KR100916889B1 - 암호화된 자가-조립 화학적 라이브러리(ｅｓａｃｈｅｌ) - Google Patents

암호화된 자가-조립 화학적 라이브러리(ｅｓａｃｈｅｌ)

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KR100916889B1
KR100916889B1 KR1020047014042A KR20047014042A KR100916889B1 KR 100916889 B1 KR100916889 B1 KR 100916889B1 KR 1020047014042 A KR1020047014042 A KR 1020047014042A KR 20047014042 A KR20047014042 A KR 20047014042A KR 100916889 B1 KR100916889 B1 KR 100916889B1
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아이드게노쉬쉐 테흐니쉐 호흐슐레 쥬리히
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Abstract

본 발명은 표적 분자(예를 들어, 생물학적인 표적)과 결합 상호작용을 수행할 수 있는 화학 모이어티(p) 및 추가로 올리고뉴클레오티드(b) 또는 그것의 기능성 유사체를 포함하는 화학적 화합물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 첫 번째 구현에서, 화학적 화합물은 올리고뉴클레오티드(b) 또는 기능성 유사체가 화학적 모이어티(q)를 포함하는 또 다른 화학적 화합물에 결합된 보충적인 올리고뉴클레오티드 또는 기능적인 유사물의 하나 이상의 자가-조립 서열(b1')와의 조합 반응을 수행할 수 있는 하나 이상의 자가-조립 서열을 포함한다는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 두 번째 구현예에서, 화학적 모이어티(p)의 동정화에 대하여 코드화하는 코팅 서열(b1)을 포함하는 화학적 화합물은 화학적 화합물이 화학적 모이어티(q)를 포함하는 유사한 화학적 화합물의 하나 이상의 자가-조립 모이어티(m')와의 조합 반응을 수행할 수 있는 하나 이상의 자가-조립 모이어티를 추가로 포함한다는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 표적 분자의 바이오패닝 및 이러한 표적의 동정화 방법 뿐만 아니라 화학적 화합물의 상응하는 라이브러를 포함한다.

Description

암호화된 자가-조립 화학적 라이브러리(ＥＳＡＣＨＥＬ){Encoded self-assembling chemical libraries(ESACHEL)}
해결해야할 문제점
특이 결합 분자(예를 들어, 유기 분자)의 단리는 화학, 생물학, 약제학에서 중요한 문제점이다. 전형적으로, 적절한 후보물질을 구하기 위해서는 몇 백개의 분자가 선별되어야 한다. 통상적으로, 수 많은 유기분자들의 라이브러리의 제조는 부담이 된다. 더구나, 후보물질의 풀(pool)로부터 특이 결합 분자의 동정과 관련된 복잡성은 선별되어야 할 화학적 라이브러리의 크기와 함께 커진다.
해결책
본 발명에서, 본 발명자들은 유기 분자의 자가-조립(self-assembling) 라이브러리(전형적으로 이량체, 삼량체 또는 사량체)를 사용하고, 여기서, 유기 분자는 라이브러리의 자가-조립을 중재하는 그리고/또는 각각의 결합 모이어티(moiety)에 연결된 코드를 제공하는 올리고뉴클레오티드에 연결된다. 생성된 라이브러리는 (더 작은 서브-라이브러리의 조합적인 자가-조립에 의해 기원되므로) 매우 클 수 있다. 관심의 표적에 대한 원하는 결합 특이성의 포착 후, "결합 코드"는 많은 실험적인 기술에 의해(예를 들어, DNA 칩에서의 혼성화 또는 변형된 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 기술 및 서열화에 의해) "해독화"될 수 있다.
도입
특이 결합 분자(예를 들어, 유기 분자)의 단리는 화학, 생물학 및 약학의 중요한 문제점이다. 예를 들어, 미국 식품 및 의약품 안전청에 의해 승인된 수많은 약의 대부분은 하기 카테고리 중 하나에 속하는 생물학적인 표적의 특이적 결합제이다: 효소, 수용체 또는 이온 채널. 다른 분자 특성(약물 신체 반응학적인 행동 및 안정성과 같은)이 약의 수행능력에 기여한다는 것이 널리 인식되어 있기 때문에, 생물학적인 표적에 대한 특이적 결합 그 자체가 결합 분자를 약으로 바꾸기에 충분하지 않다. 하지만, 적절한 생물학적인 표적에 대한 특이적 결합제의 단리는 전형적으로 신규한 약을 이끄는 공정의 출발점을 나타낸다[Drews J. Drug discovery: a historical perpective. Science (2000) 287: 1960-1964].
관심있는 생물학적 표적에 대한 특이 결합제를 빠르게 생성하는 능력은 화학적 및 생물학적 응용의 다양성을 위해 매우 중요하다. 예를 들어, 선택된 세포내 단백질의 특정 에피토프의 특이적 중화는 이 에피토프(및 결과적으로 이 단백질)의 기능적인 역할에 대한 정보를 제공할 수 있다. 원칙적으로, 주어진 에피토프에 대하여 특이적인 모노클로날 항체의 사용은 동일한 형태의 정보를 제공할 수 있다[Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, Hoogenboom HR. Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol. (1994) 12: 433-455]. 하지만, 대부분의 항체는 세포막을 쉽게 통과하지 않고, 인위적으로 관심세포로 도입되어야 한다. 원칙적으로, 세포내 항체는 또한 표적화된 유전자 전달(예를 들어, 항체의 발현을 지향하는 DNA에 의한 세포 트랜스펙션)에 의해 표적 세포로 발현될 수 있다. 이 경우에, 항체는 감소된 세포내 환경이 항체 안정성에 대한 핵심적인 방법에 종종 기여하는 디술파이드 결합의 형성을 허용하지 않으므로, 흔히 접히지 않는다[Desiderio A, Franconi R, Lopez M, Villani ME, Viti F, Chiaraluce R, Consalvi V, Neri D, Benvenuto E. A semi-synthetic repertoire of intrinsically stable antibody fragments derived from a single-framework scaffold. J Mol Biol. (2001) 310: 603-615]. 화학적 합성이 가능한 높은 친화도의 결합 분자는 항체 기술에 유익한 대체물을 제공한다.
화학 및 재료과학에서, 특이 결합 분자의 용이한 단리는 바이오센서의 생성, 화학 반응의 가속화, 신규 특성을 가진 재료의 고안, 표적 분자의 선별적 포착/분리/고정화와 같은 다양한 목적에 유용하다.
정교한 스크리닝 방법론과 결합된, (예를 들어, 동적결합화학(Dynamic combinational chemistry)에 의한) 분자의 많은 레퍼토리의 생성(Otto S, Furlan RL, Sanders JK. Dynamic combinatorial chemistry. Drug Discov Today. (2002) 7: 117-125)은 원하는 결합 특이성의 단리를 위한 중요한 수단으로 인식된다. 예를 들어, 많은 큰 제약회사들은 선도물질의 동정화를 위해 연구한, 독점적인 화학적 라이브러리를 가진다. 이들 라이브러리는 1백만 개를 넘을 정도로 많지만, 어떤 경우에서는, 아직 관심있는 결합 특이성을 산출하지 않는다[Bohn HJ, Stahl M, Structure-based library design: molecular modeling merges with combinatorial chemistry. Current Opinion in Chemical Biology (2000) 4: 283-286]. 몇 백만개의 화합물을 포함하는 라이브러리의 스크리닝은 매우 정교한 합성법 뿐만 아니라 라이브러리 구성원의 저장, 스크리닝 및 평가를 위한 복잡한 로봇 공학 및 인프라를 요구한다.
