KR20160122174A - 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스, 이의 어레이 및 이의 용도 - Google Patents

부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스, 이의 어레이 및 이의 용도 Download PDF

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KR20160122174A
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페르 하베리
매이든 페이드헌개트
로빈 프린스
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다이스 몰레큘스 에스브이, 엘엘씨
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Abstract

리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스, 이러한 모놀리스의 제조 방법, 이의 어레이 및 이의 사용이 본 명세서에서 제공된다. 예를 들면, 본 명세서에서 제공된 모놀리스는 칼럼 및 이의 어레이에서 사용될 수 있다.

Description

부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스, 이의 어레이 및 이의 용도{MONOLITHS WITH ATTACHED RECOGNITION COMPOUNDS, ARRAYS THEREOF AND USES THEREOF}
본 출원은 각각 2014년 1월 28일 및 2014년 6월 2일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/932,747호 및 제62/006,845호를 35 U.S.C. §119(e) 하에 우선권으로 주장하고, 이는 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입된다.
분야
리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스(monolith), 이러한 모놀리스의 제조 방법, 이의 어레이 및 이의 용도가 본 명세서에서 제공된다. 예를 들면, 본 명세서에서 제공된 모놀리스는 칼럼(column) 및 이의 어레이에서 사용될 수 있다.
가교결합된 중합체 지지체는 촉매작용, 분리 및 고체상 합성에 유용하였다. 가교결합된 중합체 지지체는 초기에 균질한 다공성 입자로서 제공되었고, 이는, 그 중에서도, 크로마토그래피를 포함한 연속 흐름 공정에서 전형적으로 사용되었다. 그러나, 미립자 흡착제의 사용과 관련하여 다수의 중요한 사안이 존재한다: 특히 거대분자의 경우, 불량한 분별능을 야기하는 대류 흐름 사이의 느린 교환 및 고체 지지체에 대한 결합, 채워진 입자 사이의 큰 공극 용적, 높은 배압 및 낮은 동적 결합 능력. 상기 한계점은 다양한 리간드를 결합시킬 수 있는 부착된 인식 분자를 갖는 작용화된 지지체로서 균질한 다공성 입자의 사용을 제한시켰다.
보다 최근에, 다공성 모놀리스형 물질이 개발되었다(Arrua, et al., Materials(2009) 2 2429-2466; Svec et al., Monolith Materials, J. of Chromatography Library, Vol. 67, Svec et al.,(Eds.); Wu et al., J. Chromatography A(2008) 369-392). 이들 비균질 매크로다공성 중합체는 경직된 다공성 구조를 갖고, 이는 제조 동안 형성되고 임의의 용매 중에 또는 건조한 상태에서 유지되며 모놀리스에 스폰지와 같은 특성을 부여한다. 중요하게, 큰 공극 용적(즉, 높은 투수율), 거대분자의 느린 교환(즉, 불량한 물질 전달 속도), 불량한 분별능 및 높은 배압의 문제점은 이러한 모놀리스형 물질에서 완화되고, 여기서 유체 흐름은 모놀리스의 기공을 통한다. 최근에, 모놀리스는 주로 크로마토그래피 분리를 위해 사용되어 왔고, 리간드 결합 및, 예를 들면, 어레이에서 사용을 위한 부착된 인식 분자(특히, DNA)를 갖는 작용화된 모놀리스의 제조는 상대적으로 적은 관심을 받았다.
따라서, 필요한 것은 부착된 인식 화합물을 포함하는 모놀리스 및 이러한 모놀리스의 어레이이다. 이러한 모놀리스 및 이의 어레이는, 그 중에서도, 리간드 결합에 유용할 것이다.
본 발명은 인식 화합물을 갖는 작용화된 모놀리스, 이의 어레이 및 이의 사용을 제공한다. 하나의 양상에서, 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스가 제공된다. 인식 화합물은 리간드를 선택적으로 결합시킨다. 몇몇 실시형태에서, 인식 화합물은 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드(peptoid), 중합체, 폴리실록산, 50 달톤 초과의 분자량의 무기 화합물, 약 3000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합이다. 다른 실시형태에서, 리간드는 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드, 중합체, 폴리실록산, 50 달톤 초과의 분자량의 무기 화합물, 약 3000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합이다.
몇몇 실시형태에서, 리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 포함하는 모놀리스를 포함하는 하우징(housing)이 제공된다. 다른 실시형태에서, 하우징은 화합물 라이브러리의 멤버들을 선택적으로 결합시키고, 이는 파지 디스플레이, RNA 디스플레이 또는 핵산 프로그램가능한 조합 화학에 의해 제공될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 어레이가 제공된다. 어레이는 리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 포함하는 모놀리스를 포함하는 둘 이상의 하우징을 포함한다. 다른 실시형태에서, 어레이는 하우징을 함유하는 2개 이상의 웰(well)을 포함하는 블록을 포함한다. 하우징은 리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 포함하는 모놀리스를 포함한다.
또 다른 양상에서, 모놀리스 매질이 제공된다. 모놀리스형 매질은 리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 갖는 응집된 입자를 포함한다.
또 다른 양상에서, 둘 이상의 이온 교환 하우징을 포함하는 어레이가 제공된다. 이온 교환 하우징은 이온화가능 기를 갖는 모놀리스를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 어레이는 필터 플레이트 또는 이동상을 통한 흐름을 허용하는 임의의 기타 유형의 마이크로플레이트 또는 디바이스, 및 이온 교환 물질을 함유하는 2개 이상의 웰을 포함하는 블록을 포함한다. 이온 교환 물질은 이온화가능 기를 포함하는 모놀리스를 포함한다.
또 다른 양상에서, 화학적 화합물의 핵산 프로그래밍된 라이브러리의 제조 방법이 제공된다. 방법은 핵산 분자의 혼합물을 둘 이상의 어드레서블(addressable) 웰을 갖는 블록을 포함하는 어레이와 접촉시키는 단계를 포함한다. 각각의 웰은 하나 이상의 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 포함하고, 이는 단일 가닥 핵산을 선택적으로 결합시켜 핵산 분자를 소집단(subpopulation)으로 분할한다. 핵산 분자의 소집단은, 예를 들면, 상승된 온도, 이온 강도의 변화 또는 pH 변화를 사용하여, 임의로 인식 화합물로부터 해리될 수 있고, 해리된 핵산 분자는 별도의 컨테이너로 이송된다. 그 다음, 핵산 분자의 분리된 소집단은 상이한 화학 소단위(subunit)와 반응하고, 여기서 핵산 분자는 적어도 하나의 결합 서열 및 하나의 화학 반응 부위를 포함한다. 핵산 분자의 소집단이 임의로 별도의 컨테이너로 이송되는 경우, 핵산을 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 포함하는 웰은 어드레서블 방식으로 별도의 컨테이너와 정렬된다.
또 다른 양상에서, 화학적 화합물의 핵산 프로그래밍된 라이브러리의 제조 방법이 제공된다. 방법은 핵산 분자의 혼합물을 둘 이상의 어드레서블 웰을 갖는 블록을 포함하는 어레이와 접촉시키는 단계를 포함한다. 각각의 웰은 하나 이상의 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 포함하고, 이는 단일 가닥 핵산을 선택적으로 결합시켜 핵산 분자를 소집단으로 분할한다. 핵산 분자의 소집단은 필터 플레이트 또는 이동상을 통한 흐름을 허용하는 임의의 기타 유형의 마이크로플레이트 또는 디바이스, 및 둘 이상의 어드레서블 웰을 함유하는 블록을 포함하는 제2 어레이로 이송된다. 핵산 분자의 소집단은, 예를 들면, 상승된 온도, 이온 강도의 변화 또는 pH의 변화를 사용하여, 인식 화합물로부터 해리될 수 있다. 제2 어레이의 웰은 핵산 분자의 소집단을 비특이적으로 고정화시키는 음이온 교환 물질을 포함한다. 핵산 분자의 고정화된 소집단은 상이한 화학 소단위와 반응한다. 핵산을 선택적으로 결합시키는 하나 이상의 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 포함하는 웰은 어드레서블 방식으로 음이온 교환 물질을 포함하는 웰과 정렬된다. 핵산 분자는 적어도 하나의 결합 서열 및 하나의 화학 반응 부위를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 음이온 교환 물질은 음이온 교환기를 갖는 모놀리스를 포함한다.
또 다른 양상에서, 디바이스가 제공된다. 디바이스는 분리된 블록을 포함하는 2개의 어레이를 포함한다. 제1 어레이의 블록은 리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 포함하는 둘 이상의 어드레서블 웰을 포함한다. 제2 어레이의 블록은 필터 플레이트 또는 이동상을 통한 흐름을 허용하는 임의의 기타 유형의 마이크로플레이트 또는 디바이스, 및 이온 교환 물질을 포함하는 둘 이상의 어드레서블 웰을 포함한다. 리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 포함하는 웰은 이온 교환 물질을 포함하는 웰과 정렬된다. 몇몇 실시형태에서, 이온 교환 물질은 이온 교환기를 갖는 모놀리스를 포함한다.
도 1은 단편의 라이브러리의 예시적인 DNA-지정된 분할을 나타낸다. 당해 예시에서 핵산 태그의 퇴화 가계(degenerate family)는 카테나 20 염기쌍 뉴클레오타이드 서열로 구성되고, 이는 불변(C1-C5) 또는 가변(a1-j4)이다. DNA 단편의 가변 영역에서 문자 a1 내지 j4는 직교 혼성화 성질을 갖는 별개의 20 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 제1 분할을 수행하기 위하여, 단편의 퇴화 가계는 서열 a1 c-j1 c를 나타내는 상이한 친화성 수지 10개의 1 세트를 통과하고, 이는 제1 가변 영역에서 서열 a1-j1에 상보적이다(예시적인 친화성 수지는 원형으로 표시된다). 단편의 원래 가계의 10개의 서브풀(sub-pool)이 야기된다. 그 다음, 핵산 태그의 각각의 서브풀은 별개의 화학 단량체와 반응하여, 각각의 핵산 태그의 화학 반응 부위에서 별개의 화학 단량체의 커플링을 허용한다. 그 다음, 서브풀은 재조합되고, 라이브러리는 서열 a2-j2 등을 기반으로 하는 서브풀의 새로운 세트로 분할된다.
도 2는 핵산 태그의 화학 반응 부위에서 예시적인 화학 커플링 반응을 보여준다. 화학 반응 부위를 포함하는 핵산 태그를 DMF 중의 FMOC-알라닌의 NHS 에스터로 처리한다. FMOC 보호기를 피페리딘으로 제거하여 핵산 태그의 화학 반응 부위에 커플링된 알라닌을 제공한다. 별개의 폴리펩타이드의 라이브러리를 제조하기 위하여 연속적인 단계로 다양한 아미노산으로, 공정을 수회 반복할 수 있다.
도 3a 내지 도 3d는 일련의 칼럼을 사용하여 별개의 화학적 화합물의 라이브러리를 생성시키는 분배 기반 화학적 합성의 방법을 도시한다.
도 4는 좌측에서 우측으로 A12, D11, T1, D12 및 A11인 예시적인 혼성화 어레이를 도시한다. 앞면은 상부에 있고, 디바이스의 상부는 좌측에 있다.
도 5는 좌측에서 우측으로 D01, T1 및 D02인 예시적인 이송 어레이를 도시한다. 앞면은 상부에 있고, 디바이스의 상부는 좌측에 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명에 속한 분야의 숙련가에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 용어에 대한 복수의 정의가 존재하는 경우, 달리 기재되지 않는다면 당해 부문의 정의가 우선한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 단수형이 복수의 지시대상을 포함한다는 것을 주의하여야 한다. 따라서, 예를 들면, "태그"에 대한 언급은 복수의 이러한 태그를 포함하고, "화합물"에 대한 언급은 하나 이상의 화합물 및 당해 분야의 숙련가에게 알려진 이의 대등체를 포함하는 것 등이다.
청구항은 임의의 선택적 요소를 제외하는 것으로 작성될 수 있다는 것을 추가로 주의한다. 이와 같이, 이러한 기재는 청구 요소의 열거와 관련하여 "단독으로", "오직" 등으로서 이러한 독점적 용어의 사용, 또는 "부정적인" 제한의 사용을 위한 선행 근거의 역할을 하는 것을 의도한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "알킬"은 전형적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 임의의 포화 또는 불포화, 분지형 또는 비분지형, 환형 또는 이의 조합을 나타내고, 이는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, t-부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 아이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 아이소헥실, 사이클로헥실을 포함하고, 이는 임의로 메틸로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "알킬렌"은 전형적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 임의의 분지형 또는 비분지형, 환형 또는 이의 조합을 나타내고, 이는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, t-부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 아이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 아이소헥실, 사이클로헥실을 포함하고, 이는 임의로 메틸로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "화합물 집단(population)의 증폭"은 본 명세서에 기재된 반복 방법에 의해 제조된 핵산 태그의 카테나 혼성화 서열에 따라 합성된 화합물의 집단을 증가시키는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편, 예를 들면, 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하는 단편에 의해 실질적으로 또는 부분적으로 암호화된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 나타낸다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라, 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 전형적으로, 예를 들면, 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 전형적으로, 예를 들면, 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 이는 차례로 각각 면역글로불린 분류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다. 전형적인 면역글로불린(항체) 구조적 단위는 사량체를 포함한다. 사실상, 각각의 사량체는 폴리펩타이드 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kD) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70 kD)를 갖는다. 각각의 쇄의 N-말단은 항원 인식의 주요 책임이 있는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 나타낸다. 항체는 온전한 면역글로불린 또는 다양한 펩티다제에 의한 소화에 의해 제조된 다수의 잘 특성화된 단편로서 존재한다. 따라서, 예를 들면, 펩신은 경첩 영역의 다이설파이드 연결 아래의 항체를 소화시켜 F(ab)'2(단편 항원 결합) 및 Fc(결정화가능 단편, 또는 단편 상보 결합을 생성한다. F(ab)'2는 Fab의 이량체이고, 이는 그 자체로 다이설파이드 결합에 의해 VH-CH1에 연결된 경쇄이다. F(ab)'2는 온화한 조건하에 환원되어 경첩 영역에서 다이설파이드 연결이 파괴되어, (Fab')2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 경첩 영역의 부분을 갖는 Fab이다. 항체 분자의 Fc 부분은 면역글로불린 중쇄의 불변 영역에 주로 상응하고, 항체의 이펙터 기능을 책임진다(항체 단편의 보다 상세한 설명을 위하여 문헌 [Fundamental Immunology, 4th edition. W.E. Pa㎕, ed., Raven Press, N.Y.(1998)]을 참조한다). 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 소화에 관하여 정의되고, 당해 분야의 숙련가는 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론, 펩타이드 디스플레이 등을 이용하여 이러한 Fab' 또는 Fc 단편을 새로이 합성할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 항체는 또한 전체 항체의 변형에 의해 제조되거나 재조합 DNA 방법론을 사용하여 새로이 합성된 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 단일-암(single-armed) 구성의 단일클론 항체, 가변 중쇄 및 가변 경쇄가 함께 연결되어(직접적으로 또는 펩타이드 연결기를 통해) 연속 폴리펩타이드를 형성하는 단쇄 Fv(sFv) 항체를 포함한 단쇄 항체뿐만 아니라, 다이아바디, 트라이바디 및 테트라바디를 포함한다(Pack et al.(1995) J Mol Biol 246:28; Biotechnol 11:1271; 및 Biochemistry 31:1579). 항체는, 예를 들면, 다중클론, 단일클론, 키메라, 인간화, 단쇄, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 제조된 단편 등이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "염기-특이적 이중나선 형성" 또는 "특이적 혼성화"는 주어진 길이의 올리고뉴클레오타이드에 대하여 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와 이의 상보적-서열 핵산 가닥 사이의 서열-특이적 쌍을 생성하는데 충분한 온도, 이온 강도 및/또는 용매 조건을 나타낸다. 이러한 조건은 바람직하게는 하나 이상의 내부 염기 불일치를 갖는 2개의 거의-상보적 가닥의 혼성화를 방지하거나 대부분 방지하는데 충분하게 엄중하다. 몇몇 실시형태에서, 염기-특이적 이중나선을 형성하는 2개의 서열 사이의 동일성의 영역은 약 5 bp보다 크다. 다른 실시형태에서, 동일성의 영역은 10 bp보다 크다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "포획 핵산"(capture nucleic acid), "포획 올리고뉴클레오타이드"(capture oligonucleotide), 및 "고정화된 포획 핵산"은 모놀리스에 부착된 핵산 서열을 나타낸다. 일반적으로, 포획 핵산의 서열은 핵산 태그의 상이한 혼성화 서열 중 하나(예를 들면, a1, b1, c1 등)에 상보적이고, 따라서 별도의 컨테이너에서 별개의 핵산 태깅(tagging)된 분자의 복수의 소집단으로의 핵산 태깅된 분자의 집단의 서열-특이적 분할을 허용한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "화학 반응 부위"는 아마이드, 에스터, 우레아, 우레탄, 탄소-카보닐 결합, 탄소-질소 결합, 탄소-탄소 단일 결합, 올레핀 결합, 티오에터 결합, 및 다이설파이드 결합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 화학적 결합을 형성할 수 있는 핵산 태그의 화학 성분을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "조합 라이브러리"는 전형적으로 소단위의 상이한 서열, 또는 상이한 측쇄 작용기 및 연결기의 조합을 특징으로 하는 다수의, 전형적으로 103 내지 1015 또는 그 이상의 상이한 화합물을 함유하는 분자의 라이브러리를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "DAEM"은 2(다이메틸아미노)에틸 메타크릴레이트를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "DEGDMA"는 다이에틸렌 글리콜 다이메타크릴레이트를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "뎁시펩타이드"는 하나 이상의 아마이드 결합이 에스터 결합로 대체된 본원에 정의된 바와 같은 펩타이드를 나타낸다.
