CN103343090B - 一种集成化多功能可控细胞操纵及分析微流控芯片及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微全分析系统的生物医学应用技术领域，具体涉及一种集成化多功能可控细胞操纵及分析微流控芯片及应用。本发明的微流控芯片包括由连续不对称弯管通道构成的惯性聚焦结构、多个分支通道及一个汇合通道构成的层流结构、微流控液滴形成结构、微阵列捕获结构；所述各结构之间通过通道连接，所述惯性聚焦结构、层流结构的各分支通道、微流控液滴形成结构分别设有溶液注入口，所述微阵列捕获结构设有溶液注入口和废液出口。本发明将多种功能结构集成用于细胞分析，以解决当前细胞分析方法中存在的高通量分析、微量分析及细胞可控操纵等功能难以集成的问题，并促进该技术领域的进一步发展。

Description

一种集成化多功能可控细胞操纵及分析微流控芯片及应用

技术领域

本发明属于微全分析系统的生物医学应用技术领域，具体涉及一种微流控芯片及其在多功能、高通量细胞分析系统领域的应用开发。

背景技术

随着对细胞研究的不断深入，从细胞群、细胞整体、亚细胞结构深入到分子结构；从细胞内各组分分析深入到对细胞呼吸作用、光合作用、信息传递、跨膜运输等生命活动的研究，传统的细胞分析仪器已不能满足对细胞研究的需求。近年来，伴随着微流控平台的理论和技术的逐步完善，特别是多样化芯片操纵和检测方法的建立，微流控芯片技术在细胞学研究领域展现出前所未有的活力，主要体现在细胞操纵、细胞培养和细胞内组分分析等方面的应用。细胞操纵是微流控技术用于细胞学研究领域的基础，尤其是在单细胞操纵方面，微流控芯片因为具有与单细胞相近的微小尺寸、多维网络通道对细胞的易操纵性、可满足高通量细胞分析、各细胞分析模块的易整合等特点得到了越来越多的重视和关注。微流控芯片细胞操纵是在保持细胞活性的前提上通过芯片对细胞进行运输、分离、筛选及固定等操作，为细胞成分、结构和功能等分析提供便利。现在大多的微流控细胞操纵方法都需要借助外力（比如磁场、电场、光等）才能实现细胞的有序及可控操纵，但是这些操作会对细胞的生理活性及功能状态产生一定程度的影响，这将不利于对细胞进行客观的分析和研究；另外机械操作虽然能够依靠设计的微结构对细胞进行有效固定及分析，但是机械作用形成的固定不能为细胞的生长及增殖提供一个较优的生长环境，因此，在细胞分析领域需要集成化程度更高、功能更多的新型技术平台的发展以适应高性能细胞分析的需要。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种集成化多功能可控细胞操纵及分析微流控芯片，它将多种功能结构集成用于细胞分析，以解决当前细胞分析方法中存在的高通量分析、微量分析及细胞可控操纵等功能难以集成的问题，并促进该技术领域的进一步发展。

本发明的第一个目的是通过如下的技术方案来实现的：该集成化多功能可控细胞操纵及分析微流控芯片，包括由连续不对称弯管通道构成的惯性聚焦结构、多个分支通道及一个汇合通道构成的层流结构、微流控液滴形成结构、微阵列捕获结构；所述各结构之间通过通道连接，所述惯性聚焦结构、层流结构的各分支通道、微流控液滴形成结构分别设有溶液注入口，所述微阵列捕获结构设有溶液注入口和废液出口。

具体地说，所述惯性聚焦结构包含20～50个由一个大弯管和一个小弯管组成的结构单元，大弯管的尺寸为：400～600微米宽、30-50微米深、曲率半径700～1000微米；小弯管的尺寸为：200～350微米宽、30-50微米深、曲率半径200～300微米。

所述层流结构中形成的层流包含两侧的海藻酸钠溶液和氯化钙溶液，以及中间的乙二胺四乙酸二钠盐溶液。

所述微流控液滴形成结构中，形成液滴的油相为矿物油或者氟代烃油。

本发明的第二个目的在于提供上述集成化多功能可控细胞操纵及分析微流控芯片在细胞分析中的应用，即利用微流控芯片的惯性聚焦结构，实现细胞在微流控通道中的惯性聚焦、有序排列及分离功能；利用微流控芯片的层流结构及微流控液滴形成结构对细胞进行包裹并形成水凝胶微球；利用微流控芯片的微阵列捕获结构对包裹细胞的水凝胶微球进行捕获并构建细胞分析阵列。

