JP2019523646A - 経路決定の方法、組成物、およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本明細書によると、必要に応じてデンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートおよびマクロキャプチャーテンプレートの構造および組成物、必要に応じてデンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートを用いてコーディングテンプレートを経路決定する方法、固体支持体と必要に応じてデンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとを含む新規の組合せ、固体支持体とデンドリマーとキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとの新規組合せを用いてコーディングテンプレートを経路決定する方法、コーディングテンプレートとハイブリダイズし必要に応じてデンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートおよびマクロキャプチャーテンプレートを含む新規の組成物および固体支持体を含む新規の組成物、ならびに、コーディングテンプレートとハイブリダイズした必要に応じてデンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレート、が提供される。
Description
本出願は、35U.S.C.§119(e)に基づき、2016年6月5日および2016年12月2日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第62/345,826号および第62/429,252号に由来する優先権を主張する。これらの出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ここで提供されるのは、必要に応じてデンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートおよびマクロキャプチャーテンプレートの構造および組成物;必要に応じてデンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートを用いてコーディングテンプレートを経路決定(route)する方法;固体支持体と、必要に応じてデンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとを含む新規な組合せ;固体支持体、デンドリマー、および、キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートの新規な組合せを用いてコーディングテンプレートを経路決定する方法;必要に応じてデンドリマーに結合するとともにコーディングテンプレートとハイブリダイズしたキャプチャーテンプレートおよびマクロキャプチャーテンプレートを含む新規の組成物;および、固体支持体と、任意にデンドリマーに結合しコーディングテンプレートとハイブリダイズしたキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとを含む新規の組成物;である。
小分子のコンビナトリアルライブラリーは20年以上前に最初に開発され、現在では、多種多様な生物学的標的(例えば、受容体、酵素、核酸など)に対する新規の高親和性リガンドを同定するために日常的に使用されており、創薬における重要性が高まっている。コンビナトリアルライブラリーのうちでも、とりわけ、DNAに機能的に結合したリガンドによって行われる合成工程を記録するためタグとしてDNAを用いるライブラリー※1や、場合によっては、DNAに機能的に結合したリガンドによって行われる合成工程を指示するためのライブラリー※2は、特に今日の関心を集めている。DNAシーケンシング、PCR技術、およびリガンド結合法が進歩すれば、コンビナトリアルリガンドの複雑な混合物から、生物学的標的に結合するDNAと機能的に連結したリガンドを、識別し、選択する方法が提供され得る。
なお、ライブラリー※1については、Pedersenら,米国特許第7,277,713号;Pedersenら,米国特許第7,413,854号;Goulievら,米国特許第7,704,925号;Franchら,米国特許第7,915,201号;Goulievら,米国特許第8,722,583号;Freskgardら,米国特許出願第2006/0269920号;Freskgardら,米国特許第2012/0028812号;Hansenら,米国特許第7,928,211号;Hansenら,米国特許第8,202,823号;Hansenら,米国特許出願第2013/0005581号;Hansenら,米国特許出願第2013/0288929号;Morganら,米国特許第7,972,992号;Morganら,米国特許第7,935,658号;Morganら,米国特許出願第2011/0136697号;Morganら,米国特許第7,972,994号;Morganら,米国特許第7,989,395号;Morganら,米国特許第8,410,028号;Morganら,米国特許第8,598,089号;Morganら,米国特許出願第14/085,271号;Wagnerら,米国特許出願第2012/0053901号;Keefeら,米国特許出願第2014/0315762号;Dowerら,米国特許第6,140,493号;Lernerら,米国特許第6,060,596号;Dowerら,米国特許第5,789,162号;Lernerら,米国特許第5,723,598号;Dowerら,米国特許第5,708,153号;Dowerら,米国特許第5,639,603号;および、Lernerら,米国特許第5,573,905号を参照のこと。また、ライブラリー※2については、Harburyら,米国特許第7,479,472号;Harburyら,米国特許出願第2006/0099626号;Liuら,米国特許第7,070,928号;Liuら,米国特許第7,223,545号;Liuら,米国特許第7,442,160号;Liuら,米国特許第7,491,160号;Liuら,米国特許第7,557,068号;Liuら,米国特許第7,771,935号;Liuら,米国特許第7,807,408号;Liuら,米国特許第7,998,904号;Liuら,米国特許第8,017,323号;および、Liuら,米国特許第8,183,178号を参照のこと。
なお、ライブラリー※1については、Pedersenら,米国特許第7,277,713号;Pedersenら,米国特許第7,413,854号;Goulievら,米国特許第7,704,925号;Franchら,米国特許第7,915,201号;Goulievら,米国特許第8,722,583号;Freskgardら,米国特許出願第2006/0269920号;Freskgardら,米国特許第2012/0028812号;Hansenら,米国特許第7,928,211号;Hansenら,米国特許第8,202,823号;Hansenら,米国特許出願第2013/0005581号;Hansenら,米国特許出願第2013/0288929号;Morganら,米国特許第7,972,992号;Morganら,米国特許第7,935,658号;Morganら,米国特許出願第2011/0136697号;Morganら,米国特許第7,972,994号;Morganら,米国特許第7,989,395号;Morganら,米国特許第8,410,028号;Morganら,米国特許第8,598,089号;Morganら,米国特許出願第14/085,271号;Wagnerら,米国特許出願第2012/0053901号;Keefeら,米国特許出願第2014/0315762号;Dowerら,米国特許第6,140,493号;Lernerら,米国特許第6,060,596号;Dowerら,米国特許第5,789,162号;Lernerら,米国特許第5,723,598号;Dowerら,米国特許第5,708,153号;Dowerら,米国特許第5,639,603号;および、Lernerら,米国特許第5,573,905号を参照のこと。また、ライブラリー※2については、Harburyら,米国特許第7,479,472号;Harburyら,米国特許出願第2006/0099626号;Liuら,米国特許第7,070,928号;Liuら,米国特許第7,223,545号;Liuら,米国特許第7,442,160号;Liuら,米国特許第7,491,160号;Liuら,米国特許第7,557,068号;Liuら,米国特許第7,771,935号;Liuら,米国特許第7,807,408号;Liuら,米国特許第7,998,904号;Liuら,米国特許第8,017,323号;および、Liuら,米国特許第8,183,178号を参照のこと。
しかし、大部分の複雑な小分子コンビナトリアルライブラリーはスプリット・プール合成法により作成されるものの、ワトソン・クリック塩基対を形成するポリマーによって等分が促進されるような方法によって作成されたライブラリーのみが、進化分子工学を通じて進化することができる。ここで、ポリマー配列は、リガンドの化学合成を特異的に誘導するので、それ故、各々のリガンドは結合したポリマーによってコードされる。したがって、ライブラリー合成中に特異な結合リガンドを提供するためには、各々の特異なポリマー配列(すなわち、コーディングテンプレート)を、専用の経路を介して経路決定(すなわち、空間的に局在化)しなければならない。
ポリマーを別個の空間位置に経路決定(routing:ルーティング)する方法(すなわち、テンプレートをコーディングする方法)が当技術分野で記載されている(Harburyら,米国特許第7,479,472号;Harburyら,米国特許出願第2006/0099626号;Wrennら,J. Am. Chem. Soc, 129(43), 13137, 2007;Weisingerら,PLOS, e28056, 2012;Halpinら,PLOS, 1015, 2004;Halpinら,PLOS, 1022, 2004;Halpinら,PLOS, 1031, 2004;および、Gloklerら,国際公開第2012/004204号公報)。しかしながら、ポリマー配列を経路決定する新規で潜在的に優れた方法を開発するためには、コーディングテンプレート密度およびハイブリダイゼーション速度を高める必要がある。
本発明は、以下のものを提供することによって、上記および他の要求を満たす。すなわち、必要に応じてデンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートおよびマクロキャプチャーテンプレートの構造および組成物;必要に応じてデンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートを用いてコーディングテンプレートを経路決定する方法;必要に応じてデンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートと固体支持体とを含む新規の組合せ;固体支持体とデンドリマーとキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとの新規の組合せを用いてコーディングテンプレートを経路決定する方法;必要に応じてデンドリマーに結合し、コーディングテンプレートとハイブリダイズしたキャプチャーテンプレートおよびマクロキャプチャーテンプレートを含む新規の組成物;および、必要に応じてデンドリマーに結合し、コーディングテンプレートとハイブリダイズしたキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートと固体支持体とを含む新規の組成物;を提供する。
一態様では、nが1よりも大きい整数であるときに、n個のコーディングテンプレートの混合物を1よりも大きい空間位置に経路決定する方法を提供する。この方法は、コーディングテンプレートの混合物を空間的に局在化したキャプチャーテンプレートに添加するステップと、空間的に局在化したキャプチャーテンプレートに対して相補的なコーディングテンプレートの間に塩基特異的な二重らせんを形成するステップと、非ハイブリダイズコーディングテンプレートを他の空間的に局在化したキャプチャーテンプレートに移すステップと、空間的に局在化したキャプチャーテンプレートに対して相補的なコーディングテンプレートの間に塩基特異的な二重らせんを形成するステップと、非ハイブリダイズコーディングテンプレートを別の空間位置に移すか、または第3および第4ステップをn−1回反復するステップと、を含む。
さらに別の態様では、n個のコーディングテンプレートの混合物を1よりも大きい空間位置に経路決定する方法を提供する。この方法は、コーディングテンプレートの混合物を空間的に局在化したマクロキャプチャーテンプレートに添加するステップと、空間的に局在化したマクロキャプチャーテンプレートに対して相補的なコーディングテンプレートの間に塩基特異的な二重らせんを形成するステップと、非ハイブリダイズコーディングテンプレートを他の空間的に局在化したマクロキャプチャーテンプレートに移すステップと、空間的に局在化したマクロキャプチャーテンプレートに対して相補的なコーディングテンプレートの間に塩基特異的な二重らせんを形成するステップと、非ハイブリダイズコーディングテンプレートを別の空間位置に移すか、または第3および第4ステップをn−1回反復するステップと、を含む。
さらに別の態様では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、多価デバイスと一緒に空間的に局在化した2つ以上のキャプチャーテンプレートをコーディングテンプレートの混合物に添加するステップと、コーディングテンプレートと空間的に局在化したキャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、を含む。
また別の態様では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、多価デバイスと一緒に空間的に局在化した2つ以上のマクロキャプチャーテンプレートをコーディングテンプレートの混合物に添加するステップと、コーディングテンプレートと空間的に局在化したマクロキャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、を含む。
また別の態様では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上のキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、各キャプチャーテンプレートが、少なくとも1つの二次キャプチャーテンプレートを含むステップと、コーディングテンプレートと相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、二次キャプチャーテンプレートと、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、を含む。
さらに別の態様では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上のマクロキャプチャーテンプレートに添加するステップと、コーディングテンプレートと相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、二次キャプチャーテンプレートと、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、を含む。
