JP6602772B2 - 認識化合物付着モノリス、そのアレイ、およびその使用 - Google Patents
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Description
他に定義されていない限り、本明細書中の科学技術用語は全て、本発明が属する技術分野における当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。1つの用語に複数の定義が存在する場合には、特に明記されていない限り、本項に記載のものが優先する。
モノリスは、粒子間空隙のない、一体に連続した多孔質媒体であって、クロマトグラフィ担体として一般に使用されている(例えば、Ueki et al., Anal. Chem. (2004) 76, 7007-7012; Ueki et al., J. Chromatography A (2006) 1106, 106-111; Saburadin et al., Analytica Chimica Acta (2012) 736 108-114; Shu et al., J. Chromatography A (2011) 1218 5288-5234; Lubbad et al., J. Chromatography A (2011) 1218 8897-8902; Lubbad et al., J. Chromatography A (2011) 1218 2362-2367)。概略的には、モノリスは、相互接続されたセルまたはチャネルの繰返しを含む任意の単体の構造体であり、所定の空隙率によって特徴付けられ、固相とそれを囲む移動相との間の相互作用をサポートする。移動相が多孔質のモノリスメディアを通過させられることにより、対流が生じ、物質移動が促進される。モノリスは、ポリマー(すなわち有機物)、シリカ、有機物−シリカハイブリッド、無機物、クライオゲルおよびアガロースをベースとすることができ、最初の2つのタイプが最も一般的である。
核酸プログラム型化合物ライブラリーの調製方法が提供される。その方法は、核酸分子の混合物を、2つ以上のアドレス可能なウェルを有するブロックを含むアレイと接触させる工程を含む。各ウェルは、一本鎖核酸と選択的に結合することで核酸分子を亜集団にスプリットする1つ以上の付着認識化合物を有するモノリスを含む。いくつかの実施形態においては、アレイは2つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、各カラムの付着オリゴヌクレオチドは化学反応サイトまたはリガンドに動作的に結合している相補的オリゴヌクレオチドに選択的に結合する。ここで、上記相補的ヌクレオチドは混合物の成分である。
2個の#4チタン製グレード5のワッシャー(United Titanium、外径=0.3125インチ、内径=0.125インチ、厚さ=0.032インチ)に、#6−32タップ(外形=0.136インチ、32ネジ山/インチ)でネジを切り、水で洗浄し、アセトンで洗浄した後、5分間乾燥させた。その後、各ワッシャーをエッペンドルフチューブに入れ、115μlのMPS(Gelestから入手した[3−(メタクリロイルオキシ)プロピル]トリメトキシシラン)の溶液約250μl、および345μlのヘプタンに溶解した40μlのチタンn−ブトキシド(Gelest)を加え、チューブを振盪し、上下を反転させた。約15分後、上記ワッシャーを15〜30分間空気乾燥させ、99℃で45分間硬化させ、アセトンで濯いで過剰の未反応試薬を除去し、さらに5分間の空気乾燥を行った。
上記シラン処理したチタンワッシャーをフォイルバッグ(Sigma #183385)に入れ、そのバッグをN2で5回フラッシュした後に閉じた。3mLのGMA、1mLのEDMA、3mLの1−プロパノール、2.4mLの1,4−ブタンジオールおよび0.6mLの水を含む混合物をN2で約2分間スパージし、約10分間超音波処理し、この時点で10mgのAIBN(2,2’−アゾビス(2−メチルプロピオニトリル)を加え、この混合物を撹拌して開始剤を溶解させた。さらに1分間この混合物を超音波処理し、上部の空間をN2で約30秒間パージし、上記シラン処理したワッシャーが入っているフォイルバッグに注ぎ、残留する空気/N2を除去した後、封をした。上記ワッシャーは2枚の外側のアルミニウム板でサンドイッチ状に挟まれており、これによりポリマーはワッシャーのネジ穴(「ウェル」)内にのみ生成した。このアセンブリを60℃のオーブン内に水平に置き、終夜インキュベーションした。上記プレート/クランプアセンブリをオーブンから取り出し、室温と平衡化させ、中身を取り出してモノリスワッシャーを得た。過剰のモノリスは上記ワッシャーのエッジから除去した。