本发明的优点是：采用不借助外力的流体力学原理进行细胞操纵，能够保证细胞能更好的进行各种生命活动，为客观研究生命活动的本质提供基础；将微流控液滴技术与水凝胶微球制备技术结合起来，在微通道内可控的制备出固定尺寸的水凝胶微球；同时将一到多个固定数量的细胞可控包裹其中，将能够为标准化单细胞研究、标准化细胞通讯研究及标准化干细胞研究提供一种重要的技术平台；以包裹细胞的水凝胶微球阵列替代机械操作产生的细胞阵列，将能够为细胞的各种生命活动提供较优的生长环境，这使得细胞能更好的进行各种生命活动，为客观研究生命活动的本质提供基础；用于微球捕获的微阵列结构简单，制作容易，依靠水动力学固定微球简化了芯片的操作流程及芯片的复杂性；芯片集成度高，可在芯片内实现多种功能的细胞操纵。

附图说明

图1是本发明微流控芯片各部分结构的总体连接关系示意图。

图2是图1中惯性聚焦结构的原理结构示意图。

图3是本发明基于层流及微流控液滴技术的水凝胶形成示意图。

图4是本发明微阵列捕获结构的原理结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的描述。

参见图1，本实施例的微流控芯片包括由连续不对称弯管通道构成的惯性聚焦结构7、多个分支通道及一个汇合通道构成的层流结构8、微流控液滴形成结构9、微阵列捕获结构10，由图1可见，上述各结构之间依次通过通道连接。参见图2，惯性聚焦结构7包含20～50个由一个大弯管701和一个小弯管702组成的结构单元，大弯管701的尺寸为：400～600微米宽、30-50微米深、曲率半径700～1000微米；小弯管702的尺寸为：200～350微米宽、30-50微米深、曲率半径200～300微米；在惯性聚焦结构7的起始端设有溶液注入口2，从该溶液注入口2注入海藻酸钠溶液和细胞。溶液在惯性聚焦结构7的不对称弯曲微通道流动时，会由于离心作用产生二次涡流，因此溶液中的微球或者细胞除了受到由惯性流给予的惯性举力外，还会受到由二次涡流给予的迪安拖曳力。当细胞流经不对称弯曲微通道时，由于不同的作用力（惯性举力和迪安拖曳力）在通道内的固定位置达到平衡，则细胞就会在通道内按相对固定的位置运动，而且同一尺寸的细胞在相同条件下运动轨迹是一致的，因此利用此原理就可以实现同一细胞在通道内按照相同的轨迹运动并排列成行，也可以实现不同尺寸细胞由于按照不同轨迹运动而分离，如图2所示，从而实现细胞的惯性聚焦、有序排列及分离等功能。

参见图1和图3，层流结构8中形成的层流包含上侧从溶液注入口2注入的海藻酸钠溶液，下侧从溶液注入口4注入的氯化钙溶液，以及中间从溶液注入口3注入的乙二胺四乙酸二钠盐溶液。从图1和图3中可见，微流控液滴形成结构9中，形成液滴的油相是从上下两侧溶液注入口1注入的矿物油或者氟代烃油。因此，本发明使用的用于形成包裹细胞的水凝胶的微结构包括层流结构8及微流控液滴形成结构9，如图3所示。层流技术分别提供藻酸钙水凝胶生成需要的褐藻酸盐（海藻酸钠溶液）、钙离子溶液（氯化钙溶液）以及中间的EDTA溶液（乙二胺四乙酸二钠盐溶液）层，这样就可以控制层流界面并不发生水凝胶生成；通过液滴形成技术产生固定尺寸和形状的微球，在微球内褐藻酸盐与钙离子充分混合并发生凝固，生成球形的水凝胶微球。由于细胞已经在上游惯性聚焦结构7的不对称弯曲通道内进行了有序化处理，细胞有相对固定的间距，通过控制液滴产生的频率及细胞间距的大小，可以实现一到多个细胞的可控包裹。

参见图1和图4，微阵列捕获结构10设有溶液注入口5和废液出口6。本发明使用的用于包裹细胞水凝胶微球捕获的微阵列结构利用了水动力学固定原理，如图4所示。当陷阱为空时，path1产生的流动阻力小于path2产生的流动阻力，因此溶液中的微球将被主流体携带入path1而被捕获陷阱固定。一旦微球被固定，path1产生的流动阻力将大于弯曲通道产生的流动阻力，主流体将沿着path2流动，随后的微球则绕过填充后的陷阱被携带入弯曲通道。基于这样一个简单的原理，将能很轻松的形成水凝胶微球阵列。

因此，利用本发明的微流控芯片的惯性聚焦结构，实现细胞在微流控通道中的惯性聚焦、有序排列及分离功能；利用微流控芯片的层流结构及微流控液滴形成结构对细胞进行包裹并形成水凝胶微球；利用微流控芯片的微阵列捕获结构对包裹细胞的水凝胶微球进行捕获并能构建细胞分析阵列。

