1之间设置有废液转移通道，废液转移通道上设置有控制开闭的废液转移开关21，用于控制样本区11和废液区2之间液路的打开和关闭，不使用时处于关闭状态。废液区2中设置有负压接口22，负压接口22能够和负压源(如真空泵)连通，用于提供负压以排出样本区11中的废液。

提取纯化单元1和第一扩增区3之间设置有液流通道，液流通道上设置有控制开闭的核酸转移开关34，用于控制样本区11和第一扩增区3之间液路的打开和关闭，不使用时处于关闭状态。

第一扩增区3中存储有第一轮核酸扩增所需的扩增试剂，扩增试剂可以液体形式预存于第一扩增区3内。扩增试剂包括存核酸扩增所需要的各种引物、dNTP、生物酶等试剂，可以对核酸分子进行特异性扩增，满足生物样本的检测需要。进一步地或可选的，第一扩增区3中未预先储存扩增试剂，该微流控芯片还包括和第一扩增区3连通的用于向第一扩增区3中补加扩增试剂的第一补液孔32，通过第一补液孔32向第一扩增区3中加入扩增试剂。第一补液孔32和第一扩增区3之间设置有气压阀I 33。

该微流控芯片还包括设置于第一扩增区3和第二扩增区5之间的试剂缓冲区4。试剂缓冲区4，用于消除第一轮PCR扩增产物中气泡的功能性区域；也可以作为第一轮PCR扩增产物和巢式PCR扩增试剂混合的功能性区域。该微流控芯片还包括用于将第一扩增区3中的微流体加入试剂缓冲区4中的气压阀II 41及和试剂缓冲区4连通的用于向试剂缓冲区4中加入扩增试剂的第二补液孔42，用于补加第二轮核酸扩增(巢式PCR扩增)所需的试剂，其中第二对引物除外。第二补液孔42和试剂缓冲区4之间设置有气压阀III 43。

各第二扩增区5中分别存储有引物，不同的第二扩增区5中的引物相同或不同，这是由于第二对引物具有较高的特异性，必须在对应腔室单独储存；引物可以以冻干粉形式预存于第二扩增区5，遇溶液后即可熔化。本实施例中，各第二扩增区5中的引物互不相同，从而实现多指标检测。第二扩增区5中还存储有用于第二轮核酸扩增的扩增试剂，或微流控芯片还包括用于向第二扩增区5中加入扩增试剂的补液孔。在第二扩增区5中可以对第一轮PCR产物内的一段DNA片段进行扩增，从而提高反应的特异性。第二扩增区5可以选择是否储存核酸扩增所需要的第二对引物、dNTP、各种生物酶等巢式PCR扩增试剂，如果只储存第二对引物，而未储存其它巢式PCR扩增试剂，则可以由第二补液孔42处加入所需试剂。第二扩增区5，同时也兼顾作为核酸扩增产物的检测区域存在。各第二扩增区5分别与一通气孔51连通，通气孔51为微流控芯片上与外界大气相通的位置，用于保证定量分配装置6分配的微流体在流入第二扩增区5时的芯片内外气压平衡。

结合图3至图5所示，定量分配装置6设置于用于连通第一扩增区3和第二扩增区5的微通道中。定量分配装置6包括多个定量分配单元60，每个定量分配单元60对应一个第二扩增区5。每个定量分配单元60分别包括一个定量盘61，定量盘61具有内腔及分别与内腔连通的进液口和出液口。定量盘61能够移动或转动，从而具有第一位置和第二位置，在第一位置时，进液口直接或间接和试剂缓冲区4连通，出液口连通下一定量盘61的进液口或指示区63，以使来自第一扩增区3或试剂缓冲区4的微流体流入内腔中；当各定量盘61的内腔中分配有微流体后，定量盘61移动一段距离或转动一定角度，从而切换到第二位置；在第二位置时，进液口被封闭或与一气压阀(气压阀IV 65a、气压阀V 65b、气压阀VI 65c、气压阀VII65d、气压阀VIII 65e、气压阀IX 65f)连通，出液口连通对应的第二扩增区5，将内腔中的微流体注入该第二扩增区5中。上述的指示区63作为识别定量划分溶液过程的区域，用于终止划分溶液的操作。下面对定量分配单元60进行举例说明。