機械加工により384ウェルのプレートに形成された厚さ3.125mmの6061グレードアルミニウム板を水道水で洗浄し、蒸留水で5分間濯ぎ、アセトン中で15分間洗浄し、5分間空気乾燥した。上記プレートを、約45℃で約10分間、10%NaOHで処理し、過剰のNaOHを拭取り除去し、該プレートの表面全体が銀色になるまで30%HNO3溶液に浸漬した(1〜3分間)。その後、上記プレートを蒸留水で濯ぎ、10〜60分間空気乾燥させ、60℃で15分間、30%のMPSアセトン溶液で処理し、アセトン中で3回洗浄し、空気乾燥させ、80℃で終夜硬化させた。その後、上記プレートをアセトンで洗浄し、約10〜15分間空気乾燥させた。
実施例3で調製した、シラン処理したアルミニウムプレートをフォイルバッグ(Sigma #Z183393)に入れ、そのバッグをN2で5回フラッシュした後に閉じた。15mLのGMA、5mLのEDMA、15mLの1−プロパノール、12mLの1,4−ブタンジオールおよび3mLの水を含む混合物をN2で約5分間スパージし、約10分間超音波処理し、この時点で25〜50mgのAIBNを加え、この混合物を撹拌して開始剤を溶解させた。さらに1分間、混合物を超音波処理し、上部の空間をN2で約1分間パージし、上記シラン処理したアルミニウムプレートが入っているフォイルバッグに注ぎ、残留する空気/N2を除去した後、封をした。その後、封入された上記シラン処理アルミニウムプレートを2個の外側アルミニウムブロックの間に挟み、該アルミニウムブロックをC型クランプで締め付けた。これにより、ポリマーが確実にプレートの機械加工された穴(「ウェル」)の内部でのみ生成するようにした。このアセンブリを60℃のオーブン内に水平に置き、終夜インキュベーションした。上記プレート/クランプアセンブリをオーブンから取り出し、室温と平衡化させ、中身を取り出してモノリスアレイプレートを得た。過剰のモノリスは上記プレートのエッジから除去した。
簡潔に言えば、実施例4で調製したモノリスアレイの各ウェルに、20μlのアジ化ナトリウムの水溶液(8mLの水および4.6mLの氷酢酸に25mmol)を加え、真空を使用してモノリスを通して抜き出した。上記手順を1回繰り返し、上記アジド溶液を入れたバスに上記アレイを移し、約5分間脱ガスを行い、上記アジド溶液を満たしたリザーバに移し、30℃で終夜インキュベーションを行い、蒸留水で十分に洗浄し、水中に保管してアジドアルコール官能化モノリスアレイを得た。
0.1Mのリン酸ナトリウム、pH7.0、625μMのCuSO4、3.125mMのTHPTA(トリス(3−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン、Sigma−Aldrich)、12.5mMのアミノグアニジン−HCl、0.3MのNaCl、12.5mMのアスコルビン酸塩および1nmolの固定化されるべきオリゴヌクレオチド(一般構造は5’ヘキシニル−TTTTTTTTTT−アンチコドン、Eurofins MWG Operon Inc., 2211 Seminole Drive Huntsville, AL 35805より購入)を含有する30μlの「クリック」溶液を、アレイの各アジド−アルコール官能化モノリスに加え、合計1時間のインキュベーションを行った。上記「クリック」溶液を一定間隔(約15分毎)でモノリスから遠心分離し、新しいアスコルビン酸塩を補充(100mMのアスコルビン酸塩3μl以下を添加)して同じモノリスに戻した。1時間のインキュベーションの後、上記「クリック」溶液をモノリスから遠心分離し、30μlのトリス−EDTA緩衝液(10mMのトリス−HCl、pH8.0、1mMのEDTA)でアレイを3回洗浄して銅をキレート化し、反応を停止させた。得られた官能化アレイは、1mMのEDTA、0.02%のアジド中、4℃で保管した。
実施例6で処理したモノリスアレイ中の任意の未反応アジ化物群は、次のようにしてプロピオール酸と反応させることによりブロックした。0.1Mのリン酸ナトリウム、pH7.0、625μMのCuSO4、3.125mMのTHPTA(トリス(3−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン、Sigma−Aldrich)、12.5mMのアミノグアニジン−HCl、0.3MのNaCl、12.5mMのアスコルビン酸塩および8mMのプロピオール酸を含有する30μlの「クリック」溶液を、アレイの各官能化モノリスに加え、合計30分間のインキュベーションを行った。上記「クリック」溶液を一定間隔(約15分毎)でモノリスから遠心分離し、新しいアスコルビン酸塩を補充(100mMのアスコルビン酸塩3μl以下を添加)して同じモノリスに戻した。30分のインキュベーション後、上記「クリック」溶液をモノリスから遠心分離し、30μlのトリス−EDTA緩衝液(10mMのトリス−HCl、pH8.0、1mMのEDTA)でアレイを3回洗浄して銅をキレート化し、反応を停止させた。処理したアレイを、1mMのEDTA、0.02%のアジ化物中、4℃で保管した。
上記プレートを、約45℃で約15分間、約10%のNaOHで処理したこと以外は、実施例3と同様にしてシラン処理を行った。
実施例5の手順を使用して上記モノリスアレイを得た。