また別の態様では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、コーディングテンプレートの混合物を、少なくとも1つの二次キャプチャーテンプレートを含む2つ以上のキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、ここで、各キャプチャーテンプレートが、デンドリマーに結合しており、少なくとも1つの二次キャプチャーテンプレートを含むステップと、コーディングテンプレートと、デンドリマーに結合した相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、二次キャプチャーテンプレートと、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、を含む。
さらに別の態様では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上のマクロキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、ここで、各マクロキャプチャーテンプレートは、デンドリマーに結合しているステップと、コーディングテンプレートと、デンドリマーに結合した相補的マクロキャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、二次キャプチャーテンプレートと、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、を含む。
また別の態様では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上のキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、ここで、各キャプチャーテンプレートは、標識を含み、且つデンドリマーに結合しているステップと、コーディングテンプレートと、デンドリマーに結合した相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、標識を用いて、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体にデンドリマーを結合させるステップと、を含む。
さらに別の態様では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上のマクロキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、ここで、各マクロキャプチャーテンプレートは、標識を含み、且つデンドリマーに結合しているステップと、コーディングテンプレートと、デンドリマーに結合した相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、標識を用いて、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体にデンドリマーを結合させるステップと、を含む。
また別の態様では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上のキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、ここで、各キャプチャーテンプレートが、特異な標識を含むデンドリマーに結合しているステップと、コーディングテンプレートと、デンドリマーに結合した相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、標識を用いて、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体にデンドリマーを結合させるステップと、を含む。
さらに別の態様では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上のマクロキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、ここで、各マクロキャプチャーテンプレートが、特異な標識を含むデンドリマーに結合しているステップと、コーディングテンプレートと、デンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートの相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、標識を用いて、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体にデンドリマーを結合させるステップと、を含む。
また別の態様では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、コーディングテンプレートの混合物をn個の巨視的ビーズに添加するステップであって、ここで、各巨視的ビーズが、結合したキャプチャーテンプレートおよび特異な結合標識を含むステップと、コーディングテンプレートと巨視的ビーズの相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、n個の巨視的ビーズをn個の空間位置に分類するステップと、標識を用いて、ビーズを識別するステップと、ビーズからコーディングテンプレートを溶離するステップと、コーディングテンプレートをn個の空間位置に配列するステップと、を含む。
さらに別の態様では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、コーディングテンプレートの混合物をn個の巨視的ビーズに添加するステップであって、ここで、各巨視的ビーズが、結合したマクロキャプチャーテンプレートおよび特異な結合標識を含むステップと、コーディングテンプレートと巨視的ビーズの相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、n個の巨視的ビーズをn個の空間位置に分類するステップと、標識を用いて、ビーズを識別するステップと、ビーズからコーディングテンプレートを溶離するステップと、コーディングテンプレートをn個の空間位置に配列するステップと、を含む。
また別の態様では、コーディングテンプレートとハイブリダイズし、必要に応じてデンドリマーに結合した、キャプチャーテンプレートおよびマクロキャプチャーテンプレートを含む新規の組成物が提供される。
さらに別の態様では、固体支持体、必要に応じてデンドリマー、ならびにコーディングテンプレートとハイブリダイズした、キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートを含む新規の組成物が提供される。
定義
別途定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。ある用語に複数の定義が存在する場合、別途記載のない限り、このセクションの定義が優先されるものとする。
別途定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。ある用語に複数の定義が存在する場合、別途記載のない限り、このセクションの定義が優先されるものとする。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その、前記(the)」は、文脈上明らかにそうではないとの指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「1つのタグ」についての言及は、複数のそうしたタグを包含し、「その化合物」についての言及は、1つまたはそれ以上の化合物および当業者に公知のその化合物の等価物等についての言及を包含する。
さらに、特許請求の範囲は、あらゆる任意の要素を除外するように作成される場合もあることに留意されたい。したがって、この記載内容は、クレームの要素の列記に関する「唯一」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または、「否定的な」限定の使用の前提基準としての役割を果たすことが意図される。
本明細書で使用されるように、また別途明示されていない限り、「約」および「おおよそ」という用語は、数値または値の範囲を伴う特性に関して用いられる場合は、当該値または値の範囲が依然として特定の特性を記載していても、当技術分野の当業者には妥当とみなされる範囲まで逸脱し得ることを示す。具体的には、「約」および「おおよそ」という用語がこの文脈で使用されるとき、当該数値または値の範囲が、特定の確固とした形態を依然として記載していても、記載される値または値の範囲の5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%または0.1%分変動し得ることを示す。
本明細書で使用される「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片、例えば、1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含有する断片によって実質的もしくは部分的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質を指す。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、典型的には、例えば、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、典型的には、例えば、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらが、免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEをそれぞれ定義する。典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含む。本来、各四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一対から構成され、各対は、1つの「軽鎖」(約25kD)と1つの「重鎖」(約50〜70kD)を有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識を担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を画定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。抗体は、インタクトな免疫グロブリンまたは様々なペプチダーゼでの消化によって生成される、いくつかの十分に特性決定された断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下の抗体を消化して、F(ab)’2(抗原結合断片)およびFc(結晶化しやすい断片、または補体結合断片)を生成する。F(ab)’2は、Fabの二量体であり、これは、それ自体で、ジスルフィド結合によりVH−CH1に結合した軽鎖である。F(ab)’2は、穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を破壊することにより、F(ab)’2二量体をFab’モノマーに変換し得る。Fab’モノマーは、実質的に、ヒンジ領域の一部を含むFabである。抗体分子のFc部分は、主として免疫グロブリン重鎖の定常領域に対応し、抗体のエフェクター機能を担う(抗体断片の詳細な説明については、Fundamental Immunology, 4th edition. W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1998),を参照されたい)。インタクトな抗体の消化に関して、様々な抗体断片が定義されるが、当業者であれば、そうしたFab’またはFc断片を化学的に、または組換えDNA方法、ペプチドディスプレイなどを使用して新しく合成することができることは理解されよう。このように、抗体という用語は、本明細書で使用されるとき、全抗体の修飾により生成されるか、または組換えDNA方法を用いて新しく合成される抗体断片をも包含する。抗体はまた、単一アーム複合モノクローナル抗体、可変重鎖および可変軽鎖が互いに(直接、またはペプチドリンカーを介して)結合されて、連続的なポリペプチドを形成する一本鎖Fv(sFv)抗体をはじめとする一本鎖抗体、ならびにダイアボディ、トリボディ、およびテトラボディを含む(Packら,(1995) J Mol Biol 246:28; Biotechnol 11: 1271;および、Biochemistry 31:1579)。抗体は、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、一本鎖、Fab断片、Fab発現ライブラリーにより生成された断片などである。
本明細書で使用される「塩基特異的二重らせんの形成」または「ハイブリダイゼーション」は、所与の長さのオリゴヌクレオチドについて、一本鎖オリゴヌクレオチドとその相補的配列の核酸鎖との間の配列特異的対合を生成する上で有効な温度、イオン強度および/または溶媒条件を指す。こうした条件は、1つまたは複数の内部塩基ミスマッチを含む2つのほぼ相補的な鎖のハイブリダイゼーションを防止または大幅に防止する上で好ましくは十分に緊縮性である。一部の実施形態では、塩基特異的二重らせんを形成する2つの配列の間のアイデンティティの領域は、約5塩基対より大きい。別の実施形態では、アイデンティティの領域は、約10塩基対より大きい。
本明細書で使用される「キャプチャーテンプレート」は、核酸配列を認識することができるポリマーを指す。一般に、キャプチャーテンプレートは、コーディングテンプレートの様々なハイブリダイゼーション配列(例えば、a1、b1、c1など)の1つに対して相補的であるため、コーディングテンプレートの集団を、個別の空間位置における異なるコーディングテンプレートの複数の亜集団へと配列特異的に分割することを可能にする。一部の実施形態では、キャプチャーテンプレートは、コーディングテンプレートのハイブリダイゼーション配列とほぼ同数のヌクレオチドを有することになる。しかし、当業者には周知のように、コーディングテンプレートとキャプチャーテンプレートとのハイブリダイゼーションが十分である限り、キャプチャーテンプレートは、コーディングテンプレートのハイブリダイゼーション配列より小さくても、または大きくてもよい。一部の実施形態では、キャプチャーテンプレートは、固体支持体に結合している。キャプチャーテンプレートは、オリゴヌクレオチド、拘束ヌクレオシド、架橋ヌクレオシド、ロックド核酸、拘束エチルヌクレオシド、一本鎖RNA、一本鎖DNA、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイドまたはポリマーであってよい。一部の実施形態では、キャプチャーテンプレートは、オリゴヌクレオチド、L−核酸、ペプチド核酸、一本鎖RNAまたは一本鎖DNAである。他の実施形態では、キャプチャーテンプレートは、オリゴヌクレオチドである。
本明細書で使用される「コーディングテンプレート」は、各々が複数のハイブリダイゼーション配列(すなわち、コドン)と官能基または結合エンティティを含む核酸配列を指す。コーディングテンプレートは、オリゴヌクレオチド、拘束ヌクレオシド、架橋ヌクレオシド、ロックド核酸、拘束エチルヌクレオシド、一本鎖RNAまたは一本鎖DNAであってよい。「ハイブリダイゼーション配列」は、約3〜最大100、3〜最大50、約5〜約30核酸サブユニットを含むオリゴヌクレオチドを指す。こうしたコーディングテンプレートは、カテネイトハイブリダイゼーション配列に基づくコンビナトリアルライブラリーの合成を誘導することができる。コーディングテンプレートは、官能基または必要に応じて結合エンティティに機能的に連結している。コーディングテンプレートは、キャプチャーテンプレートにより固定されて、DPCCにおいてコンビナトリアルライブラリー合成を誘導し得る。一部の実施形態では、コーディングテンプレートは、DPCCの間不変である。
