CN113528310B - 一种模拟宫颈微环境的仿生微流控芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微流控芯片技术领域,具体为一种模拟宫颈微环境的仿生微流控芯片及其制备方法。本发明的仿生微流控芯片设计有进样池、微柱、筛选通道、收集池;微柱有若干个,均匀排布于进样池中,用于过滤待测原始精液中的杂质过滤;进样池与收集池之间由多条相互并行的筛选通道联通;用于筛选出大量合格的、可直接应用于辅助生殖技术的高质量精子;筛选通道中灌注有与宫颈粘液功能类似的微量透明质酸溶液,用于模拟宫颈微环境;本发明芯片可用于精子筛选,鉴定出基因缺陷精子,可简单快速筛选出由于基因缺陷导致不孕不育的人群。本发明操作简单便捷、成本低廉、实用性强。
Description
技术领域
本发明属于微流控芯片技术领域,具体涉及一种模拟女性生殖系统中宫颈微环境的仿生微流控芯片及其制备方法。
背景技术
据世界卫生组织(WHO)评估,每7对夫妇中约有1对夫妇存在生殖障碍。生殖障碍不仅使不育夫妇承受着极大的心理压力,甚至会引发离异等家庭乃至社会的问题。而辅助生殖技术是实现不育夫妇妊娠生子的愿望、解决不育所引发的相关问题的直接手段。据临床统计,约20%的不育患者夫妇需要借助辅助生殖技术实现生儿育女。
不孕夫妇生殖功能受损与精子穿透宫颈粘液的能力改变有关。体内精卵受精过程中,精子需经过宫颈,穿过宫颈粘液,进入女性生殖系统完成受精。而DEFB126基因缺陷的精子无法穿过宫颈黏液,无法进入女性生殖系统进行受精。目前该基因缺陷的不孕人群只能通过宫颈粘液穿透测试才能检测出,而宫颈粘液获取途径难、个体差异大,严重制约了辅助生殖技术相关研究的发展。因此模拟宫颈微环境,构建精子在宫颈微环境的真实筛选过程,是解决该基因缺陷人群不孕不育的关键突破点。透明质酸在粘度和电荷上与宫颈粘液类似,对该基因缺陷的精子同样具有筛选作用,因此透明质酸这种生物相容性材料能够替代宫颈粘液,作为检测基因缺陷的标准品。目前精子筛选的方法主要是上游法和超速离心法,这两种方法都需耗费大量的样本和时间,并且人为干扰大、无统一标准,尤其是离心会对精子的DNA造成损伤。为了推进辅助生殖技术的相关研究、提高辅助生殖技术的效率,发展体外宫颈微环境模拟仿生新技术新方法势在必行。
基于透明质酸的仿生芯片,能够模拟宫颈微环境,将筛选过程标准化,筛选出基因缺陷(DEFB126)的精子。采用微流控技术对精子进行筛选,只需要微升级样本,且能将繁琐的实验操作转移到芯片上,快速鉴定出精子是否是DEFB126基因缺陷型,同时减少人为操作带来的干扰、提高处理效率。因此,此芯片能够为临床精子筛选提供结构简单、响应快速、筛选高效的标准方法。
与其他种类的基材相比,聚二甲基硅氧烷基材不仅具有高强度、高韧性和高弹性的优点,并且制造成本低廉、加工温度低、工艺成熟且稳定性好。
发明内容
本发明针对上述现有技术的缺陷,提出一种模拟女性生殖系统中宫颈微环境的仿生微流控芯片及其制备方法。
本发明结合旋涂工艺、光固化与光刻技术,构建图案化的模板,再利用模板法制备具有特定结构、良好弹性、疏水性和化学稳定性的聚二甲基硅氧烷基材,然后利用等离子体处理,将上述聚二甲基硅氧烷基材与玻片键合,最后通过芯片中注入透明质酸溶液,构建模拟女性生殖系统中宫颈微环境的微流控芯片。利用上述微流控芯片,能够准确、高效地鉴定出有DEFB126基因缺陷的精子,筛选出无基因缺陷(DEFB126)的精子,并将其直接应用于辅助生殖技术。
本发明提供的宫颈微环境的仿生微流控芯片,由芯片基片和玻片组成;其中,所述芯片基片上设计有进样池、微柱、筛选通道、收集池;其中:
所述微柱有若干个,均匀排布于进样池中,用于过滤待测原始精液中的杂质过滤,避免杂质堵塞筛选通道,防止其影响精子在微通道中的迁移;
所述进样池与收集池之间由多条相互并行的筛选通道联通;用于准确、高效地筛选出大量合格的、可直接应用于辅助生殖技术的高质量精子;
所述筛选通道中灌注有与宫颈粘液功能类似的微量透明质酸溶液,用于模拟宫颈微环境;
玻片与芯片基片的外形匹配,两者键合密封组成所需仿生微流控芯片。
本发明中,芯片进样池中设计的微柱结构,微柱间距位为20-200µm,优选为50 µm。
本发明中,芯片本中设计的筛选通道有多条,优选为1-100条,等宽度,且相互并行、互不影响。