#10−32タップ(外径=0.19インチ、ネジ山数/インチ=32)を用いてワッシャーにネジを切り、シンチレーションバイアル中、1:10のEDMA:メタノール溶液に浸した。入射UV光を分散させるために、各ワッシャーの中央部にステンレス製のコーンを配置した。また、外径面を結合強度の試験に使用するために、ワッシャーの側面周囲にもコーンを配置した。次いで、バイアルを約1cmの高さまでEDMA:メタノール溶液に浸漬させた。その後、約3cmの距離から15分間、302nmのUV光をワッシャーに照射し、ワッシャーを反転させて、約3cmの距離から15分間、302nmのUV光を再度照射し、メタノールで3回濯ぎ、空気乾燥させ、窒素下でフォイルバッグ中に保管した。このワッシャーを使用して実施例2に記載の手順によりモノリスを成型した。
Claims (14)
- 核酸ライブラリーを予備的に分離するデバイスであって、
移動相が流通可能な複数のウェルを含む固相ブロックと、
前記ブロックの各ウェルにそれぞれ形成されたモノリスと、
を備えており、
ここで、前記各ウェルのモノリスのそれぞれは、化学反応サイトまたはリガンドに動作的に結合している相補的オリゴヌクレオチドに選択的に結合する付着オリゴヌクレオチドを有しており、溶媒に対して透過性を有するモノリスカラムとして形成されている、デバイス。 - 前記各ウェルのモノリスのそれぞれは、アミド結合、エステル結合、ウレア結合、ウレタン結合、炭素−ケイ素結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、エーテル結合、チオエーテル結合、もしくはジスルフィド結合を形成することにより、または環状付加により、該ウェルの表面に共有結合的に結合されている、請求項1に記載の分離デバイス。
- 前記ブロックは、チタン、アルミニウム、ステンレス鋼、ドープドメタル、ガラス、石英、ポリカーボネート、溶融シリカ、ポリ(メチルメタクリレート)、プラスチック、ポリエーテルエーテルケトン、ドープドポリエーテルエーテルケトン、ドープドポリスチレン、環状オレフィンコポリマー、ポリエーテルイミド、ドープドポリプロピレン、またはこれらの組合せから構成されている、請求項1に記載の分離デバイス。
- 前記ブロックは、アルミニウムから構成されている、請求項3に記載の分離デバイス。
- 前記アルミニウムの表面は、シラン処理されている、請求項4に記載の分離デバイス。
- 前記モノリスは、ポリマーからなるモノリスであり、該モノリスと前記表面がシラン処理されたアルミニウムとの共有結合は、炭素−炭素結合である、請求項5に記載の分離デバイス。
- 前記モノリスは、ポリマーからなるモノリスである、請求項1に記載の分離デバイス。
- 前記モノリスは、ポリ(GMA−co−EDMA)から構成されている、請求項7に記載の分離デバイス。
- 前記各ウェルのモノリスのそれぞれは、約0.5fmol/μL〜約0.4nmol/μLの一本鎖核酸を結合し得る、請求項1に記載の分離デバイス。
- 前記モノリス上の前記付着オリゴヌクレオチドの密度は、約1pmol/10μL〜約1μmol/μLである、請求項1に記載の分離デバイス。
- 前記各ウェルのモノリスのそれぞれは、約0.5fmol/μL〜約0.4nmol/μLの一本鎖核酸を結合し得る、請求項10に記載の分離デバイス。
- 前記付着オリゴヌクレオチドの前記相補的オリゴヌクレオチドに結合する速度定数は、約1×10 2 M−1s−1〜約1×106M−1s−1である、請求項1に記載の分離デバイス。
- 核酸プログラム型化合物ライブラリーを調製する方法であって:
請求項1〜12のいずれか一項に記載のデバイスの前記ウェルに形成された前記モノリスに、核酸分子の混合物を接触させ、それによって該核酸分子を複数の亜集団にスプリットすること;
前記核酸分子の亜集団を分離容器に移すこと;
および、
前記分離された核酸分子の亜集団を、異なる化学サブユニットと反応させること、ここで、前記デバイスの各ウェルは前記分離容器とアドレス可能に配列される;
を包含する、核酸プログラム型化合物ライブラリーの調製方法。 - 核酸プログラム型化合物ライブラリーを調製する方法であって:
請求項1〜12のいずれか一項に記載のデバイスの前記ウェルに形成された前記モノリスに、核酸分子の混合物を接触させ、それによって該核酸分子を複数の亜集団にスプリットすること;
前記核酸分子の亜集団を、アニオン交換材を含む2つ以上のアドレス可能なウェルを具備するブロックを含むアレイに移すことにより、該核酸分子の亜集団を該ウェルに固定すること;
および、
前記固定された核酸分子の亜集団を、異なる化学サブユニットと反応させること、ここで、前記デバイスの各ウェルは、前記アニオン交換材を含む前記アレイのアドレス可能なウェルとアドレス可能に配列される;
を包含する、核酸プログラム型化合物ライブラリーの調製方法。
Applications Claiming Priority (5)
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