CN101661031B - 一种可寻址介观流控多元分析装置及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可寻址介观流控多元分析装置,它包括分析反应模块,动力控制模块,液体处理模块和信号采集模块,其中分析反应模块由微珠载体和反应微通道组成。动力控制模块由动力泵和连接各模块的毛细管以及阀门组成,液体处理模块由各种反应液,缓冲液及废液处理元件组成,信号采集模块由光信号采集及转换设备构成。本发明还提供了一种用可寻址介观流控多元分析装置检测样本的方法。本发明优点在于:提供的一种可寻址介观流控多元分析装置,集样本富集,检测和回收一体化的检测分析系统,同时还具有试剂消耗量低,反应速度快,效率高,检测灵敏度高,自动化程序高等特点。
Description
【技术领域】
本发明涉及微流控生物芯片技术和微分析技术领域,具体地说是一种可寻址介观流控多元分析装置及其检测方法。
【背景技术】
近年来,生物芯片技术取得了飞速的发展。微电子和微加工技术将生物信号分子固定在基片表面上,然后与生物样本中的靶标分子的特异性识别反应,再通过与识别反应相偶联的信号指示反应结果,经数据分析处理得到相关的生物信息。生物芯片对样品的检测是以高通量、集成化、并行化和微型化为特征的芯片带给人们最大的优势是能同时分析和处理大量的样品。基于这种快速、高效的特点,微阵列生物芯片在生物学、医学等领域获得了广泛应用,包括测定基因和蛋白质表达图谱、研究特定的基因和蛋白质功能、研究分子间的交互作用、寻找疾病的生物学标记和药物靶标等。
目前,市场中有检测样品的设备、也有样本富集的设备,但还没有关于集样本富集、检测和回收一体化的设备。
中国专利申请:200610016978.2公开了一种磁性微珠ABO血型反定型自动检测仪,中国专利申请:200710034888公开了利用一维微流控生物芯片检测细胞中基因突变的方法,但是关于可寻址介观流控多元分析装置及其检测方法目前还未见报道。
【发明内容】
本发明的目的是,提供一种可寻址介观流控多元分析装置。
本发明的再一的目的是,提供一种用可寻址介观流控多元分析装置检测样本的方法。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
一种可寻址介观流控多元分析装置,它包括微分析反应模块,动力控制模块,液体处理模块和信号采集模块。
所述的微分析反应模块由载体微珠和微通道组成,所述的微通道包括反应通道、微珠装载兼扫描通道、样本通道、和洗涤通道。
所述的微珠装载兼扫描通道通过第一微阀门,连接反应通道;
所述的样本通道通过第二微阀门,连接反应通道;
所述的洗涤通道通过第三微阀门,连接反应通道;
所述的反应通道、微珠装载兼扫描通道、样本通道、洗涤通道通过毛细管相互连接。作为优选的技术方案,所述的反应通道与样本通道之间,样本通道与微珠装载兼扫描通道之间,微珠装载兼扫描通道与洗涤通道之间,洗涤通道与反应通道之间呈90度。
作为可选的技术方案,所述的反应通道、微珠装载兼扫描通道、样本通道和洗涤通道是玻璃或塑料或聚二甲基硅氧烷与玻璃片偶联形成。
作为可选的技术方案,所述的载体微珠材料可以是玻璃、金属、硅、陶瓷、可控多孔玻璃微珠或多聚高分子中的一种。作为优选的技术方案,所述的载体微珠为玻璃微珠。
作为可选的技术方案,所述的各通道的内径由微珠直径决定,反应通道、微珠装载兼扫描通道的内径略大于微珠直径,样本通道和洗涤通道的内径略小于微珠直径直径。作为优选的技术方案,所述的反应通道、微珠装载兼扫描通道的直径为280微米-320微米,样本通道和洗涤通道的直径为180微米-220微米。
所述的动力控制模块由动力泵,连接泵和反应装置的毛细管,控制管道液体流动的微阀门以及控制器组成。
所述的微分析反应模块中的反应通道另一端连接动力泵。