本发明中,两端的进样池和收集池为圆形,其直径为0.5-5 mm,其深度为40-200 µm;优选直径为1-2 mm,其深度为50 µm。
本发明中,筛选通道宽度为100-1000µm,深度为40-200µm;优选筛选通道宽度为300 µm,深度为50µm,长度为5 cm。
本发明中,芯片筛选通道采用与宫颈粘液功能类似(在粘度和电荷方面)的透明质酸溶液填充,透明质酸溶液的浓度为0.1-25 mg/ml,优选为5 mg/ml;能够确保芯片在精子筛选过程中的性质与宫颈粘液中的一致,起到模拟宫颈微环境对于精子迁移的作用。
本发明中,芯片进样池和收集池均用凝胶封住,保证精子筛选在无液流地条件下进行,能够排除液流等因素对于精子筛选结果的影响。
本发明提供的宫颈微环境的仿生微流控芯片的制备方法,具体步骤如下:
(1)用软光刻技术制作微流控芯片,包括旋涂,前烘,紫外曝光,后烘,显影等步骤。其中,芯片结构包括进样池、微柱、筛选通道、收集池;具体地,硅模板上利用旋涂工艺,获得具有特定厚度的光刻胶涂层;经过光刻和光固化,获得微结构图案;
(2)将聚二甲基硅氧烷预聚物与聚合剂以质量比为(8-12):1的比例混合,置于离心机中离心去除气泡;
(3)在光刻好的硅片上浇筑聚二甲基硅氧烷,置于烘箱中,固化;聚二甲基硅氧烷固化后形成带有微柱阵列和筛选通道的芯片;
(4)将芯片有通道的一面与玻璃基底置于等离子体清洗机中,通过等离子体轰击使硅氧键打开形成羟基,将玻璃基底与芯片贴合;
(5)在筛选通道中灌注透明质酸溶液;
(6)在芯片进出口处贴上薄凝胶,封口。
本发明提供的宫颈微环境的仿生微流控芯片,可用于检测基因缺陷的精子,具体操作步骤如下:
(1)揭开芯片进口处的凝胶。
(2)在进口处直接加入待检测精液样本。
(3)将进口处的凝胶重新盖回进口处。
(4)2h后,观察精子是否能够游至2cm处。
本发明用于解决现有精子筛选应用于辅助生殖中的技术的问题;具有如下特点:
芯片进样池中设计了特殊的微柱结构,能将原始精液中的杂质过滤,避免杂质堵塞筛选通道,防止其影响精子在微通道中的迁移;
芯片本中特别设计了多条筛选通道,相互并行、互不影响,能够准确、高效地筛选出大量合格的、可直接应用于辅助生殖技术的高质量精子;
芯片筛选通道采用与宫颈粘液功能类似(在粘度和电荷方面)的透明质酸溶液填充,能够确保芯片在精子筛选过程中的性质与宫颈粘液中的一致,起到模拟宫颈微环境对于精子迁移的作用;
芯片进样池和收集池均用凝胶封住,保证精子筛选在无液流地条件下进行,能够排除液流等因素对于精子筛选结果的影响。
本发明设计的芯片对于基因缺陷的精子具有检测作用,DEFB126基因缺陷的精子无法穿过宫颈芯片的筛选通道到达收集池,无基因缺陷的精子将成功到达收集池,进一步应用于辅助生殖技术。
本发明具有如下优点:
(1)本发明用生物相容性材料透明质酸代替宫颈粘液,模拟宫颈微环境,提供了一个标准化的测试方法;
(2)本发明将宫颈粘液穿透测试集成到微流控芯片上,减少了人为操作带来的干扰,将操作程序化,规范化;
(3)本发明将宫颈粘液穿透测试集成到微流控芯片上,样本量少,可将测试应用于少精症等患者,并能实现批量、快速的精子筛选。
附图说明
图1为模拟宫颈微环境的仿生微流控芯片结构图示(俯视图)。
图2为宫颈芯片中精子筛选的原理图。
图3为透明质酸溶液和人宫颈粘液的粘度测试结果。
图中标号:1为进样池;2为微柱;3为筛选通道;4为收集池。5为DEFB126基因缺陷型精子;6为无基因缺陷的精子。
具体实施方式
下面结合实施例和附图,对本发明做进一步详细的说明,但本发明的实施方式不限于此。
一种模拟女性生殖系统中宫颈微环境的仿生微流控芯片,包括进样池1,筛选通道3,收集池4。进样池设有微柱阵列2,筛选通道中充满透明质酸溶液。透明质酸溶液的粘度与人类宫颈粘液的粘度类似(图3)。
该仿生微流控芯片中,两端的进样池和收集池为圆形,其直径为0.5-2mm,其深度为50 µm;微柱间距为50 µm,直径为50 µm;以阵列形式均匀分布于进样池中,微柱的作用是分离精液样本中的杂质细胞;筛选通道的宽度为300 µm,深度50µm,长度5 cm。
本发明提供的宫颈微环境的仿生微流控芯片的制备方法,具体步骤如下:
(1)用软光刻技术制作微流控芯片,包括旋涂,前烘,紫外曝光,后烘,显影等步骤。具体操作如下:将SU-8负性光刻胶以2500rpm的转速旋涂在硅基底上,依次置于65℃热台2min,95℃热台8min;待硅片冷却,将有图案的掩模板置于硅片上方,在光刻机上进行紫外曝光30s;将硅片置于65℃热台2 min,95℃热台7min;将硅片置于显影液中,显影3min;然后将硅片置于150℃热台上坚膜15min。