本明細書で使用される「コンビナトリアルライブラリー」は、多数の、典型的には約103〜約1015またはそれ以上の異なる化合物を含む分子のライブラリーを指し、これらの化合物は、典型的に、サブユニットの様々な配列、または様々な側鎖官能基および結合の組合せによって特徴づけられる。
本明細書で使用される「デプシペプチド」は、1つまたは複数のアミド結合が、エステル結合により置換された、本明細書で定義されるペプチドを指す。
本明細書で使用される「官能基」は、例えば、求電子基、求核基、ジエン、ジエノフィルなどの化学基を指す。官能基の例として、これに限定されるものではないが、−NH2、−SH、−OH、−CO2H、ハロ、−N3、−CONH2などが挙げられ、上記官能基を含むデンドリマーも含み得る。官能基は、コンビナトリアルライブラリーのリガンドの合成の際に中間体と結合させてもよい。
本明細書で使用される「標識」は、キャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートに結合した識別子である。標識は、リンカーを介してキャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートに結合させることができる。標識の例として、抗体基質、抗体、不可逆的受容体結合剤、受容体、不可逆的酵素阻害剤、酵素、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどが挙げられる。こうした標識の特徴として、相補的物質との複合体の形成があり、これは、一部の実施形態において、不可逆的である。このように、上記リストは、包括的ではなく、例示的なものである。
本明細書で使用される「リガンド」は、オリゴヌクレオチド、拘束ヌクレオシド、架橋ヌクレオシド、ロックド核酸、拘束エチルヌクレオシド、一本鎖RNA、一本鎖DNA、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、ポリマー、ポリシロキサン、分子量50ダルトン超の無機化合物、分子量約1500ダルトン未満の有機化合物を指す。
本明細書で使用される「結合エンティティ」は、コーディングテンプレートに機能的に連結し、且つ、ほとんどの実施形態において、少なくとも1つの官能基を含む分子を指す。いくつかの事例では、結合エンティティの官能基は、リガンド合成を開始するための開始部位として作用する。また別の事例では、結合エンティティは、リガンド合成中に中間体に結合した官能基であってもよい。さらに別の事例では、結合エンティティは、リガンドであってもよく、これは、リンカーに結合した官能基を含有し得る。他の事例では、結合エンティティの官能基は、別の結合エンティティまたはデンドリマーに連結するための部位であってもよい。一部の実施形態では、結合エンティティの官能基は、当業者には周知の方法によって保護され得る。結合エンティティは、構造および長さが変動し得る。結合エンティティは、疎水性または親水性であっても、長いまたは短くても、剛性、半剛性若しくは柔軟性などであってもよい。結合エンティティは、例えば、−(CH2)n−鎖などのポリメチレン鎖、−(CH2CH2O)n−鎖などのポリ(エチレングリコール)鎖(いずれの場合も、nは、1〜約40の整数である)、5’−O−ジメトキシトリチル−1’,2’−ジデオキシリボース−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト;9−O−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール、1−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト;3−(4,4’−ジメトキシトリチルオキシ)プロピル−1−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト;ならびに18−O−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール、1,−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト、アミノ−カルボン酸リンカー(例えば、ペプチド(例えば、Z−Gly−Gly−Gly−Osu若しくはZ−Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−Osu)、PEG(例えば、Fmoc−アミノPEG2000−NHS若しくはアミノ−PEG(12−24)−NHS)、またはアルカン酸鎖(例えば、Boc−ε−アミノカプロン酸−Osu))、クリックケミストリーリンカー(例えば、ペプチド(例えば、アジドホモアラニン−Gly−Gly−Gly−Osu若しくはプロパルギルグリシン−Gly−Gly−Gly−Osu)、PEG(例えば、アジド−PEG−NHS)、またはアルカン酸鎖(例えば、5−アジドペンタン酸、(S)−2−(アジドメチル)−1−Boc−ピロリジン、または4−アジド−ブタン−1−酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル))、チオール−反応性リンカー(例えば、PEG(例えば、SM(PEG)nNHS−PEG−マレイミド)、アルカン鎖(例えば、3−(ピリジン−2−イルジスルファニル)−プロピオン酸−Osuまたはスルホスクシンイミジル6−(3’−[2−ピリジルジチオ]プロピオンアミド)ヘキサン酸塩)))、オリゴヌクレオチド合成のためのアミダイト(例えば、アミノ修飾塩基(例えば、6−(トリフルオロアセチルアミノ)−ヘキシル−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト)、チオール修飾塩基(例えば、S−トリチル−6−メルカプトヘキシル−1−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト、またはクリックケミストリー修飾塩基(例えば、6−ヘキシン−1−イル−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト、3−ジメトキシトリチルオキシ−2−(3−(3−プロパルギルオキシプロパンアミド)プロパンアミド)プロピル−1−O−スクシノイル、長鎖アルキルアミノCPG、若しくは4−アジド−ブタン−1−酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル))を含み得る。一部の実施形態では、結合エンティティは、官能基化デンドリマーを含み得るが、これは、例えば、Sigma Aldrich, ST. Louis, MO., Polymer Factory Sweden AB, Teknikringen 48, SE-114, 28 Stockholm, Sweden, Dendritech, Inc. 3110 Schuette Rd., Midland, MI, 48642、または、NanoSynthons LLC, 1200 N. Facher Ave., Mt. Pleasant, MI 48858などのいくつかの供給業者から入手可能である。デンドリマーは、例えば、PANAMデンドリマーまたはポリプロピレンイミンデンドリマーであってもよい。
本明細書で使用される「リンカー」は、1つのキャプチャーテンプレートを別のキャプチャーテンプレートに連結して、マクロキャプチャーテンプレートを形成する任意の分子または物質である。リンカーは、例えば、構造および長さが変動し得る。リンカーは、疎水性または親水性であっても、長いまたは短くても、剛性、半剛性若しくは柔軟性などであってもよい。リンカーは、定常オリゴヌクレオチド、−(CH2)n−鎖などのポリメチレン鎖、−(CH2CH2O)n−鎖などのポリ(エチレングリコール)鎖(いずれの場合も、nは、1〜約40の整数である)、5’−O−ジメトキシトリチル−1’,2’−ジデオキシリボース−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト;9−O−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール、1−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト;3−(4,4’−ジメトキシトリチルオキシ)プロピル−1−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト;ならびに18−O−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール、1,−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト、アミノ−カルボン酸リンカー(例えば、ペプチド(例えば、Z−Gly−Gly−Gly−Osu若しくはZ−Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−Osu)、PEG(例えば、Fmoc−アミノPEG2000−NHS若しくはアミノ−PEG(12−24)−NHS)、またはアルカン酸鎖(例えば、Boc−ε−アミノカプロン酸−Osu))、クリックケミストリーリンカー(例えば、ペプチド(例えば、アジドホモアラニン−Gly−Gly−Gly−Osu若しくはプロパルギルグリシン−Gly−Gly−Gly−Osu)、PEG(例えば、アジド−PEG−NHS)、またはアルカン酸鎖(例えば、5−アジドペンタン酸、(S)−2−(アジドメチル)−1−Boc−ピロリジン、または4−アジド−ブタン−1−酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル))、チオール−反応性リンカー(例えば、PEG(例えば、SM(PEG)nNHS−PEG−マレイミド)、アルカン鎖(例えば、3−(ピリジン−2−イルジスルファニル)−プロピオン酸−Osuまたはスルホスクシンイミジル6−(3’−[2−ピリジルジチオ]プロピオンアミド)ヘキサン酸塩)))、オリゴヌクレオチド合成のためのアミダイト(例えば、アミノ修飾塩基(例えば、6−(トリフルオロアセチルアミノ)−ヘキシル−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト)、チオール修飾塩基(例えば、S−トリチル−6−メルカプトヘキシル−1−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト、またはクリックケミストリー修飾塩基(例えば、6−ヘキシン−1−イル−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイト、3−ジメトキシトリチルオキシ−2−(3−(3−プロパルギルオキシプロパンアミド)プロパンアミド)プロピル−1−O−スクシノイル、長鎖アルキルアミノCPG、若しくは4−アジド−ブタン−1−酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル))を含み得る。リンカーは、一部の実施形態では、デンドリマーまたは核酸であってもよい。
本明細書で使用される「マクロキャプチャーテンプレート」は、1つまたは複数の同一キャプチャーテンプレートを含む、約500〜25,000核酸サブユニットの核酸分子を指す。マクロキャプチャーテンプレートは、1つまたは複数の二次キャプチャーテンプレート若しくは1つまたは複数のリンカーまたはそれらの組合せを含む。二次キャプチャーテンプレートまたはリンカーは、キャプチャーテンプレート間にランダムに点在させてもよいし、またはキャプチャーテンプレート単位を隔てるために用いてもよい。
本明細書で使用される「核酸」は、以下に定義する通りのオリゴヌクレオチド類似体、ならびに二重鎖または一本鎖DNAおよびRNA分子を指す。DNAおよびRNA分子は、以下に定義する様々な類似体を含み得る。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は、約3〜最大約500、典型的には約5〜約250、約3〜約100または約3〜50核酸サブユニットを含む核酸オリゴマーを指す。ライブラリー化合物の合成を誘導し得るオリゴ(例えば、ハイブリダイゼーション配列)に関して、オリゴは、線状ポリマー中でアセンブリングされるとき、配列特異的塩基対を形成することができる、天然に存在するヌクレオチド残基、ヌクレオチド類似体残基、または他のサブユニットを含むか、またはそれらから構成され得るが、但し、ポリマーは、ポリメラーゼと、1つまたは複数のヌクレオチド三リン酸、例えば、通常のデオキシリボヌクレオチドの存在下で鎖指定重合に好適な基質を提供することができるものとする。「既知配列オリゴ」は、核酸配列がわかっているオリゴである。オリゴヌクレオチドは、修飾されており、且つそれが由来するオリゴヌクレオチドの化学または生物活性の一部若しくは全部が可能である核酸を含む。オリゴヌクレオチド類似体は、一般に、ホスホジエステル結合を含有するが、いくつかのケースでは、別の骨格を有し得るオリゴヌクレオチド類似体も含まれる。リボース−リン酸骨格の修飾は、標識などの別の部分の添加を促進し得るか、またはそうした分子の安定性および半減期を増大するために実施してもよい。さらに、天然に存在する核酸と類似体の混合物を製造することもできる。あるいは、異なる核酸類似体の混合物、および天然に存在する核酸と類似体の混合物を製造することもできる。オリゴヌクレオチドは、明記されるように、一本鎖若しくは二本鎖であってもよいし、または二本鎖若しくは一本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、DNA、RNAまたはハイブリッドであってもよく、ここで、核酸は、デオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの任意の組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニン(xathanine)、ヒポキサタニン(hypoxathanine)、イソシトシン、イソグアニンなどをはじめとする、塩基の任意の組合せを含む。
本明細書で使用される「ペプチド」は、約2〜50アミノ酸残基、約2〜20アミノ酸残基、または約2〜10残基のアミノ酸残基のポリマーを指す。ペプチドは、例えば、グリコペプチド、PEG化ペプチド、リポペプチドなどの修飾ペプチド、有機若しくは無機リガンドと共役したペプチド、ペプチド結合イソスター(例えば、Ψ[CH2S]、Ψ[CH2NH2]、Ψ[NHCO]、Ψ[COCH2]、Ψ[(E)または(Z)CH=CH]など)を含むペプチドを含有し、また、環状ペプチドを含む。一部の実施形態では、アミノ酸残基は、任意のL−α−アミノ酸、D−α−アミノ残基、それらのN−アルキル変異体またはそれらの組合せであってもよい。他の実施形態では、アミノ酸残基は、任意のL−α−アミノ酸、D−α−アミノ残基、βアミノ酸、γアミノ酸、それらのN−アルキル変異体またはそれらの組合せであってもよい。
本明細書で使用される「機能的に結合した」は、本明細書に記載される様々な操作によって連結した状態を維持するように互いに結合された少なくとも2つの化学構造を意味する。典型的に、リガンドまたは官能基およびコーディングテンプレートは、適切なリンカーを介して共有結合されている。リンカーは、オリゴヌクレオチドの結合部位とリガンド若しくは官能基の結合部位を有する少なくとも1つの二価分子である。例えば、官能部分は、ポリアミド化合物であるとき、ポリアミド化合物は、N末端、C末端で結合基と結合するか、または一方の側鎖上の官能基を介して結合することができる。リンカーは、少なくとも1つの原子で、また一部の実施形態では、2個以上の原子で、リガンドとコーディングテンプレートを隔てるのに十分である。ほとんどの実施形態では、リンカーは、コーディングテンプレートとは独立な様式で、リガンドが標的分子と結合することを可能にする上で十分に柔軟である。