所述的控制器分别连接第一微阀门、第二微阀门、第三微阀门。
作为可选的技术方案,所述的控制器是可编程控制器。
作为可选的技术方案,所述的动力泵是蠕动泵或注射泵。作为优选的技术方案,所述的动力泵是蠕动泵。
作为优选的技术方案,所述的第一微阀门是电磁阀门、第二微阀门是电磁阀门、第三微阀门是电磁阀门。
作为可选的技术方案,所述的液体处理模块由反应液,缓冲液供给系统及反应后液体收集系统组成。
作为可选的技术方案,所述的信号采集模块为设在微分析反应模块中微珠装载兼扫描通道一端的荧光检测设备或激光诱导荧光检测设备。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
一种用可寻址介观流控多元分析装置检测样本的方法,包括以下步骤:
(a)微珠的表面处理;
(b)微珠与探针结合,得到预包被探针的微珠;
(c)将预包被探针的微珠导入分析装置,利用分析装置检测样本。
作为可选的技术方案,所述的(c)步骤包括以下步骤:(c1)微珠的封闭;
(c2)样本溶液和微珠在反应通道中反应;(c3)洗涤溶液在反应通道中洗涤微珠;(c4)洗涤后的微珠泵入微珠装载兼扫描通道,进行扫描。
作为可选的技术方案,所述的(c)步骤包括以下步骤:(c1)微珠的封闭;(c2)样本溶液和微珠在反应通道中反应;(c3)洗涤溶液在反应通道中洗涤微珠;(c4)第二种样本溶液和微珠在反应通道中反应;(c5)洗涤溶液在反应通道中洗涤微珠;(c6)洗涤后微珠泵入微珠装载兼扫描通道进行扫描。
本发明优点在于:提供了一种可寻址介观流控多元分析装置,一种集样本富集、检测和回收一体化的检测分析系统,它同时还具有试剂消耗量低,反应速度快、效率高、检测灵敏度高、自动化程度高的特点。该分析装置可广泛应用于各种免疫分析,如药物靶标筛选、酶活性分析、食品中药物残留检测、环境污染物检测等,以及基因分析,如遗传病诊断、单核苷酸多态性分析等等。
【附图说明】
附图1是一种可寻址介观流控多元分析装置的结构示意图。
附图2是不同浓度的氯霉素检测荧光图。
附图3是不同富集程度的氯霉素检测荧光图。
【具体实施方式】
下面结合附图对本发明提供的一种可寻址介观流控多元分析装置及其检测方法的具体实施方式做详细说明。
附图中涉及的附图标记和组成部分如下所示:
101.微珠装载兼扫描通道 102.反应通道
103.样本通道 104.洗涤通道
201.第一微阀门 202.第二微阀门
203.第三微阀门 301.动力泵
302.控制器 303.激光诱导荧光检测器
401.液体储存容器
实施例1
一种可寻址介观流控多元分析装置
请参照图1
图1为一种优选的可寻址介观流控多元分析系统装置,该分析装置由微分析反应模块,动力控制模块,液体处理模块和信号采集模块组成。所述的微分析反应模块上设有反应通道102、微珠装载兼扫描通道101、样本通道103和洗涤通道104,所述的动力控制模块上设有动力泵301、控制器302、第一微阀门201、第二微阀门202、第三微阀门203。所述的微珠装载兼扫描通道101通过第一微阀门201,连接反应通道102;所述的样本通道103通过第二微阀门202,连接反应通道102;所述的洗涤通道104通过第三微阀门203,连接反应通道102;所述的反应通道102、微珠装载兼扫描通道101、样本通道103、洗涤通道104相互连接成一个四通十字形结构;所述的反应通道102另一端连接动力泵301;所述的控制器302分别连接第一微阀门201、第二微阀门202、第三微阀门203。所述的微珠装载兼扫描通道101一端设有荧光检测设备303。