결합 특이성(파지 디스플레이[Winter, 1994], 플라스미드 상의 펩티드[Cull MG, Miller JF, Schatz PJ. Screening for receptor ligands using large libraries of peptides linked to the C terminus of the lac repressor. Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89; 1865-1869] 리보솜 디스플레이[Schaffitzel C, Hanes J, Jermutus L, Pluckthun A. Ribosome display: an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries. J Immunol Methods. (1999) 231: 119-135] 효모 디스플레이[Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. (1997) 15: 553-557], 사이토메트릭 스크리닝을 이용한 원형질막 주위 발현[Chen G, Hayhurst A, Thomas JG, Harvey BR, Iverson BL, Georgiou G. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nat Biotechnol. (2001) 19: 537-542], 반복 콜로니 필터 스크리닝[Giovannoni L, Viti F, Zardi L, Neri D. Isolation of anti-angiogenesis antibodies from a large combinatorial repertoire by colony fiter screening. Nucleic Acids Res. (2001) 29: E27]등과 같은)을 확인하기 위한 효율적인 생물학적 및/또는 생화학적 방법과 함께, 많은 고분자 레퍼토리의 생성(예를 들어, 펩티드 또는 단백질 라이브러리)은 특이적 모노크로날 항체, 개선된 호르몬 및 신규 DNA-결합 단백질과 같은, 유용한 폴리펩티드 결합제의 단리를 가능하게 한다. 통상적인 화학적 라이브러리와 대조적으로, 상기 구현예에서의 단백질 라이브러리는 관심있는 결합 특이성 조사에서, 1-100억개의 개체수 정도로 많은 효율적인 스크리닝을 가능하게 한다. 한편, 유전자의 라이브러리의 생성(예를 들어, 항체 유전자의 조합적인 돌연변이생성; Winter, 1994; Viti F, Nilsson F, Demartis S, Huber A, Neri D. Design and use of phage display libraries for the selection of antibodies and enzymes. Methods Enzymol. (2000) 326: 480-505)은 적절한 발현 시스템(예를 들어, 박테리아, 효모, 포유동물 세포)을 사용하여 단백질의 라이브러리로 직접적으로 번역될 수 있다. 더구나, 파아지 디스플레이와 같은 방법은 표현형(전형적으로 섬유형 파지의 표면에 디스플레이된, 단백질의 결합 특성)이 상응하는 유전형(즉, 파지에 디스플레이된 단백질을 코딩하는 유전자)에 물리적으로 결합된 입자를 생산하고[Winter, 1994], 원하는 결합 특이성을 가진 멤버에 결합하는 라이브러리의 용이한 증폭 및 동정화를 허용한다.
그러나, 특이 결합 생물 고분자의 단리를 위한 생물학적/생물화학적 방법이 매우 유용한 결합 특이성을 제공할 수 있지만, 그들의 범주는 본질적으로 핵산의 폴리펩티드의 레퍼토리로 제한된다[Brody EN, Gold L. Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J Biotechnol. (2000) 74:5-13]. 몇몇 적용에서, (단백질 또는 DNA와 같은) 큰 생체고분자는 이상적이지 않다. 예를 들어, 그들은 종종 세포막을 효율적으로 통과할 수는 없고, 생체 내에서 가수분해적 감성을 겪을 수 있다.
화학적 라이브러리를 벗어난, 원하는 결합 특성을 가진 유기분자의 동정을 위한 유사 생물학적인/생물화학적인 방법에 대한 시도에서, Brenner 및 Lerner[Brenner S, Lerner RA. Encoded combinatorial chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89: 5381-5383]은 암호화된 화학적 라이브러리(ECL)의 사용을 제안하고 있다. 그들의 발명에서, 발명자들은 독특한 뉴클레오티드 서열을 가진 화학물질의 많은 라이브러리의 각각을 암호화하기 위하여 선택적 병행 조합 합성법을 착안하였다. 특히 발명자들은 고체 지지체(예를 들어, 비드) 상의 중합성 화학적 화합물의 조합 합성을 가설하였고, 여기서 조합 합성에서의 단계 이후에 비드에서 수행된 화학 반응을 위한 "기억 태그(memory tag)"로서 사용되어질 DNA 서열의 (동일한 비드 상의)합성이 이어진다. 통상적인 적용에서, DNA-암호화된 비드는 표적 분자(예를 들어, 약학적인 타당성을 가진 단백질)에 의해 인큐베이션될 것이다. 중합성 화학적 엔티티(chemical entity)를 함유하는 DNA-태그된 비드가 표적에 결합된 후, 복제에 의해 유전 태그를 증폭시키고 그것을 라이브러리의 서브세트에 대한 일련의 혼성화에 의해 결합된 분자의 풍부화에 사용하는 것이 허용된다. 수용체에 결합된 중합성 화학 구조의 특성은 뉴클레오티드 태그를 서열화함으로써 해독화될 수 있다.
ECL법은, "읽혀질" 수 있고 PCR에 의해 증폭되는 상응하는 올리고뉴클레오티드 서열을 가진, 비드상에서 합성된 특이적 중합성 화학적 모이어티를 "코드화"하는 개념을 도입하는 이점을 가진다. 그러나, ECL법은 많은 단점을 가진다. 첫째로, 일반화학은 비드에서 (종종 다른 반응성 특징을 가진) 중합성 유기분자의 선택적 합성 및 DNA 합성을 허용할 것을 요구한다. 둘째로, 많은 라이브러리(예를 들어, >1백만개의 개별적 멤버)의 합성, 관리 및 품질 조절은 각별한 과업으로 남아 있다. 사실상, ECL법의 유용성은 아직 실험적 예에 의해 설명되어야 한다.
선행 기술
US 5,573,905로부터, 암호화된 조합적인 화학적 라이브러리는 일반식 A-B-C에 따른 다수의 2기능성 분자를 포함하고, 여기서 A는 중합성 화학적 모이어티이다. B는 A와 C를 효율적으로 연결하는 링커(linker) 분자이고, 1 내지 약 20개 원자의 사슬 길이로 이루어지고, 바람직하게는 고체 지지체에 부착하기 위한 수단을 포함한다. C는 화학적 모이어티의 구조를 동정화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 동정화 올리고뉴클레오티드이다. 고체 지지체로의 부착은 화학적 모이어티(서브유니트 X1-n로 만들어진 중합체) 및 올리고뉴클레오티드(중합체의 화학적인 서브유니트를 코드화하고 동정화하는 뉴클레오티드 Z1-n로 만들어진)를 단계별로 합성하는 경우에 특히 바람직하다. 라이브러리의 2기능성 분자, 및 예비선별된 결합 상호작용에서 생물학적 활성 분자에 결합하는 라이브러리 내의 화학 구조를 동정하기 위한 라이브러리의 사용법이 또한 개시된다. 중합체 A의 동정화를 위한 코드 C의 활용 및 링커 분자 B를 갖는 중합체 A에 코드 C의 부착은 중합체의 정확한 동정을 가능하게 하지만, US 5,573, 905(기본적으로 Brenner 및 Lerner, 1992에 의해 발표된 것과 동일한)에 기재된 용액은 이런 특별한 형태의 화학적 모이어티로 제한된다. 개별적인 합성이 각각의 화학적 라이브러리에 대해 수행되어야 한다는 사실은 또 다른 불이익으로 간주된다.