本明細書で使用される「ペプチド核酸」は、核酸の糖リン酸主鎖がプソイドペプチド骨格により置換されているオリゴヌクレオチド類似体を指す(例えば、N−(2−アミノエチル)−グリシン、Nielsenら,米国特許第5,539,082号;Nielsenら,米国特許第5,773,571号;Burchardtら,米国特許第6,395,474号;Nielsen et al.,米国特許第5,539,082号;Nielsen et al.,米国特許第5,773,571号;Burchardt et al.,米国特許第6,395,474号)。
本明細書で使用される「ペプトイド」は、ポリN置換グリシンのポリマー(Simon et al., Proc. Natl. Acad. Set (1992) 89(20) 9367-9371)を指し、それらの環状変異体を含む。
本明細書で使用される「ポリペプチド」は、典型的には50超のアミノ酸残基を含む、アミノ酸残基のポリマーを指し、それらの環状変異体を含む。ポリペプチドは、タンパク質(糖タンパク質、PEG化タンパク質、リポタンパク質、有機若しくは無機リガンドとのポリペプチドコンジュゲートなどの修飾タンパク質を含む)受容体、受容体断片、酵素、構造タンパク質(例えば、コラーゲン)などを含む。一部の実施形態では、アミノ酸残基は、任意のL−αアミノ酸、D−α−アミノ残基、またはそれらの組合せであってよい。他の実施形態では、アミノ酸残基は、任意のL−αアミノ酸、D−α−アミノ残基、それらのN−アルキル変異体またはそれらの組合せであってもよい。
本明細書で使用される「ポリマー」は、コポリマーを含み、「モノマー」という用語は、「コモノマー」を含む。ポリマーとして、例えば、ポリアミド、リン脂質、ポリカーボネート、多糖、ポリウレタン、ポリエステル、ポリ尿素、ポリアセテート、ポリアリーレンスルフィド、ポリエチレンイミン、ポリイミドなどが挙げられる。
本明細書で使用される「二次キャプチャーテンプレート」は、例えば、一部の実施形態において、ビーズ樹脂、ガラススライド、濾紙若しくはマイクロ流体デバイスなどの固定された支持体に結合した核酸配列と相補的なマクロキャプチャーテンプレート中に含まれる核酸配列を指す。一般に、二次キャプチャーテンプレートは、固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドの様々なハイブリダイゼーション配列の1つに対して相補的であるため、コーディングテンプレートの集団を、個別の空間位置における異なるコーディングテンプレートの複数の亜集団へと配列特異的に分割することを可能にする。一般に、様々な二次キャプチャーテンプレート配列の数は、コーディングテンプレート配列の数と同等となる。二次キャプチャーテンプレートは、コーディングテンプレートのハイブリダイゼーション配列とほぼ同数のヌクレオチドを有することになる。しかし、当業者には周知のように、二次キャプチャーテンプレートと相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが十分である限り、二次キャプチャーテンプレートは、相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列より小さくても、または大きくてもよい。二次キャプチャーテンプレートは、オリゴヌクレオチド、拘束ヌクレオシド、架橋ヌクレオシド、ロックド核酸、拘束エチルヌクレオシド、一本鎖RNA、一本鎖DNA、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイドまたはポリマーであってよい。一部の実施形態では、キャプチャーテンプレートは、オリゴヌクレオチド、L−核酸、ペプチド核酸、一本鎖RNAまたは一本鎖DNAである。他の実施形態では、キャプチャーテンプレートは、オリゴヌクレオチドである。
本明細書で使用される「固体支持体」は、例えば、ビーズ(例えば、磁気、着色、多孔性および非多孔性)、樹脂(セファロース、アガロース、DEAE、ポリスチレンなど)、ガラススライド、濾紙またはマイクロ流体デバイスを指す。明示的に述べられていない他の固体支持体は、本開示の範囲に含まれる。
本明細書で使用される「空間的に局在化した」は、特異な単離された空間位置を意味する。空間的に局在化した物質の一例は、ウェルプレートの個別のウェル内に同一の結合キャプチャーテンプレートを含む磁気ビーズである。空間的に局在化した物質の別の例は、ウェルプレートの個別のウェル内に相補的コーディングテンプレートとハイブリダイズした同一の結合キャプチャーテンプレートを含む、特異に着色されたビーズである。
これから本発明の実施形態を詳細に参照していく。本発明は、これらの実施形態に関して説明するが、本発明を以下の実施形態に限定することを意図するものではないことは理解されよう。反対に、添付の請求項により記載される本発明の精神および範囲に含まれ得る代替物、改変物、および同等物を包含することが意図される。
経路決定の方法
特定の理論に束縛されることは意図しないが、コーディングテンプレートの経路決定または分別は、一般に2つの異なる方法により実施することができる。第1の方法では、事前に、空間的に局在化させたキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートによって、コーディングテンプレートを分別する。コーディングテンプレートの混合物をキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートと順次または連続的のいずれかで接触させることにより、個々のコーディングテンプレートを、キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとの複合体の一部として、個別の空間位置に局在化させる。第2の方法では、コーディングテンプレートをバッチ処理でキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートと接触させる。キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートを固体支持体に結合させてもよく、この場合、キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとハイブリダイズしたコーディングテンプレートの複合体が結合した固体支持体を、支持体のサイズ、色などに基づいて分別または分類する。ここで、支持体が十分な巨視的サイズであれば、キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートが結合した、コーディングテンプレートの数と同数の支持体をコーディングテンプレートと混合した後、個別の空間位置に手で配置することができる。あるいは、コーディングテンプレートとキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとを含む複合体の混合物をクロマトグラフィー手段および/またはゲル電気泳動によって分別することもできる。また別の方法では、キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートにバーコードを付けて、コーディングテンプレートとキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとの複合体をバーコードに基づいて(例えば、バーコードのハイブリダイゼーション若しくは物理的性質により)分割することができる。さらに別の方法では、各キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートは、サイズが異なっていてもよく、コーディングテンプレートとキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとの複合体を、電気泳動または例えば、サイズ排除クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー手段により分割することができる。
特定の理論に束縛されることは意図しないが、コーディングテンプレートの経路決定または分別は、一般に2つの異なる方法により実施することができる。第1の方法では、事前に、空間的に局在化させたキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートによって、コーディングテンプレートを分別する。コーディングテンプレートの混合物をキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートと順次または連続的のいずれかで接触させることにより、個々のコーディングテンプレートを、キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとの複合体の一部として、個別の空間位置に局在化させる。第2の方法では、コーディングテンプレートをバッチ処理でキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートと接触させる。キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートを固体支持体に結合させてもよく、この場合、キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとハイブリダイズしたコーディングテンプレートの複合体が結合した固体支持体を、支持体のサイズ、色などに基づいて分別または分類する。ここで、支持体が十分な巨視的サイズであれば、キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートが結合した、コーディングテンプレートの数と同数の支持体をコーディングテンプレートと混合した後、個別の空間位置に手で配置することができる。あるいは、コーディングテンプレートとキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとを含む複合体の混合物をクロマトグラフィー手段および/またはゲル電気泳動によって分別することもできる。また別の方法では、キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートにバーコードを付けて、コーディングテンプレートとキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとの複合体をバーコードに基づいて(例えば、バーコードのハイブリダイゼーション若しくは物理的性質により)分割することができる。さらに別の方法では、各キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートは、サイズが異なっていてもよく、コーディングテンプレートとキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとの複合体を、電気泳動または例えば、サイズ排除クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー手段により分割することができる。
したがって、本明細書には、コーディングテンプレートの混合物をn個の空間位置に経路決定する方法が提供され、これは、とりわけ、複雑なコンビナトリアルライブラリーを提供することができるDNAプログラムコンビナトリアルケミストリー(DNA Programmed Combinatorial Chemistry:DPCC)において使用され得る。コンビナトリアルライブラリーは、重要な生物学的標的に結合するリガンドを含み得る(Harbury et al.,米国特許第7,479,472号;Harbury et al.,米国特許出願第2006/0099626号;Wrenn et al.,J. Am. Chem. Soc. 129(43), 13137, 2007;Weisinger et al.,PLOS One, e28056, 2012;Halpin et al.,PLOS One, 1015, 2004;Halpin et al.,PLOS One, 1022, 2004;Halpin et al.,PLOS One, 1031, 2004;Glokler et al.,国際公開第2012/004204号)。本明細書に記載される方法は、様々なポリマー(すなわち、コーディングテンプレート)および/または固体支持体の特性を特異な空間位置に経路決定するために、キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートを使用し、これは、小分子コンビナトリアルケミストリーライブラリーのポリマー誘導合成のために重要である。
以下に、小分子コンビナトリアルライブラリーを生成するために用いられるいくつかのコーディングテンプレートをさらに詳しく説明する。当業者には、多くの異なるタイプのコーディングテンプレートが考慮され得ることは明らかなはずである。したがって、下記の説明は、包括的ではなく、例示的であることが意図され、本発明は、以下に記載されるコーディングテンプレートに限定されない。
コーディングテンプレートは、少なくとも1つ、典型的には2つ以上の異なるカテネイトハイブリダイゼーション配列と、任意選択の定常スペーサ配列と、結合した結合エンティティまたは官能基(すなわち、化学反応部分)を含む核酸配列を有する化合物である(図1)。コーディングテンプレートは、ハイブリダイゼーション配列および/または定常スペーサ配列の数が限定されていない。いかなるコーディングテンプレート中のハイブリダイゼーション配列も、概して、いずれか他のコーディングテンプレート中の配列とは異なる。異なるコーディングテンプレートが、共通のコドンを有し得ることは留意すべきである。各コーディングテンプレートのハイブリダイゼーション配列が、結合エンティティまたは官能基に結合した特異なリガンドを合成するために連続的合成ステップの各々で使用される特定の化学化合物を決定する。したがって、各コーディングテンプレートのハイブリダイゼーション配列は、結合エンティティまたは官能基に対する特定の化学単位の結合の順序も決定する。
一般に、コーディングテンプレートの各ハイブリダイゼーション配列は、相補的キャプチャーまたはマクロキャプチャーテンプレートとハイブリダイズするための個別の配列を提供する。コーディングテンプレートの異なるハイブリダイゼーション配列は、コーディングテンプレートの集団を異なるコーディングテンプレートの複数の亜集団に配列特異的に分割することができる。続いて、コーディングテンプレートの各亜集団は、個別の化学サブユニットと反応して、個別の化学サブユニットを結合エンティティまたは官能基の官能基とカップリングすることができる。
第1の反応ステップを実施するために、コーディングテンプレートの集団を、異なるコーディングテンプレートの複数の亜集団、例えば、各コーディングテンプレート内の「第1」位置(V1、例えば、a1、b1、またはc1)の10の異なるハイブリダイゼーション配列に対応する10の異なる亜集団に分割する(図3A、上および中央のパネル)。これは、例えば、コーディングテンプレートを、コーディングテンプレート内の異なる「第1位置」ハイブリダイゼーション配列(例えば、a1’、b1’、またはc1’)のうちの1つと相補的な配列を含むキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートの第1群と接触させることにより、実施される:接触のステップによって、コーディングテンプレートの集団をX1個の亜集団(ここで、Xは、プールされたコーディングテンプレートを隔てるのに使用する異なるキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートの数を表す)への分割を達成し、その際、キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートの各亜集団は、コーディングテンプレートと少なくとも1つの共通のハイブリダイゼーション配列を有する。