将与试剂缓冲区4直接连通的定量分配单元60记为第一个定量分配单元。第一个定量分配单元包括活动设置的第一定量盘61a，第一定量盘61a具有内腔、及分别与内腔连通的进液口和出液口。第一扩增区3和第一个定量分配单元60之间设置有第一微通道62a，第一个定量分配单元和第二个定量分配单元之间设置有第二微通道62b。第一定量盘61a具有第一位置和第二位置，当第一定量盘61a在第一位置时，第一定量盘61a的进液口和第一微通道62a连通，出液口和第二微通道62b连通(如图4所示)；当第一定量盘61a在第二位置时，第一定量盘61a的进液口脱离第一微通道62a，出液口和第一个第二扩增区5连通(如图5所示)。

将距试剂缓冲区4最远的定量分配单元60记为第N个定量分配单元。第N个定量分配单元包括活动设置的第N定量盘，第N定量盘具有内腔、及分别与内腔连通的进液口和出液口。该定量分配装置6还包括上述的指示区63，第N个定量分配单元和指示区63之间设置有指示区微通道64。第N定量盘具有第一位置和第二位置，当第N定量盘在第一位置时，第N定量盘的进液口和第N微通道连通，出液口和指示区微通道连通；当第N定量盘在第二位置时，第N定量盘的进液口脱离第N微通道，出液口和第N个第二扩增区连通。

将第一个定量分配单元和第N个定量分配单元之间的任一定量分配单元记为第n个定量分配单元，n为大于1且小于N的正整数，N＝定量分配单元60的总数＝第二扩增区5的总数。第n个定量分配单元包括活动设置的第n定量盘，第n定量盘具有内腔、及分别与内腔连通的进液口和出液口。第n个定量分配单元和第n-1个定量分配单元之间设置有第n微通道，第n个定量分配单元和第n+1个定量分配单元之间设置有第n+1微通道。第n定量盘具有第一位置和第二位置，当第n定量盘在第一位置时，第n定量盘的进液口和第n微通道连通，出液口和第n+1微通道连通；当第n定量盘在第二位置时，第n定量盘的进液口脱离第n微通道，出液口和第n个第二扩增区5连通。

具体到本实施例中，第二扩增区5、定量分配单元60的数量均为六个且自左至右按照第一个至第六个的顺序依次排列。N＝6，上述的第N个定量分配单元即为第六个定量分配单元。当n取值为2时，第n个定量分配单元60即为第二个定量分配单元。第二个定量分配单元包括活动设置的第二定量盘61b，第二定量盘61b具有内腔、及分别与内腔连通的进液口和出液口，第二个定量分配单元和第三个定量分配单元之间设置有第三微通道62c，第二定量盘61b具有第一位置和第二位置，当第二定量盘61b在第一位置时，第二定量盘61b的进液口和第二微通道62b连通，出液口和第三微通道62c连通；当第二定量盘61b在第二位置时，第二定量盘61b的进液口脱离第二微通道62b，出液口和第二个第二扩增区5连通。n取值为3、4、5的情况依次类推，即第三个、第四个、第五个定量分配单元的结构与第二个定量分配单元类似。还需要说明的是，相邻两个定量盘61之间的微通道(上述第二微通道至第六微通道)为S形。

进一步地，如图3所示，定量盘61具有由多次折弯形成的盘管611，内腔由盘管611的管腔形成。各定量盘61同步处于第一位置(如图4所示)，或同步处于第二位置。每个定量分配单元60包括气压阀((气压阀IV 65a、气压阀V 65b、气压阀VI 65c、气压阀VII 65d、气压阀VIII 65e、气压阀IX 65f))，当定量盘61在第二位置时，进液口和相应的气压阀连通，以将分配至相应定量盘61中的微流体注入相应的第二扩增区5中。上述的定量分配装置6还包括用于调节指示区63内压力的气压阀X 65g，以用于使试剂缓冲区4内的微流体进入依次流入各定量盘61中。

微流控芯片包括通道层及固定于通道层上方的盖板层102，通道层及盖板层102的厚度分别为1～20mm。上述的样本区11、试剂储存区12、废液区2、第一扩增区3、试剂缓冲区4和第二扩增区5分别为设于通道层中的腔室。用于连通不同腔室的上述微通道(包括第一微通道至第N微通道、废液转移通道等)开设于通道层中。上述的定量盘61可绕其中心轴线旋转地设置于通道层中，每个定量盘61连接有一个定量盘驱动件，定量盘驱动件可转动地设置于盖板层102中。上述的各气压阀(气压阀I～X)可上下移动地设置于盖板层102中；上述的加液活塞14、开关活塞15可上下移动地设置于盖板层102。盖板层102一方面与通道层键合后，建立封闭的腔室；另一方面为气压阀、加液活塞14、开关活塞15提供活动的行程，实现流体定量驱动和控制功能。