"상이한-서열 소분자 화합물"은 전형적으로, 하지만 본질적이지는 않게, 일반적인 모 구조(parent structure), 예를 들면, 고리 구조, 및 복수의 상이한 R기 치환체 또는 고리-구조 변형을 갖는 소 유기 분자를 나타내고, 여기서 각각은 다양한 형태, 예를 들면, 상이한 R기를 갖는다. 이러한 화합물은 일반적으로 올리고머가 아니고(즉, 유사한 소단위의 반복 서열로 이루어지지 않고), 기본 구조 및 작용기 면에서 유사할 수 있지만, 쇄 길이, 고리 크기 또는 수, 또는 치환 패턴과 같은 양상에서 다양할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "EDMA"는 에틸렌 글리콜 다이메타크릴레이트를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "핵산 태그의 유전자 재조합"은 하나 이상의 목적하는 활성을 갖는 화합물로부터 유도된 핵산 태그의 키메라를 형성하는 것을 나타낸다. 키메라는 농축 및 단계식 합성, PCR 증폭 및 단계식 합성, 부분적 소화, 재형성 및 단계식 합성의 반복된 주기 후, 유전자 재조합에 의해 형성되어, 하나 이상의 목적하는 활성을 갖는 화합물에 결합된 핵산 태그의 매우 농축된 소집단을 수득할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "GMA"는 글리시딜 메타크릴레이트를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "HEMA"는 2-하이드록실 에틸 메타크릴레이트를 나타낸다.
"수화물"은 화학량론적 비율로, 본 명세서에 기재된 화합물의 결정 격자 내에 물을 도입시켜 부가물의 형성을 야기하는 것을 나타낸다. 수화물의 제조 방법은 수증기를 함유하는 대기 중의 보관, 물을 포함하는 제형, 또는 일상적인 약제학적 프로세싱 단계, 예를 들면, 결정화(즉, 물 또는 혼합된 수성 용매로부터), 동결건조, 습식 제립법, 수성 막 코팅, 또는 스프레이 건조를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 수화물은 또한 특정한 상황하에, 수증기에 노출 후 또는 물 중의 무수 물질의 현탁 후, 용매 결정화로부터 형성될 수 있다. 수화물은 또한 수화물 동질이상을 야기하는 하나 이상의 형태로 결정화될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Guillory, K., Chapter 5, pp. 202-205 in Polymorphism in Pharmaceutical Solids, (Brittain, H. ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1999]을 참조한다. 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 상기 수화물 제조 방법은 완전하게 통상적이고, 당해 분야에서 전형적인 것 이상의 임의의 실험을 필요로 하지 않는다. 수화물은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 방법, 예를 들면, 단결정 X선 회절, X선 분말 회절, 편극화 광학 현미경, 열 현미경, 열중량분석, 시차 열 분석, 시차 주사 열량분석, IR 분광학, 라만 분광학 및 NMR 분광학에 의해 특성화 및/또는 분석될 수 있다(Brittain, H., Chapter 6, pp. 205-208 in Polymorphism in Pharmaceutical Solids, (Brittain, H. ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, 1999). 추가로, 많은 영리 회사는 용매화물의 제조 및/또는 특성화를 포함한 서비스[예를 들면, HOLODIAG, Pharmaparc II, Voie de l'Innovation, 27 100 Val de Reuil, France(http://www.holodiag.com)]를 일상적으로 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "리간드"는 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드, 중합체, 폴리실록산, 50 달톤보다 큰 분자량의 무기 화합물, 약 1000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "링커"는 모놀리스를 인식 화합물에 연결하는 작용을 수행하는 임의의 분자 또는 성분이다. 링커는 구조 및 길이가 다양할 수 있다. 링커는 소수성 또는 친수성이거나, 길거나 짧거나, 경성, 반경성 또는 연성 등일 수 있다. 연결기는, 예를 들면, 폴리메틸렌 쇄, 예를 들면, -(CH2)n-쇄 또는 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄, 예를 들면, -(CH2CH2O)n 쇄, 두 경우 모두에서, n은 1 내지 약 20의 정수이고; 5'-O-다이메톡시트라이틸-1',2'-다이데옥시리보스-3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)]-포스포라미다이트; 9-O-다이메톡시트라이틸-트라이에틸렌 글리콜, 1-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)]-포스포라미다이트; 3-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시)프로필-1-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)]-포스포라미다이트; 및 18-O-다이메톡시트라이틸헥사에틸렌글리콜,1,-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)]-포스포라미다이트, 아미노-카복실릭 링커(예를 들면, 펩타이드(예를 들면, Z-Gly-Gly-Gly-Osu 또는 Z-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Osu), PEG(예를 들면, Fmoc-아미노PEG2000-NHS 또는 아미노-PEG(12-24)-NHS), 또는 알칸산 쇄(예를 들면, Boc-ε-아미노카프로산-Osu)), 클릭 화학(click chemistry) 링커(예를 들면, 펩타이드(예를 들면, 아지도호말라닌-Gly-Gly-Gly-OSu 또는 프로파글리글리신-Gly-Gly-Gly-OSu), PEG(예를 들면, 아지도-PEG-NHS), 또는 알칸산 쇄(예를 들면, 5-아지도펜탄산, (S)-2-(아지도메틸)-1-Boc-피롤리딘, 또는 4-아지도-부탄-1-산 N-하이드록시석신이미드 에스터)), 티올-반응성 링커(예를 들면, PEG(예를 들면, SM(PEG)n NHS-PEG-말레이미드), 알칸 쇄(예를 들면, 3-(피리딘-2-일다이설파닐)-프로피온산-Osu 또는 설포석신이미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오]프로피온아미도)헥사노에이트))), 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 아미다이트(예를 들면, 아미노 변형제(예를 들면, 6-(트라이플루오로아세틸아미노)-헥실-(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)-포스포라미다이트), 티올 변형제(예를 들면, S-트라이틸-6-머캅토헥실-1-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)]-포스포라미다이트, 또는 클릭 화학 변형제(예를 들면, 5-헥신일-TTT(T)0-7, 6-헥신일-TTT(T)0-7, 5-헥신-1-일-(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)-포스포라미다이트, 6-헥신-1-일-(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)-포스포라미다이트, 3-다이메톡시트라이틸옥시-2-(3-(3-프로파길옥시프로판아미도)프로판아미도)프로필-1-O-석시노일, 장쇄 알킬아미노 CPG, 또는 4-아지도-부탄-1-산 N-하이드록시석신이미드 에스터))를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "개시제"는 열, 광, 또는 산화환원 개시의 방식으로 모노비닐 단량체 또는 폴리비닐 단량체의 중합을 개시할 수 있는 임의의 유리 라디칼 발생제를 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "MAA"는 메타크릴산을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "MAETA"는 [2-(메타크릴옥시)에틸]트라이메틸 암모늄 클로라이드를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "γ-MAPS"는 3-(트라이메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "모놀리스"는 중간 압력에서 이동상의 높은 유속을 허용하는 큰 상호연결된 기공 또는 채널을 함유하는 연속 정지상(즉, 단일 연속 물질(예를 들면, 중합체 또는 실리카 베이스 매트릭스)를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "모놀리스형 매질"은 입자 크기를 기반으로 예상되는 것보다 유의미하게 낮은 칼럼 압력을 갖는 응집된 입자의 패킹을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "NBE"는 노본-2-엔을 나타낸다.
"비특이적 모놀리스"와 관련되어 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "비특이적 결합"은 모놀리스에 적용된 핵산 서열에 의존하지 않는 핵산의 결합을 나타낸다. 비특이적 결합을 위한 예시적인 물질은 하나의 이온 강도에서 핵산 태깅된 분자를 비특이적으로 포획하고, 더 높은 이온 강도에서 분자 반응 후 핵산 태깅된 분자를 방출하는데 효과적인 이온-교환 물질을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "핵산"은 하기와 같이 정의된 올리고뉴클레오타이드 유사체뿐만 아니라 이중 가닥 DNA 및 RNA 분자를 나타낸다. DNA 및 RNA 분자는 하기 정의된 다양한 유사체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "핵산 태그-지정된 합성" 또는 "태그-지정된 합성" 또는 "화학적 번역"은 본 명세서에 기재된 방법에 따른 핵산 태그의 카테나 혼성화 서열을 기반으로 한 복수의 화합물 합성을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "핵산 태그", "핵산 지지체", "합성-지정 핵산 태그", 및 "DNA-태그"는 각각 적어도 (i) 상이한 제1 혼성화 서열, (ii) 상이한 제2 혼성화 서열, 및 (iii) 화학 반응 부위를 포함하는 핵산 서열을 나타낸다. "혼성화 서열"은 약 3 내지 50 이하, 전형적으로 약 5 내지 약 30 핵산 소단위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 이러한 "핵산 태그"는 카테나 혼성화 서열을 기반으로 한 조합 라이브러리의 합성을 지정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "올리고"는 약 3 내지 약 50 이하, 전형적으로 약 5 내지 약 30 핵산 소단위를 함유하는 핵산 올리고머를 나타낸다. 라이브러리 화합물의 합성을 지정하는 올리고(예를 들면, 혼성화 서열)의 맥락에서, 올리고는 선형 중합체에서 조립되는 경우, 천연 발생 뉴클레오타이드 잔기, 뉴클레오타이드 유사체 잔기, 또는 서열-특이적 염기쌍을 형성할 수 있는 다른 소단위를 포함하거나 이로 구성될 수 있고, 단, 중합체는 폴리머라제 및 하나 이상의 뉴클레오타이드 트라이포스페이트, 예를 들면, 통상적인 데옥시리보뉴클레오타이드의 존재하에 가닥-지정된 중합을 위한 적합한 기질을 제공할 수 있다. "공지된-서열 올리고"는 핵산 서열이 공지된 올리고이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "올리고뉴클레오타이드 유사체"는 이로부터 유도된 올리고뉴클레오타이드의 몇몇 또는 모든 화학적 또는 생물학적 활성을 갖고 변형된 핵산을 나타낸다. 몇몇 경우, 대안적인 골격을 갖을 수 있는 올리고뉴클레오타이드 유사체가 포함됨에도 불구하고, 올리고뉴클레오타이드 유사체는 일반적으로 포스포다이에스터 결합을 함유할 것이다. 리보스-포스페이트 골격의 변형은 추가의 모이어티, 예를 들면, 라벨의 첨가를 촉진할 수 있거나, 이러한 분자의 안전성 및 반감기를 증가시키도록 수행될 수 있다. 추가로, 천연 발생 핵산 및 유사체의 혼합물이 만들어질 수 있다. 대안적으로, 상이한 핵산 유사체의 혼합물, 및 천연 발생 핵산 및 유사체의 혼합물이 만들어질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 명시된 바와 같이 단일 가닥 또는 이중 가닥이거나, 이중 가닥 또는 단일 가닥 서열 둘 다의 부분을 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 DNA, RNA 또는 혼성체일 수 있고, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 임의의 조합, 및 우라실, 아데닌, 타이민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 잔타닌 하이폭사타닌, 아이소사이토신, 아이소구아닌 등을 포함한 염기의 임의의 조합을 함유한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "펩타이드"는 약 2 내지 50 아미노산 잔기, 약 2 내지 20 아미노산 잔기, 또는 약 2 내지 10 잔기의 아미노산 잔기의 중합체를 나타낸다. 펩타이드는 변형된 펩타이드, 예를 들면, 글리코펩타이드, 페길화된 펩타이드, 리포펩타이드, 유기 또는 무기 리간드와 접합된 펩타이드, 펩타이드 결합 등입체를 함유하는 펩타이드(예를 들면, ψ[CH2S], ψ[CH2NH2], ψ[NHCO], ψ[COCH2], ψ[(E) 또는 (Z) CH=CH]) 등을 포함하고, 또한 환형 펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 아미노산 잔기는 임의의 L-α-아미노산, D-α-아미노 잔기, 이의 N-알킬 변이체 또는 이의 조합일 수 있다. 다른 실시형태에서, 아미노산 잔기는 임의의 L-α-아미노산, D-α-아미노 잔기, β-아미노산, γ-아미노산, 이의 N-알킬 변이체 또는 이의 조합일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "작동적으로 연결됨(operatively linked)"은 함께 연결된 적어도 2개의 화학 기 또는 구조를 나타낸다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드는 리간드 또는 화학 반응 부위에 링커를 통해 공유 부착될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 기 또는 구조는, 예를 들면, 공정 단계와 같은 다양한 조작을 통해 함께 연결된 채로 있을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "펩타이드 핵산"은 핵산의 당 포스페이트 골격이 유사펩타이드 골격(예를 들면, N-(2-아미노에틸)-글리신)으로 대체된 올리고뉴클레오타이드 유사체를 나타낸다(Nielsen et al., 미국 특허 제5,539,082호; Nielsen et al., 미국 특허 제5,773,571호; Burchardt et al., 미국 특허 제6,395,474호).
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "펩토이드"는 폴리 N-치환된 글리신의 중합체(Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1992) 89(20) 9367-9371)를 나타내고, 이의 환형 변이체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "폴리펩타이드"는 전형적으로 50 아미노산 잔기 이상을 포함하는 아미노산 잔기의 중합체를 나타내고, 이의 환형 변이체를 포함한다. 폴리펩타이드 단백질(변형된 단백질, 예를 들면, 글리코단백질, 페길화된 단백질, 지질단백질, 유기 또는 무기 리간드와의 폴리펩타이드 접합체 등 포함) 수용체, 수용체 단편, 효소, 구조 단백질(예를 들면, 콜라겐) 등을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 아미노산 잔기는 임의의 L-α-아미노산, D-α-아미노 잔기, 또는 이의 조합일 수 있다. 다른 실시형태에서, 아미노산 잔기는 임의의 L-α-아미노산, D-α-아미노 잔기, 이의 N-알킬 변이체 또는 이의 조합일 수 있다.
"중합체"는 공중합체를 포함하고, 용어 "단량체"는 코모노머를 포함한다. 중합체는, 예를 들면, 폴리아마이드, 인지질, 폴리카보네이트, 다당류, 폴리우레탄, 폴리에스터, 폴리우레아, 폴리아세테이트, 폴리아릴렌 설파이드, 폴리에틸렌이민, 폴리이미드 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "포로겐" 또는 "포로겐 용매"는 이의 중합 동안 중합체 매트릭스에서 기공을 형성할 수 있는 용매를 나타내고, 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 에스터, 아마이드, 알코올, 케톤, 에터, 가용성 중합체의 용액, 및 이의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "인식 화합물"은 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드, 중합체, 폴리실록산, 50 달톤 초과의 분자량의 무기 화합물, 약 1000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합을 나타낸다.
"염"은 모 화합물의 목적하는 약리학적 활성을 갖는 화합물의 염을 나타낸다. 이러한 염은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산과 형성되거나, 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 석신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄-다이설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄포르설폰산, 4-메틸바이사이클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트라이메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등과 같은 유기산과 형성된 산 부가염; 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들면, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토 이온, 또는 알루미늄 이온으로 대체되거나, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트라이에탄올아민, N-메틸글루카민 등과 같은 유기 염기로 배위되는 경우 형성되는 염을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 염은 존재하는 산성 양성자가 무기 염기(예를 들면, 수산화나트륨, 탄산나트륨, 수산화칼륨, 수산화알루미늄, 수산화칼슘 등) 및 유기 염기(예를 들면, 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등)과 반응할 수 있는 경우에 형성될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 염은 약제학적으로 허용된다.
"용매화물"은 화학량론적 비율로, 본 명세서에 기재된 화합물의 결정 격자 내에 용매를 도입시켜 부가물의 형성을 야기하는 것을 나타낸다. 용매화물의 제조 방법은 용매를 함유하는 대기 중의 보관, 용매를 포함하는 제형, 또는 일상적인 약제학적 프로세싱 단계, 예를 들면, 결정화(즉, 용매 또는 혼합된 용매로부터) 증기 확산 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 용매화물은 또한 특정한 상황하에, 용매에 노출 후 또는 용매 중의 물질의 현탁 후, 용매화물 또는 수화물의 다른 결정화로부터 형성될 수 있다. 용매화물은 용매화물 동질이상을 야기하는 하나 이상의 형태로 결정화될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Guillory, K., Chapter 5, pp. 205-208 in Polymorphism in Pharmaceutical Solids, (Brittain, H. ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1999)]을 참조한다. 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 상기 용매화물 제조 방법은 완전하게 통상적이고, 당해 분야에서 전형적인 것 이상의 임의의 실험을 필요로 하지 않는다. 용매화물은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 방법, 예를 들면, 단결정 X선 회절, X선 분말 회절, 편극화 광학 현미경, 열 현미경, 열중량분석, 시차 열 분석, 시차 주사 열량분석, IR 분광학, 라만 분광학 및 NMR 분광학에 의해 특성화 및/또는 분석될 수 있다(Brittain, H., Chapter 6, pp. 205-208 in Polymorphism in Pharmaceutical Solids, (Brittain, H. ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, 1999). 추가로, 많은 영리 회사는 용매화물의 제조 및/또는 특성화를 포함한 서비스[예를 들면, HOLODIAG, Pharmaparc II, Voie de l'Innovation, 27 100 Val de Reuil, France(http://www.holodiag.com)]를 일상적으로 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "목적하는 활성을 위한 선택"은 분자의 물리적 성질을 기반으로 하여 덜 바람직한 분자로부터 더 바람직한 분자를 분리하는 임의의 생화학적 과정이다. 이와 같이 이는 분자의 비균질 혼합물로부터 목적하는 성질을 나타내는 화합물의 물리적 분리를 포함한다. 예는 고정화된 표적 단백질에 대한 결합에 의한 혼합물로부터 리간드의 친화 정제, 또는 친화 핸들의 효소-매개된 부착에 의한 혼합물로부터의 효소 기질의 단리 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "SPMA"는 3-설포프로필 메타크릴레이트를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "TRIM"은 트라이메틸올프로판 트라이메타크릴레이트를 나타낸다.