第1分割ステップの後、X1個の異なるコーディングテンプレート亜集団(例えば、図3Aに例示するコーディングテンプレートの10の異なる亜集団)をX1個の異なる化学サブユニットと反応させる(図3A、中央のパネル)。反応は、カップリングステップで使用される各化学サブユニットのアイデンティティが、亜集団内のコーディングテンプレートの特定の第1位置ハイブリダイゼーション配列により指定されるように実施される。図3Aに例示するように、化学サブユニットA1、B1、またはC1は、第1位置(例えば、a1、b1、またはc1)の特定のコーディングテンプレートハイブリダイゼーション配列に対応する。第1化学カップリングステップは、特定の化学サブユニットを、各コーディングテンプレート亜集団の結合エンティティまたは官能基の官能基と共役させることにより、各コーディングテンプレート内の結合エンティティまたは官能基の官能基を試薬特異的化合物中間体に変換する(例えば、図2に例示するように、A1、B1、またはC1)。この結果は、コーディングテンプレートのN1個の異なる亜集団が得られ、各亜集団は、各コーディングテンプレート亜集団に結合した官能基を含む異なる化学サブユニットを有する(図3A、下のパネル)。例えば、コーディングテンプレートの3つの異なる集団(ハイブリダイゼーションにより、分割ステップで、a1、b1、またはc1に分離されている)を図3Aの下のパネルに示すが、ここで、a1配列により隔てられたコーディングテンプレートの第1亜集団は、化学サブユニットA1を含有するように修飾され、b1配列により隔てられた分子の第2亜集団は、化学サブユニットB1を含有するように修飾され、c1配列により隔てられた分子の第3亜集団は、化学サブユニットC1を含有するように修飾される。各々の事例で、化学サブユニットは、コーディングテンプレートの結合エンティティまたは官能基の官能基とカップリングさせるが、その際、添加された化学サブユニットは、要望に応じて、次のステップにおける別のサブユニットのカップリングのための結合エンティティまたは官能基の官能基を提供する。
第1分割および化学カップリングステップに続いて、X1個のコーディングテンプレート亜集団をプールし、第2群の試薬(キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレート、例えば、a2’、b2’、またはc2’)と接触させるが、これらは各々、コーディングテンプレートのX2個の異なる第2位置ハイブリダイゼーション配列(例えば、a2、b2、またはc2)の1つと相補的である配列を有する(図3B、上および中のパネル)。その結果、プールされたコーディングテンプレートの集団は、異なるコーディングテンプレートの複数のX2個の亜集団に分割される。第2ステップにおける亜集団の数(X2)は、第1段階分割から得られた亜集団の数(X1)と同じでも、異なっていてもよい。前述したように、コーディングテンプレートの各亜集団は、コーディングテンプレートの「第2位置」ハイブリダイゼーション配列(例えば、a2、b2、またはc2)により決定される(図3B、中央のパネル)。
次に、コーディングテンプレートの異なる「第2位置」亜集団の各々を第2の複数の化学サブユニットの1つ、すなわち、各サブセットについて異なる化学サブユニット(例えば、A2、B2、またはC2)と反応させる(図3B、中央のパネル)。その結果、コーディングテンプレートのX2個の異なる亜集団が得られ、これらの集団の各々が、各コーディングテンプレートの前の化学サブユニットと共役した異なる化学サブユニットを有する(図3B、下のパネル)。例えば、図3Bの下のパネルに例示するように、コーディングテンプレートの9つの異なる亜集団を生成することができ、ここで、第1集団は、化学サブユニットA1およびA2を含み、第2集団は、化学サブユニットA1およびB2を含み、第3集団は、化学サブユニットA1およびC2を含み、第4集団は、化学サブユニットB1およびA2を含み、第5集団は、化学サブユニットB1およびB2を含み、第6集団は、化学サブユニットB1およびC2を含み、第7集団は、化学サブユニットC1およびA2を含み、第8集団は、化学サブユニットC1およびB2を含み、第9集団は、化学サブユニットC1およびC2を含む。
事前に反応したコーディングテンプレートをXn個の異なる亜集団(ここで、Xは、プールされた化合物を分離するために用いられる異なるキャプチャー配列の数を表し、nは、合成スキームのステップ数を表す)に分割するこのプロセスは、要望に応じて反復することができる。例えば、図3Cおよび3Dに示すように、コーディングテンプレートをキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートの新しいセットとハイブリダイズさせた後、コーディングテンプレートのXn個の分割された亜集団をXn個の異なる選択された化学サブユニットと反応させることができる。これらのステップは、所望の反応ステップの全てがコーディングテンプレートの反応部位で連続的に実施されるまで、反復することができる(図3Cおよび図3D)。結果は、X1×X2×・・・×XN個の異なるコーディングテンプレートから成るコンビナトリアルライブラリーであり、ここで、コーディングテンプレートのN個の位置(例えば、V1、V2、およびV3、図1を参照)の特定のハイブリダイゼーション配列が、得られた結合リガンドの化学サブユニットの配列を決定する。
図3Dの上のパネルに例示するように、図3A〜3Cに例示したステップから、コーディングテンプレートの27の異なる集団を生成することができる。リガンドの例示的なコンビナトリアルライブラリーとして、例えば、化学サブユニットA1、A2、およびA3を含む第1集団、化学サブユニットA1、B2、およびA3を含む第2集団、化学サブユニットA1、C2、およびA3を含む第3集団、化学サブユニットB1、A2、およびA3を含む第4集団、化学サブユニットB1、B2、およびA3を含む第5集団、化学サブユニットB1、C2、およびA3を含む第6集団、化学サブユニットC1、A2、およびA3を含む第7集団、化学サブユニットC1、B2、およびA3を含む第8集団、ならびに化学サブユニットC1、C2、およびA3を含む第9集団などが挙げられる。
図1に例示するように、コーディングテンプレートは、異なるカテネイト核酸配列と結合エンティティまたは官能基のZn(例えば、n=9)領域から構成される。これらの領域のうち5つは、C1〜C5と示され、コーディングテンプレートの場合と同じ「定常」または「スペーサ」配列を指す。残る4つのZ領域は、V1〜V4と示され、第1〜第4位置の「可変」ハイブリダイゼーション配列を指す。代表的な実施形態では、V領域およびC領域は、核酸タグの3’末端から核酸タグの5’末端まで交互に順に並ぶ。特定の実施形態では、最初のZ領域は、C領域である。他の実施形態では、最初のZ領域は、V領域である。特定の実施形態では、最後のZ領域は、C領域である。他の実施形態では、最後のZ領域は、V領域である。
可変ハイブリダイゼーション配列は、一般に、各位置の亜集団コーディングテンプレートの各々の群について異なる。この実施形態では、全てのV領域は、2つの異なるC領域によって境界を成している。以下から理解されるように、2つのV領域配列が、互いにクロスハイブリダイズしないように、V領域配列は全て直交型である。例えば、4つの可変領域と、4つの可変領域の各々について400の異なる核酸配列とを含むコーディングテンプレートを含む実施形態において、合計1,600直交型核酸ハイブリダイゼーション配列が存在する。こうしたハイブリダイゼーション配列は、公知の方法にしたがって設計することができる。例えば、可変ハイブリダイゼーション配列が各々20ヌクレオチドを含み、各位置に4つのヌクレオチドのうちの1つがあるという可能性がある場合、420の異なる配列が考えられる。考えられる様々な候補のうち、各配列が、少なくとも2〜3、またはそれ以上の異なる内部ヌクレオチドだけ別の配列と異なるように、特定の配列を選択することができる。
一部の実施形態では、好適なCおよびV領域は、約12〜約40ヌクレオチド、約10〜約30ヌクレオチド長をはじめとする、約8〜約50ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、CおよびV領域は、約12〜約28、約13〜約27、約14〜約26、約14〜約25、約15〜約24、約16〜約23、約17〜約22、約18〜約21、および約19〜約20ヌクレオチド長をはじめとする、約11ヌクレオチド〜約29ヌクレオチド長を含む。代表的な実施形態では、CおよびV領域は、約20ヌクレオチド長を含む。
コーディングテンプレートは、約200、約300、約500、またはそれ以上の異なるV領域をはじめとする、約1〜約100またはそれ以上の異なるV領域(ハイブリダイゼーション配列)を含み得る。代表的な実施形態では、コーディングテンプレートは、約2〜約48、約3〜約46、約4〜約44、約5〜約42、約6〜約40、約7〜約38、約8〜約36、約9〜約34、約10〜約32、約11〜約30、約12〜約29、約13〜約28、約13〜約28、約14〜約27、約15〜約26、約16〜約25、約17〜約24、約18〜約23、約19〜約22、約20〜約21の異なるV領域をはじめとする、約1〜約50の異なるV領域を含む。
コーディングテンプレートは、約200、約300、約500、またはそれ以上の異なるC領域をはじめとする、約1〜約100またはそれ以上の異なるC領域(定常配列)を含み得る。代表的な実施形態では、コーディングテンプレートは、約2〜約48、約3〜約46、約4〜約44、約5〜約42、約6〜約40、約7〜約38、約8〜約36、約9〜約34、約10〜約32、約11〜約30、約12〜約29、約13〜約28、約13〜約28、約14〜約27、約15〜約26、約16〜約25、約17〜約24、約18〜約23、約19〜約22、約20〜約21の異なるC領域をはじめとする、約1〜約50の異なるC領域を含む。
コーディングテンプレートは、領域Z1からZn(例えば、n=9)が互いに連結し、3’のZ1から開始して順に連続し、Znの後の5’末端に結合エンティティまたは官能基が位置するように合成される。例えば、核酸タグの3’末端で開始し、Z1はZ2に連結し、Z2はZ3に連結し、Z3はZ4に連結する等々であり、結合エンティティまたは官能基は、コーディングテンプレートのオリゴヌクレオチド部分の任意の部位、例えば、3’末端、5’末端など、またはオリゴヌクレオチドの任意の他の位置でZnに連結する。
上に記載したように、コーディングテンプレートの集団は、変性している、すなわち、コーディングテンプレートのオリゴヌクレオチド部分のほぼ全てが、ヌクレオチド配列において互いに異なる。コーディングテンプレート同士のヌクレオチドの違いは、全てがハイブリダイゼーション配列(V領域)にある。例えば、コーディングテンプレートの初期集団は、各亜集団のV1の特定の配列に基づき、コーディングテンプレートのオリゴヌクレオチド部分の400の最初の亜集団を含み得る。このように、各亜集団のV1領域は、400の異なる20塩基対ハイブリダイゼーション配列のいずれか1つを含む。V1に基づくコーディングテンプレートのこうした集団の分割によって、コーディングテンプレートの400の異なる亜集団が生じる。同様に、コーディングテンプレートの同じ初期集団も、各亜集団のV2の特定の配列に基づき、コーディングテンプレートの400の第2亜集団を含み得るが、ここで、第2亜集団は、第1亜集団とは異なる。
図1に描くコーディングテンプレートの例示的な集団では、第1のハイブリダイゼーション配列の最初の数個は、異なるコーディングテンプレートのV1領域において、a1、b1、c1・・・j1のように示される。同様に、異なるコーディングテンプレートのV2領域において、第2のハイブリダイゼーション配列の最初の数個は、a2、b2、c2・・・j2のように示される。V3では、第3のハイブリダイゼーション配列の最初の数個は、a3、b3、c3・・・j3のように示される、等々。
特定の実施形態では、コーディングテンプレートは、指定されたスペーサ領域について同じ20塩基対配列を共有するが、異なるスペーサ領域の間には異なる20塩基対配列を有する。例えば、コーディングテンプレートは、同じC1スペーサ領域、同じC2スペーサ領域、および同じC3スペーサ領域を含み、ここで、C1、C2、およびC3は、互いに異なる。
このように、各180ヌクレオチドコーディングテンプレートは、4つの可変領域(a1、b1、c1・・・d5、e5、f5、・・・h10、i10、j10)と5つのスペーサ領域(z1・・・z11)を交互の順に含む9つの異なる20塩基対領域の規則正しいアセンブリーから構成される。20塩基対領域は、下記の特性を有する:(i)マイクロモル濃度の全ての領域配列が、Tmで表示する指定温度の溶液中で効率的に相補的DNA配列とハイブリダイズし、(ii)領域配列が、ハイブリダイゼーションに関して、互いに直交型であり、これは、温度Tmで、領域配列のいずれも、別の領域配列と、または他の領域配列のいずれかに対する補体と効率的にクロスハイブリダイズしないことを意味する。
変性コーディングテンプレートは、Stemmer et al.,Gene (1995) 164(1) 49-53により記載されるプライマーなしのPCRアセンブリー法によって、またはライゲーション戦略によって構成要素構築ブロックからアセンブリングすることができる。
一部の実施形態では、キャプチャーテンプレートは、65、66または67ヌクレオチド長より大きい。他の実施形態では、キャプチャーテンプレートのハイブリダイゼーション配列は、7ヌクレオチド長より大きい。また別の実施形態では、コーディングテンプレートとハイブリダイズしないキャプチャーテンプレートの部分は、45ヌクレオチド長より大きい。
上に記載したように、コーディングテンプレートは、3’末端、5’末端、またはコーディングテンプレート上の任意の他の位置に、リガンド、結合エンティティまたは官能基を含む。一部の実施形態では、リガンド、結合エンティティまたは官能基は、線状スペーサ、例えば、第1級アミン基で終結する12炭素鎖に係留したリン酸基を導入する市販の試薬(例えば、Glen Researchから入手可能なもの、またはチオール若しくは他の化学反応部位を合成核酸に導入するために利用可能な多数の他の試薬)を用いて、コーディングテンプレートのオリゴヌクレオチド部分の5’塩基の5’アルコールを修飾することによって添加することができる。
結合エンティティまたは官能基の官能基は、特定のリガンドが、コーディングテンプレートのV領域配列の順序により合成され、決定される部位である。例示的な官能基は、第1級アミンである。第1級アミン以外にも多くの様々なタイプの官能基を任意の部位、例えば、3’末端、5’末端、またはコーディングテンプレート上の任意の他の位置などに導入することができる。例示的な官能基として、限定されないが、アミド、エステル、尿素、ウレタン、炭素−カルボニル結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素単結合、オレフィン結合、チオエーテル結合、およびジスルフィド結合を形成することができる化学成分が挙げられる。酵素合成の場合、有効な触媒のための必要に応じて、補因子を補充してもよい。こうした補因子は、当業者には周知である。例示的な補因子は、ポリケチド合成に有用なホスホパンテチエニル基である。