下面结合具体实验实例对本发明的微流控芯片的应用作更加详细的描述。

实施例1：将本发明的微流控芯片应用于细胞应激分析。

（1）本发明集成化多功能可控细胞操纵及分析微流控芯片的设计：

设计的微流控芯片能够在芯片内对细胞进行有序操纵、可控包裹及形成阵列，完成上述三个模块的设计及功能验证，然后将三个模块的流路及结构特点整合到一块芯片上并以通道连接。该芯片包含细胞有序操纵模块（不对称弯曲通道）、细胞可控包裹模块（液滴形成需要的两侧油相通道和中间水相通道）、细胞阵列形成模块及一个简单的基于层流扩散原理的浓度梯度形成通道。

（2）微流控芯片的制备：

首先将设计的芯片结构图样通过绘图软件（CorelDRAW9.0）绘制出来，并以2400dpi的分辨率打印在Kodak的菲林胶片上制备出芯片的光掩膜；然后将光掩膜的图案通过紫外曝光的方法转移到覆盖有光刻胶的PCB板上，并用化学刻蚀方法在曝光PCB板上制备出芯片的阳模板；最后将聚二甲基硅氧烷前聚体与固化剂按10:1（质量比）比例混合后于真空泵中除去气泡，然后平铺在芯片阳模板上（厚约1mm）。置于65°C烘箱中3h，待固化后取出，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）片基从阳模板上剥离下来。PDMS片基用等离子体处理3min后与洁净的玻片不可逆贴合。

（3）溶液注入接口制备：

贴合完成后将1-2cm长两端磨平的1-2mm直径的空心金属管插入预先打孔的样品孔中，制备相应的中空接口并使得金属管伸出接口上端，注入5:1（质量比）的PDMS前聚体与固化剂混合的未固化的PDMS溶剂，65℃加热固化，静置30分钟，除去气泡，最后置于80℃恒温加热台上加热2.5-3h使其完全固化并牢固在样品口处。此时，该接口可通过聚苯乙烯微管与微量注射泵连接用于溶液进样。

（4）细胞在微流控芯片中的可控包裹并形成阵列：

将细胞与浓度为0.5%-3%的海藻酸钠溶液混合，从图1所示的溶液注入口2注入通道，流速为0.5-1μL/min；从溶液注入口3注入EDTA溶液，浓度为40-100mM，流速为0.5-1μL/min；从溶液注入口4注入氯化钙溶液，浓度为50-150mM，流速为0.5-1μL/min；从溶液注入口1注入油相溶剂（Mineral oil(Abil EM90)），Abil EM90浓度为1%-2%，流速为10-20μL/min。四个溶液注入口同时进样，保证液相溶液同时达到油相汇合口，细胞在惯性聚焦结构7中聚焦后流入层流结构8通道，与EDTA溶液和钙离子溶液一起被油相溶液包裹，在微流控液滴形成结构9通道中混合并固化形成水凝胶微球，当流入微阵列捕获结构10时能够被固定并形成阵列，废液从废液出口6流出。

（5）细胞应激分析：

以ATP刺激-钙离子释放为研究模型，考察本发明芯片用于细胞应激的可行性。采用RPMI1640培养液培养细胞，添加10%胎牛血清、2mM L-谷氨酸、100U/ml青霉素、100U/mL链霉素，于5%CO₂、37℃下培养。细胞传代培养消化后用6μM Fluo3-AM室温下处理30min，使荧光染料能够进入细胞中，再在细胞培养箱中5%CO₂、37℃下孵育30min。然后，流入本发明芯片进行多重操纵，在阵列完成后，结合一种简单的层流扩散原理，在细胞阵列中产生ATP的浓度梯度（从图1中溶液注入口5流入ATP），水凝胶微球具有良好的通透性，能使微球内与微球外的ATP浓度一致。ATP作为信号分子，能够与细胞相应受体结合导致细胞内钙离子浓度升高，释放的Ca²⁺离子能够与染料Fluo3-AM结合，通过荧光显微镜根据荧光强弱可以分析细胞对外界ATP的响应情况。结果显示：该芯片用于细胞应激分析体现出良好的响应。

实施例2：将本发明的微流控芯片用于抗肿瘤药物的性能分析。

（1）本发明集成化多功能可控细胞操纵及分析微流控芯片的设计：

设计的微流控芯片能够在芯片内对细胞进行有序操纵、可控包裹及形成阵列，完成上述三个模块的设计及功能验证，然后将把三个模块的流路及结构特点整合到一块芯片上并以通道连接。该芯片包含细胞有序操纵模块（不对称弯曲通道）、细胞可控包裹模块（液滴形成需要的两侧油相通道和中间水相通道）、细胞阵列形成模块及一个简单的基于层流扩散原理的浓度梯度形成通道。