"태깅된 화합물", "DNA-태깅된 화합물", 또는 "핵산-태깅된 화합물"은 (a) 특이한 핵산 태그를 함유하고, 각각의 화합물의 각각의 특이한 핵산 태그는 적어도 하나 및 바람직하게는 둘 이상의 카테나 상이한 혼성화 서열을 포함하고, 여기서 혼성화 서열은 상보적 고정화된 포획 핵산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, (b) 화합물 전구체, 부분적으로 합성된 화합물, 또는 완전한 화합물을 포함할 수 있는 화학 반응성 반응 모이어티를 함유하는 화합물을 나타내는데 사용된다. 화학 반응성 모이어티가 완전한 합성 화합물인 핵산 태깅된 화합물은 또한 핵산-태깅된 화합물로서 언급된다.
부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스 및 이의 어레이
모놀리스는 지지체로서 전형적으로 사용되어 온 입자간 공극이 없는 통합된 연속성 다공성 매질이다(예를 들면, 문헌 [Ueki et al., Anal. Chem.(2004) 76, 7007-7012; Ueki et al., J. Chromatography A(2006) 1106, 106-111]; [Saburadin et al., Analytica Chimica Acta(2012) 736 108-114]; [Shu et al., J. Chromatography A(2011) 1218 5288-5234]; [Lubbad et al., J. Chromatography A(2011) 1218 8897-8902]; [Lubbad et al., J. Chromatography A(2011) 1218 2362-2367]). 모놀리스는, 광범위하게, 정의된 다공성을 특징으로 하고 고체와 주위 이동상 사이의 상호작용을 지지하는 상호연결된 반복 셀 또는 채널을 함유하는 임의의 단일체 구조이다. 이동상은 대류 흐름 및 개선된 물질 전달을 야기하는 다공성 모놀리스형 매질을 통과하게 된다. 모놀리스는 중합체(즉, 유기물), 실리카, 유기-실리카 혼성체, 무기물, 크라이오겔 및 아가로스를 기반으로 할 수 있고, 처음 두 가지 유형이 가장 지배적이다.
넓은 의미에서, 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스 및 이의 어레이가 본원에서 제공된다. 하나의 양상에서, 리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 모놀리스는 다공성이다. 다른 실시형태에서, 모놀리스는 이온화가능 기를 포함한다. 이들 몇몇 실시형태에서, 인식 화합물은 모놀리스에 이온적으로 부착된다. 이들 다른 실시형태에서, 인식 화합물은 모놀리스에 공유 부착된다.
몇몇 실시형태에서, 인식 화합물은 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드, 중합체, 폴리실록산, 50 달톤 초과의 분자량의 무기 화합물, 약 3000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합이다. 다른 실시형태에서, 리간드는 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드, 중합체, 폴리실록산, 50 달톤 초과의 분자량의 무기 화합물, 약 3000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합이다. 다른 실시형태에서, 인식 화합물은 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드, 약 3000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합이고, 리간드는 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드, 약 3000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합이다.
몇몇 실시형태에서, 인식 화합물은 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산 또는 이의 조합이다. 다른 실시형태에서, 리간드는 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA 또는 이의 조합이다. 다른 실시형태에서, 인식 화합물은 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산 또는 이의 조합이고, 리간드는 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA 또는 이의 조합이다.
몇몇 실시형태에서, 인식 화합물은 단백질성 DNA 결합 단백질, 예를 들면, lac 억제인자, trp 억제인자, 람다 억제인자, arc 억제인자, 또는 신규한 DNA 결합 특이성을 갖는 이들 억제인자의 조작된 변이체이고, 리간드는 이중 가닥 DNA이다. 다른 실시형태에서, 인식 화합물은 부위 특이적 뉴클레아제, 예를 들면, CreI 패밀리 메가뉴클레아제, 또는 뉴클레아제 활성은 부족하지만 서열 특이적 DNA 인식 성질을 보유한 TALEN 뉴클레아제이다.
몇몇 실시형태에서, 모놀리스는 실리카 공중합체로부터 형성된다. 다른 실시형태에서, 실리카 공중합체는
Figure pct00001
또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단량체를 포함한다.
실리카계 모놀리스는 포로겐의 존재하에, 산에 의해 촉매된, 알콕시실란의 가수분해 및 중축합에 의해 제조될 수 있다. 가열 및 건조 후, 졸겔(sol-gel) 네트워크가 실릴화에 의해 유도체화될 수 있다. 인식 화합물의 부착에 적절한 작용기는 제작 공정에서 작용화된 단량체의 직접적인 도입에 의해 또는 실리카 모놀리스의 변형에 의해 실리카 모놀리스 내로 도입될 수 있다. 예를 들면,
Figure pct00002
는 하기 GMA-코-EDMA 중합체 모놀리스에 대해 기재된 바와 같이 작용화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법을 실시하기 위하여 유용할 수 있는 또 다른 실리카 모놀리스는 폴리(p-메틸스티렌-코-비스(p-비닐벤질)다이메트실란(Wieder et al., J. Chromatography A(2008), 1191 252-263)이다.
화학 작용성의 변화는 신규한 모놀리스의 물리적 성질의 최적화를 필요로 하지 않기 때문에, 실리카 모놀리스의 변형은 일반적으로 바람직하다. 여기서, 졸겔 모놀리스는 오가노클로로실란 또는 오가노알콕시실란 시약, 예를 들면, 상기 나타낸 몇몇 단량체에 의한 실릴화에 의해 화학적으로 변형된다. 실리카 모놀리스의 작용기는, 인식 화합물이 상보적 작용성을 갖는 경우, 인식 화합물에 의해 직접적으로, 예를 들면, 에터, 에스터 또는 아마이드 결합 형성에 의하여, 작용화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상보적 작용기의 고리화 첨가(예를 들면, 아자이드 및 아세틸렌; 다이엔 및 전자 부족 올레핀) 또는 클릭 화학(Evans, R.A., Australian J. of Chemistry, 60(6): 384-395(2007))이 인식 화합물을 모놀리스에 부착하는데 사용될 수 있다.
대안적으로, 이작용성 링커의 상보적 작용기와의 아마이드, 카바메이트, 에스터, 우레아, 우레탄, 탄소-질소, 탄소-탄소, 에터, 티오에터 또는 다이설파이드 결합의 형성을 통해, 이작용성 링커는 실리카 모놀리스의 작용기 및 모놀리스에 공유적으로 결합된 인식 화합물에 부착될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상보적 작용기의 고리화 첨가(예를 들면, 아자이드 및 아세틸렌; 다이엔 및 전자 부족 올레핀) 또는 클릭 화학은 모놀리스에 공유적으로 결합된 링커를 인식 화합물에 부착시키는데 사용될 수 있다.
추가로, 인식 화합물은 실리카 모놀리스의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 함유한 링커에 의해 작용화될 수 있다. 상기와 같이, 링커에 부착된 인식 화합물은 링커의 상보적 작용기와의 아마이드, 카바메이트, 에스터, 우레아, 우레탄, 탄소-질소, 탄소-탄소, 에터, 티오에터 또는 다이설파이드 결합의 형성을 통해 모놀리스에 공유적으로 결합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상보적 작용기의 고리화 첨가(예를 들면, 아자이드 및 아세틸렌; 다이엔 및 전자 부족 올레핀) 또는 클릭 화학은 인식 화합물에 공유적으로 결합된 링커에 모놀리스를 부착하는데 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 모놀리스는 무기 모놀리스 및 유기 모놀리스 둘 다의 장점(즉, 유기 용매 중의 기계적 및 구조적 안정성 및 용이한 작용화)을 조합한 유기-무기 실리카 혼성체이다. 이러한 모놀리스는 이의 구조의 일부로서 유기 작용기를 갖도록 변형된 실란으로부터 제조될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 모놀리스는 무기 모놀리스, 예를 들면, 지르코니아, 하프니아 또는 티타니아 모놀리스일 수 있다(Hoth et al., J. Chromatogr. A, (2005) 392; Randon et al., J. Chromatogr. A, (2006) 19; Rivera et al., Analyst, (2009), 31; Kubo et al., Mater. Let., (2010) 177; Konishi et al., J. Chromatogr. A, (2009) 7375). 상기 무기 모놀리스는 실리카 모놀리스와 문제가 있을 수 있는 극도의 pH 및 온도에 내성을 갖고, 종종 일반적이고 특이한 선택성을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 무기 모놀리스는 실리카 모놀리스에 대하여 상기 기재된 방식으로 인식 화합물에 의하여 작용화될 수 있다.
중합체계 모놀리스는 내부 구조가 기공에 의해 분리된 융합된 어레이 마이크로구상체를 포함하는, 일반적으로 고도로 가교결합된 구조이다. 다공성 중합체 모놀리스의 구조적 경성은 이들 구조에서 전형적으로 발견된 과도한 가교결합으로 인한 것이다.
몇몇 실시형태에서, 모놀리스는 유기 공중합체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 유기 공중합체는 모노비닐 중합체 및 폴리비닐 중합체의 조합이다. 다른 실시형태에서, 유기 공중합체는 모노비닐 중합체 및 폴리비닐 중합체의 조합이다. 다른 실시형태에서, 유기 공중합체는 폴리비닐 중합체 또는 폴리비닐 중합체의 조합이다.
상기 몇몇 실시형태에서, 공중합체는 비닐 스티렌, 비닐나프탈렌, 비닐안트라센 및 이의 고리 치환된 유도체, 여기서 치환체는 클로로메틸, 10개의 탄소 원자 이하의 알킬, 하이드록실, t-부틸옥시카보닐, 할로젠, 니트로, 보호된 하이드록실 또는 아미노기를 포함하고; 아크릴아마이드, 및 메타크릴아마이드 및 1 또는 2개의 C1-5 알킬로 질소 원자에서 치환된 이의 유도체, C1-4 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬, C1-4 메톡시아미노알킬, C1-4 다이메톡시 또는 다이에톡시아미노알킬, C1-4 메톡시알킬, 테트라하이드로피라닐, 및 테트라하이드로푸르푸릴기, N-아크릴로일피페리딘, N-아크릴로일피롤리돈, 및 이의 혼합물, 아크릴산 에스터, 메타크릴산 에스터, 알킬 아크릴레이트, 알킬 메타크릴레이트, 퍼플루오린화된 알킬 아크릴레이트, 퍼플루오린화된 알킬 메타크릴레이트, 글리시딜 아크릴레이트, 글리시딜 메타크릴레이트, 하이드록시알킬 아크릴레이트, 하이드록시알킬 메타크릴레이트, 여기서 상기 언급된 알킬 각각에서 알킬기는 1 내지 10개의 탄소 원자로 이루어지고; 설포알킬 아크릴레이트, 설포알킬 메타크릴레이트, 올리고에틸렌옥사이드 아크릴레이트, 올리고에틸렌옥사이드 메타크릴레이트, 아크릴레이트 및 1차, 2차, 3차, 및 4차 아민을 포함한 메타크릴레이트 유도체, 에폭사이드 및 쌍성이온 작용성, 비닐 피리딘, 비닐아세테이트, 비닐피롤리돈, 비닐아즈락톤 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 모노비닐 단량체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 모노비닐 단량체는 스티렌, 비닐나프탈렌, 비닐안트라센 및 이의 고리 치환된 유도체를 포함하지만 이에 한정되지 않고, 치환체는 클로로메틸, 18개 이하의 탄소 원자의 알킬, 하이드록실, t-부틸옥시카보닐, 할로젠, 니트로, 보호된 하이드록실, 아미노기 또는 이의 조합를 포함한다. 다른 실시형태에서, 모노비닐 단량체는 아크릴아마이드, 메타크릴아마이드 및 질소 원자에서 1 또는 2개의 C1-5 알킬로 치환된 이의 유도체, C1-4 알킬아미노알킬 또는 다이알킬아미노알킬, C1-4 메톡시아미노알킬, C1-4 다이메톡시 또는 다이에톡시아미노알킬, C1-4 메톡시알킬, 테트라하이드로피라닐, 및 테트라하이드로푸르푸릴기, N-아크릴로일피페리딘 및 N-아크릴로일피롤리돈 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 다른 실시형태에서, 모노비닐 단량체는 또한 아크릴산 및 메타크릴산 에스터, 알킬 아크릴레이트, 알킬 메타크릴레이트, 퍼플루오린화된 알킬 아크릴레이트, 퍼플루오린화된 알킬 메타크릴레이트, 하이드록시알킬 아크릴레이트, 하이드록시알킬 메타크릴레이트, 여기서 상기 언급된 알킬의 각각에서 알킬기는 1-10 탄소 원자로 이루어지고; 설포알킬 아크릴레이트, 설포알킬 메타크릴레이트, 올리고에틸렌옥사이드 아크릴레이트, 올리고에틸렌옥사이드 메타크릴레이트, 및 아크릴레이트 및 1차, 2차, 3차 및 4차 아민을 포함한 메타크릴레이트 유도체, 에폭사이드 및 쌍성이온 작용성, 비닐아세테이트, 비닐피롤리돈, 비닐아즈락톤 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 공중합체는
Figure pct00003
및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 모노비닐 단량체를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 폴리비닐 단량체는 알킬렌 다이아크릴레이트, 알킬렌 다이아크릴아마이드, 알킬렌 다이메타크릴레이트, 알킬렌 다이아크릴아마이드, 알킬렌 다이메타크릴아마이드, 하이드록시알킬렌 다이아크릴레이트, 하이드록시알킬렌 다이메타크릴레이트, 여기서 상기 언급된 알킬렌 단량체의 각각에서 알킬렌기는 1 내지 10개의 탄소 원자로 이루어지고, 올리고에틸렌 글리콜 다이아크릴레이트, 올리고에틸렌 글리콜 다이메타크릴레이트, 폴리카복실산의 비닐 에스터, 다이비닐벤젠, 다이비닐나프탈렌, 펜타에리트리톨 다이메타크릴레이트, 펜타에리트리톨 트라이메타크릴레이트, 펜타에리트리톨 테트라메타크릴레이트, 펜타에리트리톨 다이아크릴레이트, 펜타에리트리톨 트라이아크릴레이트, 펜타에리트리톨 테트라아크릴레이트, 트라이메틸로프로판 트라이메타크릴레이트, 트라이메틸로프로판 아크릴레이트 또는 이의 조합이다. 다른 실시형태에서, 폴리비닐 단량체는
Figure pct00004
및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
중합체 모놀리스는 일반적으로 적어도 하나의 포로겐 중에 용해된 유리 라디칼 개시제 및 단량체(적어도 하나의 폴리비닐 단량체 포함)를 포함하는 혼합물로부터 제작된다. 전형적인 포로겐 용매는 일반적인 유기 용매, 예를 들면, 테트라하이드로푸란, 아세토나이트릴, 톨루엔, 클로로벤젠, 헥산, 메탄올, 다이메틸포름아마이드, 사이클로헥산올, 도데칸올, 초임계 CO2, 에터 등을 포함한다. 모놀리스의 형성은 외부 공급원(예를 들면, 광개시, 열 등)에 의한 유리 라디칼로의 개시제(예를 들면, AIBN, TEMPO, APS, TMED 등)의 붕괴, 또는 반응 혼합물로부터 침전되어 결국 함께 응집하여 연속 고체 구조를 형성하는 중합체 쇄의 형성을 유도하는 개시제(예를 들면, 벤조페논)의 광여기에 의해 촉발된다. 모놀리스의 형태학은 다수의 변수, 예를 들면, 폴리비닐 단량체(들), 모노비닐 단량체, 온도, 포로겐 용매(포로겐)의 조성 및 퍼센트, 유리 라디칼 개시제의 농도 및 중합을 개시하는데 사용된 방법에 따라 좌우된다.
몇몇 실시형태에서, 중합체 모놀리스는 개시제 및 포로겐의 존재하에 하나 이상의 폴리비닐 단량체를 포함하는 혼합물을 중합시킴으로써 제조된다. 다른 실시형태에서, 중합체 모놀리스는 개시제, 포로겐 및 하나 이상의 모노비닐 단량체의 존재하에 하나 이상의 폴리비닐 단량체를 포함하는 혼합물을 중합시킴으로써 제조된다. 혼합물은 일반적으로 적합한 용매로 세척되어 포로겐 및 기타 불순물을 제거한다.
몇몇 실시형태에서, 혼합물은 하나 이상의 폴리비닐 단량체 약 10 내지 약 60 용적%, 포로겐 약 45% 내지 약 90 용적% 및 개시제 약 0.1 내지 약 1 용적%이다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 하나 이상의 폴리비닐 단량체 약 10 내지 약 50 용적%, 포로겐 약 45% 내지 약 85 용적% 및 개시제 약 0.1 내지 약 1 용적%이다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 하나 이상의 폴리비닐 단량체 약 20 내지 40 용적%, 포로겐 약 45 내지 약 80 용적% 및 개시제 약 0.1 내지 약 1 용적%이다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 하나 이상의 폴리비닐 단량체 약 15 내지 40 용적%, 포로겐 약 45 내지 약 85 용적% 및 개시제 약 0.1 내지 약 1 용적%이다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 하나 이상의 모노비닐 단량체 약 10-40%, 하나 이상의 폴리비닐 단량체 10 내지 40 용적%, 포로겐 약 20 내지 약 80 용적% 및 개시제 약 0.1 내지 약 1 용적%이다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 하나 이상의 모노비닐 단량체 약 20-30%, 하나 이상의 폴리비닐 단량체 20 내지 30 용적%, 포로겐 약 20 내지 약 60 용적% 및 개시제 약 0.1 내지 약 1 용적%이다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 폴리비닐 단량체 약 25 내지 35 용적%, 포로겐 약 20 내지 약 75 용적% 및 개시제 약 0.1 내지 약 1 용적%이다.
몇몇 실시형태에서, 모놀리스는 폴리(GMA-코-EDMA), 폴리(HEMA-코-EDMA), 폴리(EDMA-코-MAA), 폴리(HEMA-코-EDMA-코-SPMA), 폴리(GMA-코-DEGDMA), 폴리(DAEM-코-PEGDA), 폴리(MAETA-코-PGDA), 폴리(HMA-코-EDMA), 폴리(LMA-코-EDMA), 폴리(BMA-코-EDMA), 폴리(ODMA-코-EDMA), 폴리(CMS-코-DVB), 폴리(GMA-코-DVB), 폴리(GMA-코-TRIM), 폴리(스티렌-코-DVB, NBE-코-(NBE-CH2O)3SiCH3)이다. 이들 실시형태에서, 상기 중합체는 각각 EDMA와 GMA, EDMA와 HEMA, MAA와 EDMA, EDMA 및 SPMA와 HEMA, DEGDMA와 GMA, PEGDA와 DAEM, PGDA와 MAETA, EDMA와 HMA, EDMA와 LMA, EDMA와 BMA, EDMA와 ODMA, DVB와 CMS, DVB와 GMA, TRIM과 GMA 및 DVB와 스티렌의 중합에 의해 제조될 수 있다.