コーディングテンプレートの分割と、コーディングテンプレートの結合エンティティまたは官能基への化学サブユニットの化学および/または生化学的カップリングのラウンドを交互に実施することによって、コンビナトリアルライブラリー全体を合成する。
生成された複数の化学化合物を、化学構造の識別を容易にする核酸配列タグと連結させる。従来のDNAシーケンシング法は、容易に入手可能であり、合成誘導核酸タグの配列の決定のために有用である。(例えば、Maniatis et al., eds.,"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照されたい)。特に、Next Gen DNAシーケンシングが有用であり、これは当業者には周知である。
化合物ライブラリーは、所望の活性、例えば、特定の反応を触媒する、または固定された受容体と高いアフィニティで結合する能力についてスクリーニングしてもよい。ほとんどのケースで、所望の活性を有する分子の亜集団、ならびにそれらの核酸タグは、選択の最中に、シブリングから物理的に分離される。選択の後、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)によって、選択分子に結合した核酸タグを合成する(Saiki et al., Science (1988) 239(4839) 487-491)。コーディング鎖を合成するために用いる5’末端プライマーの5’ヒドロキシルは、新しい第1級アミン化学反応部位に係留したリン酸基で修飾する。合成の後、コーディング鎖を非コーディング鎖から分離する。核酸タグは、個別の化合物の合成履歴に関して報告するだけではなく、ライブラリー合成を誘導することから、第1ライブラリーから増幅したコーディング鎖を用いて、第2世代化合物ライブラリーの構築を誘導することができる。この手順の反復、すなわち、選択、DNAタグ増幅、およびライブラリー再合成の複数ラウンドを実施することによって、個々の望ましい化合物を極めて複雑なライブラリーから増幅することが可能になる。
上の方法により生成された化合物ライブラリー全体または個々のライブラリーメンバーは、ある活性を調節する、または所望の構造若しくは機能的特性を有する化合物を識別することができるスクリーニングアッセイにおいて、1つまたは複数の活性について評価してもよい。例示的なアッセイおよび機能分析として、限定されないが、酵素アッセイ、非酵素触媒アッセイ、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、受容体/リガンド結合法および細胞ベースのアッセイが挙げられる。さらに具体的には、例示的な細胞ベースの方法は、以下;(1)細胞表面に対するライブラリー化合物の差別的結合(すなわち、非癌細胞ではなく癌細胞への結合);(2)細胞抽出物の成分に対するライブラリー化合物の結合(例えば、全細胞抽出物をスクロース勾配で分離することにより生成された細胞画分に対する結合);(3)細胞によるエンドサイトーシスが可能なライブラリー化合物、および(4)ライブラリーを動物に注射することによる、ライブラリー化合物のin vivo局在化および結合特性に基づく。(例えば、腫瘍血管に特異的に戻るペプチドを単離するためのファージディスプレイライブラリーのin vivo選択を記載するArap et al., Science (1998) 279(5349) 377-80を参照されたい)。当業者には理解されるように、こうしたアッセイは、本明細書に記載する方法によって合成した化合物のライブラリー全体またはそれに由来する亜集団に対して実施することができる。
本明細書に記載のコンビナトリアルライブラリーによって生成される所望のリガンドとして、限定されないが、オリゴヌクレオチド、一本鎖RNA、一本鎖DNA、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、抗体、ペプトイド、ポリマー、ポリシロキサン、分子量50ダルトン超の無機化合物、分子量約3000ダルトン〜約50ダルトンの有機化合物またはそれらの組合せが挙げられる。
選択されたライブラリーメンバーの増幅を可能にすることに加えて、本方法は、コードされた化合物ライブラリーの進化も可能にする。より具体的には、選択された化合物の亜集団をコードする核酸タグ同士の遺伝子組換えを、核酸タグ配列の突然変異誘発またはランダムフラグメント化によりin vitroで実施した後、関連核酸配列の生成("gene shuffling", Stemmer, Nature, (1994) 370 389-391 ; Stemmer et al.;米国特許第5,811,238号)、続いて、別の化合物の段階的合成を実施する。この手順の反復、すなわち、選択、DNAタグ増幅、遺伝子組換えおよびライブラリー再合成を複数ラウンド実施することにより、個々の望ましい化合物を極めて複雑なライブラリーから進化させることができる。
図4〜16は、キャプチャーテンプレートおよびマクロキャプチャーテンプレート、ならびに固体支持体とマクロキャプチャーテンプレートの新規の組合せの構造および組成のアセンブリーを説明および例示し、これらは、本明細書に記載する様々な経路決定方法において、コーディングテンプレートの混合物を分別するために使用することができる。さらに、図の多くには、コーディングテンプレートにハイブリダイズし、必要に応じてデンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートおよびマクロキャプチャーテンプレートを含む新規の組成物、ならびに固体支持体と、必要に応じてデンドリマーと、コーディングテンプレートにハイブリダイズしたキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートとを含む新規の組成物も描かれている。図5、6、8、9、11、12、14、15および16において、Xは、リガンド、官能基または結合エンティティのいずれかを表す。以下の描写が、包括的ではなく例示的であり、また何ら限定的ではないことは理解すべきである。
図4は、キャプチャーテンプレート402が必要に応じてリンカー、標識または二次キャプチャーテンプレート404に結合され得る、キャプチャーテンプレート分子400を描く。
図5は、キャプチャーテンプレート502が、コーディングテンプレート506にハイブリダイズすると共に、リンカー504が、別のリンカー510を介して固体支持体508に結合している、複合体500を描く。
図6は、キャプチャーテンプレート602が、コーディングテンプレート606にハイブリダイズすると共に、二次キャプチャーテンプレート604が、固体支持体612に結合した相補的オリゴヌクレオチド610とハイブリダイズしている、複合体600を描く。また、相補的オリゴヌクレオチド610は、リンカー(図示していない)を介して固体支持体に結合することもできる。
図7は、キャプチャーテンプレート704に結合した標識702(一部の実施形態では、生物学的標識である)を含むマクロキャプチャーテンプレート700を描く。マクロキャプチャーテンプレート700は、必要に応じて、マクロキャプチャーテンプレート700のキャプチャーテンプレート704を非連続性にすることができるリンカー706を含む。
図8は、コーディングテンプレート810とハイブリダイズしており、必要に応じてリンカー806により隔てられたキャプチャーテンプレート804を含む複合体800を描く。図示しているように、標識802が、末端キャプチャーテンプレートに結合している。一部の実施形態では、標識802は、リンカーに結合している。
図9は、標識902(一部の実施形態では、生物学的標識である)が、薬剤910(一部の実施形態では、固体支持体914に結合した生物剤である)との複合体を形成する複合体を描く。マクロキャプチャーテンプレート900は、コーディングテンプレート908とハイブリダイズしたキャプチャーテンプレート904に結合した標識902を含む。マクロキャプチャーテンプレート900は、必要に応じて、キャプチャーテンプレート904を非連続性にするリンカー906を含む。標識902は、リンカー912により固体支持体914に結合された薬剤910との複合体を形成する。一部の実施形態では、薬剤910は、固体支持体914に直接結合してもよい。
図10は、二次キャプチャーテンプレートおよび/またはリンカー1004が散在する複数のキャプチャーテンプレート1002を含むマクロキャプチャーテンプレート1000を描く。キャプチャーテンプレート1002と二次キャプチャーテンプレートおよび/またはリンカー1004の配列は、規則的またはランダムであってよく、上記マクロキャプチャーテンプレート1000におけるそれらの比は大きく変動し得る。
図11は、二次キャプチャーテンプレートおよび/またはリンカー1104が散在するキャプチャーテンプレート1102を含む複合体1100を描く。キャプチャーテンプレート1102は、コーディングテンプレート1106とハイブリダイズしている。
図12は、キャプチャーテンプレート1204と二次キャプチャーテンプレート1206とから成るマクロキャプチャーテンプレート1202を含む複合体1200を描く。キャプチャーテンプレート1204は、コーディングテンプレート1208とハイブリダイズしている。二次キャプチャーテンプレート1206は、相補的オリゴヌクレオチド1212とハイブリダイズし、相補的オリゴヌクレオチド1212は、固体支持体1210と結合して、複合体1200を形成する。
図13は、デンドリマー1308に結合した複数のマクロキャプチャーテンプレート1302を含む複合体1300を描く。マクロキャプチャーテンプレート1302は、キャプチャーテンプレート1304と二次キャプチャーテンプレートまたはリンカー1306とを含む。デンドリマーに結合したマクロキャプチャーテンプレートの数は、変動する可能性があり、これは、主にデンドリマー構造によって限定される。
図14は、デンドリマー1410に結合した複数のマクロキャプチャーテンプレート1402を含む複合体1400を描く。マクロキャプチャーテンプレート1402は、キャプチャーテンプレート1404と二次キャプチャーテンプレートまたはリンカー1406とを含み、ここで、キャプチャーテンプレート1404は、コーディングテンプレート1408とハイブリダイズしている。
図15は、複数のマクロキャプチャーテンプレート1502がデンドリマー1514に結合し、キャプチャーテンプレート1504がコーディングテンプレート1508とハイブリダイズし、二次キャプチャーテンプレート1506が、固体支持体1510に結合した相補的オリゴヌクレオチド1512とハイブリダイズしている、複合体1500を描く。固体支持体は、例えば、表面、1つまたは複数のビーズであってよい。
図16は、複数のマクロキャプチャーテンプレート1602がデンドリマー1616に結合し、キャプチャーテンプレート1604がコーディングテンプレート1608とハイブリダイズし、デンドリマーに結合したオリゴヌクレオチド1614が、固体支持体1610に結合した相補的オリゴヌクレオチド1612とハイブリダイズしている、複合体1600を描く。マクロキャプチャーテンプレート1602は、キャプチャーテンプレート1604と二次キャプチャーテンプレートまたはリンカー1606を含み、デンドリマー1616に結合している。
図に開示したキャプチャーテンプレートおよびマクロキャプチャーテンプレートの構造および組成、ならびに固体支持体とマクロキャプチャーテンプレートとの新規の組合せ、ならびに新規の複合体を用いて、以下の様々な方法でコーディングテンプレートの混合物を分別することができる。
一部の実施形態では、n個のコーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供され、ここで、nは、2以上の整数である。本方法は、コーディングテンプレートの混合物を空間的に局在化したキャプチャーテンプレートに添加するステップと、空間的に局在化したキャプチャーテンプレートに対して相補的なコーディングテンプレートの間に塩基特異的な二重らせんを形成するステップと、非ハイブリダイズコーディングテンプレートを他の空間的に局在化したキャプチャーテンプレートに移すステップと、空間的に局在化したキャプチャーテンプレートに対して相補的なコーディングテンプレートの間に塩基特異的な二重らせんを形成するステップと、非ハイブリダイズコーディングテンプレートを別の空間位置に移すか、または第3および第4ステップをn−1回反復するステップと、を含む。
別の実施形態では、2つ以上の空間位置にn個のコーディングテンプレートの混合物を経路決定する方法が提供され、ここで、nは、2以上の整数である。本方法は、コーディングテンプレートの混合物を空間的に局在化したマクロキャプチャーテンプレートに添加するステップと、空間的に局在化したマクロキャプチャーテンプレートに対して相補的なコーディングテンプレートの間に塩基特異的な二重らせんを形成するステップと、非ハイブリダイズコーディングテンプレートを他の空間的に局在化したマクロキャプチャーテンプレートに移すステップと、空間的に局在化したマクロキャプチャーテンプレートに対して相補的なコーディングテンプレートの間に塩基特異的な二重らせんを形成するステップと、非ハイブリダイズコーディングテンプレートを別の空間位置に移すか、または第3および第4ステップをn−1回反復するステップと、を含む。
一部の実施形態では、キャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートを、空間的に局在化した磁気ビーズに結合させる。これらの実施形態では、磁界を用いて、磁気ビーズを空間的に局在化させてもよい。また別の実施形態では、キャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートを色が異なるビーズに結合させ、例えば、FACSにより分類した後、空間的に局在化させてもよい。また別の実施形態では、n個のテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートをn個の空間的に局在化した巨視的ビーズに結合させる。
他の実施形態では、キャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートは、不可逆的複合体形成により空間的に局在化したビーズに結合させる。例えば、キャプチャーテンプレートが結合したビオチン化ビーズを、個別の空間位置(例えば、ウェル、表面など)に結合したストレプトアビジンまたはアビジンとの反応によって、個別の空間位置に固定することができる。生体分子同士の不可逆的複合体形成の他の例は、当業者の知識の範囲内である。
一部の実施形態では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、多価デバイスと一緒に空間的に局在化した2つ以上のキャプチャーテンプレートをコーディングテンプレートの混合物に添加するステップと、コーディングテンプレートと空間的に局在化したキャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、を含む。
別の実施形態では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、多価デバイスと一緒に空間的に局在化した2つ以上のマクロキャプチャーテンプレートをコーディングテンプレートの混合物に添加するステップと、コーディングテンプレートと空間的に局在化したマクロキャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、を含む。