（2）微流控芯片的制备：

首先将设计的芯片结构图样通过绘图软件（CorelDRAW9.0）绘制出来，并以2400dpi的分辨率打印在Kodak的菲林胶片上制备出芯片的光掩膜；然后将光掩膜的图案通过紫外曝光的方法转移到覆盖有光刻胶的PCB板上，并用化学刻蚀方法在曝光PCB板上制备出芯片的阳模板；最后将聚二甲基硅氧烷前聚体与固化剂按10:1（质量比）比例混合后于真空泵中除去气泡，然后平铺在芯片阳模板上（厚约1mm）。置于65°C烘箱中3h，待固化后取出，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）片基从阳模板上剥离下来。PDMS片基用等离子体处理3min后与洁净的玻片不可逆贴合。

（3）溶液注入接口制备：

贴合完成后将1-2cm长两端磨平的1-2mm直径的空心金属管插入预先打孔的样品孔中，制备相应的中空接口并使得金属管伸出接口上端，注入5:1（质量比）的PDMS前聚体与固化剂混合的未固化的PDMS溶剂，65℃加热固化，静置30分钟，除去气泡，最后置于80℃恒温加热台上加热2.5-3h使其完全固化并牢固在样品口处。此时，该接口可通过聚苯乙烯微管与微量注射泵连接用于溶液进样。

（4）细胞在微流控芯片中的可控包裹并形成阵列：

将细胞与浓度为0.5%-3%的海藻酸钠溶液混合，从图1所示的溶液注入口2注入通道，流速为0.5-1μL/min；从溶液注入口3注入EDTA溶液，浓度为40-100mM，流速为0.5-1μL/min；从溶液注入口4注入氯化钙溶液，浓度为50-150mM，流速为0.5-1μL/min；从溶液注入口1注入油相溶剂（Mineral oil(Abil EM90)），Abil EM90浓度为1%-2%，流速为10-20μL/min。四个溶液注入口同时进样，保证液相溶液同时达到油相汇合口，细胞在惯性聚焦结构7中聚焦后流入层流结构8通道，与EDTA溶液和钙离子溶液一起被油相溶液包裹，在微流控液滴形成结构9通道中混合并固化形成水凝胶微球，当流入微阵列捕获结构10时能够被固定并形成阵列，废液从废液出口6流出。

（5）抗肿瘤药物性能分析：

由于细胞被藻酸钙水凝胶包裹，作为一种优良的细胞外基质，具有良好的通透性、生物相容性、易塑性等特点，能较好的为细胞附着、生长、增殖以及外界物质交换等生命活动提供条件。细胞在培养瓶中培养2-3天，覆盖率达到60%-70%后消化，并进入芯片内进行包裹、固定。芯片置于细胞培养箱中过夜，使细胞能够较好的贴附伸展，然后流入抗肿瘤药物并形成浓度梯度（从图1中溶液注入口5流入抗肿瘤药物），继续在低流速下（0.1μl/min）孵育24h，使用特殊的荧光探针识别药物刺激引起的细胞凋亡标识物的变化（如：细胞膜通透性、核形态、线粒体膜电位），探针有rhodamine123（用于指示线粒体膜电位）、Hoechst33342（用于指示染色质浓缩及碎裂）、Propidium iodide（用于指示细胞膜通透性变化）。根据细胞凋亡相关生化现象对药物的性能进行分析。结果显示：所使用的抗肿瘤药物体现出良好的抗肿瘤细胞的能力。

Claims (2)

1.一种集成化多功能可控细胞操纵及分析微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片包括由连续不对称弯管通道构成的惯性聚焦结构、多个分支通道及一个汇合通道构成的层流结构、微流控液滴形成结构、微阵列捕获结构；所述各结构之间通过通道连接，所述惯性聚焦结构、层流结构的各分支通道、微流控液滴形成结构分别设有溶液注入口，所述微阵列捕获结构设有溶液注入口和废液出口；

所述惯性聚焦结构包含20～50个由一个大弯管和一个小弯管组成的结构单元，大弯管的尺寸为：400～600微米宽、30-50微米深、曲率半径700～1000微米；小弯管的尺寸为：200～350微米宽、30-50微米深、曲率半径200～300微米；

所述层流结构中形成的层流包含两侧的海藻酸钠溶液和氯化钙溶液，以及中间的乙二胺四乙酸二钠盐溶液；

所述微流控液滴形成结构中，形成液滴的油相为矿物油或者氟代烃油。

2.一种基于权利要求1所述的集成化多功能可控细胞操纵及分析微流控芯片在细胞分析中的应用，其特征在于：利用微流控芯片的惯性聚焦结构，实现细胞在微流控通道中的惯性聚焦、有序排列及分离功能；利用微流控芯片的层流结构及微流控液滴形成结构对细胞进行包裹并形成水凝胶微球；利用微流控芯片的微阵列捕获结构对包裹细胞的水凝胶微球进行捕获并构建细胞分析阵列。