优选方案中,微分析反应模块中反应通道102、微珠装载兼扫描通道101、样本通道103和洗涤通道104是由玻璃制成的,相互成90度连接。所述的反应通道102、微珠装载兼扫描通道101的直径为300微米,样本通道103和洗涤通道104的直径为200微米。动力控制模块中动力泵301是蠕动泵,控制器302是可编程控制器,第一微阀门201,第二微阀门202和第三微阀门203是电磁阀门。信号采集模块中,303是激光诱导荧光检测器。液体处理模块中,401是液体贮存容器。
实施例2
一种可寻址介观流控多元分析装置操作
请参照图1
图1中102为反应通道。微珠表面的探针与靶标反应场所。图中101为微珠装载兼扫描通道(所述的微珠装载兼扫描通道101在反应开始时为微珠装载通道,在反应结束后为微珠扫描通道)。反应开始时,开启第一微阀门201,微珠装载兼扫描通道101与反应通道102形成通路,微珠利用缓冲液在蠕动泵301的作用下泵入反应通道102。当微珠全部装载完毕后,第一微阀门201关闭。第二微阀门202开启,样本通道103与反应通道102形成通路,样本溶液开始进入反应通道103,样本溶液在蠕动泵301的作用下在样本通道103与反应通道102间来回摆动或循环流动。微珠表面预包被的探针将与样本溶液中的靶标进行反应,被捕获的靶标偶联在微珠表面。探针与靶标完全反应后,第二微阀门202关闭,第三微阀门203开启,洗涤通道104与反应通道102形成通路,洗液在蠕动泵301的作用下泵入反应通道102中,多余未反应的样本溶液随洗液流出。若存在多步反应,刚在洗涤过程结束之后,第三微阀门203关闭,第二微阀门202重新开启,另一种样本溶液在蠕动泵301的作用下泵入反应通道102,开始新的反应。反应结束后,重复洗涤过程,即第二微阀门202关闭,第三微阀门203开启,洗涤通道104与反应通道102形成通路,洗液在蠕动泵301的作用下泵入反应通道102,洗去多余未反应的样本溶液。所有反应结束后,第三微阀门203关闭,第一微阀门201重新开启,清洗后的微珠在蠕动泵301的作用下逆向进入微珠装载兼扫描通道101。激光诱导荧光检测器303扫描仪沿扫描通道方向顺序扫描并记录各个微珠表面的荧光信号值。
实施例3
抗生素多元检测
请参照图1
一、玻璃微珠的表面处理
1、二氧化硅微珠表面羟基化处理
称取100mg二氧化硅微珠置于1.5ml的离心管中,用乙醇洗涤三次,除去表面杂质和有机物,然后加入1ml浓度为6M的盐酸,37℃振荡反应过夜,反应过后用去离子水多遍洗涤至中性,洗净后置于110℃真空干燥箱中干燥2h。
2、羟基化微珠的硅烷化修饰
将羟基活化修饰微珠浸入浓度为2%的3-氨丙基三甲氧基硅烷的无水甲苯溶液,室温下振荡反应5h,用无水甲苯溶液清洗5次,每次3min;110℃真空干燥至少3h。用TNBS显色检验。硅烷化反应后的微珠直接置于室温下保存。
二、微珠表面抗生素探针的固定
取10mg氨基活化的微珠放于1.5ml的离心管中,向其中加入100μl浓度为4mg/ml的琥珀酸氯霉素、100μl浓度为0.2mol/l的MES缓冲液及15μl浓度为10mg/ml的碳二亚胺,37℃振荡反应2h后,再加入7.5μl浓度为100mg/ml的碳二亚胺,37℃再振荡反应1h,然后再加入7.5μl浓度为100mg/ml的碳二亚胺,37℃振荡反应4h,最后洗涤得固定有氯霉素的微珠。取10mg氨基化微珠加入1.5ml的离心管,再加入浓度为10%的琥珀酸酐100μl,37℃振荡反应24h得羧基化微珠。取10mg羧基化微珠加入1.5ml的离心管中,加入100μl浓度为2mg/ml的磺胺二甲基嘧啶,100μl浓度为0.2mol/l的MES缓冲液和15μl浓度为10mg/ml的碳二亚胺,37℃振荡反应2h后,再加入7.5μl浓度为100mg/ml的碳二亚胺,37℃再振荡反应1h,然后再加入7.5μl浓度为100mg/ml的碳二亚胺,37℃振荡反应4h,洗涤后得固定有磺胺二甲嘧啶的微珠。
三、利用可寻址介观流控多元分析装置检测分析