多価デバイスは、例えば、複数のプロングを有する磁気デバイスであってもよい。ビーズが単離される特定の個別空間位置にわたってプロングが配列されていれば、既知キャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートを含む磁気ビーズを磁界によって多価デバイスの特定のプロングに結合させることができる。次に、多価デバイスに結合させたビーズをコーディングテンプレートのプールと接触させる。コーディングテンプレートとのハイブリダイゼーション後、個別の容器(例えば、ウェルプレート内の個別ウェル)にわたってアームを配列し、デバイスから磁気を除くことにより、ビーズを特異な空間位置に送達する。
KingFisher(商標)システムなどの多価デバイスは、供給業者(例えば、Thermo Fisher Scientific)から入手可能であり、磁気ビーズと一緒に使用するように設計されている。KingFisher(商標)システムは、空間的に異なるウェルヘッドを有し、これらが、電磁的に活性化されると、磁気ビーズに結合する。磁気ビーズは、様々な官能形態(すなわち、例えば、アジド、エポキシ、カルボキシ、アミノ基またはストレプトアビジンなどで官能基化されたビーズ)のものが、供給業者(例えば、Perkin Elmer, Waltham, MA;Bioclone, Inc., San Diego, CA.など)から入手可能である。したがって、キャプチャーテンプレートと磁気ビーズの結合は、十分に当業者の知識の範囲内である。また、Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Set, 2003, 100, 15, 8817を参照されたい。
上の実施形態のいくつかにおいて、キャプチャーテンプレートは、核酸および溶媒に対して透過性の容器に含まれる支持体に結合している。容器は、例えば、その孔径が、支持体に結合したキャプチャーテンプレートを保持するために十分小さく、且つ核酸に対して透過性であるために十分大きい膜またはメッシュであり得る。次に、支持体に結合したキャプチャーテンプレートを含む容器と、複数のウェルヘッドを備えるデバイスとの結合の後、ハイブリダイゼーションが完了するまで、ウェルヘッドをコーディングテンプレートレザバー中に浸漬する。一部の実施形態では、接着または機械的手段により、容器をデバイスに結合させる。容器内に含まれ、現時点でコーディングテンプレートとハイブリダイズしているキャプチャーテンプレートを、規定の様式で結合の接着または機械的手段を破壊することにより、空間的に異なる位置に分散させる。
一部の実施形態では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。本方法は、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上のキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、各キャプチャーテンプレートが、少なくとも1つの二次キャプチャーテンプレートを含むステップと、コーディングテンプレートと相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、二次キャプチャーテンプレートと、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、を含む。
他の実施形態では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。この方法は、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上のマクロキャプチャーテンプレートに添加するステップと、コーディングテンプレートと相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、二次キャプチャーテンプレートと、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、を含む。
上の実施形態において、二次キャプチャーテンプレートは、選択性ハイブリダイゼーションによるコーディングテンプレートの経路決定を可能にするバーコードとして役立つ。他のバーコードは、例えば、サイズに基づいてコーディングテンプレートとキャプチャーテンプレートおよび/またはマクロキャプチャーテンプレートの複合体の分割を可能にし得る様々な長さのオリゴヌクレオチド、または極性、電荷などに基づいて複合体を識別するリガンドを含み得る。こうした複合体をクロマトグラフィーまたはゲル電気泳動により分割して、ハイブリダイゼーションの破壊後、空間的に局在化したコーディングテンプレートを提供することができる。
また別の実施形態では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。本方法は、コーディングテンプレートの混合物を、2つ以上のキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、ここで、各キャプチャーテンプレートは、デンドリマーに結合しており、且つ少なくとも1つの二次キャプチャーテンプレートを含むステップと、コーディングテンプレートと、デンドリマーに結合した相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、二次キャプチャーテンプレートと、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、を含む。
さらに別の実施形態では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。本方法は、コーディングテンプレートの混合物を、2つ以上のマクロキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、ここで、各マクロキャプチャーテンプレートが、デンドリマーに結合しているステップと、コーディングテンプレートと、デンドリマーに結合した相補的マクロキャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、二次キャプチャーテンプレートと、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、を含む。
また別の実施形態では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。本方法は、コーディングテンプレートの混合物を、2つ以上のキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、ここで、各キャプチャーテンプレートが、標識を含み、且つデンドリマーに結合しているステップと、コーディングテンプレートと、デンドリマーに結合した相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、標識を用いて、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体にデンドリマーを結合させるステップと、を含む。
さらに別の実施形態では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。本方法は、コーディングテンプレートの混合物を、2つ以上のマクロキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、ここで、各マクロキャプチャーテンプレートが、特異な標識を含むデンドリマーに結合しているステップと、コーディングテンプレートと、デンドリマーに結合した相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、標識を用いて、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体にデンドリマーを結合させるステップと、を含む。
また別の実施形態では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。本方法は、コーディングテンプレートの混合物を、2つ以上のキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、ここで、各キャプチャーテンプレートが、特異な標識を含むデンドリマーに結合しているステップと、コーディングテンプレートと、デンドリマーに結合したキャプチャーテンプレートの相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、標識を用いて、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体にデンドリマーを結合させるステップと、を含む。
さらに別の実施形態では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。本方法は、コーディングテンプレートの混合物を、2つ以上のマクロキャプチャーテンプレートに添加するステップであって、ここで、各マクロキャプチャーテンプレートが、標識を含み、且つデンドリマーに結合しているステップと、コーディングテンプレートと、デンドリマーに結合した相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、標識を用いて、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、空間的に局在化した容器または分類可能な容器内の固体支持体にデンドリマーを結合させるステップと、を含む。
一部の実施形態では、標識は、二次キャプチャーテンプレートである。他の実施形態では、二次キャプチャーテンプレートは、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズと、または分類可能な容器または樹脂、ビーズ若しくはそれらの組合せを含む容器内で、結合したオリゴヌクレオチドと塩基特異的二重らせんを形成する。
別の実施形態では、標識は、生物学的標識である。標識は、例えば、抗体基質、不可逆的受容体結合剤、不可逆的酵素阻害剤またはそれらの組合せであってよい。標識は、空間的に局在化されたビーズに、分類可能なビーズ若しくは局在化された樹脂、または二重らせんに対して透過性の容器に取り囲まれたビーズ内で、結合した特異な生物剤との不可逆的複合体を形成し得る。標識は、電磁デバイス、質量分析タグ、半導体チップ、RFトランスミッタ、光学記憶装置など(Nova et al.,米国特許第No. 5,741,462号)であってもよい。
一部の実施形態では、空間的に局在化されたビーズは、磁気ビーズである。他の実施形態では、ビーズは、色、サイズ、形状、密度またはそれらの組合せにより分類可能である。多種の官能基化された着色ビーズが、サーモフィッシャー・サイエンティフィック(San Jose, CA)、シグマアルドリッチ(St Louis MO)およびSpherotech社(Lake Forest, IL)などの供給業者から入手可能である。キャプチャーテンプレートとこれらの粒子の結合は、当業者の知識の範囲内である。
ビーズは、FACSにより特異な空間位置に分類可能であるものでよい。ランタニドおよび有機色素などの多くの色素および色素の組合せを用いて、FACSにより効果的に分類することができる、様々な蛍光プロフィールを有する着色ビーズを形成してもよい(Maecker et al., Nature Methods, an6, 2008;Perfetto et al., Nature Reviews 648, 2004;Autisser et al., Cytometry, 410, 2010)。
分類可能な容器は、支持体に結合したキャプチャーテンプレートと、結合された標識とを含み得る。容器は、例えば、その孔径が、支持体に結合したキャプチャーテンプレートを保持する上で十分小さく、且つ核酸に対して透過性である上で十分大きい膜またはメッシュであり得る。分類可能な容器は、別の標識を含み、これは、前述した標識のいずれであってもよい。標識は、容器を識別し、特定の容器を特異な空間的に局在化された位置に送達することを可能にする。
一部の実施形態では、キャプチャーテンプレートは、マクロキャプチャーテンプレートに含まれている。別の実施形態では、2つ以上の標識が、マクロキャプチャーテンプレートに含まれている。また別の実施形態では、標識とキャプチャーテンプレートの比は、約10:1〜1:10である。さらに別の実施形態では、標識とキャプチャーテンプレートの比は、約5:1〜1:5である。また別の実施形態では、標識とキャプチャーテンプレートの比は、約2:1〜1:2である。さらにまた別の実施形態では、マクロキャプチャーテンプレートは、約1〜約100のキャプチャーテンプレートを含む。また別の実施形態では、マクロキャプチャーテンプレートは、約1〜約50のキャプチャーテンプレートを含む。さらに別の実施形態では、マクロキャプチャーテンプレートは、約1〜約25のキャプチャーテンプレートを含む。また別の実施形態では、マクロキャプチャーテンプレートは、約1〜約15のキャプチャーテンプレートを含む。さらにまた別の実施形態では、マクロキャプチャーテンプレートは、約1〜約5のキャプチャーテンプレートを含む。別の実施形態では、キャプチャーテンプレートは、1つまたは複数の標識、リンカーまたはそれらの組合せにより隔てられる。また別の実施形態では、標識は、キャプチャーテンプレートの3’若しくは5’末端のいずれかまたは両端にある。
また別の実施形態では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。本方法は、コーディングテンプレートの混合物を、n個の巨視的ビーズに添加するステップであって、ここで、各巨視的ビーズは、結合したキャプチャーテンプレートおよび特異な結合標識を含むステップと、コーディングテンプレートと巨視的ビーズの相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、n個の巨視的ビーズをn個の空間位置に分類するステップと、標識を用いて、ビーズを識別するステップと、ビーズからコーディングテンプレートを溶離するステップと、コーディングテンプレートをn個の空間位置に配列するステップと、を含む。
さらに別の実施形態では、コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法が提供される。本方法は、コーディングテンプレートの混合物を、n個の巨視的ビーズに添加するステップであって、ここで、各巨視的ビーズは、結合したマクロキャプチャーテンプレートおよび特異な結合標識を含むステップと、コーディングテンプレートと巨視的ビーズの相補的キャプチャーテンプレートとの間に塩基特異的二重らせんを形成するステップと、n個の巨視的ビーズをn個の空間位置に分類するステップと、標識を用いて、ビーズを識別するステップと;ビーズからコーディングテンプレートを溶離するステップと;コーディングテンプレートをn個の空間位置に配列するステップと、を含む。
上の実施形態のいくつかにおいて、巨視的ビーズは、個別の空間位置に手で分散させてもよく、コーディングテンプレートは、ハイブリダイゼーションの破壊によってビーズから溶離させる。ビーズからの分離および個別の位置への配置後、例えば、Next Genシーケンシングにより各コーディングテンプレートのアイデンティティを決定することができる。
一部の実施形態では、巨視的ビーズは、約100ピコモル超のキャプチャーテンプレートを含む。別の実施形態では、各巨視的ビーズは、少なくとも約100ピコモルのキャプチャーテンプレートを含む。また別の実施形態では、ビーズは大型粒子ソータにより分類される。標識は、質量分析標識、FACS標識、無線周波数標識、DNA配列または生物学的標識であってよい。さらに別の実施形態では、ビーズは、質量分析法、FACS、DNAシーケンシングまたは生物剤により識別される。