동적 조합 화학은, 표적 분자(예를 들어, 표적 단백질)의 존재에 의해 안정화될 수 있고 그것으로 인하여 안정화된 복합체의 회복을 가능하게 하는, 결합 모이어티의 비가역적인(공유결합의 또는 비-공유결합의) 어셈블리를 위한 하나의 수단으로서 확립해 왔다[Ramstrom and Lehn (2002) "Drug discovery by dynamic combinatorial libraries". Nature Reviews Drug Discovery, Vol. 1, page 26-36].
DE 196 19 373는 동적 조합 화학적 라이브러리의 이행을 위한 전략을 개시한다. 상기 전략은 올리고뉴클레오티드 스트랜드(또는 유사체)의 가역적 어셈블리에 의존하고, 각각의 스트랜드는 중합성 또는 모노머성 화학적 엔티티에 의해 화학적으로 변형되고, 헤테로이중체를 형성할 수 있다. 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 어셈블리 및 디스어셈블리는 표적 분자(예를 들어, 표적 단백질 또는 "기질(substrate)")가 특정 거대분자 어셈블리를 안정화할 때까지 필수적이라고 보고되고 있다. 상기 기술의 전형적인 이행에서, 긴 (화학적으로 변형된) 올리고뉴클레오티드는 짧은(화학적으로 변형된) 올리고뉴클레오티드에 의한 일시적인 자가-조립이 긴 올리고뉴클레오티드의 독특한 구역을 가진 가역적인 헤테로이중체의 형성을 유도하는데 사용된다. 통상적으로, 동일한 올리고뉴클레오티드 서열은 다른 라이브러리 멤버들의 등가의 재-혼합 특성을 보장하므로, 다른 화학적 화합물에 대하여 사용된다. 하지만, 개시된 기술은 대부분의 동적 조합 화학적 라이브러리에 대해 동일한 문제, 즉 결합 복합체 동정화의 어려움 (특히 큰 라이브러리가 사용된 경우)를 나타낸다.
WO 00/23458은 통상적인 분할(split) 및 풀 조합 화학적 기술(일반적으로, 비드 상의 화합물에 한정된)의 변형을 개시한다. 중합성(또는 적어도 모듈식의(modular)) 화학적 화합물의 합성을 위한 담체는 긴 DNA 스트랜드이고 이것은 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 지니는 수지상에서 합성 중간체의 특이적이고 올바른 정제를 허용하는 중합성 화학 화합물 및 (연결 영역에 의해 분리된) 특정 올리고뉴클레오티드 서열의 성장을 위한 부위가 동시 존재함을 특징으로 한다. 다른 올리고뉴클레오티드 코드를 지니는, 생성된 다른 합성 중간체들은 특이적 반응 부위에서 단량체와 화학적으로 변경되고 풀화될 수 있다. 사이클(cycle)이 반복되어 DNA에 연결된 암호화된 중합성(또는 적어도 모듈식의) 화학 구조가 성장하도록 한다. 이 합성 구조는 "DNA 섞기" 및 직접적인 진화 선택적 전략을 위한 재합성에 알맞다. 그것의 고유한 디자인은 이 전략을 중합성(또는 적어도 모듈식의) 화학적 화합물에 대하여 한정시키고, 이것의 합성은 올리고뉴클레오티드의 동시적인 존재를 간섭하지 않는다. 동일한 제한이 개개의 DNA 분자의 전-합성(pre-synthesis) 또는 성장 합성(growing synthesis) 중 하나를 필요로 하는 라이브러리 중의 각각의 화합물에 적용된다(즉, 106개의 화학적 화합물에 대한 106개의 DNA 분자). 화학적 구조물을 지지하는 DNA 올리고뉴클레오티드의 길이로 인한 합성에서 및 표적 분자에 의한 선별 중에서 문제가 예상된다.
DE 197 41 716는 하나 이상의 고정된 결합 파트너 A (적어도 B에 결합할 수 있는) 및 하나 이상의 결합 파트너 B (결합 파트너 A에 결합할 수 있는)으로 이루어진 인식 시스템을 개시한다. "리더(reader)"-상보적 올리고뉴클레오티드를 전달하는 전기화학적인 장치에 의하여 충분히 태그된 분자의 동정화를 촉진하기 위해, 개별적인 올리고뉴클레오티드 태그와 개별적인 분자의 태깅(tagging)(이전에 US 5,573,905에 개시된 또는 [Sano T, Smith CL, Cantor CR. (1992) Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science, vol. 258, pages 120-22])으로 발표된 것과 유사한)이 개시된다. 예를 들어, 독특한 올리고뉴클레오티드와 개별적인 항체의 태깅은 선별적인 결합 작용의 탐지를 위한 방법으로 제안된다.
US 5,573,905는 유전적 태크가 합성된 중합성 화학 구조에 화학적으로 연결되는 것과 같은, 두 개의 선택적인 평행 조합적인 합성을 개시한다. 이 방법에서, 화학적 유니트(예를 들어, 아미노산)의 (전형적으로 비드 상에서)첨가 후 올리고뉴클레오티드 서열이 첨가되고, 이것은 중합성 화합물의 구조를 동정하는 것(identifier)으로 작용한다. 라이브러리는 풀링 후 공정의 반복 및 각 단계에서 얻어진 반응 생성물의 분배(division)에 의해 만들어진다. 이 방법의 한계는 합성되고 사용될 수 있는 라이브러리의 크기가 합성에 요구되는 비드의 수에 의해 제한된다는 것을 포함한다. 중합성 화학 구조물의 "해독화"는 선택적 화학적 합성에 의하여 적용된다.
그러므로, 본 발명의 목적은 표적 분자(예를 들어, 생물학적인 표적)와의 결합 상호작용을 수행할 수 있는 모든 종류의 화학적 모이어티를 포함하는, 그리고 화학적 라이브러리를 구축하기 위하여 화학적 화합물을 개별적으로 합성할 필요가 없는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 기능성 유사체를 추가로 포함하는 화학적 화합물을 제공하는 것이다.
이 목적은 표적 분자(예를 들어, 생물학적인 표적)와의 결합 상호작용을 수행할 수 있는 화학적 모이어티(p)를 포함하고 추가로 올리고뉴클레오티드(b) 또는 그것의 기능성 유사체를 포함하는 화학적 화합물을 정의하는 최초 출원시의 독립항 제 1항의 특징의 조합에 의한 첫번째 관점에 따라서 이루어지고, 여기서, 올리고뉴클레오티드(b) 또는 그것의 기능성 유사체는 화학적 모이어티(q)를 포함하는 또 다른 화학적 화합물에 결합된 상보적 올리고뉴클레오티드 또는 기능성 유사체의 적어도 하나의 자가-조립 서열(b1')과 조합 반응을 수행할 수 있는 적어도 하나의 자가-조립 서열(b1)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
이 목적은 표적 분자(예를 들어, 생물학적인 표적)와의 결합 상호작용을 수행할 수 있는 화학적 모이어티(p)를 포함하고 추가로 올리고뉴클레오티드(b) 또는 그것의 기능성 유사체를 포함하는 화학적 화합물을 정의하는 최초 출원시의 독립항 제 3항에 기재된 특징의 조합에 의한 두번째 관점에 따라 이루어지고, 이것은 화학적 모이어티(p)의 동정을 위해 코드화되는 코딩 서열(b1)을 포함하고, 이것은 상기 화학적 화합물이 추가로 화학적 모이어티(q)를 포함하는 또 다른 화학적 화합물의 적어도 하나의 자가-조립 모이어티(m')와 조합 반응을 수행할 수 있는 적어도 하나의 자가-조립 서열(m)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 추가적인 관점과 특성은 종속항에서 유도된다.