开启第一微阀门201,将固定有琥珀酸氯霉素和磺胺二甲嘧啶的微珠按特定的顺序利用PBS缓冲液,在蠕动泵301作用下通过微珠装载兼扫描通道101泵入反应通道102中。然后关闭第一微阀门201,开启第二微阀门202,首先泵入1%的BSA溶液,保持反应通道102在37℃,封闭反应10min。封闭反应结束后,关闭第二微阀门202,开启第三微阀门203,控制蠕动泵流速为10μl/min,分别泵入PBST和PBS分别各洗涤微珠3min。接下来,关闭第三微阀门203,再开启第二微阀门202,泵入氯霉素抗体,磺胺二甲嘧啶抗体及两种药物标准品的混合物,保持反应通道102在37℃,控制蠕动泵流速1μl/min条件下,反应10min。反应结束后关闭第二微阀门202,开启第三微阀门203,重复上述洗涤过程。洗涤过后关闭第三微阀门203,再开启第二微阀门202,泵入cy5标记的羊抗鼠IgG,保持反应通道102在37℃,流速1μl/min条件下,反应10min。反应结束后关闭第二微阀门202,开启第三微阀门203,重复洗涤过程。所有反应结束后,第三微阀门203关闭,第一微阀门201重新开启,反应结束并清洗后的微珠在蠕动泵301的作用下逆向进入微珠装载兼扫描通道101。激光共聚焦荧光扫描仪303沿扫描通道方向顺序扫描并记录各个微珠表面的荧光信号值,利用可寻址介观流控多元分析装置,根据荧光竞争免疫原理检测氯霉素的荧光扫描结果见图2。
实施例4
DNA多元检测
请参照图1
一、微珠表面的处理
1、二氧化硅微珠表面羟基化处理
称取100mg二氧化硅微珠置于1.5ml的离心管中,用乙醇洗涤三次,除去表面杂质和有机物,然后加入1ml浓度为6M的盐酸,37℃振荡反应过夜,反应过后用去离子水多遍洗涤至中性,洗净后置于110℃真空干燥箱中干燥2h。
2、玻璃微珠的硅烷化
将酸洗玻璃微珠浸入浓度为2%的3-氨丙基三甲氧基硅烷的无水甲苯溶液,室温下振荡反应5h,用无水甲苯溶液清洗5次,每次3min;110℃真空干燥至少3h。用TNBS显色检验。硅烷化反应后的微珠直接置于室温下保存。
3、异硫氰酸化珠NCS-Beads的制备
10mg硅烷化处理的玻璃微珠浸泡在500μl含0.2%的1,4-苯二异硫氰酸酯和10%吡啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,37℃转速为600rpm振荡反应2h,DMF洗5遍,无水乙醇洗3遍,二氯甲烷洗3遍,最后室温真空干燥。
二、寡核苷酸在异硫氰酸化珠NCS-Beads上的固定
利用DNA的固相化学合成的方法按设计要求合成4种含35个碱基不同序列的寡核苷酸链,其序列如下:
编号 Oligo序列
1 5’-NH2(T)20-CTGACTTTTATGCCC-3’(见SEQ ID NO:1)
2 5’-NH2(T)20-CTGACTTCTATGCCC-3’(见SEQ ID NO:2)
3 5’-NH2(T)20-AGGGCCTCACCACCA-3’(见SEQ ID NO:3)
4 5’-NH2(T)20-AGGGCCTTACCACCA-3’(见SEQ ID NO:4)
5mg异硫氰酸化珠NCS-Beads置于含3μM的上述4种β地贫寡核苷酸探针的浓度为0.05M,pH为8.5的硼酸钠缓冲液40μl。37℃下避光振荡反应过夜,用去离子水洗5次,常温真空干燥。
三、利用可寻址介观流控多元分析装置进行DNA多元分析