인식 화합물의 부착에 적절한 작용기는 제작 공정에서 작용화된 단량체의 직접적인 도입 또는 중합체 모놀리스의 변형에 의해 중합체 모놀리스 내로 도입될 수 있다. 작용화된 단량체의 몇몇 예는 하기 도시된 것들을 포함한다:
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화학 작용성의 변화는 신규한 모놀리스의 물리적 성질의 최적화를 필요로 하지 않기 때문에, 중합체 모놀리스의 변형은 일반적으로 바람직하다. 여기서, 중합체 모놀리스는, 예를 들면, 작용화된 단량체의 중합에 의하여 모놀리스의 표면에 위치한 에폭시, 클로로메틸, 페놀성 하이드록실 및 아자락톤 작용기에 의한 반응(Luo et al., J. Chomatogr. A(2001) 926 255; Gusev et al., J. Chomatogr. A(1999) 855 273; Xie, et al., Biotechnol Bioeng.(1999) 62 30)에 의하여 화학적으로 변형될 수 있다. 인식 화합물이 상보적 작용성을 함유하는 경우, 중합체 모놀리스의 작용기는, 예를 들면, 에터, 에스터 또는 아마이드 결합 형성에 의하여, 인식 화합물과 직접적으로 반응할 수 있다.
대안적으로, 이작용성 링커는 이작용성 링커의 상보적 작용기와의 아마이드, 카바메이트, 에스터, 우레아, 우레탄, 탄소-질소, 탄소-탄소, 에터, 티오에터 또는 다이설파이드 결합 형성을 통해 중합체 모놀리스의 작용기 및 모놀리스에 공유적으로 결합된 인식 화합물에 부착될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상보적 작용기의 고리화 첨가(예를 들면, 아자이드 및 아세틸렌; 다이엔 및 전자 부족 올레핀) 또는 클릭 화학은 모놀리스에 공유적으로 결합된 링커를 인식 화합물에 부착하는데 사용될 수 있다.
추가로, 인식 화합물은 중합체 모놀리스의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 함유한 링커에 의해 작용화될 수 있다. 상기와 같이, 링커에 부착된 인식 화합물은 링커의 상보적 작용기와의 아마이드, 카바메이트, 에스터, 우레아, 우레탄, 탄소-질소, 탄소-탄소, 에터, 티오에터 또는 다이설파이드 결합의 형성을 통해 모놀리스에 공유적으로 결합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상보적 작용기의 고리화 첨가(예를 들면, 아자이드 및 아세틸렌; 다이엔 및 전자 부족 올레핀) 또는 클릭 화학은 인식 화합물에 공유적으로 결합된 링커에 모놀리스를 부착하는데 사용될 수 있다.
중합체 모놀리스에 인식기의 부착을 위하여 옥시란기를 함유하는 단량체, 예를 들면, GMA 또는 이의 유도체가 유용하다. 이러한 단량체를 함유하는 공중합체는 다양한 친핵체, 예를 들면, 아자이드, 설파이드 이온, 아민 등에 의해 개환될 수 있고, 그 다음, 이작용성 링커의 상보적 작용성, 인식 화합물에 부착된 링커 또는 인식 화합물과 반응하는데 사용되어, 마지막 두 경우, 모놀리스에 부착된 인식 화합물을 제공할 수 있다. 예를 들면, 활성화된 에스터, 아자이드, 설파이드 이온 또는 아민과의 반응 후, 폴리(GMA-코-EDMA) 또는 폴리(GMA-코-DVB)는 다이엔, 아세틸렌, 티올 및 활성화된 에스터를 함유하는 인식 화합물과 반응하여 각각 디엘스 알더(Diels Alder) 부가물, 1,3 쌍극성 사이클로부가물, 다이설파이드 및 아마이드를 제공할 수 있다. 유사하게, 아자이드, 설파이드 이온 또는 아민과의 반응 후, 폴리(CMS-코-DVB)는 아세틸렌, 티올 및 활성화된 에스터를 함유하는 인식 화합물과 반응하여 각각 1,3 쌍극성 사이클로부가물, 다이설파이드 및 아마이드를 제공할 수 있다. 폴리(GMA-코-EDMA) 또는 폴리(GMA-코-DVB)는 또한 다이올로 가수분해될 수 있고, 그 다음, 알데하이드로 산화될 수 있다. 상기 작용성은 둘 다 링커의 상보적 작용성, 인식 화합물에 부착된 링커 또는 인식 화합물과 반응하여, 마지막 두 경우, 모놀리스에 부착된 인식 화합물을 제공할 수 있다.
상기 몇몇 실시형태에서, 인식 화합물은 핵산이다. 다른 실시형태에서, 인식 화합물은 올리고뉴클레오타이드이다. 예시적인 실시형태에서, 폴리(GMA-코-EDMA) 또는 폴리(GMA-코-DVB) 또는 폴리(CMS-코-DVB) 모놀리스는 아자이드와 반응하여 아자이드 작용성을 함유하는 모놀리스를 제공한다. 이들 몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 링커(예를 들면, PEG 또는 폴리 T)에 의해 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 부착된 5' 알키닐기(예를 들면, C3-C20)를 함유한다. 상기 몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 Cu(I) 의존적 클릭 화학에 의해 모놀리스에 연결될 것이다.
다른 예시적인 실시형태에서, 폴리(GMA-코-EDMA) 또는 폴리(GMA-코-DVB) 또는 폴리(CMS-코-DVB) 모놀리스는 아자이드와 반응하여 아자이드기를 함유하는 모놀리스를 제공한다. 이들 몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 말단 알킨, 디벤조사이클로옥틴 또는 바이사이클로[6.1.0]노닌을 함유하고, 이는 링커(예를 들면, PEG 또는 폴리 T)에 의해 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 부착된다. 상기 몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 Cu 무함유 클릭 화학에 의해 모놀리스에 연결될 것이다.
유리 라디칼 첨가, 그래프팅 및 광그래프팅 접근법이 또한 중합체 리간드를 모놀리스의 표면 위에 첨가함으로써 반응성 작용성을 갖는 모놀리스를 작용화하는데 사용될 수 있다(Myer et al., Macromolec㎕es(2000) 3, 7769-7775; Rohr et al., Macromolec㎕es(2003) 36, 1677-1684; Wang et al., J. Chromatography A(2007) 1147, 24-29). 이러한 리간드 함유 중합체는 모놀리스 표면 위의 작용기의 밀도를 실질적으로 증가시키고, 따라서 모놀리스 표면의 결합 능력을 증가시킬 수 있다. 숙련가는 많은 다른 방법이 중합체 모놀리스를 작용화하고 인식 요소를 모놀리스에 부착하는데 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
몇몇 실시형태에서, 활성화된 에스터, 아자이드, 설파이드 이온 또는 아민과의 반응 후, 폴리(GMA-코-EDMA) 또는 폴리(GMA-코-DVB)는 이온 교환 수지로 전환된다. 다른 실시형태에서, 아자이드, 설파이드 이온 또는 아민과의 반응 후, 폴리(CMS-코-DVB)는 이온 교환 수지로 전환된다. 폴리(GMA-코-EDMA) 또는 폴리(GMA-코-DVB)는 또한 다이올로 가수분해될 수 있고, 그 다음, 알데하이드로 산화되고, 작용기 조작을 통해 추가로 이온 교환 수지로 전환될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 다공성 모놀리스는 약 45% 내지 약 85%의 퍼센트 다공성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 다공성 모놀리스는 약 60% 내지 약 75%의 퍼센트 다공성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 중간기공(5㎚ 내지 50㎚)의 용적 분획은 약 30% 내지 약 80%이다. 다른 실시형태에서, 미세기공(2㎚)의 용적 분획은 약 0% 내지 약 10%이다. 다른 실시형태에서, 기공(50㎚ 내지 300㎚)의 용적 분획은 약 1% 내지 약 20%이다. 다른 실시형태에서, 기공(300㎚ 초과)을 통한 흐름의 용적 분획은 약 40% 미만이다.
몇몇 실시형태에서, 다공성 중합체 모놀리스의 기공 크기는 약 5㎚ 내지 약 10,000㎚ 범위이다. 다른 실시형태에서, 다공성 중합체 모놀리스의 기공 크기는 약 50㎚ 내지 약 5,000㎚ 범위이다. 다른 실시형태에서, 다공성 중합체 모놀리스의 기공 크기는 약 100㎚ 내지 약 10,000㎚ 범위이다. 다른 실시형태에서, 다공성 중합체 모놀리스의 기공 크기는 약 50㎚ 내지 약 700㎚ 범위이다.
다른 실시형태에서, 모놀리스의 평균 미세기공 크기는 약 2㎚ 미만이다. 다른 실시형태에서, 모놀리스의 평균 중간기공 크기는 약 2㎚ 내지 약 50㎚이다. 다른 실시형태에서, 모놀리스의 평균 미세기공 크기는 약 2㎚ 미만이고, 모놀리스의 평균 중간기공 크기는 약 2㎚ 내지 약 50㎚이고, 모놀리스의 평균 기공 크기는 약 50㎚ 내지 약 700㎚이다.
몇몇 실시형태에서, 중합체 매트릭스의 비표면적은 약 0.5 ㎡/g 내지 약 1000 ㎡/g 범위이다. 다른 실시형태에서, 중합체 매트릭스의 비표면적은 약 1 ㎡/g 내지 약 500 ㎡/g 범위이다. 다른 실시형태에서, 중합체 매트릭스의 비표면적은 약 5 ㎡/g 내지 약 200 ㎡/g 범위이다. 다른 실시형태에서, 중합체 매트릭스의 비표면적은 약 10 ㎡/g 내지 약 100 ㎡/g 범위이다. 다른 실시형태에서, 중합체 매트릭스의 비표면적은 약 20 ㎡/g 내지 약 60 ㎡/g 범위이다. 다른 실시형태에서, 중합체 매트릭스의 비표면적은 약 30 ㎡/g 내지 약 50 ㎡/g 범위이다.
몇몇 실시형태에서, 모놀리스의 투수율은 약 1 밀리다시(millidarcy) 내지 약 1×104 다시(darcy)이다. 다른 실시형태에서, 모놀리스의 투수율은 약 8.9×102 다시 내지 약 8.9×104 다시이다. 다른 실시형태에서, 모놀리스의 투수율은 약 1 밀리다시 내지 약 1×103 다시이다. 다른 실시형태에서, 모놀리스의 투수율은 약 8.9×103 다시이다.
이론과 결부되는 것을 원하지 않고, 리간드의 라우팅(routing) 또는 결합에서 중요할 수 있는 모놀리스의 성질은 모놀리스에 고정화된 인식 요소에 대한 용액 중의 큰 리간드 거대분자의 신속한 혼성화 속도론, 낮은 배압 및 부착된 인식 요소를 갖는 모놀리스의 리간드에 대한 높은 결합 능력을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 인식 화합물의 밀도는 약 1 p㏖/10 ㎕ 내지 약 1 μ㏖/10 ㎕이다. 다른 실시형태에서, 인식 화합물의 밀도는 약 1n㏖/10 ㎕이다.
몇몇 실시형태에서, 인식 화합물은 올리고뉴클레오타이드이고, 리간드는 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA 서열 또는 이의 조합이다. 상기 몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 약 10개의 핵산 소단위 내지 약 50개의 핵산 소단위를 갖는다. 상기 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 약 15개의 핵산 소단위 내지 약 40개의 핵산 소단위를 갖는다. 상기 다른 실시형태에서, 인식 화합물의 상보적 핵산 서열에 대한 결합의 속도 상수는 약 1×102 M-1s-1 내지 약 1×106 M-1s-1이다. 상기 다른 실시형태에서, 인식 화합물의 상보적 핵산 서열에 대한 결합의 속도 상수는 약 1×103 M-1s-1 내지 약 1×106 M-1s-1이다. 상기 다른 실시형태에서, 인식 화합물의 상보적 핵산 서열에 대한 결합의 속도 상수는 약 1×102 M-1s-1 내지 약 1×105 M-1s-1이다. 일반적으로, 상기 기재된 바와 같은 모놀리스를 통한 흐름은 신속하고 특이적 DNA/RNA/핵산 혼성화에 유용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 동종중합체가 아니다.
몇몇 실시형태에서, 모놀리스는 크라이오겔 모놀리스(Malik et al., J. Sep Sci.(2006) 1686; Galaer et al., J. Sep Sci.(2012) 1173; Arvidsson et al., J. Chromatography A(2002) 27; Daniak et al., J. Chromatography B(2006) 145)이다. 크라이오겔은 예시적인 화학적 및 물리적 안정성을 갖는 단량체 및 중합체 전구체의 적당하게 냉동된 용액의 존재하에 형성된 겔 매트릭스이다. 전형적으로 폴리아크릴아마이드를 기반으로 한 크라이오겔 모놀리스는 다른 겔의 것보다 전형적으로 큰 기공을 보유하고, 이는 이들을 단백질 응집체, 막 단편, 바이러스 등과 같은 큰 개체에 특히 유용한 매트릭스로 만든다. 몇몇 실시형태에서, 인식 화합물은 상기 제공된 방법에 의해 크라이오겔 모놀리스에 부착될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 모놀리스는 아가로스계 모놀리스이다. 다른 실시형태에서, 모놀리스는 초다공성 아가로스계 모놀리스이다. 이들 몇몇 실시형태에서, 초기공의 직경은 약 20㎛ 내지 약 200㎛이다. 이들 다른 실시형태에서, 초기공의 용적은 약 20% 내지 50%로 다양하다. 아가로스 모놀리스는 아가로스 에멀젼의 주조에 의해 제조할 수 있다(Gustavsson et al., J. Chromatography A, (1999), 832 29-39; Gustavsson et al., J. Chromatography A, (2000), 925 69-78).
일반적으로, 아가로스로부터 유도된 모놀리스는 다당류의 교대 D-갈락토스 및 L-갈락토피라노스 소단위의 유리 하이드록실기와의 반응에 의하여 인식 화합물로 작용화될 수 있다. 하이드록실기는, 예를 들면, 인식 화합물이 상보적 작용성을 함유하는 경우, 에터, 에스터 또는 카바메이트 결합 형성에 의해, 인식 화합물로 직접적으로 작용화될 수 있다. 대안적으로, 이작용성 링커는 다당류의 하이드록실기, 및 아마이드, 카바메이트, 에스터, 우레아, 우레탄, 탄소-질소, 탄소-탄소, 에터, 티오에터 또는 다이설파이드 결합의 형성을 통해, 또는 부착된 링커의 적절한 작용기(예를 들면, 아자이드, 다이엔 또는 전자 부족 올레핀)와의 고리화 첨가 또는 클릭 화학에 의해 부착된 인식 화합물에 부착될 수 있다. 추가로, 인식 화합물은 하이드록실 화합물과 반응할 수 있는 기를 함유한 이작용성 링커에 의해 작용화될 수 있다.
또 다른 양상에서, 모놀리스 매질이 제공된다. 모놀리스형 매질은 리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 갖는 응집된 입자를 포함한다. 제한 없이 예시의 방식으로, 음 하전된 수지 입자를 그래프팅하여 양 하전된 그래프팅된 수지 입자를 제공할 수 있다. 그 다음, 양 하전된 그래프팅된 수지 입자를 코팅되지 않은 수지 입자와 혼합하여 이온 결합을 통해 응집된 입자를 형성한다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다양한 방법으로 인식 화합물을 응집된 입자에 부착할 수 있고, 응집된 입자를 사용하여 칼럼을 형성할 수 있다. 이러한 접근법의 장점은 응집된 입자의 패킹이 벽 표면과 모놀리스 사이의 갭을 방지하기 때문에 벽에 대한 모놀리스의 공유 또는 비공유 접착이 필요하지 않다는 것이다.
몇몇 실시형태에서, 하우징(예를 들면, 칼럼 또는 웰)이 제공된다. 하우징은 리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 포함하는 하나 이상의 모놀리스를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 모놀리스는 하우징에 결합된다. 몇몇 실시형태에서, 하우징은 화합물 라이브러리의 멤버를 선택적으로 결합시킨다. 이들 몇몇 실시형태에서, 라이브러리는 파지 디스플레이, RNA 디스플레이 또는 핵산 프로그램가능한 조합 화학에 의해 제공된다. 이들 다른 실시형태에서, 라이브러리는 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA 서열, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드, 약 3000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 인식 화합물이 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드, 약 3000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합이고, 리간드가 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드, 약 3000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합인 하우징(예를 들면, 칼럼 또는 웰)이 제공된다. 다른 실시형태에서, 인식 화합물은 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산 또는 이의 조합이고, 리간드는 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA 또는 이의 조합이다.
몇몇 실시형태에서, 인식 화합물이 올리고뉴클레오타이드이고, 리간드가 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA 서열 또는 이의 조합인 하우징(예를 들면, 칼럼 또는 웰)이 제공된다. 이들 몇몇 실시형태에서, 하우징은 약 0.5 f㏖/㎕ 내지 약 0.4 n㏖/㎕의 단일 가닥 핵산을 결합시킬 수 있다. 이들 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 핵산에 서열 특이적이다. 이들 몇몇 실시형태에서, 칼럼은 부착된 리간드, 예를 들면, 펩타이드, 환형 펩타이드, 트리아젠 및 소 유기 분자를 포함하는 DNA 라이브러리를 라우팅한다.