발명의 요약
본 발명에서, 본 발명자들은 매우 큰 화학적 라이브러리의 생성(및 스크리닝)에 대한 핵심적인 기여는 암호화된 분자의 "자가-조립(self-assembly)"으로 실현될 수 있다고 판단했다. 특히, 본 발명자들은 DNA-태그된 화학적 엔티티의 자가-조립(예를 들어, 동종이량체화(homodimerization), 이종(헤테로)이량체화(heterodimerization), 다중화(multimerization))이 작은 DNA-태그된 화학적 라이브러리로부터 개시되는, 매우 큰 DNA-태그된 화학적 라이브러리의 손쉬운 생성을 위한 방법을 제시한다고 판단했다. 예를 들어, 1,000개의 멤버를 함유하는 두 개의 라이브러리의 자가-조립(이종이량체화)은 1,000,000개의 다른 조합, 즉 1,000,000개의 다른 화학적 엔티티를 제공할 것이다. 특히, 1,000개의 DNA-태그된 멤버를 함유하는 암호화된 라이브러리의 동종- 또는 이종-삼량체화는 1,000,000,000개의 다른 DNA-태그된 조합, 즉, 화학적 엔티티를 함유하는 라이브러리를 제공할 것이다. 그러므로, 본 발명은 표적 분자(예를 들어, 생물학적인 표적)와의 결합 상호작용을 수행할 수 있는 임의의 화학적 모이어티를 포함하고, 추가로 별도로 합성된 다음 함께 결합될 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 유사체를 포함하는 화학적 화합물(chemical compound: 화합물)을 제공한다. 얻어진 올리고뉴클레오티드의 화학 유도체(들)는 고차 구조물 및 화합물의 암호화된 라이브러리를 생성하는 다른 유사한 화합물과 추가로 조립될 수 있다.
예시를 목적으로, 본 발명의 하나의 특이적 구현예는 도 1에서 묘사된다. 2개의 화학적 라이브러리는 이중체(duplex) 형성이 가능한 올리고뉴클레오티드의 각각 3'말단(end) 및 5'말단의 화학적인 변형에 의해 합성되고, 그것은 (그들의 극단(extremity)에 부착된 화학적 모이어티와 결합된[그러므로 "코드화된"]) 특징적인 "서열 태그"를 운반한다. 생성된 암호화된 자가-조립 화학적 라이브러리(ESACHEL)는 (2개의 더 작은 라이브러리의 조합적 자가-조립으로부터 기원하는 것으로서) 매우 클 수 있고, 생물학적인 표적(예를 들어, 관심의 약학적인 단백질)에의 결합에 대하여 스크리닝될 수 있다. 적합한 결합 특이성을 나타내는 라이브러리의 이들 멤버들은 관심의 표적으로 (예를 들어, 고체 지지체에 고정된 표적을 사용하여) 포획될 수 있다. 그리고 나서, 관심의 결합 특이성을 야기하는 화학적 엔티티를 암호화하는 그들의 유전적 코드는 "발명의 설명"(하기 참조) 부분에서 개시되는 많은 정교한 방법을 사용하여 검색될 수 있다.
정의
특이(specific):
이 용어는 특이결합쌍의 한 멤버가 그것의 특이결합짝을 제외한 다른 분자에는 현저한 결합성을 나타내지 않는 상황을 언급하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 특이성은 "비-특이적인" 표적에 비해, 결합 친화도에서의 현저한 차이와 관련된다. 이 용어는 또한 예를 들어, 결합 멤버가 표적 분자(이후로, "에피토프"라 함)의 특정 표면에 특이적인 경우에 적용할 수 있고, 이 경우 이 특이성을 갖는 특이결합 멤버는 에피토프를 지니는 다양한 표적 분자에 결합할 수 있다.
발명의 설명
ESACHEL 기술의 주요 요소는 [화학적 화합물의 (동종- 또는 이종-)이량체화(dimerization), 삼량체화(trimerization) 또는 사량체화(tetramerization)를 중재할 수 있는]올리고머화 도메인에 연결되고, 화학적 엔티티에 연결된, 표적 분자와의 특이적 결합 상호작용에 포함될 수 있는 올리고뉴클레오티드 모이어티(통상적으로, DNA 서열)을 포함하는 화학적 화합물들이다(도 2). 올리고뉴클레오티드 모이어티의 서열의 일부는 화학적 엔티티와 독특하게 결합될 것이다(그러므로 "코드"로 작용한다). 많은 경우에서, 동일한 올리고뉴클레오티드의 일부는 올리고머화 도메인 및 코드로서 제공할 것이다.
올리고뉴클레오티드 모이어티:
ESACHEL 기술에서 올리고뉴클레오티드 모이어티의 특성 및 고안은, 하기 설명 및 실시예에 제공되는 "코드화" 시스템의 설명으로 잘 이해된다. 서론으로서, 독특한 올리고뉴크레오티드 서열(예를 들어, DNA 또는 DNA 유사체의 서열)과 화학적 엔티티를 안정하게 결합시킴에 의해, 독특한 코드를 갖는 화학적 엔티티를 제공하는데, 이것은 다양한 방법(서열화, DNA 칩에 대한 혼성화 등)으로 "판독(read)"될 수 있고 증폭(예를 들어, 폴리머라제 사슬반응[PCR]의 사용으로)될 수 있다고 말할 수 있다. 더구나, 하기와 같은 정교한 방법을 사용하여, 하나의 특정 화학적 화합물의 코드는, 이들 화학 화합물들이 올리고머화 도메인에 의하여 연결될 때, 다른 화학적 화합물(들)의 코드에 물리적으로 연결될 수 있다.
올리고머화 도메인:
적절한 DNA 서열(헤테로이중체, 삼중체[Strobel SA, Dervan PB. Single-site enzymatic cleavage of yeast genomic DNA mediated by triple helix formation. Nature. (1991) 350:172-174] 또는 사중체[Various authors. Issue of Biopolymers (2000-2001), volume 56 (3)]형성이 가능한)은 가능한 올리고머화 도메인으로 고려될 수 있다.
선택적으로, 다른 자가-조립 폴리펩티드(예를 들어, 류신 지퍼와 같은 양쪽 친매성 펩티드 나선)의 사용이 고려될 수 있다. 더 많은 화학적 모이어티는 화학적으로 정의된, 올리고머성 모이어티의 중재자로 간주될 수 있다. 예를 들어, 적절한 리간드(디피리딜 또는 트리피리딜 유도체와 같은)를 가진 금속 원자의 복합체가 고찰될 수 있다. 더구나, 비-공유결합성 상호작용은 다른 화학적 화합물들을 합칠 것이고, 이것은 그리고 나서 서로 반응하여 공유결합으로 결합할 수 있다고 고찰된다.