其中,芯片结构包括进样池、微柱、筛选通道、收集池;具体地,硅模板上利用旋涂工艺,获得具有特定厚度的光刻胶涂层;经过光刻和光固化,获得微结构图案。
(2)将聚二甲基硅氧烷预聚物与聚合剂以质量比为10:1的比例混合,置于离心机中离心去除气泡;
(3)在光刻好的硅片上浇筑聚二甲基硅氧烷,置于80℃烘箱3h;聚二甲基硅氧烷固化后形成带有微柱阵列和筛选通道的芯片;
(4)将芯片有通道的一面与玻璃基底置于等离子体清洗机中,通过等离子体轰击使硅氧键打开形成羟基,将玻璃基底与芯片贴合;
(5)在筛选通道中灌注浓度为5 mg/ml的透明质酸溶液;
(6)在芯片进出口处贴上薄凝胶,封口。
从芯片收集池处连接注射泵,使芯片通道注满透明质酸溶液;透明质酸溶液的浓度为5 mg/ml;
将芯片进样池和收集池用凝胶密封,静置,使芯片内液体保持平衡;
揭开进样池凝胶,在进样池加入原始精液,重新用凝胶将进样池密封,静置;
将芯片置于显微镜观察,有基因缺陷的精子不能穿过筛选通道,无基因缺陷的精子将穿过筛选通道到达收集池。
本发明芯片能够简化WHO上的精子穿透实验,将繁琐耗时的手工制作设备,换成了可批量生产,简单操作的微流控芯片。并用透明质酸代替了获取困难,品质部均一的宫颈粘液。并且只需使用微升级别的精液样本,即可检验精子穿透宫颈粘液的能力。DEFB126基因缺陷的精子能够通过本发明设备直接检验出,病人无需做其余检测即可用IVF和IUI两种方式进行不孕不育治疗。本发明芯片可用不孕不育诊断的初筛。
Claims (3)
1.一种模拟宫颈微环境的仿生微流控芯片,其特征在于,由芯片基片和玻片组成;其中,所述芯片基片上设计有进样池、微柱、筛选通道、收集池;其中:
所述微柱有若干个,均匀排布于进样池中,用于过滤待测原始精液中的杂质过滤,避免杂质堵塞筛选通道,防止其影响精子在微通道中的迁移;
所述进样池与收集池之间由多条相互并行的筛选通道联通;用于筛选出大量合格的、可直接应用于辅助生殖技术的高质量精子;
所述筛选通道中灌注有与宫颈粘液功能类似的微量透明质酸溶液,用于模拟宫颈微环境;
玻片与芯片基片的外形匹配,两者键合密封组成所需仿生微流控芯片;
所述芯片进样池中的微柱间距为50 µm;
所述筛选通道为1-100条;
所述透明质酸溶液的浓度为5 mg/ml;
两端的进样池和收集池为圆形,其直径为0.5-5 mm,其深度为40-200 µm;筛选通道宽度为300 µm,深度为50µm,长度为5 cm。
2.一种如权利要求1所述的模拟宫颈微环境的仿生微流控芯片的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)用软光刻技术制作微流控芯片,包括旋涂,前烘,紫外曝光,后烘,显影;其中,芯片结构包括进样池、微柱、筛选通道、收集池;硅模板上利用旋涂工艺,获得具有特定厚度的光刻胶涂层;经过光刻和光固化,获得微结构图案;
(2)将聚二甲基硅氧烷预聚物与聚合剂以质量比为(8-12):1的比例混合,置于离心机中离心去除气泡;
(3)在光刻好的硅片上浇筑聚二甲基硅氧烷,置于烘箱中,固化;聚二甲基硅氧烷固化后形成带有微柱阵列和筛选通道的芯片;
(4)将芯片有通道的一面与玻璃基底置于等离子体清洗机中,通过等离子体轰击使硅氧键打开形成羟基,将玻璃基底与芯片贴合;
(5)在筛选通道中灌注透明质酸溶液;
(6)在芯片进出口处贴上薄凝胶,封口。
3.一种如权利要求1所述的模拟宫颈微环境的仿生微流控芯片用于检测基因缺陷的精子,具体操作步骤如下:
(1)揭开芯片进口处的凝胶;
(2)在进口处直接加入待检测精液样本;
(3)将进口处的凝胶重新盖回进口处;
(4)2h后,观察精子是否能够游至2cm处。
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Legal Events
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---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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