通道层和盖板层102上分别设置有相互配合的定位孔103，用于通道层和盖板层102的键合定位。定位孔103分别位于微流控芯片的四个角上。

上述的通道层和盖板层102材料可以是PS、PMMA、PDMA、PC等高聚物，也可以是玻璃、金属等材料。加液活塞14材质主要是橡胶或硅胶，不与生物样本及试剂发生反应，且表面光滑、气密性好。微流控芯片的加工方式包含但不限于光刻、注塑、机加工、激光切割等方式；键合方式包含但不限于热键合、阳极键合、低温键合等。

本实施例中，流体驱动方式主要为气压式驱动，即通过气压差将微流控芯片上的微流体驱动到特定位置，具体采用加液活塞或气压阀，气压阀具体采用柱状活塞，位于微通道的中间或一端，使用方式有下压操作也有上提操作，主要作用是通过气压差驱动流体进行定量转移，有时候也兼顾阀门的作用。可以将活塞的初始位置校正在一定位置后定量驱动溶液，也可以通过外接精密注射泵定量驱动溶液。

本实施例还提供一种用于核酸检测的方法，其采用上述的微流控芯片进行检测，具体过程描述如下。

步骤一、在样本区11加入生物样本后，将开关活塞15下压至位置Ⅰ，同时将位于最左侧的第一个加液活塞14下压到底，则裂解试剂储存区12a的试剂全部进入到样本区11，与生物样本中的细菌或病毒进行反应，并释放其中的核酸物质，释放的核酸物质将被样本区11中的磁珠牢牢吸附，通过固定磁铁组件进而固定磁珠，之后打开废液转移开关21，通过抽负压将废液排至废液区2并关闭废液转移开关21。

步骤二、待核酸物质被样本区11的磁珠吸附后，将开关活塞15下压至位置Ⅱ，同时将第二个加液活塞14下压到底，则漂洗试剂A储存区12b的试剂全部进入到样本区11，与样本区11非核酸分子进行作用，初步漂洗样本区11的非核酸物质，之后打开废液转移开关21，通过抽负压将废液排至废液区2并关闭废液转移开关21。

步骤三、完成初步漂洗操作后，将开关活塞15下压至位置Ⅲ，同时将第三个加液活塞14下压到底，则漂洗试剂B储存区12c的试剂全部进入到样本区11，与磁珠上非核酸分子进行作用，纯化磁珠上的核酸分子，之后打开废液转移开关21，通过抽负压将废液排至废液区2并关闭废液转移开关21。

步骤四、完成漂洗操作后，将开关活塞15下压至位置Ⅳ，同时将位于最右侧的第四个加液活塞14下压到底，则洗脱试剂储存区12d的试剂全部进入到样本区11，与磁珠上核酸分子进行作用，将磁珠上纯化后的核酸分子洗脱到样本区11。

步骤五、完成洗脱操作后，将开关活塞15下压到底，同时打开核酸转移开关34，此时气压阀Ⅱ处于下压关闭状态，通过气压阀Ⅰ的上提操作将纯化的核酸分子转移至第一扩增区3，关闭核酸转移开关34。如果核酸第一扩增区预先储存有核酸扩增所需要的各种引物、dNTP、生物酶等试剂，则直接可以混合并反应，通过变换核酸第一扩增区3的温度进行第一轮PCR扩增；如果没有储存PCR扩增试剂，则可以由第一补液孔32处加入所需试剂。

步骤六、待第一轮PCR扩增完成后，驱动第一扩增区3的微流体至六个定量盘61上，定量划分核酸第一扩增区3的溶液。操作方式有两种：一种方式是去掉气压阀Ⅹ，将气压阀Ⅹ变成通气孔51使用，接着依次打开、关闭气压阀IV～IX，核酸第一扩增区的微流体依次流过各定量盘61，实现定量划分溶液的功能；另外一种方式是按照一定速度依次将气压阀IV～IX下压到底，同时以相同的速度将气压阀Ⅹ上提，当指示区63出现溶液的同时停止定量划分溶液操作，保持微流控芯片内外间的气压平衡。