ESACHEL 기술의 몇몇 실제적 구현예:
ESACHEL 기술의 하나의 가능한 실제적 구현예를 설명하기 위하여, 본 발명자들은 (도 3에서 묘사된) 하기 예를 고려하였다.
반응성 모이어티(예를 들어, 티올-반응성 말레이미도 또는 요오드아세트아미도기)를 지니는 n개의 다른 화합물들은 반응성 모이어티(예를 들어, 3'말단에서의 티올기)를 지니는 n개의 다른 DNA 올리고뉴클레오티드와 (개별 반응에서)반응한다. n개의 콘주게이트에 상응하는 풀은 도면에서 "풀 A"로 나타낸다. 풀 A의 올리고뉴클레오티드는 다음을 갖는 것으로 고안된다:
- 풀 B의 화합물에 혼성화될 수 있는 DNA 서열의 한부분(도 3 및 하기 설명 참조)
- 풀 A의 n개의 멤버 각각에 대한 독특한 DNA 서열
- "해독화" 결합 조합을 위하여 신중하게 고안된 DNA 서열의 추가적 부분(임의적; "해독화"에 관한 지문 및 실시예 참조).
유사하게, 티오-반응성 모이어티(예를 들어, 말레이미도 또는 요오드아세트이미도기)를 지니는 m개의 다른 화학적 화합물들은 5'말단에서의 티올기를 지니는 m개의 다른 DNA 올리고뉴클레오티드와 (개별적인 반응에서)반응한다. m개의 콘주게이트에 상응하는 풀은 도에서 "풀 B"로 나타낸다.
풀 B의 올리고뉴클레오티드는 다음을 갖는 것으로 고안된다:
- 풀 A의 화합물에 혼성화될 수 있는 DNA 서열의 한부분(도 3 참조)
- 풀 B의 m개의 멤버 각각에 대한 독특한 DNA 서열
- "해독화" 결합 조합을 위하여 신중하게 고안된 DNA 서열의 추가적인 부분(임의적).
풀 A 및 풀 B의 DNA 콘주게이트의 부분적으로 상보적인 스트랜드들은 풀 A의 다른 n개의 멤버 및 풀 B의 m개의 멤버 내에서 필적하는 효율성을 가지며, 용액에서 쉽게 이종이량체화할 수 있다. 풀 A 및 풀 B의 화합물의 적절한 열역학적인 비율이 사용된다면, 풀 A의 화합물의 n개의 다른 형태는 풀 B의 화합물의 m개의 다른 화합물과 이종이량체화하여, m×n 규모의 조합적인 자가-조립 화학적 라이브러리를 제공할 것이다. 예를 들어, 수천개 화합물의 두 라이브러리는 수백만개의 다른 조합을 제공할 것이다. 더구나, 생성된 자가-조립된 m×n 조합은 구별되는 DNA 코드를 운반할 것이고, 이것은 풀 B의 멤버의 DNA 코드와 풀 A의 멤버의 DNA 코드의 비-공유결합이지만 안정된 결합(이종이량체화)에 상응할 것이다.
티올-보유 올리고뉴클레오티드에 대한 화학적 엔티티의 커플링(coupling)에 대한 대안으로서 다수의 표준 화학 대체물(예를 들어, 하나의 극단에서 포스포디에스테르 결합을 수반하는, -O-P(O)2-O-(CH2)n-NH-CO-R과 같은 화학 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드, 여기서 R은 다른 화학적 엔티티의 수에 상응할 것이고, n은 1~10의 범위일 것이다)이 고려될 수 있다.
본 발명자들은 라이브러리의 하나의 특정 멤버가 관심의 표적에 대해(예를 들어, 비드 상에 고정된 단백질) 특이결합을 할 수 있다고 가정한다. 또한 본 발명자들은 (이 특이결합을 촉진할 수 있는 킬레이트 효과의 검토를 위하여, 하기 참조) 스트랜드 A 및 B 모두가 특이결합 상호작용에 기여한다고 가정한다. 바람직하게는 m×n 조합 이상으로 A 및 B의 이 특정 조합을 (예를 들어, 비드 상의 표적 단백질에 라이브러리를 노출시키고, 이 후 라이브러리 용액으로부터 비드를 물리적으로 제거하고, 이어서 비드에서 비-특이적 결합체의 양을 감소시키기 위하여 비드를 신중히 세척함에 의해) 풍부하게 하는 것이 가능할 것이다. 항체 파아지 라이브러리(Viti, 2000)와 함께 사용된 바이오패닝 공정에 대한 이 공정의 유사성은 당업자에게 명백할 것이다.
원하는 결합 특이성을 나타내는 A 및 B의 특정 조합을 구한 후, 두개의 스트랜드 A와 B의 DNA 코드를 동정함으로써 결합을 가져오는 화학적 엔티티를 동정할 수 있다[DNA 코드의 동정화를 위한 가능한 전략의 검토를 위해 "해독화"에 대한 다음 섹션을 참조].
여러 적용의 경우, ESACHEL 공정의 마지막에, 표적에 대한 특이결합의 원인이 되는 두개의 화학적 엔티티 A 및 B을 연결하는 것이 바람직할 것이다(도 3). 여러 다양한 화학 링커를 시도할 수 있고, 화학적 엔티티 A 및 B에서 유래된, 생성된 화학적 화합물이 원하는 분자 특성(예를 들어, 표적에 대한 높은 친화도, 표적에 대한 높은 특이성, 적절한 화학적 안정성, 적절한 용해성 특성, 적절한 약제학적인 특성 등)을 나타내는가를 평가할 수 있다. 예를 들어, A 및 B 사이의 화학 링커의 길이는 콘주케이트의 결합특성에 극적으로 영향을 줄 것이다(검토를 위해, 킬레이트 효과에 관한 하기 섹션 참조).
도 3의 경우, DNA 부분이 이종이량체화 도메인으로서 사용되고, 티오에테르 결합 형성은 라이브러리의 화학적 엔티티에 대한 DNA 올리고뉴클레오티드의 커플링을 위하여 사용된다. 그러나, DNA에 대한 화학적 엔티티의 커플링을 위하여 다른 화학적 수단 뿐 아니라, 다른 올리고머화 도메인이 고려될 수 있다.
특정 DNA는 안정한 삼량체성 복합체[Strobel,1991] 또는 안정한 사량체성 복합체[Various authors, 2000-2001]를 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, DNA 삼량체의 호그스텐 쌍은, 각각 n, m 및 l개 멤버를 함유하는, 풀 A×B×C의 자가-조립을 허용할 수 있다(도 4). DNA-(화학적 모이어티) 콘주게이트의 사량체성 어셈블리는 작은 규모의 서브-라이브러리 A, B, C 및 D로부터 출발하여, 더 큰 라이브러리 크기도 가능할 것이다. 하지만, 결합 상호작용의 해독화는, 어떤 경우에는, 이량체 라이브러리에 비하여 삼량체성 및/또는 사량체성 자가-조립된 암호화된 라이브러리에서 더욱 어려워질 수 있다. 더구나, DNA 스트랜드 및 그들의 극단에 나타난 화학적 모이어티 사이의 링커의 길이 및 적응성(flexibility)은 암호화된 자가-조립된 화학적 라이브러리 (ESACHEL)의 특이 결합 멤버의 동정화를 촉진하거나 방해할 수 있다. 어느 정도의 적응성은 적절한 화학적 모이어티가 표적 분자에서 상보적 포켓을 발견할 수 있도록 할 것이다(도 4). 한편, 킬레이트 효과의 친화도 기여는 링커 길이에 의해 감소되는 것으로 예상된다.