开启第一微阀门201,将固定有4种不同β地贫寡核苷酸探针的微珠按特定的顺序利用PBS缓冲液,在蠕动泵301作用下通过微珠装载兼扫描通道101泵入反应通道102中。然后关闭第一微阀门201,开启第二微阀门202,首先泵入1%的BSA溶液,保持反应通道102在37℃,封闭反应10min。封闭反应结束后,关闭第二微阀门202,开启第三微阀门203,控制蠕动泵流速为10μl/min,分别泵入2×SSC+0.02%SDS和2×SSC分别各洗涤微珠3min。接下来,关闭第三微阀门203,再开启第二微阀门202,泵入荧光标记的人血红蛋白(HBB)基因的PCR扩增产物杂交液10μl,保持反应通道102在37℃,流速1μl/min条件下,反应10min。反应结束后关闭第二微阀门202,开启第三微阀门203,重复上述洗涤过程。洗涤过后关闭第三微阀门203,第一微阀门201重新开启,微珠在蠕动泵301的作用下逆向进入微珠装载兼扫描通道101。激光共聚焦荧光扫描仪303沿扫描通道方向顺序扫描并记录各个微珠表面的荧光信号值。
实施例5
样本富集
请参照图1
微珠的处理及表面琥珀酸氯霉素的固定方法同实施例3。反应开始时,首先开启第一微阀门201,将固定有琥珀酸氯霉素的微珠利用PBS缓冲液,在蠕动泵作用下通过微珠装载通道泵入反应通道102中。然后关闭第一微阀门201,开启第二微阀门202,首先泵入1%的BSA溶液,保持反应通道102在37℃,封闭反应10min。封闭反应结束后,关闭第二微阀门202,开启第三微阀门203,控制蠕动泵流速为10μl/min,分别泵入PBST和PBS分别各洗涤微珠3min。接下来,关闭第三微阀门203,再开启第二微阀门202,泵入氯霉素抗体和氯霉素标准品或待测样本,保持反应通道102在37℃,流速1μl/min条件下,反应10min。当进行实际样本检测时,在上述反应条件下,保持反应样本溶液多次循环流动实现富集功能。反应结束后关闭第二微阀门202,开启第三微阀门203,重复上述洗涤过程。洗涤过后关闭第三微阀门203,再开启第二微阀门202,泵入cy5标记的羊抗鼠IgG,保持反应通道102在37℃,流速1μl/min条件下,反应10min。反应结束后关闭第二微阀门202,开启第三微阀门203,重复上述洗涤过程。所有反应结束后,第三微阀门203关闭,第一微阀门201重新开启,反应结束并清洗后的微珠在蠕动泵301的作用下逆向进入微珠装载兼扫描通道101。激光共聚焦荧光扫描仪303沿扫描通道方向顺序扫描并记录各个微珠表面的荧光信号值,利用可寻址介观流控多元分析装置,根据荧光免疫原理检测氯霉素荧光扫描结果见图3。
实施例6
样本回收
请参照图1
微珠的处理及表面寡核苷酸探针的固定方法同实施例4。反应开始时,开启第一微阀门201,将固定有1号探针(SEQ ID NO:1,5’-NH2(T)20-CTGACTTTTATGCCC-3’)的微珠利用PBS缓冲液,在蠕动泵作用下通过微珠装载通道泵入反应通道102中。然后关闭第一微阀门201,开启第二微阀门202,首先泵入1%的BSA溶液,保持反应通道102在37℃,封闭反应10min。封闭反应结束后,关闭第二微阀门202,开启第三微阀门203,控制蠕动泵流速为10μl/min,分别泵入PBST和PBS分别各洗涤微珠3min。接下来,关闭第三微阀门203,再开启第二微阀门202,泵入待测DNA样本,保持反应通道102在42℃,流速1μl/min条件下,反应10min。反应结束后关闭第二微阀门202,开启第三微阀门203,重复上述洗涤过程。反应结束后,第三微阀门203关闭,第一微阀门201重新开启,反应结束并清洗后的微珠在蠕动泵301的作用下逆向进入微珠装载兼扫描通道101。激光共聚焦荧光扫描仪303光头沿扫描通道方向顺序扫描并记录各个微珠表面的荧光信号值,扫描结束并记录相关分析数据后,第一微阀门201重新开启,微珠再通过装载通道进行入反应通道102,然后关闭第一微阀门201,开启第二微阀门202,泵入0.15M的NaOH溶液,液体在37℃循环反应30分钟以洗脱与微珠上固定DNA片段杂交的目标DNA片段,收集洗脱液,经乙醇沉淀回收样本DNA,从而实现该系统的样本回收功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>华东理工大学