步骤7、完成定量划分溶液操作后，将定量盘61逆时针旋转一定角度，使各定量盘61分别接通相应的气压阀和第二扩增区5之间的液路。将气压阀IV～IX下压到底，则定量盘61的盘管611中的溶液分别进入第二扩增区5。如果第二扩增区5预先储存有核酸扩增所需要的第二对引物、dNTP、生物酶等试剂，则直接可以混合并反应，通过变换第二扩增区5的温度进行巢式PCR扩增；如果没有储存巢式PCR扩增试剂，则可以在步骤六操作时由补液孔Ⅱ处加入所需试剂。当巢式PCR扩增结束后，通过荧光检测技术读取第二扩增区5的荧光信号完成检测过程。

应用实施例1

采用上述的用于核酸检测的方法，分别在六个第二扩增区5添加不同的引物，每个第二扩增区5只添加1种引物，则可以以巢式PCR的方式实现生物样本中6种指标的检测需求。

应用实施例2

采用上述的用于核酸检测的方法，分别在六个第二扩增区5添加不同的引物，每个第二扩增区5都添加m(m＞1)种引物，且引物种类均不相同，引物可以用不同颜色的荧光基团进行标记，则可以实现6m种指标的检测需求，极大地提高了核酸分析检测的通量，缩短了多指标的检测时间。

应用实施例3

采用上述的用于核酸检测的方法，采用具有七个第二扩增区5和七个定量分配单元60的微流控芯片，分别在七个第二扩增区5添加不同的引物，每个第二扩增区5都添加m(m＞1)种引物，且引物种类均不相同，引物可以用不同颜色的荧光基团进行标记，则可以实现7m种指标的检测需求。

上述的微流控芯片是一种集成化的多通道微流控芯片，芯片上不仅集成了核酸提取、纯化、扩增和检测等一系列功能，还实现多通道的检测需求，实现生物样本的高通量核酸分析检测，极大地缩短了多指标检测的检测时间；同时还具有操作过程简单、试剂消耗量低、分析速度快等特点，特别适合于生物样本的高通量、全自动核酸分析检测。

此外，该微流控芯片的结构可以根据检测指标量需求进行适当调整，例如需要检测生物样本中7n种指标，可以将定量盘61和核酸第二轮扩增区的数量扩大至7个。同比例的扩大或缩小定量盘61和核酸第二轮扩增区的数量(大于1)，可以满足任意指标量的检测需求。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种用于核酸检测的微流控芯片，其特征在于，包括：

提取纯化单元，其用于对生物样本中的核酸分子进行提取和纯化；

第一扩增区，其用于对核酸分子进行第一轮扩增，所述第一扩增区能够和所述提取纯化单元连通；

多个第二扩增区，其用于对第一轮扩增后的核酸分子进行巢式扩增，各所述第二扩增区能够和所述第一扩增区连通；及

定量分配装置，其用于将所述第一扩增区中的微流体定量划分并分配给各所述第二扩增区。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述定量分配装置设置于用于连通所述第一扩增区和所述第二扩增区的微通道中。

3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述定量分配装置包括多个定量分配单元，每个定量分配单元对应一个所述第二扩增区。