100개 멤버의 서브-라이브러리로 시작되는 삼량체성 ESACHEL 라이브러리는 106개 멤버를 함유하지만, 사량체성 ESACHEL 라이브러리는 108개 멤버를 함유한다는 것은 언급할 가치가 있다. 다른 규모의 서브-라이브러리로부터 시작하여 생성된 라이브러리 크기를 계산하는 것은 쉽다. 암호화된 자가-조립 화학적 화합물의 큰 조합 복합체는 특이 결합 멤버의 동정화를 가능하게 하고, 통상의 조합적 화학적 방법을 사용한 동정화와 구별된다. 유사성은 항체 파지 기술의 분야에서 유도되고, 라이브러리 크기는 고-친화성 항체의 단리에서 결정적인 역할을 한다.
ESACHEL 코드 및 해독화 방법:
ESACHEL 기술에서, 독특한 올리고뉴클레오티드 서열(통상적으로, DNA 서열)은 독특한 코드를 갖는 화학적 엔티티를 제공한다. 라이브러리 멤버들을 동정화하기 위하여, 얼마나 많은 별개의 서열들이 필요한가?
상기와 같이, ESACHEL 기술의 핵심 구성성분은 올리고머화 도메인에 연결된, 또한 화학적 엔티티에 연결된, 올리고뉴클레오티드 모이어티(전형적으로, DNA 서열)를 포함하는 화학적 화합물이다. 대부분의 경우, 올리고뉴클레오티드 모이어티는 또한 올리고머화 도메인을 제공할 것이다. 결과적으로, 대부분의 경우, ESACHEL 성분들은 신중하게 선택된 DNA 올리고뉴클레오티드에 결합된 화학적 엔티티일 것이다. 통상적으로, 이러한 올리고뉴클레오티드는 고정 부분 및 (라이브러리의 각 멤버에 대하여 독특하게 특징되는) 변형 부분을 함유할 것이다.
본 발명자들은 예로서, 도 3에 예시되고 및 "ESACHEL 기술의 특정 실제적 구현예" 부분에 개시된 경우를 고려하였다(상기 참조). 이 예에서, (DNA 올리고뉴클레오티드의 3'극단에 부착된 n개의 화합물을 함유하는) 서브-라이브러리 "A"는 (올리고뉴클레오티드 5'말단에 부착된 m개의 화합물을 함유하는) 서브-라이브러리 "B"와 조립된다. 서브-라이브러리 A는 x 염기의 DNA 서열에 의해 표현될 수 있고, 여기서, 4x는 n과 같거나 더 크다. 서브-라이브러리 B는 y 염기의 DNA 서열에 의해 표현될 수 있고, 여기서, 4y는 m과 같거나 더 크다. 대부분의 경우에서(하기 참조), 서브-라이브러리 멤버의 코드의 동정화는 또한 특정 코드(그러므로 특정 화합물)가 속하는 서브-라이브러리에 관한 정보를 제공한다.
ESACHEL 코드를 "해독화"하는 많은 방법이 고찰될 수 있다. 하기에서, 본 발명자들은 다른 실험 필요 조건에 상응하고 ESACHEL 기술의 적응성을 예시하는 세 가지 경우를 예시한다.
본 발명자들은 간단하게 도 3의 ESACHEL 구현예를 고려하였다. 서브-라이브러리 A 및 B를 기준으로 하는 올리고뉴클레오티드의 알맞은 고안을 도 5에서 나타내었다. 서브-라이브러리 A의 올리고뉴클레오티드는 3'말단에 화학적 엔티티를 내포한다. 3'극단 쪽으로, DNA 서열은 서브-라이브러리 B의 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 DNA 서열에 혼성화하도록 고안된다. 혼성화 영역(region)는 작은 분절(segment)에 의해 차단된다. 서브-라이브러리 A에서, 이 작은 분절은 편의상 (도에서 d-스페이서로 명명된) 염기가 없는 포스포디에스테르 백본으로 구성되고; 서브-라이브러리 B에서, 상응하는 짧은 분절은 서브-라이브러리의 각 멤버에 대해 독특한 (그러므로 서브-라이브러리 B에 대한 "코드"로서 작용하는) 서열을 가질 것이다. 대조적으로, 서브-라이브러리 A의 올리고뉴클레오티드는 5' 말단 쪽으로 그들의 독특한 코드를 가진다.
바이오패닝 후, 원하는 결합 특이성을 나타내는 결합 멤버의 코드에 관해 연구하는 것이 바람직하다. 서브-라이브러리 B의 올리고뉴클레오티드는 서브-라이브러리 A의 올리고뉴클레오티드에 안정하게 어닐링된 채 유지되고, 주형 A 상에서 DNA 폴리머라제 반응을 위한 프라이머로 작용할 수 있다. 코드 A 및 코드 B 모두를 지니는 생성된 DNA 분절은 DNA 분절의 일정한 극단에서 혼성화되는 프라이머를 사용하여 증폭(통상적으로 PCR에 의해)될 수 있다(도 5).
여러 개의 특이적 결합 멤버가 바이오패닝 실험의 마지막에서 단리된다면, 여러 개의 PCR 산물은 도 5에 예시된 방법으로 생성될 것이다. 이들 생성물은 A 및 B 서브-라이브러리 멤버를 위한 코드화 영역을 제외하고는 유사한 서열을 가질 것이다. 별개의 특이적 결합 멤버의 상대적인 풍부성에 관하여 더욱 연구하기 위하여, 반응 혼합물에서 다양한 PCR 산물로부터 출발하는 연쇄체(concatenamer)를 생성하는 것이 편리할 것이다. 이러한 연쇄화된 서열은 (특정 라이브러리 멤버에 독특하게 상응하는) 코드 A 및 코드 B 쌍의 동정화 및 빈도 모두를 나타내는 서열화에 의해 "판독"될 수 있다.
대체가능한 해독화 전략을 도 6에 나타내었다. 서브-라이브러리 A 및 B는 부분적으로-어닐링 올리고뉴클레오티드의 극단에 화학적 모이어티를 운반한다. 대부분의 경우에서, 헤테로이중체를 형성하는 DNA 부분은 라이브러리 내에 일정할 것이다. 반대로, 다른 극단은 헤테로이중체 형성이 선호되지 않는 방법으로 고안될 것이다. 이러한 짝짓지 않은 DNA 스트랜드는 표적 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 하나 이상의 칩에 고정화된 DNA 올리고뉴클레오티드)와의 혼성화에 이용가능할 것이다. 예를 들어, 칩 A는 바이오패닝 실험 후 얻어진 서브-라이브러리 A의 멤버의 동정화(및 빈도)의 판독을 가능하게 할 것이다. 유사하게, 칩 B는 서브-라이브러리 B의 멤버의 동정화(및 빈도)의 판독을 가능하게 할 것이다. 칩상의 결합 반응의 가시화를 위해 다양한 전략이 고려될 수 있다(예를 들어, DNA 방사선표지화, DNA 비오틴화 후 스트렙타비딘-기저 시약으로의 탐지).