上の実施形態の多くで、固体支持体は、樹脂(セファロース、アガロース、DEAE、ポリスチレンなど)、ビーズ(例えば、磁気、着色、巨視的、多孔性、非多孔性など)またはモノリスであってよい。一般に、キャプチャーまたはマクロキャプチャーテンプレートは、共有結合形成を介して直接、または固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドとの塩基特異的二重らせんの形成により間接的に、固体支持体に結合される。上の実施形態の多くで、コーディングテンプレートは、コーディングテンプレートと、コーディングテンプレートを含むキャプチャーテンプレートとの間の塩基特異的二重らせん形成のTmより約10℃低い温度で攪拌する。上の実施形態の他のものでは、キャプチャーテンプレートは、共有結合により、塩基特異的二重らせんの形成または生物学的結合事象によって、ビーズまたは樹脂に結合される。
一部の実施形態では、Harbury et al.,米国特許出願第2015/0209753号に記載されているように、マクロキャプチャーテンプレートは、モノリスに結合して、コーディングテンプレートの混合物を分別するために使用してもよい。
一部の実施形態では、固体支持体上のキャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートの線密度は、100μM/m〜約0.05μM/mである。別の実施形態では、固体支持体上のキャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートの線密度は、10μM/m〜約0.5μM/mである。また別の実施形態では、固体支持体上のキャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートの線密度は、5μM/m〜約1.5μM/mである。さらに別の実施形態では、固体支持体上のキャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートの線密度は、約3.3μM/mである。さらにまた別の実施形態では、固体支持体上のキャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートの密度は、約1pm/10μl〜約1μmol/10μlである。また別の実施形態では、固体支持体上のキャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートの密度は、約1nm/10μlである。
一部の実施形態では、キャプチャーテンプレートの相補的核酸配列に対する結合の速度定数は、約1×102M−1s−1〜約1×106M−1s−1である。別の実施形態では、キャプチャーテンプレートの相補的核酸配列に対する結合の速度定数は、約1×103M−1s−1〜約1×106M−1s−1である。別の実施形態では、キャプチャーテンプレートの相補的核酸配列に対する結合の速度定数は、約1×102M−1s−1〜約1×105M−1s−1である。
固体支持体上の官能基は、キャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートが、相補的官能基を含んでいれば、例えば、エーテル、エステル若しくはアミド結合形成により、キャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートで直接官能基化してもよい。一部の実施形態では、相補的官能基の添加環化(例えば、アジドとアセチレン;ジエンと電子不足オレフィン)またはクリックケミストリー(Evans, Australian J. of Chemistry, 60 (6): 384-395 (2007))を用いて、キャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートを固体支持体に結合させてもよい。
あるいは、二官能価リンカーを固体支持体の官能基に結合させて、二官能価リンカー上の相補的官能基とのアミド、カルバメート、エステル、尿素、ウレタン、炭素−窒素、炭素−炭素、エーテル、チオエーテル若しくはジスルフィド結合の形成を介して、キャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートを固体支持体と共有結合させてもよい。一部の実施形態では、相補的官能基の添加環化(例えば、アジドとアセチレン;ジエンと電子不足オレフィン)またはクリックケミストリーを用いて、固体支持体と共有結合したリンカーをキャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートに結合させてもよい。
さらに、キャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートは、固体支持体上の官能基と反応することができる官能基を含有するリンカーで官能基化してもよい。上と同様に、リンカーに結合したキャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートは、リンカー上の相補的官能基とのアミド、カルバメート、エステル、尿素、ウレタン、炭素−窒素、炭素−炭素、エーテル、チオエーテル若しくはジスルフィド結合の形成を介して、固体支持体と共有結合させてもよい。一部の実施形態では、相補的官能基の添加環化(例えば、アジドとアセチレン;ジエンと電子不足オレフィン)またはクリックケミストリーを用いて、固体支持体を、キャプチャーテンプレートまたはマクロキャプチャーテンプレートと共有結合したリンカーに結合させてもよい。
本明細書で引用する全ての刊行物および特許は、刊行物が引用されるものに関して方法および/または材料を開示および説明するために、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。矛盾が存在する限り、本開示が、組み込まれた刊行物のあらゆる開示内容に取って代わることは理解される。本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前にあくまでそれらの開示のためのみに提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明のために、そうした刊行物に先行する資格がないことの承認として解釈すべきではない。さらに、記載される公開日は、実際の公開日とは異なる可能性があり、実際の公開日は、独立に確認が必要な場合もある。
以下の実施例は、説明の目的で提供され、本発明の範囲を制限する意図はない。
実施例1:キャプチャーテンプレートが結合した磁気ビーズの調製
カップリングバッファー(1200μLの5M NaCl、1200μLの1M NaPO4(pH7)、150μLの100mMアミノグアニジン、6mLの水、120μLの0.5%Triton−X−100)にN2を5分間スパージした。100mMアスコルビン酸塩を散布し、音波処理した。次に、アジド磁気ビーズ(Jena Bioscience, Gena, Germany)を500μLの水(3×)、500μLのES2バッファー(20mM NaOH、15mM NaCl、0.02% SDS、0.005%Triton−X−100)で5分間洗浄し、余剰の液体を除去し、500μLの水、余剰の液体を除去し、500μLのカップリングバッファー(2×)を、150μLのカップリングバッファー中に懸濁させて、平衡させた(少なくとも10分)後、余剰の液体を除去した。次に、90μLのカップリングバッファー、2.5μLの100MMアスコルビン酸塩、およびDNAライブラリーの1つのコーディングテンプレートと相補的であるように設計された2.5μLの1つの特異なmMヘキシニル−オリゴヌクレオチドを、連続的にスパージしながら、3つの異なるチューブ(各チューブは、特異なキャプチャーテンプレートを含有し、チューブの数は、実験変数である)に独立に添加した。3μLのCu/THPTA混合物(12.5μL、50mM CuSO4を6.5μLの500mM THPTAと混合した)をスパージしながら添加した。1400rpmで振盪しながら、チューブを37℃で30分間インキュベートした後、5μLのアスコルビン酸塩を添加し、振盪インキュベーションをさらに30分間継続した。次に、ビーズをTEバッファー(10mM Tris、pH8.0、1mM EDTA)(3×)で洗浄してから、100μLのTEバッファー中に保存した。
カップリングバッファー(1200μLの5M NaCl、1200μLの1M NaPO4(pH7)、150μLの100mMアミノグアニジン、6mLの水、120μLの0.5%Triton−X−100)にN2を5分間スパージした。100mMアスコルビン酸塩を散布し、音波処理した。次に、アジド磁気ビーズ(Jena Bioscience, Gena, Germany)を500μLの水(3×)、500μLのES2バッファー(20mM NaOH、15mM NaCl、0.02% SDS、0.005%Triton−X−100)で5分間洗浄し、余剰の液体を除去し、500μLの水、余剰の液体を除去し、500μLのカップリングバッファー(2×)を、150μLのカップリングバッファー中に懸濁させて、平衡させた(少なくとも10分)後、余剰の液体を除去した。次に、90μLのカップリングバッファー、2.5μLの100MMアスコルビン酸塩、およびDNAライブラリーの1つのコーディングテンプレートと相補的であるように設計された2.5μLの1つの特異なmMヘキシニル−オリゴヌクレオチドを、連続的にスパージしながら、3つの異なるチューブ(各チューブは、特異なキャプチャーテンプレートを含有し、チューブの数は、実験変数である)に独立に添加した。3μLのCu/THPTA混合物(12.5μL、50mM CuSO4を6.5μLの500mM THPTAと混合した)をスパージしながら添加した。1400rpmで振盪しながら、チューブを37℃で30分間インキュベートした後、5μLのアスコルビン酸塩を添加し、振盪インキュベーションをさらに30分間継続した。次に、ビーズをTEバッファー(10mM Tris、pH8.0、1mM EDTA)(3×)で洗浄してから、100μLのTEバッファー中に保存した。
実施例2:磁気ビーズに結合したキャプチャーテンプレートを含むDNAライブラリーの経路決定
540μLのDNAライブラリーのうち約30μL(Weisenger et al.,PLOS One,e28056)をqPCRアッセイのために取っておく。残りのライブラリーに、10μLの0.5mg/mLtRNA、5μLの2%SDSおよび5μLの0.5%Triton−X−100を添加して、530μLの総ライブラリー量を取得する。実施例1で調製した磁気ビーズを3つの個別のチューブに分散し、150mLのES2(3×)、500μLのHBE2tRNA(150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、0.02%SDS、0.005%Triton−X−100、0.2エタノールアミン、10μgのtRNA、50mMのTris−HCl、pH7.5)(3×)で洗浄し、余剰の液体を除去する。チューブ内のビーズをDNAライブラリーと順次照合する。ビーズを含む各チューブを1400rpmで1時間振盪しながら、40℃でDNAライブラリーと一緒にインキュベートした後、次のチューブに上清を移す。全てのチューブをDNAライブラリーと一緒にインキュベートするまで、インキュベーションを繰り返す。チューブ内に残ったビーズを500μLのHBE2tRNA(6×)で洗浄し、余剰の液体を除去する。続いて、各チューブ内に存在する分別DNAライブラリーを30μLのES2バッファーで溶離し、3μLの1M Tris−HCl、pH7.5で中和した。ビーズを100μLのTEバッファーで洗浄し、4℃のTEバッファー中に保存する。各チューブから溶離、分別したDNAライブラリーをqPCRおよびNextGenシーケンシングにより分析して、アイデンティティを確認する。
540μLのDNAライブラリーのうち約30μL(Weisenger et al.,PLOS One,e28056)をqPCRアッセイのために取っておく。残りのライブラリーに、10μLの0.5mg/mLtRNA、5μLの2%SDSおよび5μLの0.5%Triton−X−100を添加して、530μLの総ライブラリー量を取得する。実施例1で調製した磁気ビーズを3つの個別のチューブに分散し、150mLのES2(3×)、500μLのHBE2tRNA(150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、0.02%SDS、0.005%Triton−X−100、0.2エタノールアミン、10μgのtRNA、50mMのTris−HCl、pH7.5)(3×)で洗浄し、余剰の液体を除去する。チューブ内のビーズをDNAライブラリーと順次照合する。ビーズを含む各チューブを1400rpmで1時間振盪しながら、40℃でDNAライブラリーと一緒にインキュベートした後、次のチューブに上清を移す。全てのチューブをDNAライブラリーと一緒にインキュベートするまで、インキュベーションを繰り返す。チューブ内に残ったビーズを500μLのHBE2tRNA(6×)で洗浄し、余剰の液体を除去する。続いて、各チューブ内に存在する分別DNAライブラリーを30μLのES2バッファーで溶離し、3μLの1M Tris−HCl、pH7.5で中和した。ビーズを100μLのTEバッファーで洗浄し、4℃のTEバッファー中に保存する。各チューブから溶離、分別したDNAライブラリーをqPCRおよびNextGenシーケンシングにより分析して、アイデンティティを確認する。
Claims (4)
- コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法であって、
多価デバイスと一緒に空間的に局在化した2つ以上のキャプチャーテンプレートを前記コーディングテンプレートの混合物に添加すること;および、
前記コーディングテンプレートと前記空間的に局在化したキャプチャーテンプレートとの間に、塩基特異的な二重らせんを形成すること;
を含む方法。 - 前記多価デバイスが、多価磁気デバイスである、請求項1に記載の方法。
- コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法であって、
前記コーディングテンプレートの混合物を2つ以上のキャプチャーテンプレートに添加すること、ここで、各キャプチャーテンプレートは、少なくとも1つの二次キャプチャーテンプレートを含む;
コーディングテンプレートと相補的キャプチャーテンプレートとの間に、塩基特異的な二重らせんを形成すること;および、
前記二次キャプチャーテンプレートと、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、あるいは、空間的に局在化した容器内または分類可能な容器内の固体支持体に結合した相補的オリゴヌクレオチドと、の間に塩基特異的二重らせんを形成すること;
を含む方法。 - コーディングテンプレートの混合物を2つ以上の空間位置に経路決定する方法であって、
前記コーディングテンプレートの混合物を2つ以上のキャプチャーテンプレートに添加すること、ここで、各キャプチャーテンプレートは、少なくとも1つの特異な標識を含む;
前記コーディングテンプレートと相補的キャプチャーテンプレートとの間に、塩基特異的二重らせんを形成すること;および、
前記標識を用いて、前記二重らせんを、空間的に局在化したビーズ、分類可能なビーズ、あるいは、空間的に局在化した容器内または分類可能な容器内の固体支持体に結合させること;
を含む方法。
Applications Claiming Priority (5)
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2017
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