몇몇 실시형태에서, 화학 반응 부위 또는 리간드에 조작 가능하게 연결된 상보적 올리고뉴클레오타이드를 선택적으로 결합시키는 부착된 올리고뉴클레오타이드를 갖는 모놀리스를 포함하는 하우징(예를 들면, 칼럼 또는 웰)이 제공된다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 약 10개의 핵산 소단위 내지 약 50개의 핵산 소단위이다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 약 15개의 핵산 소단위 및 약 40개의 핵산 소단위이다. 다른 실시형태에서, 상보적 올리고뉴클레오타이드에 대한 결합의 속도 상수는 약 1×102 M-1s-1 내지 약 1×106 M-1s-1이다. 다른 실시형태에서, 상보적 올리고뉴클레오타이드에 대한 결합의 속도 상수는 약 1×103 M-1s-1 내지 약 1×106 M-1s-1이다. 다른 실시형태에서, 상보적 올리고뉴클레오타이드에 대한 결합의 속도 상수는 약 1×102 M-1s-1 내지 약 1×105 M-1s-1이다. 다른 실시형태에서, 상보적 올리고뉴클레오타이드는 화학 반응 부위를 포함하는 리간드에 작동적으로 연결되고, 여기서 리간드는 펩타이드, 펩토이드, 2000 달톤 미만의 분자량의 유기 화합물이다.
몇몇 실시형태에서, 모놀리스의 투수율은 약 1 밀리다시 내지 약 1×104 다시이다. 다른 실시형태에서, 모놀리스의 투수율은 약 1 밀리다시 내지 약 1×103 다시이다. 다른 실시형태에서, 모놀리스의 투수율은 약 8.9×102 다시 내지 약 8.9×104 다시이다. 다른 실시형태에서, 모놀리스의 투수율은 약 8.9×103 다시이다. 다른 실시형태에서, 칼럼은 예비적으로 상보적 올리고뉴클레오타이드를 결합시킨다. 다른 실시형태에서, 칼럼은 약 0.5 f㏖/㎕ 내지 약 0.4 n㏖/㎕의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 결합시킨다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드에 조작 가능하게 연결된 알킨기에 의한 모놀리스의 아자이드기의 고리화 첨가에 의해 모놀리스에 부착되어 1, 2, 3 트리아졸을 형성한다.
몇몇 실시형태에서, 화학 반응 부위 또는 리간드에 조작 가능하게 연결된 상보적 올리고뉴클레오타이드를 선택적으로 결합시키는 부착된 올리고뉴클레오타이드를 갖는 모놀리스를 포함하는 2개 이상의 칼럼을 포함하는 어레이로서, 상보적 뉴클레오타이드가 혼합물의 한 성분인 어레이가 제공된다. 다른 실시형태에서, 어레이는 2개 이상의 웰을 포함하는 블록이고, 여기서 각각의 웰은 상이한 칼럼을 포함한다. 다른 실시형태에서, 칼럼은 웰의 표면(들)에 부착된다. 다른 실시형태에서, 칼럼은 아마이드, 에스터, 우레아, 우레탄, 탄소-규소, 탄소-질소, 탄소-탄소, 에터, 티오에터, 또는 다이설파이드 결합의 형성 또는 고리화 첨가에 의해 웰의 표면에 공유 부착된다. 다른 실시형태에서, 블록은 티타늄, 알루미늄, 스테인레스강, 도핑된 금속, 유리, 석영, 폴리카보네이트, 용융 실리카, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 플라스틱, 폴리에터 에터 케톤, 도핑된 폴리에터 에터 케톤, 도핑된 폴리스티렌, 환형 올레핀 공중합체, 울템폴리에터이미드, 도핑된 폴리프로필렌 또는 이들의 조합물로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 블록의 내벽은 벽의 표면적을 증가시키기 위하여 변형된다. 다른 실시형태에서, 웰은 연마된다. 다른 실시형태에서, 웰은 나사산 형성(threading)된다. 다른 실시형태에서, 웰의 치수는 내부 직경 약 3.5 내지 4㎜이고, 높이 약 1 내지 4㎜이다. 다른 실시형태에서, 웰은 어드레서블이다.
몇몇 실시형태에서, 2개 이상의 웰을 갖는 블록을 포함하는 어레이가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 웰은 리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 포함하는 하우징을 함유한다. 다른 실시형태에서, 모놀리스는 웰의 표면에 부착된다. 모놀리스는 웰 표면에 아마이드, 에스터, 우레아, 우레탄, 탄소-규소, 탄소-질소, 탄소-탄소, 에터, 티오에터, 또는 다이설파이드 결합의 형성함으로써 웰의 표면에 공유 부착될 수 있다. 대안적으로, 클릭 화학 또는 고리화 첨가는 웰 표면 위의 적절한 작용성과 모놀리스 위의 기 사이의 사이클로부가물을 제공할 수 있다. 작용성은, 예를 들면, 작용화된 실란 화합물(예를 들면, 3-트라이메톡시실릴)프로필메타크릴레이트)에 의한 웰 표면의 실릴화 또는 메타크릴로일옥시데실다이하이드로젠 포스페이트의 이온성 부착에 의하여 웰 표면에 부착될 수 있다. 대안적으로 웰 표면은 중합체(예를 들면, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리다이메틸실록산, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리-2-노보렌-코-에틸렌)로 코팅될 수 있고, 예를 들면, 벤조페논의 조사에 의해 개시된, 유리 라디칼 첨가를 통해 모놀리스에 부착될 수 있다. 다른 실시형태에서, 폴리비닐 단량체는 모놀리스 형성 동안에 중합체 코팅된 웰 표면에 부착될 수 있고, 추가로 모놀리스 표면 위의 펜던트 올레핀과 추가로 반응하여 모놀리스를 웰 표면에 공유적으로 결합시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 모놀리스는 웰에 직접적으로 부착될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 블록은 티타늄, 알루미늄, 스테인레스강, 도핑된 금속, 유리, 석영, 폴리카보네이트, 용융 실리카, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 플라스틱, 폴리에터 에터 케톤, 도핑된 폴리에터 에터 케톤, 도핑된 폴리스티렌, 울템폴리에터이미드, 환형 올레핀 공중합체, 도핑된 폴리프로필렌 또는 이의 조합을 포함한다. 블록의 웰은 연마, 나사산 형성 또는 수련가에게 알려진 기타 방법에 의해 벽의 표면적을 증가시키도록 변형될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 웰의 치수는 직경 약 0.1㎜ 내지 약 50㎜이고, 높이 약 0.1㎜ 내지 약 10㎜이다. 다른 실시형태에서, 웰의 치수는 직경 약 10㎜이고, 높이 약 10㎜이다. 다른 실시형태에서, 웰의 치수는 내부 직경 약 3.5 내지 약 4㎜이고, 높이 약 1 내지 약 4㎜이다. 몇몇 실시형태에서, 웰은 어드레서블이다.
몇몇 실시형태에서 둘 이상의 이온 교환 하우징(예를 들면, 칼럼 또는 웰)을 갖는 어레이로서, 필터 플레이트 또는 이동상을 통한 흐름을 허용하는 임의의 다른 유형의 마이크로플레이트 또는 디바이스를 포함하는 어레이가 제공된다. 이들 몇몇 실시형태에서, 이온 교환 하우징은 이온화가능 기를 갖는 모놀리스를 포함한다. 이들 몇몇 실시형태에서, 이온화가능 기는 아민, 카복실산 또는 설폰산이다. 이들 몇몇 실시형태에서, 모놀리스는 글리시딜 메타크릴레이트를 포함하는 공중합체와 아민 또는 설폰산 대등체의 반응 생성물이다. 이들 다른 실시형태에서, 모놀리스는 폴리(GMA-코-EDMA), 폴리(GMA-코-DEGDMA) 또는 폴리(GMA-코-DVB)와 아민 또는 설폰산 대등체의 반응 생성물이다. 이들 다른 실시형태에서, 모놀리스는 폴리(CMS-코-DVB)와 아민 또는 설폰산 대등체의 반응 생성물이다. 몇몇 실시형태에서, 이온 교환 칼럼은 통상적인 이온 교환 물질을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 필터 플레이트 또는 이동상을 통한 흐름을 허용하는 임의의 다른 유형의 마이크로플레이트 또는 디바이스를 포함하는 어레이가 제공된다. 어레이는 또한 2개 이상의 웰을 갖는 블록을 포함한다. 각각의 웰은 이온 교환 물질을 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 이온 교환 물질은 이온화가능 기를 갖는 모놀리스를 포함한다. 이들 몇몇 실시형태에서, 이온화가능 기는 아민, 카복실산 또는 설폰산이다. 이들 몇몇 실시형태에서, 모놀리스는 글리시딜 메타크릴레이트을 포함하는 공중합체와 아민 또는 설폰산 대등체의 반응 생성물이다. 이들 다른 실시형태에서, 모놀리스는 폴리(GMA-코-EDMA), 폴리(GMA-코-DEGDMA) 또는 폴리(GMA-코-DVB)와 아민 또는 설폰산 대등체의 반응 생성물이다. 이들 다른 실시형태에서, 모놀리스는 폴리(CMS-코-DVB)와 아민 또는 설폰산 대등체의 반응 생성물이다. 몇몇 실시형태에서, 이온 교환 물질은 통상적인 이온 교환 물질이다.
몇몇 실시형태에서, 칼럼은 웰의 표면(들)에 부착된다. 다른 실시형태에서, 칼럼은 아마이드, 에스터, 우레아, 우레탄, 탄소-규소, 탄소-질소, 탄소-탄소, 에터, 티오에터, 또는 다이설파이드 결합의 형성 또는 고리화 첨가에 의해 웰의 표면에 공유 부착된다.
몇몇 실시형태에서, 블록은 티타늄, 알루미늄, 스테인레스강, 도핑된 금속, 유리, 석영, 폴리카보네이트, 용융 실리카, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 플라스틱, 폴리에터 에터 케톤, 도핑된 폴리에터 에터 케톤, 도핑된 폴리스티렌, 환형 올레핀 공중합체, 울템폴리에터이미드, 유리 섬유 필터플레이트, 도핑된 폴리프로필렌 또는 이의 조합을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 웰의 치수는 직경 약 0.1㎜ 내지 약 50㎜ 및 높이 약 0.1㎜ 내지 약 10㎜이다. 다른 실시형태에서, 웰의 치수는 직경 약 10㎜이고, 높이 약 10㎜이다. 다른 실시형태에서, 웰의 치수는 내부 직경 약 3.5 내지 4㎜이고, 높이 약 1 내지 4㎜이다. 몇몇 실시형태에서, 웰은 어드레서블이다.
부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스 및 이의 어레이의 사용 방법
화학적 화합물의 핵산 프로그래밍된 라이브러리의 제조 방법이 제공된다. 방법은 핵산 분자의 혼합물을 둘 이상의 어드레서블 웰을 갖는 블록을 포함하는 어레이와 접촉시키는 단계를 포함한다. 각각의 웰은 단일 가닥 핵산을 선택적으로 결합시켜 핵산 분자를 소집단으로 분할하는 하나 이상의 부착된 인식 화합물을 포함하는 모놀리스를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 어레이는 각각의 칼럼의 부착된 올리고뉴클레오타이드가 화학 반응 부위 또는 리간드에 조작 가능하게 연결된 상보적 올리고뉴클레오타이드를 선택적으로 결합시키는 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상보적 뉴클레오타이드는 혼합물의 성분이다.
핵산 분자의 소집단은, 예를 들면, 상승된 온도, 이온 강도의 변화 또는 pH 변화를 사용하여, 임의로 인식 화합물로부터 해리될 수 있고, 해리된 핵산 분자는 별도의 컨테이너로 이송된다. 그 다음, 핵산 분자의 분리된 소집단은 상이한 화학 소단위와 반응하고, 여기서 핵산 분자는 적어도 하나의 결합 서열 및 조작 가능하게 연결된 하나의 화학 반응 부위를 포함한다. 핵산 분자의 소집단이 임의로 별도의 컨테이너로 이송되는 경우, 핵산을 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 포함하는 웰은 어드레서블 방식으로 별도의 컨테이너와 정렬된다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 분자의 분리된 소집단은 상이한 화학 소단위와의 반응 전에 고정화된다. 다른 실시형태에서, 핵산 분자의 분리된 소집단은 상이한 화학 소단위와의 반응 전에 음이온 교환 칼럼 위에 고정화된다. 다른 실시형태에서, 음이온 교환 칼럼은 이온 교환기를 갖는 모놀리스를 포함한다.
화학적 화합물의 핵산 프로그래밍된 라이브러리의 또 다른 제조 방법이 제공된다. 방법은 핵산 분자의 혼합물을 둘 이상의 어드레서블 웰을 갖는 블록을 포함하는 어레이와 접촉시키는 단계를 포함한다. 각각의 웰은 단일 가닥 핵산을 선택적으로 결합시켜 핵산 분자를 소집단으로 분할하는 하나 이상의 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 어레이는 각각의 칼럼의 부착된 올리고뉴클레오타이드가 화학 반응 부위 또는 리간드에 조작 가능하게 연결된 상보적 올리고뉴클레오타이드를 선택적으로 결합시키는 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상보적 뉴클레오타이드는 혼합물의 성분이다.
핵산 분자의 소집단은 필터 플레이트 또는 이동상을 통한 흐름을 허용하는 임의의 기타 유형의 마이크로플레이트 또는 디바이스, 및 둘 이상의 어드레서블 웰을 함유하는 블록을 포함하는 제2 어레이로 이송된다. 핵산 분자의 소집단은, 예를 들면, 상승된 온도, 이온 강도의 변화 또는 pH의 변화를 사용하여, 인식 화합물로부터 해리될 수 있다. 제2 어레이의 웰은 핵산 분자의 소집단을 비특이적으로 고정화시키는 음이온 교환 물질을 포함한다. 핵산 분자의 고정화된 소집단은 상이한 화학 소단위와 반응한다. 핵산을 선택적으로 결합시키는 하나 이상의 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 포함하는 웰은 어드레서블 방식으로 음이온 교환 물질을 포함하는 웰과 정렬된다. 핵산 분자는 적어도 하나의 결합 서열 및 조작 가능하게 연결된 하나의 화학 반응 부위를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 음이온 교환 물질은 음이온 교환기를 갖는 모놀리스를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 어레이는 각각의 칼럼의 부착된 올리고뉴클레오타이드가 화학 반응 부위 또는 리간드에 조작 가능하게 연결된 상보적 올리고뉴클레오타이드를 선택적으로 결합시키는 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 상보적 뉴클레오타이드는 혼합물의 성분이다. 다른 실시형태에서, 음이온 교환 물질은 이온 교환기를 갖는 모놀리스 칼럼을 포함한다. 다른 실시형태에서, 핵산 분자의 분리된 소집단은 상이한 화학 소단위와의 반응 전에 고정화된다. 다른 실시형태에서, 핵산 분자의 분리된 소집단은 상이한 화학 소단위와의 반응 전에 음이온 교환 물질 위에 고정화된다.
이와 같이, 상기 기재내용은 하기 기재된 DNA-프로그래밍된 조합 화학("DPCC")(예를 들면, 문헌 [Wrenn et al., J. Am. Chem. Soc.(2007) 129(43) 13137-13143]; [Wrenn et al., Annu. Rev. Biochem.(2007) 76, 331-349]; Harbury et al., 미국 특허 제7,479, 472호; Harbury et al., 미국 특허 출원 제US2006/0099626호 참조)의 신규한 수행 방법을 나타낸다.
DPCC는 핵산-주형의 조합 화학 라이브러리의 합성, 스크리닝 및 증폭 방법을 제공한다. 조합 화학 라이브러리는 각각이 상이한 화학적 화합물 모이어티 및 특이한 식별자 핵산 서열 모이어티(즉, 핵산 태그)를 포함하는 복수의 종의 이작용성 분자(즉, 핵산 태깅된 분자)를 포함하고, 여기서 핵산 서열은 상응하는 화학적 화합물 모이어티의 합성을 정의하고 지정한다. 조합 핵산 태깅된 화합물의 합성 및 스크리닝에 사용되는 핵산 태깅된 분자 및 전통적인 전략의 세부사항은 상기 참조에 기재된다.
소분자 조합 라이브러리의 제조에 사용되는 핵산 태깅된 분자는 하기 더 상세하게 기재된다. 핵산 태깅된 분자는 적어도 하나의, 전형적으로 둘 이상의 상이한 카테나 혼성화 서열 및 부착된, 전형적으로 공유 부착된, 화학 반응 모이어티를 함유하는 핵산 태크를 갖는 태깅된 화합물이다(도 1). 임의의 주어진 핵산 태그의 혼성화 서열은 일반적으로 임의의 다른 핵산 태그의 서열과 상이하다. 상이한 핵산 태그가 공통의 코돈을 공유할 수 있다는 것을 주의하여야 한다. 각각 핵산 태그의 혼성화 서열은 화학 반응 부위에 부착된 특이한 화학적 화합물을 합성하기 위한 각각 연속적인 합성 단계에서 사용될 것인 특정한 화학 단량체를 식별한다. 이와 같이, 각각의 핵산 태그의 혼성화 서열은 또한 특정 화학 단량체의 화학 반응 부위에의 부착 순서를 식별한다.
일반적으로, 핵산 태그의 각각의 혼성화 서열은 모놀리스에 부착된 상보적 포획 핵산 서열에 혼성화를 위한 개별적인 서열을 제공한다. 핵산 태그의 상이한 혼성화 서열은 별개의 핵산 태깅된 분자의 복수의 소집단으로의 핵산 태깅된 분자의 집단의 서열-특이적 분할을 허용한다. 그 다음, 각각의 핵산 태깅된 분자의 소집단은 별개의 화학 단량체와 반응하여 각각의 핵산 태그의 화학 반응 부위에서 별개의 화학 단량체의 커플링을 허용한다.