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첫 번째 단계에서, 도 6의 해독화 방법은 특이결합 멤버에서의 코드 A 및 B의 짝지움에 관한 정보를 제공하지 않을 것이다. 하지만, 칩 A 및 B에서의 해독화는 바이오패닝의 연속적인 과정에서 재-어닐링되고 선별되어질 서브-라이브러리 A 및 B의 후보 구성성분을 제안할 것이다. 표적에 대한 더욱 더 스트린전트한 결합은 칩에서 동정화된, A 및 B 멤버의 수의 지속적인 감소에 의해 반영될 것이다. 최종적으로, 후보물질 A 및 B 멤버의 가능한 조합은 개별적으로(또는 더 작은 풀에서) 조립되고, 표적에 대한 결합이 평가될 것이다. 본 발명자들은 이 반복 전략을 탈나선(deconvolution)으로 명명한다.
명백하게는, 도 6의 해독화 방법은 또한, 라이브러리가 삼량체성 또는 사량체성 복합체를 형성하기 위하여 자가-조립하는 경우에(예를 들어, 화합물의 올리고머화를 위한 DNA 삼중체 또는 사중체), ESACHEL에 유효하다. 이들 경우에서, 각각 해독화를 위한 독특한 표적 올리고뉴클레오티드를 운반하는 3 또는 4개의 칩이 사용될 수 있다.
적절하다면, 도 6의 선별된 결합 모이어티의 DNA는 칩 혼성화 이전에 PCR 증폭될 수 있다. 이 경우에서, 올리고뉴클레오티드 고안은 하기와 비슷할 것이다(도 7 참조).
또 다른 가능한 해독화 방법이 도 7에서 예시된다. 서브-라이브러리 A 및 B는 다양한 라이브러리 멤버를 코드화하는 독특한 서열에 의해 그리고 터미날에서의 일정한 DNA 분절에 의해 측면화된 헤테로이중체를 형성한다. 바이오패닝 후, 프라이머의 적합한 짝은 두 스트랜드의 PCR 증폭을 가능하게 하고, 표준 방법을 사용하여 동정화될 수 있는 서열인 PCR 산물을 제공한다(예를 들어, PCR 산물의 연쇄화 후 서브클로닝 및 서열화). 도 6 에서 예시된 칩-기저 방법과 유사하게, 도 7의 방법은, 일반적으로, 특이적 결합 멤버에서 코드 A 및 코드 B의 짝지움에 관한 직접적인 정보를 제공하지는 않을 것이다. 하지만, (도 6에서 개시된 것과 비교하여), (한 번 이상의 패닝 라운드 후 서열화 및 다음의 ESACHEL 스크리닝을 위한 서브-라이브러리 구성성분의 제한된 세트의 선택으로 이루어지는) 탈나선 공정이 적용되어 자가-조립 후 주어진 특이적 결합제의 후보물질 ESACHEL 멤버의 수를 제한할 수 있다.
라이브러리 구축:
ESACHEL 라이브러리 구축은 서브-라이브러리의 자가-조립에 의해 이루어질 수 있는 큰 규모에서뿐만 아니라, DNA 올리고뉴클레오티드의 화학 유도체의 용이한 생성 및 정제화에 의해서도 촉진된다.
상기와 같이, 3' 또는 5'말단에 티올기를 내재하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 다양한 상업적인 공급자로부터 구입될 수 있다. 요오드아세트아미도 모이어티 또는 말레이미도 모이어티와 같은 반응성 기를 내재하는 시약에 의한 티올기의 변형의 화학적 반응은 잘 확립되어 있다[예를 들어, www.probes.com에서의 molecular Probes 카탈로그 참조]. 더구나, 여러 방법이 예를 들어, 고체상 합성 과정 중에서, 학문적으로 DNA 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 극단의 화학적인 변형에 이용가능하다.
DNA(또는 일부 DNA 유사체)의 화학 유도체는 중성 pH에서 고도로 음으로 하전되는 특성을 가진다. 이것은 DNA 유도체의 일반적인 정제화 전략의 개발을 촉진한다. 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피는 수지에서 DNA 올리고뉴클레오티드(및 그 유도체)의 비-공유결합적인(그러나 안정한) 고정화를 가능하게 하는 반면에, 반응 혼합물의 다른 구성성분은 세척될 수 있다. 그 다음, DNA 유도체는 완충용액 교환으로 용출될 수 있다. 대체가능하게는, 다른 정제화 방법(예를 들어, 역상 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 (hydroxyapatite) 크로마토그래피 등)이 고려될 수 있다.
DNA 유도체에 대하여 일반적으로 응용가능한 정제화 공정의 유용성은 ESACHEL 구성성분의 합성을 무인조종화되도록 한다[예를 들어, 액체 처리 시스템 및 무인조종 조작 팔을 장치한, TECAN Genesys 200-기초한 워크스테이션을 사용(TECAN, Mannedorf, Switzerland)]. 무인조종화는 몇 백개의 다른 화합물을 함유하는 ESACHEL 서브-라이브러리를 창조하는데 필수적이다.
본 명세서에 기재된 방법론은 작은 유기분자뿐만 아니라, 펩티드 및 올리고머성 단백질에 대하여도 작용한다[예를 들어, VH 및 VL 도메인을 구성하는 항체 Fv 단편; 실시예 1 참조]. 실제로, 시스테인-테그된 VH 및 VL 도메인의 C-터미날에서 DNA 헤테로이중체의 부착은 Fv 이종이량체에 추가의 안정화를 제공할 것이다.
바이오패닝 실험:
특이적 결합제의 동정을 위한 ESACHEL의 이용은 표적 분자(예를 들어, 관심의 약제학적인 단백질)와 함께 ESACHEL 구성성분을 배양한 다음, 표적 분자와 결합하지 않은 ESACHEL 구성성분으로부터 생성된 복합체를 물리적으로 분리하는 것에 의존한다. 이 관점에서, ESACHEL 바이오패닝 실험은 파아지 라이브러리 및/또는 리보솜 디스플레이 라이브러리로 수행될 수 있는 바이오패닝 실험과 유사하고, 이것에 대해 광범위한 문헌과 여러 실험적인 프로토콜(protocol)을 이용할 수 있다[Winter, 1994;; viti, 2000; Schaffitzel, 1999]. 예를 들어, 비-결합된 ESACHEL 멤버의 풀로부터, ESACHEL 멤버 및 표적 분자 사이의 복합체의 물리적인 분리는 고체 지지체(예를 들어, 프라스틱 관, 수지, 자기 비드 등)의 표적 분자의 고정화에 의해 이루어질 수 있다.
킬레이트 효과:
특이적 결합제의 동정화를 위한 ESACHEL 기술의 기여 중 일부는, "킬레이트 효과"로 명명된 화학공정과 관련된다. 킬레이트라는 용어는 1920년에 "가재 또는 다른 갑각류의 큰 집게 또는 집게발(집게발-그리스어)로부터 유래된 형용사적 킬레이트를, 두개의 결합 유니트로서 작용하고 헤테로시클릭 고리를 생산하기 위하여 중심 원자에 고정된 집게-형 기에 대해 제안한다":고 주장한 Sir Gilbert T. Morgan 및 H.D.K. Drew[J. Chem. Soc., 1920, 117, 1456]에 의해 처음 적용되었다.