4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于：第一个定量分配单元包括活动设置的第一定量盘，所述第一定量盘具有内腔及分别与所述内腔连通的进液口和出液口，所述第一扩增区和所述第一个定量分配单元之间设置有第一微通道，所述第一个定量分配单元和第二个定量分配单元之间设置有第二微通道，所述第一定量盘具有第一位置和第二位置，当所述第一定量盘在第一位置时，所述第一定量盘的所述进液口和所述第一微通道连通，所述出液口和所述第二微通道连通；当所述第一定量盘在第二位置时，所述第一定量盘的所述进液口脱离所述第一微通道，所述出液口和第一个第二扩增区连通；和/或，第n个定量分配单元包括活动设置的第n定量盘，n为大于1且小于N的正整数，N为所述定量分配单元的总数且等于所述第二扩增区的总数，所述第n定量盘具有内腔、及分别与所述内腔连通的进液口和出液口，第n个定量分配单元和第n-1个定量分配单元之间设置有第n微通道，第n个定量分配单元和第n+1个定量分配单元之间设置有第n+1微通道，第n定量盘具有第一位置和第二位置，当第n定量盘在第一位置时，第n定量盘的所述进液口和所述第n微通道连通，所述出液口和所述第n+1微通道连通；当第n定量盘在第二位置时，第n定量盘的所述进液口脱离所述第n微通道，所述出液口和第n个第二扩增区连通；和/或，第N个定量分配单元包括活动设置的第N定量盘，所述第N定量盘具有内腔、及分别与所述内腔连通的进液口和出液口；所述定量分配装置还包括指示区，所述第N个定量分配单元和所述指示区之间设置有指示区微通道；所述第N定量盘具有第一位置和第二位置，当所述第N定量盘在第一位置时，所述第N定量盘的所述进液口和第N微通道连通，所述出液口和所述指示区微通道连通；当所述第N定量盘在第二位置时，所述第N定量盘的所述进液口脱离所述第N微通道，所述出液口和第N个第二扩增区连通。

5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片包括通道层，定量盘能够转动地设置于通道层中；和/或，所述定量盘具有多次折弯形成的盘管，所述内腔由所述盘管的管腔形成；和/或，每个所述定量分配单元包括气压阀，当定量盘在第二位置时，所述进液口和相应的所述气压阀连通；和/或，各定量盘同步处于第一位置或同步处于第二位置。

6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述第一扩增区中存储有第一轮核酸扩增所需的扩增试剂，或所述微流控芯片还包括和所述第一扩增区连通的用于向所述第一扩增区中加入扩增试剂的补液孔；所述第二扩增区中存储有引物，不同的所述第二扩增区中的所述引物相同或不同；所述第二扩增区中存储有扩增试剂，或所述微流控芯片还包括和所述第二扩增区连通的用于向所述第二扩增区中加入扩增试剂的补液孔。

7.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述提取纯化单元包括：

样本区，其用于加入样本；

多个试剂储存区，其用于存放提取纯化用的试剂，每个所述试剂储存区和所述样本区之间分别设置有一个试剂微通道；及

微通道开关，其用于切换各所述试剂微通道的开闭。

8.根据权利要求7所述的微流控芯片，其特征在于：所述微通道开关包括能够上下移动的开关活塞，所述开关活塞包括活塞本体及设置于所述活塞本体上的多个通孔，每个通孔对应一个所述试剂微通道，所述多个通孔的高度不相同，每个所述试剂微通道具有用于与相应的所述通孔对齐相接的微通道出口，当一个或若干个所述试剂微通道的所述微通道出口和相应的所述通孔相接时，其余的所述试剂微通道的所述微通道出口被所述活塞本体阻断。

9.根据权利要求7所述的微流控芯片，其特征在于：所述多个试剂储存区包括裂解试剂储存区、漂洗试剂A储存区、漂洗试剂B储存区及洗脱试剂储存区；和/或，每个所述试剂储存区中设置有加液活塞；和/或，所述提取纯化单元还包括设置于所述样本区中的能够吸附核酸物质的磁珠及用于控制所述磁珠的磁性组件。

10.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片还包括设置于所述第一扩增区和所述第二扩增区之间的试剂缓冲区，优选地，所述微流控芯片还包括和所述试剂缓冲区连通的用于向所述试剂缓冲区中加入扩增试剂的补液孔。

11.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片还包括用于接收所述提取纯化单元排出的废液的废液区。

12.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片包括通道层及固定于所述通道层上方的盖板层，所述第一扩增区和所述第二扩增区分别为设于所述通道层中的腔室。

13.一种用于核酸检测的方法，其特征在于，采用如权利要求1至12任一项所述的微流控芯片，所述方法包括如下步骤：

A、向提取纯化单元的样本区中加入生物样本，依次加入提取纯化试剂，对生物样本中的核酸分子进行提取纯化；

B、将提取纯化单元中的核酸分子转移至第一扩增区，与第一扩增区预存的扩增试剂或向第一扩增区加入扩增试剂进行反应以进行第一轮扩增；

C、使第一扩增区的微流体通过定量分配装置而均匀或非均匀地定量分配至多个第二扩增区中，分别与各第二扩增区中预存的扩增试剂或向各第二扩增区中加入扩增试剂进行巢式扩增，读取第二扩增区中的荧光信号进行检测。

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