몇몇 실시형태에서, BsaI 부위를 함유하고 57 내지 60℃ 범위의 Tm을 갖는 한 세트의 직교 20량체(하기 직교 규칙 참조)가 선택된다. 상기는 불변 영역이고, 이러한 올리고 22가 존재한다. 상기 세트는 코돈으로서 사용되는 49 내지 53℃ 범위의 Tm을 갖는 한 세트의 직교 20량체를 발생시키는데 시드(seed)로서 사용된다. 쿼리(query)와 대상(시드에서의 서열) 사이의 직교성은 하기 기준에 따라 정의된다: (a) 레지스터-내 정렬(대상 뉴클레오타이드 1과 매칭된 쿼리 뉴클레오타이드 1)은 12 뉴클레오타이드 이하의 매칭을 가져야 하고; (b) 9 뉴클레오타이드 이하의 인접 작동이 쿼리와 대상(임의의 레지스터) 사이에서 매칭되어야 하고; (c) 3' 또는 5' 말단에서 6 뉴클레오타이드 이하의 인접 작동이 쿼리와 대상 사이에서 매칭되고; (4) 모든 상기 조건은 쿼리의 역 상보에 의해 채워져야 한다.
20량체의 세트는 하기 규칙에 따라 생성된다: (a) 최근접 방법을 사용하여 Tm 계산; (b) 범위(코돈의 경우 49-53; 불변 영역의 경우 57-61)에 속하지 않는 경우 삭제; (c) 회문 없음 > 4 bps; 및 (d) 단일 염기의 수행 없음 > 4nts.
제1 반응 단계를 수행하기 위하여, 핵산 태그의 집단을 별개의 핵산 태그의 복수의 소집단, 예를 들면, 각각의 태그(도 3a, 상부 및 중간 패널)의 "제1" 위치(V1, 예를 들면, a1, b1, 또는 c1)에서 10개의 상이한 혼성화 서열에 상응하는 10개의 상이한 소집단으로 "분할한다". 이는 핵산 태그-함유 분자를 핵산 태그의 상이한 "제1-위치" 혼성화 서열(예를 들면, a1', b1', 또는 c1') 중 하나에 상보적인 서열을 갖는 부착된 포획 핵산을 갖는 모놀리스의 제1 그룹과 접촉시킴으로써 수행된다: 이들 고정화된 핵산은 때때로 "포획 핵산" 또는 "포획 올리고뉴클레오타이드"로서 본원에 언급되고, "포획 서열"로서 언급되는 핵산 태그 서열에 상보적인 서열이다. 이러한 접촉 단계는 상이한 핵산 태그를 갖는 분자의 집단을 X1 소집단(여기서, X는 풀링(pooling)된 화합물을 분리하는데 사용되는 상이한 포획 서열의 수를 나타낸다)으로 나누는 것을 제공하고, 분자의 각각의 소집단은 핵산 태그 사이에서 적어도 하나의 공통의 혼성화 서열을 공유한다.
제1 분할 단계 후, X1 상이한 핵산 태그 소집단(예를 들면, 도 3a에 예시된 것과 같은 핵산 태그의 10개의 상이한 소집단)은 X1 상이한 화학 단량체와 반응한다(도 3a, 중간 패널). 반응은 커플링 단계에서 사용되는 각각의 화학 단량체의 동일성이 소집단에서 핵산 태그의 특정한 "제1" 위치 혼성화 서열에 의해 지정되도록 수행된다. 도 3a에 예시된 바와 같이, 화학 단량체 A1, B1, 또는 C1은 "제1" 위치(예를 들면, a1, b1, 또는 c1)에서 특정한 핵산 태그 혼성화 서열에 상응한다. 제1 화학 커플링 단계는 특정한 화학 단량체를 각각의 핵산 태그 소집단의 화학 반응 부위(예를 들면, 도 2에 예시된 바와 같은 A1, B1, 또는 C1)에 접합시킴으로써, 각각의 태그에서 화학 반응 부위를 시약-특이적 화합물 중간체로 전환시킨다. 결과는 핵산 태그를 갖는 화합물의 N1 상이한 소집단이고, 여기서 각각의 소집단은 각각의 핵산 태그 소집단의 화학 반응 부위에 접합된 상이한 화학 단량체를 갖는다(도 3a, 하부 패널). 예를 들면, 핵산 태그의 3개의 상이한 집단("분할" 단계에서 a1, b1, 또는 c1에 혼성화함으로써 분리된 바와 같음)은 도 3a의 하부 패널에서 나타내고, 여기서 서열에 의해 분리된 분자의 제1 소집단은 화학 단량체 A1를 함유하도록 변형되고, b1 서열에 의해 분리된 분자의 제2 소집단은 화학 단량체 B1를 함유하도록 변형되고, 서열에 의해 분리된 분자의 제3 소집단은 화학 단량체 C1를 함유하도록 변형된다. 각각의 예에서, 화학 단량체는 핵산 태그-함유 화합물의 화학 반응 부위에 커플링되고, 여기서 첨가된 화학 단량체는 목적하는 바와 같은 후속적인 단계에서 추가의 단량체의 커플링을 위한 반응 부위를 제공한다.
제1 분할 및 화학 커플링 단계 후, X1 상이한 핵산 태그-함유 화합물 소집단을 풀링하고, 각각이 핵산 태그의 X2 상이한 "제2-위치" 혼성화 서열(예를 들면, a2, b2, 또는 c2) 중 하나에 상보적인 서열을 갖는 고체상 시약의 제2 그룹(고정화된 포획 핵산 서열, 예를 들면, a2', b2', 또는 c2')과 접촉시킨다(도 3b, 상부 및 중간 패널). 결과적으로, 핵산 태깅된 화합물의 풀링된 집단은 별개의 핵산 태그의 복수의 X2 소집단으로 분할한다. 제2 단계에서 소집단의 수(X2)는 제1 단계 분할로부터 야기된 소집단의 수(X1)와 동일하거나 상이할 수 있다. 상기와 같이, 핵산 태깅된 분자의 각각의 소집단은 핵산 태그의 "제2-위치" 혼성화 서열(예를 들면, a2, b2, 또는 c2)에 의해 결정된다(도 3b, 중간 패널).
그 다음, 핵산 태깅된 화합물의 각각의 상이한 "제2-위치" 소집단을 하위 세트에 대한 상이한 화학 단량체(예를 들면, A2, B2, 또는 C2)인 제2 복수의 화학 단량체 중 하나와 반응시킨다(도 3b, 중간 패널). 결과는 각각의 집단이 분자의 각각의 핵산 태그-함유 소집단의 이전 화학 단량체에 접합된 상이한 화학 단량체를 갖는 핵산 태그의 X2 상이한 소집단이다(도 3b, 하부 패널). 예를 들면, 도 3b의 하부 패널에 예시된 바와 같이, 핵산 태그-함유 화합물의 9개의 상이한 소집단이 생성될 수 있고, 여기서 제1 집단은 화학 단량체 A1 및 A2를 포함하고, 제2 집단은 화학 단량체 A1 및 B2를 포함하고, 제3 집단은 화학 단량체 A1 및 C2를 포함하고, 제4 집단은 화학 단량체 B1 및 A2를 포함하고, 제5 집단은 화학 단량체 B1 및 B2를 포함하고, 제6 집단은 화학 단량체 B1 및 C2를 포함하고, 제7 집단은 화학 단량체 C1 및 A2를 포함하고, 제8 집단은 화학 단량체 C1 및 B2를 포함하고, 제9 집단은 화학 단량체 C1 및 C2를 포함한다.
이전에 반응시킨 핵산 태그가 Xn 상이한 소집단으로 분할되는 이러한 공정(여기서, X는 풀링된 화합물을 분리하는데 사용된 상이한 포획 서열의 수를 나타내고, n은 합성 계획의 단계 수를 나타낸다)은 필요한 경우 반복된다. 예를 들면, 도 3c 및 도 3d에 예시된 바와 같이, 핵산 태그-함유 화합물을 고정화된 포획 올리고뉴클레오타이드의 신규한 한 세트와 혼성화시킨 다음, 태그의 Xn 분리된 소집단을 Xn 상이한 선택된 화학 단량체와 반응시킬 수 있다. 이러한 단계들은 핵산 태그-함유 화합물의 반응 부위에서 연속적으로 수행되는 모든 목적하는 반응 단계가 완료될 때까지 반복될 수 있다(도 3c 및 도 3d). 결과는 X1×X2×...×XN 상이한 핵산 태깅된 화학적 화합물의 조합 라이브러리이고, 여기서 각각의 화합물의 핵산 태그의 N 위치에서 특정한 혼성화 서열(예를 들면, V1, V2, 및 V3, 도 1 참조)은 특정한 화합물의 화학 단량체의 서열을 지시한다.
도 3d의 상부 패널에 예시된 바와 같이, 핵산 태깅된 화합물의 27개의 상이한 집단은 도 3a 내지 도 3c에 예시된 바와 같은 단계로부터 생성될 수 있다. 화합물의 예시적인 조합 라이브러리는, 예를 들면, 화학 단량체 A1, A2, 및 A3을 포함하는 제1 집단, 화학 단량체 A1, B2, 및 A3을 포함하는 제2 집단, 화학 단량체 A1, C2, 및 A3을 포함하는 제3 집단, 화학 단량체 B1, A2, 및 A3을 포함하는 제4 집단, 화학 단량체 B1, B2, 및 A3을 포함하는 제5 집단, 화학 단량체 B1, C2, 및 A3을 포함하는 제6 집단, 화학 단량체 C1, A2, 및 A3을 포함하는 제7 집단, 화학 단량체 C1, B2, 및 A3을 포함하는 제8 집단, 및 화학 단량체 C1, C2, 및 A3을 포함하는 제9 집단 등을 포함한다.
도 1에서 예시된 바와 같이, 핵산 태그는 상이한 카테나 핵산 서열의 Zn(예를 들면, n=9) 영역 및 화학 반응 부위로 이루어진다. 이러한 5개의 영역은 C1 내지 C5로 표시되고, 핵산 태그와 동일한 "불변" 또는 "스페이서" 서열을 나타낸다. 4개의 잔여 Z 영역은 V1 내지 V4로 표시되고, 제1 내지 제4 위치에서 "가변" 혼성화 서열을 나타낸다. 대표적인 실시형태에서, V 영역 및 C 영역은 핵산 태그의 3' 말단으로부터 핵산 태그의 5' 말단 순서로 교대로 나온다. 특정한 실시형태에서, 제1 Z 영역은 C 영역이다. 다른 실시형태에서, 제1 Z 영역은 V 영역이다. 특정한 실시형태에서, 마지막 Z 영역은 C 영역이다. 다른 실시형태에서, 마지막 Z 영역은 V 영역이다.
가변 혼성화 서열은 일반적으로 각각의 위치에서 핵산 태그의 소집단의 각각의 그룹과 상이하다. 이러한 실시형태에서, 모든 V 영역은 2개의 상이한 C 영역을 접하고 있다. 하기로부터 인지될 것인 바와 같이, 2개의 V-영역 서열이 서로 교차-혼성화되지 않도록 모든 V-영역 서열은 직교이다. 예를 들면, 4개의 가변 영역 및 4개의 가변 영역 각각에 대한 400개의 상이한 핵산 서열을 포함하는 핵산 태그를 포함하는 실시형태에서, 총 1,600개의 직교 핵산 혼성화 서열이 존재한다. 이러한 혼성화 서열은 공지된 방법에 따라 지시될 수 있다. 예를 들면, 각각의 가변 혼성화 서열은 20 뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 위치에서 4 뉴클레오타이드가 있을 가능성이 있는 경우, 420개의 상이한 서열이 가능하다. 상이한 가능성 후보 중에서, 특이적 서열은 각각의 서열이 다른 서열과 적어도 상이한 내부 뉴클레오타이드 2 내지 3 또는 그 이상만큼 상이하도록 선택될 수 있다.
일반적으로 적합한 C 및 V 영역은 약 10 뉴클레오타이드 내지 약 30 뉴클레오타이드, 또는 그 이상의 길이를 포함한다. 특정한 실시형태에서, C 및 V 영역은 약 11 뉴클레오타이드 내지 약 29 뉴클레오타이드의 길이를 포함하고, 이는 약 12 내지 약 28, 약 13 내지 약 27, 약 14 내지 약 26, 약 14 내지 약 25, 약 15 내지 약 24, 약 16 내지 약 23, 약 17 내지 약 22, 약 18 내지 약 21, 약 19 내지 약 20 뉴클레오타이드의 길이를 포함한다. 대표적인 실시형태에서 C 및 V 영역은 약 20 뉴클레오타이드의 길이를 포함한다.
핵산 태그는 약 1 내지 약 100 또는 그 이상의 상이한 V 영역(혼성화 서열)을 포함할 수 있고, 이는 약 200, 약 300, 약 500 이상의 상이한 V 영역을 포함한다. 대표적인 실시형태에서, 핵산 태그는 약 1 내지 약 50개의 상이한 V 영역을 포함하고, 이는 약 2 내지 약 48, 약 3 내지 약 46, 약 4 내지 약 44, 약 5 내지 약 42, 약 6 내지 약 40, 약 7 내지 약 38, 약 8 내지 약 36, 약 9 내지 약 34, 약 10 내지 약 32, 약 11 내지 약 30, 약 12 내지 약 29, 약 13 내지 약 28, 약 13 내지 약 28, 약 14 내지 약 27, 약 15 내지 약 26, 약 16 내지 약 25, 약 17 내지 약 24, 약 18 내지 약 23, 약 19 내지 약 22, 약 20 내지 약 21개의 상이한 V 영역을 포함한다.
핵산 태그는 약 1 내지 약 100개 또는 그 이상의 상이한 C 영역(불변 서열)을 포함할 수 있고, 이는 약 200, 약 300, 약 500개 이상의 상이한 C 영역을 포함한다. 대표적인 실시형태에서, 핵산 태그는 약 1 내지 약 50개의 상이한 C 영역을 포함하고, 이는 약 2 내지 약 48, 약 3 내지 약 46, 약 4 내지 약 44, 약 5 내지 약 42, 약 6 내지 약 40, 약 7 내지 약 38, 약 8 내지 약 36, 약 9 내지 약 34, 약 10 내지 약 32, 약 11 내지 약 30, 약 12 내지 약 29, 약 13 내지 약 28, 약 13 내지 약 28, 약 14 내지 약 27, 약 15 내지 약 26, 약 16 내지 약 25, 약 17 내지 약 24, 약 18 내지 약 23, 약 19 내지 약 22, 약 20 내지 약 21개의 상이한 C 영역을 포함한다.
핵산 태그는 영역 Z1 내지 Zn(예를 들면, n=9)이 3'에서 Z1로 시작하여 서로 연결되고, Zn 후 5' 말단에서 화학 반응 부위가 있는 순서로 연속되도록 합성된다. 예를 들면, 핵산 태그의 3' 말단에서 시작하여, Z1은 Z2에 연결되고, Z2는 Z3에 연결되고, Z3은 Z4에 연결되고, 화학 반응 부위는 3' 말단, 5' 말단, 또는 핵산 태그의 임의의 다른 위치를 포함하는 핵산 태그의 임의의 부위에서 Zn에 연결된다.
상의 기재된 바와 같이, 핵산 태그의 집단은 퇴화되고, 즉 거의 모든 핵산 태그는 뉴클레오타이드 서열이 서로 상이하다. 상이한 핵산 태그 사이의 뉴클레오타이드 차이는 전적으로 혼성화 서열(V 영역)로 인한 것이다. 예를 들면, 핵산 태그의 초기 집단은 각각의 소집단의 V1의 특정한 서열을 기반으로 한 핵산 태그의 400개의 제1 소집단을 포함할 수 있다. 이와 같이, 각각의 소집단의 V1 영역은 400개의 상이한 20 염기쌍 혼성화 서열 중 임의의 하나를 포함한다. V1을 기반으로 한 핵산 태그의 이러한 집단의 분리는 핵산 태그의 400개의 상이한 소집단을 야기할 것이다. 이와 같이, 핵산 태그의 동일한 초기 집단은 또한 각각의 소집단의 V2의 특정한 서열을 기반으로 한 핵산 태그의 400개의 제2 소집단을 포함할 수 있고, 여기서 제2 소집단은 제1 소집단과 상이하다.
도 1에 입증된 핵산 태그의 예시적인 집단에서, 제1 혼성화 서열의 처음 몇몇은 상이한 핵산 태그의 V1 영역에서 a1, b1, c1...j1로 표시된다. 이와 같이, 제2 혼성화 서열의 처음 몇몇은 상이한 핵산 태그의 V2 영역에서 a2, b2, c2...j2로 표시된다. 제3 혼성화 서열의 처음 몇몇은 상이한 핵산 태그의 V3 영역에서 a3, b3, c3...j3로 표시된다.
특정한 실시형태에서, 핵산 태그는 상이한 스페이서 영역 사이의 상이한 20 염기쌍 서열을 갖는, 지시된 스페이서 영역을 위한 동일한 20 염기쌍 서열을 공유한다. 예를 들면, 핵산 태그는 동일한 C1 스페이서 영역, 동일한 C2 스페이서 영역, 및 동일한 C3 스페이서 영역을 포함하고, 여기서 C1, C2, 및 C3은 서로 상이하다.
따라서 각각의 180 뉴클레오타이드 긴 핵산 태그는 교대 순서로 4개의 가변 영역(a1, b1, c1...d5, e5, f5,...h10, i10, j10) 및 5개의 스페이서 영역(z1...z11)을 포함하는 9개의 상이한 20 염기쌍 영역의 정돈된 어젬블리로 이루어진다. 20 염기쌍 영역은 하기 성질을 갖는다: (i) 마이크로몰 농도의 모든 영역 서열은 특정한 온도 지시된 Tm에서 용액 중에서 유효하게 이의 상보적 DNA 서열을 혼성화하고, (ii) 영역 서열은 혼성화에 관하여 서로 직교하고, 이는 영역 서열 중 어느 것도 온도 Tm에서 영역 서열 중 다른 것 또는 다른 임의의 영역 서열의 상보적인 것과 유효하게 교차 혼성화되지 않음을 나타낸다.