<120>一种可寻址介观流控多元分析装置及其检测方法
<130>/
<160>4
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列AGGGCCTTACCACCA
<400>4
Claims (13)
1.一种可寻址介观流控多元分析装置,包括下列组成部分:
(a)微分析反应模块;
(b)动力控制模块;
(c)液体处理模块;
(d)信号采集模块,
所述的微分析反应模块包括微珠载体和微通道,所述的微通道包括反应通道、微珠装载兼扫描通道、样本通道和洗涤通道,所述的微珠装载兼扫描通道通过第一微阀门,连接反应通道;所述的样本通道通过第二微阀门,连接反应通道;所述的洗涤通道通过第三微阀门,连接反应通道;所述的反应通道、微珠装载兼扫描通道、样本通道、洗涤通道相互连通;所述的反应通道另一端连接动力泵;
所述的动力控制模块由动力泵,连接泵和多元分析装置的毛细管,控制管道液体流动的微阀门以及控制器组成;
所述的液体处理模块由反应液,缓冲液供给系统及反应后液体收集系统组成;
所述的信号采集模块为安装在扫描通道一端的荧光信号检测设备或激光诱导荧光检测设备;
所述的反应通道、微珠装载兼扫描通道、样本通道、洗涤通道通过毛细管相互连接。
2.根据权利要求1所述的多元分析装置,其特征在于,所述的反应通道、微珠装载兼扫描通道、样本通道和洗涤通道为玻璃、塑料或聚二甲基硅氧烷与玻璃片偶联形成。
3.根据权利要求1所述的多元分析装置,其特征在于,所述的各通道的内径由微珠直径决定,反应通道、微珠装载兼扫描通道的内径略大于微珠直径,样本通道和洗涤通道的内径略小于微珠直径。
4.根据权利要求1所述的多元分析装置,其特征在于,所述的微珠材料选自玻璃、金属、硅、陶瓷或多聚高分子中的一种。
5.根据权利要求1所述的多元分析装置,其特征在于,所述的动力泵是蠕动泵或注射泵。
6.根据权利要求1所述的多元分析装置,其特征在于,所述的第一微阀门是电磁阀门或球阀门、第二微阀门是电磁阀门、第三微阀门是电磁阀门或球阀门。
7.根据权利要求1所述的多元分析装置,其特征在于,所述的控制器是可编程控制器。
8.根据权利要求1所述的多元分析装置,其特征在于,所述的控制器分别连接和控制第一微阀门、第二微阀门、第三微阀门。
9.如权利要求1所述的多元分析装置,其特征在于,利用微珠的特定装载顺序编码各个微珠,检测结果根据微珠编码顺序寻址。
10.如权利要求1所述的多元分析装置,其特征在于,不同的微珠表面固定不同的探针,多种固定不同探针的微珠同时装载入分析反应通道实现多元同时检测。
11.一种如权利要求1所述的分析装置检测样本的方法,所述方法用于非诊断目的,其特征在于,包括以下步骤:
(a)微珠的表面处理;
(b)微珠与探针结合,得到预包被探针的微珠;
(c)将预包被探针的微珠导入分析装置,利用分析装置检测样本。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述的(c)步骤包括以下步骤:(c1)样本溶液和微珠在反应通道中反应;(c2)洗涤溶液在反应通道中洗涤微珠;(c3)洗涤后的微珠泵入微珠装载兼扫描通道,进行扫描。
13.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述的(c)步骤包括以下步骤:(c1)样本溶液和微珠在反应通道中反应;(c2)洗涤溶液在反应通道中洗涤微珠;(c3)第二种样本溶液和微珠在反应通道中反应;(c4)洗涤溶液在反应通道中洗涤微珠;(c5)洗涤后微珠泵入微珠装载兼扫描通道,进行扫描。
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