퇴화 핵산 태그는 문헌 [Stemmer et al., Gene(1995) 164(1) 49-53]에 기재된 프라이머가 없는 PCR 조립 방법 또는 결찰 전략에 의해 이들의 구성 빌딩 블록으로부터 조립될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 핵산 태그는 3' 말단, 5' 말단, 또는 핵산 태그의 임의의 다른 위치를 포함하는 화학 반응 부위를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 태그의 5' 염기의 5' 알코올을 선형 스페이서에 테더링된 포스페이트기를 도입하는 상업적으로 이용가능한 시약, 예를 들면, 1차 아민기를 말단으로 갖는 12-탄소 쇄(예를 들면, 글렌 리서치(Glen Research)로부터 이용가능한 것, 또는 티올 또는 다른 화학 반응 부위를 합성 DNA에 도입하는데 이용가능한 다수의 기타 시약)에 의해 변형시킴으로써 화학 반응 부위를 가할 수 있다.
화학 반응 부위는 핵산 태그의 V 영역 서열의 순서에 의해 지시된 특정한 화합물이 합성되는 부위이다. 예시적인 화학 반응 부위는 1차 아민이다. 1차 아민 이외에 많은 상이한 유형의 화학 반응 부위가 3' 말단, 5' 말단, 또는 핵산 태그의 임의의 다른 위치를 포함한 임의의 부위에 도입될 수 있다. 예시적인 화학 반응 부위는 아마이드, 에스터, 우레아, 우레탄, 탄소-카보닐 결합, 탄소-질소 결합, 탄소-탄소 단일 결합, 올레핀 결합, 티오에터 결합, 및 다이설파이드 결합을 형성할 수 있는 화학 성분을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 효소 합성의 경우, 효과적인 촉매작용에 필요한 경우, 보조인자가 공급될 수 있다. 이러한 보조인자는 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있다. 예시적인 보조인자는 폴리케타이드 합성에 유용한 포스포판테테이닐기이다.
전체 화합물 라이브러리는 DNA-주형의 라이브러리 분할 및 핵산 태그의 각각의 하위 세트에 대한 화학적 및/또는 생화학적 커플링의 교대 라운드를 수행함으로써 합성한다.
제조된 복수의 화학적 화합물은 화학적 구조의 확인을 가능하게 하는 핵산 서열 태그에 연결된다. 통상적인 DNA 시퀀싱 방법은 합성-지정 핵산 태그의 서열의 측정에 용이하게 이용가능하고 유용하다(예를 들면, 문헌 [Maniatis et al., eds., "Molec㎕ar Cloning: A Laboratory Manual", 제2 Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)] 참조).
화합물 라이브러리는 목적하는 활성, 예를 들면, 특정한 반응을 촉매하거나 고정화된 수용체에 높은 친화성으로 결합하는 능력을 위해 스크리닝될 수 있다. 대부분의 경우, 목적하는 활성을 갖는 분자 소집단뿐만 아니라 핵산 태그는 선택 동안 동기들로부터 물리적으로 분배된다. 선택 후, 선택된 분자에 부착된 핵산 태그는 폴리머라제 연쇄 반응("PCR")(Saiki et al., Science(1988) 239(4839) 487-491)에 의해 합성된다. 암호화 가닥을 합성하는데 사용된 5'-말단 프라이머의 5'하이드록실은 신선한 1차 아민 화학 반응 부위에 테더링된 포스페이트기에 의해 변형된다. 합성 후, 암호화 가닥은 비암호화 가닥으로부터 분리된다. 핵산 태그가 개별적인 화합물의 합성 이력에 대한 보고보다는 라이브러리 합성을 지정하기 때문에, 제1 라이브러리로부터 증폭된 암호화 가닥은 제2 발생 화합물 라이브러리의 건설을 지정하는데 사용될 수 있다. 선택, DNA 태그 증폭, 및 라이브러리 재합성의 다중 라운드를 수행함으로써, 당해 과정의 반복은 개별적인 목적하는 화합물이 극도로 복잡한 라이브러리로부터 증폭되는 것을 허용한다.
상기에 의해 제조된 전체적인 화합물 라이브러리 또는 개별적인 라이브러리 멤버는 활성을 조절하거나 목적하는 구조적 또는 작용적 성질을 보유하는 화합물을 구별할 수 있는 스크리닝 검정에서 하나 이상의 목적하는 활성에 대하여 평가될 수 있다. 예시적인 검정 및 작용적 분석은 효소 검정, 비효소 촉매 검정, 단백질-단백질 결합 검정, 수용체/리간드 결합 검정 및 세포-기반 검정을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 보다 특히, 예시적인 세포-기반 방법은 하기를 기반으로 한다: (1) 세포 표면에 대한 라이브러리 화합물의 차등 결합(즉, 암 세포에 결합하고 비-암 세포에 결합하지 않음); (2) 세포 추출물의 성분에 대한 라이브러리 화합물의 결합(예를 들면, 수크로스 구배로 전체 세포 추출물을 분리함으로써 제조된 세포 분획에 대한 결합); (3) 세포에 의한 세포내섭취가 각능한 라이브러리 화합물 및 (4) 라이브러리를 동물에 주사함으로써 라이브러리 화합물의 생체내 국재화 및 결합 성질(예를 들면, 종양 혈관에 특이적으로 위치한 펩타이드를 단리하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생체내 선택이 기재되어 있는 문헌 [Arap et al., Science(1998) 279(5349) 377-80]을 참조한다). 당해 분야의 숙련가에게 인지될 것인 바와 같이, 이러한 검정은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 합성된 화합물의 전체 라이브러리 또는 이로부터 유도된 소집단에 대해 수행될 수 있다.
리간드가 DPCC에 의하여 합성되고 식별될 수 있는 다수의 가능한 인식 화합물은 사실상 무한하다. 인식 화합물은 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드, 중합체, 폴리실록산, 50 달톤 초과의 분자량의 무기 화합물, 약 3000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
핵산 태그-지정된 조합 라이브러리 방법에 의해 제조된 목적하는 리간드는 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 RNA, 단일 가닥 DNA, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 펩타이드 핵산, 펩타이드, 뎁시펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 펩토이드, 중합체, 폴리실록산, 50 달톤 초과의 분자량의 무기 화합물, 약 3000 달톤 내지 약 50 달톤의 분자량의 유기 화합물 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
선택된 라이브러리 멤버의 증폭을 허용하는 것 이외에, 방법은 암호화된 화합물 라이브러리의 평가를 허용한다. 보다 특히, 화합물의 선택된 소집단을 암호화하는 핵산 태그 사이의 유전자 재조합은 돌연변이생성 또는 핵산 태그 서열의 무작위 단편화에 의하여 시험관내 수행된 후, 관련 핵산 서열의 발생("gene shuffling", Stemmer, Nature, (1994) 370 389-391; Stemmer et al., United States Patent No. 5,811,238) 및 추가의 화합물의 후속적인 단계식 합성이 수행된다. 선택, DNA 태그 증폭, 유전자 재조합 및 라이브러리 재합성에 의한 이러한 과정의 반복은 개별적인 목적하는 화합물이 극도로 복잡한 라이브러리로부터 발생하는 것을 허용한다.
몇몇 실시형태에서, 특이한 제한 부위가 각각의 특이적 혼성화 서열 내로 도입된다. 예시의 방식으로, 11개의 특이적 혼성화 서열을 갖는 라이브러리의 부분 소화는 11개의 상응하는 제한 효소에 의한 부분 소화 후, 프라이머가 없는 PCR 재조립 반응에 의해 달성되고, 이는 라이브러리로부터 선택된 화합물을 위한 핵산 태그가 서로 재조합되도록 허용하고, 추가의 합성 단계가 수행된다. 단백질 합성에 대한 유전자 셔플링(Crameri et al., Nature (1998) 391 288-291)에서 유추하여, 화합물 라이브러리의 유전자 재조합을 수행하는 능력은 효율을 크게 증가시키고, 화합물 라이브러리에서 다양성이 탐구될 수 있고 최적화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 유전자는 원형화되었다.
따라서, 폴리뉴클레오타이드 셔플링은 구조적으로 관련된 및/또는 작용적으로 관련된 분자의 합성을 지정할 수 있는 변이체 핵산 서열의 집단, 및/또는 하나 이상의 목적하는 활성을 갖는 리간드를 생성하는 이의 변이체를 수득한다. 예를 들면, mRNA의 5' 미번역 영역(UTR)에 결합할 수 있는 분자는 당해 방식으로 식별될 수 있다. PCR에 의한 합성 지정 핵산 태그의 선택된 소집단의 시험관내 증폭은 또한 상기 기재된 방법을 사용하여 "유전자 셔플링" 전 또는 후에 가능하다.
또 다른 양상에서, 디바이스가 제공된다. 디바이스는 개별적인 블록을 포함하는 2개의 어레이를 포함한다. 제1 어레이의 블록은 리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 포함하는 둘 이상의 어드레서블 웰을 포함한다. 제2 어레이의 블록은 이온 교환 물질을 포함하는 둘 이상의 어드레서블 웰을 포함한다. 리간드를 선택적으로 결합시키는 부착된 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 포함하는 웰은 이온 교환 물질을 포함하는 웰과 정렬된다. 몇몇 실시형태에서, 이온 교환 물질은 이온 교환기를 갖는 모놀리스를 포함한다. 다른 실시형태에서, 이온 교환 물질은 음이온 교환기를 갖는 모놀리스를 포함한다. 상기 언급된 어레이의 특이적 실시형태는 상기 기재된 디바이스에서 사용될 수 있다.
이와 같이, 상기 기재내용은 DPCC를 수행하기 위한 신규한 디바이스를 나타낸다(이전 예시에 대하여, 예를 들면, 문헌[Harbury et al., 미국 특허 출원 제US2006/0099626호; Weisenger et al., PLoS ONE 7, e32299]을 참조한다). 상기 기재된 바와 같이, DNA 라이브러리는 반복된 혼성화 및 화학 사이클을 통해 소분자로 번역된다. 사이클의 수는 라이브러리를 만드는데 필요한 조합 화학 단계의 수에 따라 좌우된다. 특정한 단계에서 각각의 신톤은 특이한 코돈에 상응할 것이다. 상기 실시형태에서, 동일한 코돈을 함유한 DNA 라이브러리의 멤버(즉, 리간드)가 동족 안티-코돈 인식 화합물에 부착된 하나 이상의 모놀리스에 고정화되도록, 혼성화 어레이는 DNA 라이브러리를 어드레서블 웰로 분리한다(즉, 라우팅한다). 혼성화 어레이는 문헌 [Harbury et al., 미국 특허 출원 제US2006/0099626호]에 기재된 분할 필터 또는 문헌 [Weissenger et al., PLoS ONE 7, e32299]에 기재된 세파로스 칼럼 대신에 사용될 수 있다.
또 다른 양상에서, 동일한 코돈을 함유하는 DNA 라이브러리의 멤버(즉, 리간드)가 동족 안티코돈 인식 화합물에 부착된 하나 이상의 모놀리스에 고정화되도록, 혼성화 어레이는 DNA 라이브러리를 어드레서블 웰로 분리한다(즉, 라우팅한다). 이송 어레이는 추가의 화학 단계에서 DNA 라이브러리의 특이적으로 혼성화된 멤버를 개별적인 어드레서블 웰 내로 용리시킨다. 당해 분야의 숙련가는 이러한 디바이스의 사용이 DNA 라이브러리에 한정되지 않는다는 것을 인지할 것이다. 화합물의 여러 다양한 라이브러리는 적절하게 선택된 인식 화합물에 의해 동일한 방식으로 라우팅될 수 있고, 추가로 하기에 기재된 바와 같이 진행될 수 있다.
예시적인 혼성화 어레이는 도 4에 도시되고 상부부터 하부로 A12, D11, T1, D11 및 A11인 플레이트 5개를 포함한다. 플레이트 T1은 각각의 어드레서블 웰이 부착된 특이적 안티코돈 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 함유하는 어레이이다. 플레이트 D11 및 D12는, 예를 들면, 플레이트 T1 위의 부착된 특이적 안티코돈 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 플레이트 A11 및 A12의 내면 위에 홈과 연결시키는 구멍을 함유하는 플라스틱으로부터 제작된다. 홈은 이를 통해 기압 및 진공이 적용될 수 있는 채널에 연결된다. A와 D 플레이트 사이에 위치한 격막은 A 플레이트 위의 홈, D 플레이트의 구멍, 및 T 플레이트의 모놀리스로 이루어진 밀봉된 연속 세르펜틴 챔버를 생성한다. 하나의 D 플레이트(D11)는 이를 통해 액체가 이러한 챔버로 들어오고 나가는 포트를 갖는다. 상부 및 하부 A 플레이트의 홈은, 예를 들면, 혼성화 펌프(예를 들면, 문헌 [Weissenger et al., PLoS ONE 7, e32299] 참조)에 의해, A 플레이트의 채널로 기압 및 진공의 적절한 순환 적용이 세르펜틴 챔버에서 액체의 지향성 흐름을 설정하도록 디자인된다. 메조유체 디바이스의 순수 효과는 머리-꼬리(head-to-tail) 방식으로 연속하여 연결된 특이적 안티코돈 인식 화합물에 부착된 모놀리스 칼럼의 어레이(즉, 혼성화 어레이)를 통해 DNA 리간드의 라이브러리를 흐르는 것에 비유될 수 있다. 숙련가는 라이브러리가, 원칙적으로, 혼성화 어레이의 무한한 수 사이에 분배될 수 있도록 N형 디바이스는 연속적으로 연결될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
DNA 라이브러리가 혼성화 어레이를 통해 흐름으로써, 적절한 코돈을 함유하는 DNA 라이브러리의 멤버는 혼성화 어레이에서 동족 안티코돈 인식 화합물에 부착된 모놀리스를 혼성화시킬 것이다. 몇몇 실시형태에서, 디바이스를 통해 DNA 라이브러리를 5회 순화시키는 것은 각각의 코돈의 >90% 분배를 보장할 것이다(즉, 각각의 코돈을 갖는 DNA 라이브러리의 90%가 부착된 안티코돈 인식 화합물을 갖는 정확한 모놀리스에 고정화되고; 상기는 부착된 안티코돈 인식 화합물을 갖는 모놀리스 칼럼을 통한 DNA 라이브러리의 각각의 통과는 동족 코돈의 40% 초과를 분배하는 것을 필요로 한다). 따라서, 이러한 단계의 끝에서, 라이브러리의 90% 초과는 혼성화에 고정화될 것이다. 몇몇 실시형태에서, 디바이스는 분해되고, DNA 라이브러리의 특정한 멤버(즉, 플레이트 T1)에 결합된 동족 안티코돈 인식 화합물에 부착된 모놀리스를 포함하는 혼성화 어레이는 이제 이송 어레이를 형성하는데 사용된다.
이송 어레이는 어레이의 개별적인 모놀리스 칼럼의 평행 프로세싱을 허용하고, 여기서 부착된 안티코돈 인식 화합물을 갖는 모놀리스가 DNA 라이브러리의 특정한 멤버에 혼성화된다. 몇몇 실시형태에서, 이송 어레이는 도 5에 도시된 바와 같이 플레이트 D01, T1 및 D02를 포함한다. 이들 몇몇 실시형태에서, 실리콘 가스켓이 플레이트 D01 및 D02의 내면(T1에 인접한 면)의 스트리트 패턴 홈에 위치하여 어드레서블 이송 어레이 웰의 교차 오염을 방지한다. D01 플레이트의 상부에 적용된 액체는, 예를 들면, 원심분리에 의해, 어젬블리를 통해 끌어당겨질 것이다. 이송 어레이는 부착된 안티코돈 인식 화합물을 갖는 모놀리스를 갖는 어레이의 세척, 용리 및 재생을 허용한다. 몇몇 실시형태에서, 이송 어레이의 웰은 부착된 안티코돈 인식 화합물을 갖는 모놀리스에 혼성화된 DNA 라이브러리의 특정한 멤버를 고정화시키는데 사용될 수 있는 이온 교환 물질을 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이송 어레이 웰의 어드레스는 혼성화 어레이 웰의 어드레스에 직접적으로 상응한다.
추가로, 도면이 3' 말단을 향하여 제1 라우팅된 코돈을 도시하지만, 숙련가는 제1 라우팅된 코돈이 또한 5' 말단으로 라우팅될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 숙련가는 또한 하나 이상의 화학 단계가 각각의 라우팅 단계 후 수행될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
최종적으로, 본 발명을 실시하는 대안적인 방식이 있다는 것을 주의하여야 한다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 예시로서 고려되고 제한적이지 않은 것이며, 본 발명은 본 명세서에서 제공된 세부사항으로 한정되지 않지만, 첨부된 청구항의 범위 및 등가물 내에서 변형될 수 있다.
본 명세서에 기재된 모든 문헌 및 특허는 기재된 연관된 방법 및/또는 물질을 기재하고 설명하는 그 전문이 참조로서 인용된다. 모순이 존재하는 경우, 본 발명의 기재내용이 인용된 문헌의 임의의 기재 내용을 대체하는 것으로 이해된다. 본원에 논의된 문헌은 본 출원의 출원 날짜 전에 이의 기재내용을 단독으로 제공한다. 본원에서 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 문헌을 선행하는 권리를 주지 않는다는 인정으로서 해석되지 않는다. 추가로, 제공된 문헌의 날짜는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 문헌 날짜와 상이할 수 있다.
하기 실시예는 오직 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의도하지 않는다.
실시예
실시예 1: 티타늄 실란화
2개의 #4 티타늄 5 등급 와셔(United Titanium, 외경 = 0.3125 인치, 내경 = 0.125 인치, 두께 = 0.032 in)에 #6-32 탭(주요 직경 = 0.136 인치, 32 나사산/인치)으로 나사산 형성하고, 물로 세척하고, 아세톤으로 세척한 다음, 5분 동안 건조시켰다. 그 다음, 각각의 와셔를 에펜도르프 튜브에 놓고, 헵탄 345 ㎕ 중에 용해된 MPS([3-(메타크릴로일옥시)프로필]트라이메톡시실란(Gelest)) 115 ㎕ 및 티타늄 n-부톡사이드(Gelest) 40 ㎕의 용액 약 250 ㎕를 가한 다음, 튜브를 진탕시키고 위아래를 뒤집었다. 약 15분 후, 와셔를 15 내지 30분 동안 공기 건조시키고, 99℃에서 45분 동안 경화시키고, 아세톤으로 헹구어 과량의 미반응 시약을 제거하고, 추가 5분 동안 공기 건조시켰다.
실시예 2: 모놀리스 형성 및 실린화된 티타늄에 대한 결합
실란화된 티타늄 와셔를 포일 백(Sigma #183385)에 넣고, 백을 N2로 5회 정화한 다음 밀폐했다. GMA 3㎖, EDMA 1㎖, 1-프로판올 3㎖, 1,4-부탄다이올 2.4㎖ 및 물 0.6㎖를 포함하는 혼합물에 약 2분 동안 N2를 살포하고, 약 10분 동안 초음파처리하고, 이 시간에 AIBN 10㎎을 가하고, 혼합물을 저어 개시제를 용해시켰다. 혼합물을 추가 1분 동안 초음파처리하고, 상부 공간을 약 30초 동안 N2로 정화하고, 실란화된 와셔를 함유한 포일 백에 붓고, 임의의 잔여 공기/N2를 제거한 후 밀봉하였다. 와셔를 2개의 외부 알루미늄 플레이트 사이에 끼워넣었고, 이는 오직 중합체만이 와셔에서 나사산 형성된 홀("웰") 사이에 형성되는 것을 보장하였다. 어젬블리를 60℃의 오븐에 수평으로 놓고 밤새 배양하였다. 플레이트/클램프 어젬블리를 오븐으로부터 제거하고, 실온과 평행이 되도록 하였고, 해체하여 모놀리스 와셔를 제공하였다. 과량의 모놀리스를 와셔의 가장부위로부터 제거하였다.
모놀리스 와셔를 주사기에 부착된 필터-하우징에 놓고, 에탄올 5㎖ 및 물 5㎖로 세척하였다.
실시예 3: 알루미늄 6061 어레이의 실란화
384 웰 플레이트를 형성하도록 절삭된, 두께 3.125㎜의 6061 등급의 알루미늄 플레이트를 수돗물로 세척하고, 증류수로 5분 동안 헹구고, 아세톤 중에서 15분 동안 세척하고, 5분 동안 공기 건조시켰다. 플레이트를 약 10분 동안 약 45℃에서 10% NaOH로 처리하고, 블롯팅(blotting)하여 과량의 NaOH를 제거하고, 플레이트의 전체 표면이 은이 될 때까지(1-3분) 30% HNO3 용액 중에 함침시켰다. 그 다음, 플레이트를 증류수로 헹구고, 약 10 내지 60분 동안 공기 건조시키고, 60℃에서 15분 동안 아세톤 중의 30% MPS로 처리하고, 아세톤 중에서 3회 세척하고, 공기 건조시키고, 80℃ 밤새 경화시켰다. 그 다음, 플레이트를 아세톤으로 세척하고, 약 10 내지 15분 동안 공기 건조시켰다.
실시예 4: 모놀리스 형성 및 실란화된 알루미늄 6061 어레이에 대한 결합
실시예 3에서 제조된 실란화된 알루미늄 플레이트를 포일 백(Sigma # Z183393)에 넣고, 백을 N2로 5회 정화한 다음 밀폐했다. GMA 15㎖, EDMA 5㎖, 1-프로판올 15㎖, 1,4-부탄다이올 12㎖ 및 물 3㎖를 포함하는 혼합물에 약 5분 동안 N2를 살포하고, 약 10분 동안 초음파처리하고, 이 시간에 AIBN 25-50 mg을 가하고, 혼합물을 저어 개시제를 용해시켰다. 혼합물을 추가 1분 동안 초음파처리하고, 상부 공간을 약 1분 동안 N2로 정화하고, 실란화된 알루미늄 플레이트를 함유하는 포일 백에 붓고, 임의의 잔여 공기/N2를 제거한 후 밀봉하였다. 그 다음, 동봉된 실란화된 알루미늄 플레이트를 2개의 외부 알루미늄 블록 사이에 끼워넣고, 이를 C-클램프로 고정시켰다. 이는 오직 중합체만이 플레이트에서 절삭된 홀("웰")사이에 형성되는 것을 보장하였다. 어젬블리를 60℃의 오븐에 수평으로 놓고 밤새 배양하였다. 플레이트/클램프 어젬블리를 오븐으로부터 제거하고, 실온과 평행이 되도록 하였고, 해체하여 모놀리스 어레이 플레이트를 제공하였다. 과량의 모놀리스를 플레이트의 가장부위로부터 제거하였다.
진공(10-60초 동안 20 psi)을 사용하여 모놀리스 어레이를 에탄올 약 30㎖ 내지 약 40㎖로 3회 세척하여, 알루미늄 플레이트에 부착된 모놀리스를 통해 에탄올을 끌어당겼다. 그 다음, 에탄올 약 30 ㎕ 내지 약 40 ㎕를 각각의 웰에 가하고, 진공(약 15 내지 약 20초 동안 15 내지 20 psi)을 적용함으로써 모놀리스를 통해 끌어당겼다. 최종적으로, 에탄올 약 30㎕ 및 약 40 ㎕를 각각의 웰에 가하고, 1000 rpm 스핀으로 약 3분 동안 모놀리스를 통해 끌어당겼다. 그 다음, 모놀리스 어레이를 유사한 방식으로 물로 세척하였다. 이상적으로, 모든 웰의 모든 모놀리스는 용매에 투과성이다. 단일 불투과성 웰은 추가의 사용으로부터 어레이를 실격시키는데 충분하다.
실시예 5: 알루미늄 6061 어레이에 부착된 글리시딜 에폭사이드 모놀리스의 아자이드 개방
간단하게, 나트륨 아자이드의 수성 용액(물 8㎖ 및 빙초산 4.6㎖ 중의 25㎜ol) 20 ㎕를 실시예 4에서 제조된 모놀리스 어레이의 각각의 웰에 가하고, 진공을 사용하여 모놀리스를 통해 끌어당겼다. 상기 과정을 1회 반복하고, 어레이를 상기 아자이드 용액을 함유한 욕조로 옮기고, 약 5분 동안 탈기시키고, 상기 아자이드 용액으로 채워진 저장소로 옮기고, 30℃에서 밤새 배양하고, 증류수로 과도하게 세척하고, 물 중에 보관하여 아지도 알코올 작용화된 모놀리스 어레이를 제공하였다.
실시예 6: 알루미늄 6061 어레이에 부착된 아지도 작용화된 모놀리스에 대한 올리고뉴클레오타이드의 부착
0.1M 인산나트륨, pH 7.0, 625uM CuSO4, 3.125mM THPTA(Tris(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민, 시그마-알드리치사), 12.5mM 아미노구아니딘-HCl, 0.3M NaCl, 12.5mM 아스코르베이트, 및 고정화된 올리고뉴클레오타이드(일반 구조 5'헥신일-TTTTTTTTTT-안티코돈, 유로핀스 MWG 오페론 인크(Eurofins MWG Operon Inc., 알라바마 35805 헌츠빌주의 세미놀 드라이브 2211에 소재)로부터 구입) 1㏖을 함유하는 '클릭' 용액 30㎕를 어레이의 각각의 아지도-알코올 작용화된 모놀리스에 가하고, 총 1시간 동안 배양하였다. '클릭' 용액을 주기적으로(약 15분마다) 모놀리스로부터 원심분리하였고, 신선한 아스코르베이트(100mM 아스코르베이트 3㎕ 이하 첨가)로 보충하고, 다시 동일한 모놀리스에 가하였다. 1h 배양 후, '클릭' 용액을 모놀리스로부터 원심분리하고, 어레이를 Tris-EDTA 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA) 30㎕로 3회 세척하여 구리를 킬레이팅하고 반응을 중지시켰다. 수득된 작용화된 어레이를 1mM EDTA, 0.02% 아자이드 중에 4℃에서 보관하였다.
'클릭' 용액으로부터 올리고를 제거함으로써, 5'-헥신일-올리고를 아자이드-변형된 모놀리스에 부착하는 클릭 화학의 효율을 평가하였다. 전형적으로, 5'-OH 올리고(참조 올리고) 및 5'-헥신일 올리고(시험 올리고)인 2종의 올리고의 동일한 농도로 이루어진 시험 반응물을 총 1시간 동안 실온에서 '클릭' 버퍼 중의 모놀리스와 함께 배양한 후, 이를 모놀리스로부터 원심분리시켰다. 배출된 '클릭' 용액을 아세토나이트릴 구배(이동상 A: 135mM 트라이에틸아민, 150mM 빙초산, 5% 아세토나이트릴; 이동상 B: 25% 이동상 A, 75% 아세토나이트릴)로 C18 칼럼 상의 RP-HPLC으로 분석하여 2개의 올리고를 분리하였다. 모놀리스와 배양 전후에 샘플에서 참조 및 시험 올리고의 상대 피크 면적을 사용하여 모놀리스에 '클릭'된 5'헥신일-올리고의 비율을 추정하였다.
실시예 7: 알루미늄 6061 어레이에 부착된 올리고뉴클레오타이드 작용화된 모놀리스의 프로피올산 차단
실시예 6과 같이 처리된 모놀리스 어레이의 임의의 미반응 아자이드기를 하기와 같이 프로피올산와 반응시켜 차단하였다. 0.1M 인산나트륨, pH 7.0, 625uM CuSO4, 3.125mM THPTA(트리스(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민, 시그마-알드리치사), 12.5 mM 아미노구아니딘-HCl, 0.3M NaCl, 12.5mM 아스코르베이트, 및 8 mM 프로피올산을 함유하는 '클릭' 용액 30㎕를 어레이의 각각의 작용화된 모놀리스에 가하고, 총 30분 동안 배양하였다. '클릭' 용액을 주기적으로(약 15분마다) 모놀리스로부터 원심분리하였고, 신선한 아스코르베이트(100mM 아스코르베이트 3㎕ 이하 첨가)로 보충하고, 다시 동일한 모놀리스에 가하였다. 30분 배양 후, '클릭' 용액을 모놀리스로부터 원심분리하고, 어레이를 Tris-EDTA 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA) 30㎕로 3회 세척하여 구리를 킬레이팅하고 반응을 중지시켰다. 수득된 작용화된 어레이를 1mM EDTA, 0.02% 아자이드 중에 4℃에서 보관하였다.
실시예 8: 알루미늄 5038 어레이의 실란화
플레이트를 약 15분 동안 약 45℃에서 약 10% NaOH로 처리하는 것을 제외하고, 실란화를 실시예 3과 같이 수행하였다.
실시예 9: 모놀리스 형성 및 실란화된 알루미늄 5038 어레이에 대한 결합
실시예 5의 과정을 사용하여 상기 모놀리스 어레이를 제공하였다.
실시예 10: PEEK 와셔의 UV 처리
#10-32 탭(주요 직경 = 0.19 인치, 나사산/인치 = 32)을 사용하여 와셔에 나사산 형성하고, 섬광 바이알 내의 1:10 EDMA:메탄올 용액 중에 함침시켰다. 각각의 와셔는 이의 중심에 입사 UV 광을 분산시키는 스테인레스강 콘을 가졌다. 또한, 콘을 와셔의 측면 주위에 놓아 결합 강도에 대한 시험으로서 외부 직경면을 사용하였다. 그 다음, 바이알을 약 1㎝ 높이의 EDMA:메탄올 용액 중에 함침시켰다. 그 다음, 와셔에 15분 동안 약 3㎝의 거리에서 302㎚ UV 광을 조사하고, 뒤집고, 15분 동안 약 3㎝의 거리에서 다시 302㎚ UV 광을 조사하고, 메탄올로 3회 헹구고, 공기 건조시키고, 질소하에 포일 백에 보관하였다. 와셔를 사용하여 실시예 2에 기재된 과정에 따라 모놀리스를 주조하였다.

Claims (20)

  1. 화학 반응 부위 또는 리간드에 조작 가능하게 연결된(operatively linked) 상보적 올리고뉴클레오타이드를 선택적으로 결합시키는 부착된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 모놀리스(monolith)를 포함하는 칼럼(column).
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드가 약 10개의 핵산 소단위(subunit) 내지 약 50개의 핵산 소단위를 포함하는, 칼럼.
  3. 제1항에 있어서, 상기 상보적 올리고뉴클레오타이드에 결합하는 속도 상수가 약 1×102 M-1s-1 내지 약 1×106 M-1s-1인, 칼럼.
  4. 제1항에 있어서, 상기 상보적 올리고뉴클레오타이드는 화학 반응 부위를 포함하는 리간드에 작동적으로 연결되고, 상기 리간드는 펩타이드, 펩토이드(peptoid), 2000 달톤 미만의 분자량의 유기 화합물인, 칼럼.
  5. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드가 폴리(GMA-코-EDMA) 모놀리스와 아자이드의 반응 생성물에 부착되는, 어레이.
  6. 제1항에 있어서, 상기 모놀리스의 투수율이 약 1 밀리다시(millidarcy) 내지 약 1×103 다시(darcy)인, 칼럼.
  7. 제1항에 있어서, 상기 칼럼은 약 0.5 f㏖/㎕ 내지 약 0.4 n㏖/㎕의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 결합시키는, 칼럼.
  8. 제1항의 2개 이상의 칼럼을 포함하는 어레이로서, 상기 각각의 칼럼의 부착된 올리고뉴클레오타이드가 화학 반응 부위 또는 리간드에 조작 가능하게 연결된 상기 상보적 올리고뉴클레오타이드를 선택적으로 결합시키고, 상기 상보적 뉴클레오타이드가 혼합물의 성분인 어레이.
  9. 제8항에 있어서, 상기 혼합물이 상이한 화학 반응 부위 또는 리간드에 조작 가능하게 연결된 상이한 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 어레이.
  10. 제8항에 있어서, 2개 이상의 웰(well)을 포함하는 블록을 포함하고, 각각의 웰이 상이한 칼럼을 포함하는, 어레이.
  11. 제8항에 있어서, 상기 칼럼이 상기 웰의 표면(들)에 부착되는, 어레이.
  12. 제8항에 있어서, 상기 칼럼이 아마이드, 에스터, 우레아, 우레탄, 탄소-규소, 탄소-질소, 탄소-탄소, 에터, 티오에터, 또는 다이설파이드 결합의 형성 또는 고리화 첨가에 의해 상기 웰의 표면에 공유 부착되는, 어레이.
  13. 제8항에 있어서, 상기 블록이 티타늄, 알루미늄, 스테인레스강, 도핑된 금속, 유리, 석영, 폴리카보네이트, 용융 실리카, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 플라스틱, 폴리에터 에터 케톤, 도핑된 폴리에터 에터 케톤, 도핑된 폴리스티렌, 환형 올레핀 공중합체, 울템폴리에터이미드, 도핑된 폴리프로필렌 또는 이들의 조합물로 이루어지는, 어레이.
  14. 이온화가능 기를 갖는 모놀리스를 포함하는 둘 이상의 이온 교환 칼럼을 포함하는, 어레이.
  15. 제13항에 있어서, 상기 이온화가능 기가 아민, 카복실산 또는 설폰산인 어레이.
  16. 제13항에 있어서, 상기 모놀리스가 글리시딜 메타크릴레이트 또는 클로로메틸 스티렌을 포함하는 공중합체와 아민, 카복실산 또는 설폰산 대등체의 반응 생성물인, 어레이.
  17. 제13항에 있어서, 상기 모놀리스가 폴리(GMA-코-EDMA), 폴리(GMA-코-DEGDMA) 또는 CMS-DVB와 아민, 카복실산 또는 설폰산 대등체의 반응 생성물인, 어레이.
  18. 제14항에 있어서, 상기 블록이 티타늄, 알루미늄, 스테인레스강, 도핑된 금속, 유리, 석영, 폴리카보네이트, 용융 실리카, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 플라스틱, 폴리에터 에터 케톤, 도핑된 폴리에터 에터 케톤, 도핑된 폴리스티렌, 환형 올레핀 공중합체, 울템폴리에터이미드, 유리 섬유 필터플레이트, 도핑된 폴리프로필렌 또는 이들의 조합물로 이루어진, 어레이.
  19. 화학적 화합물의 핵산 프로그래밍된 라이브러리의 제조 방법으로서,
    핵산 분자의 혼합물을 제8항의 어레이와 접촉시켜 상기 핵산 분자를 소집단(subpopulation)으로 분할하는 단계;
    임의로 상기 핵산 분자의 소집단을 별도의 컨테이너로 이송하는 단계; 및
    상기 핵산 분자의 분리된 소집단을 상이한 화학 소단위와 반응시키는 단계를 포함하되,
    화학 반응 부위 또는 리간드에 조작 가능하게 연결된 상보적 올리고뉴클레오타이드를 선택적으로 결합시키는 부착된 올리고뉴클레오타이드를 갖는 모놀리스를 포함하는 상기 웰이 어드레서블(addressable) 방식으로 별도의 컨테이너와 정렬되는, 화학적 화합물의 핵산 프로그래밍된 라이브러리의 제조 방법.
  20. 화학적 화합물의 핵산 프로그래밍된 라이브러리의 제조 방법으로서,
    핵산 분자의 혼합물을 제8항의 어레이와 접촉시켜 상기 핵산 분자를 소집단으로 분할하는 단계;
    상기 핵산 분자의 소집단을 음이온 교환 물질을 포함하는 둘 이상의 어드레서블 웰을 포함하는 블록을 포함하는 어레이로 이송하여 상기 핵산 분자의 소집단을 고정화시키는 단계; 및
    상기 핵산 분자의 고정화된 소집단을 상이한 화학 소단위와 반응시키는 단계를 포함하되,
    화학 반응 부위 또는 리간드에 조작 가능하게 연결된 상보적 올리고뉴클레오타이드를 선택적으로 결합시키는 부착된 올리고뉴클레오타이드를 갖는 모놀리스를 포함하는 상기 웰이 어드레서블 방식으로 별도의 컨테이너와 정렬되는, 화학적 화합물의 핵산 프로그래밍된 라이브러리의 제조 방법.
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