킬레이트 효과는 킬레이트화 리간드 및 금속이온의 반응을, 비교가능한 단일돌기형 리간드를 포함하는 상응하는 반응과 비교하여 관찰할 수 있다. 예를 들어, 피리딘과 2,2'-바이피리딘 또는 암모니아와 1,2-디아미노에탄(에틸렌디아민)의 결합이 비교된다. 이러한 형태의 비교는 항상 킬레이트 리간드와 배위(coordination)로부터 생성된 복합체가 열역학적으로 더욱 더 안정하다는 것을 보여준다는 것은 수년 동안 알려져 왔다.
본 발명자들은 다중자리(multidentate; 예를 들어, 이중자리 리간드)와 비교하여, 단일자리 리간드의 해리 단계를 고려하였다. 단일자리 기가 교체되는 경우, 이것은 벌크용액으로 손실된다. 한편, 이중자리 기의 한 끝이 제거된다면, 다른 팔은 아직 부착되어 있고, 이것은 오직 팔이 주위를 회전하는 문제이며 다시 재부착될 수 있다(도 8). 일반적으로, 이중자리 기와의 복합체의 형성은 상응하는 단일자리 기와의 복합체에 비해 선호된다.
킬레이트 효과는 다중자리 금속 리간드의 경우에서 뿐 아니라, 거대분자와의 결합 상호작용을 포함하여, 많은 다른 화학적인 상황에서도 높은-친화도 결합에 기여할 수 있다는 것을 보여주고 있다(예를 들어, 다중자리 DNA 결합, 킬레이트화 재조합 항체)[Neri D, Momo M. Prospero T, Winter G. High-affinity antigen binding by chelating recombinant antibodies(CRAbs). J Mol Biol. (1995) 246:367-73].
어떤 ESACHEL 구현예를 조사할 때, 예를 들어, 두 개의 화학적 모이어티가 DNA 헤테로이중체 형성에 의해 올리고머화되는 경우에, 표적와 함께 특이적 결합 상호작용에 포함되는 두 화학적 엔티티를 다리연결하는 DNA 헤테로이중체의 안정성과 관련하여 킬레이트 효과를 예시하는 것이 유용하다. 대부분의 경우에, ESACHEL 바이오패닝을 위해 선택된 실험 조건에서 사실상 해리되지 않는 헤테로이중체(또는 삼중체 또는 사중체)를 갖는 것이 유용하다. 짧은 DNA 헤테로이중체 단편(8bp)와의 협력적인 결합의 에너지론에서의 유용한 정보 및 검토는 Distefano and Dervan, 1993에서 발견될 수 있다[Distefano MD, Dervan PB. Energetics of cooperative binding of oligonucleotides with discrete dimerization domains to DNA by triple helix formation Proc Natl Acad Sci USA. (1993) 90: 1179-1183.].
ESACHEL 바이오패닝 이후의 과정에 대한 고찰:
특정 결합 멤버가 동정화되면, ESACHEL 실험 이후 어떤 일이 발생하는가? 특정 목적(예를 들어, 특정 생화학 실험)을 위해, ESACHEL 멤버를 추가의 화학적인 변화 없이 사용하는 것이 고려될 수 있다. 예를 들어, 표적 분자에 대한 ESACHEL 멤버의 결합에 관한 결합 친화도 및 속도상수를 측정하고자 할 수 있다.
하지만, 많은 적용의 경우에, ESACHEL 자가-조립된 분자를 유사체로 변환시킬 수 있고, 여기서 결합을 가져오는 화학적 엔티티들은 공유결합적으로 연결될 수 있다. 링커의 길이, 견고성(rigidity), 입체전자공학적 화학적 특성 및 용해성은 생성된 분자의 결합 친화도 및 수행능력에 영향을 줄 것이다[Shuker SB, Hajduk PJ, Meadows RP, Fesik SW. Discovering High-Affinity Ligands For Proteins - Sar by Nmr. Science (1996) 274:1531-1534](실시예 4 참조).
도 1: ESACHEL 기술의 간단한 구현예:
ESACHEL 기술의 간단한 구현예에서, 2개의 화학적 라이브러리는 부분적인 헤테로이중체를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 각각 3'말단 및 5'말단의 개개의 화학적인 변형에 의해 합성되고, 이것은 독특한 "서열 태그"(그들의 극단에 부착된 화학적 모이어티 p 및 q와 결합된[그러므로 "코드화된"])를 운반한다. 생성된 암호화된 자가-조립된 화학적 라이브러리(ESACHEL)는 (2개 작은 라이브러리의 조합적인 자가-조립으로부터 기원함에 따라) 매우 클 수 있고, 생물학적인 표적(예를 들어, 관심의 약학적인 단백질)에의 결합을 스크리닝할 수 있다. 적합한 결합 특이성을 나타내는 라이브러리의 이들 멤버들은 (예를 들어, 고체 지지체에 고정된 표적을 사용하여) 관심있는 표적으로 포획될 수 있다. 그 다음, 관심있는 결합 특이성의 원인이 되는 화학적 엔티티를 암호화하는 그들의 유전적 코드는 "발명의 설명"(하기 참조) 부분에서 개시하는, 여러 정교한 방법을 사용하여 회수될 수 있다.
도 2: ESACHEL 도안의 일반화:
ESACHEL 기술의 주요 성분은 화학적 엔티티에 연결된 올리머화 도메인[화학적 화합물의 (동종- 또는 이종-)이량체화, 삼량체화 또는 사량체화를 중재할 수 있는]에 연결된 올리고뉴클레오티드 모이어티(전형적으로, DNA 서열)을 포함하는 화학적 화합물이고, 표적 분자와 특이적 결합 상호작용에 포함될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 모이어티의 서열의 일부는 화학적 엔티티와 독특하게 결합될 것이다(그러므로 "코드"로 작용하는). 올리고머화 도메인 및 코드는 동일한 분자(전형적으로 올리고뉴클레오티드) 중의 구별된 구역일 수 있다.
도 3: 큰 사이즈의 조합 라이브러리를 생산할 수 있는 개별적인 ESACHEL 화학적 화합물의 자가-조립:
ESACHEL 기술의 실용적인 구현예에서, 티올-반응성 모이어티(예를 들어, 말레이미도 또는 요오드아세트아미도기)를 지니는 다른 화학적 화합물의 수, n은 3'말단에 티올기를 지니는 n개의 다른 DNA 올리고뉴클레오티드와 (독립된 반응에서) 반응된다. n개의 콘주게이트(conjugate)의 상응하는 풀은 "풀 A"로서 도에서 나타낸다. 유사하게, 티올-반응성 모이어티(예를 들어, 말레이미도 또는 요오드아세트아미도기)를 지니는, 다른 화학적 엔티티의 수, m은 5'말단에서 티올기를 지니는 m개의 다른 DNA 올리고뉴클레오티드와(독립된 반응에서) 반응된다. m개의 콘주게이트(conjugate)의 상응하는 풀은 "풀 B"로서 도에서 나타낸다. 생성된 자가-조립 라이브러리 멤버는 m×n 조합에 상응할 것이다.
도 4: 삼량체화 도메인 또는 사량체화 도메인이 삼중체(triplexes) 또는 사중체(quadruplexes) 형성 DNA 서열인, ESACHEL 구현예에 의해 이루어질 수 있는 큰 라이브러리 사이즈:
특정 DNA 서열은 안정한 삼량체성 복합체 또는 안정한 사량체성 복합체를 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, DNA 삼중체의 후그스텐(Hoogsten) 쌍은 각각, n, m 및 l를 함유하는 풀 A×B×C의 자가-조립을 가능하게 한다. DNA-(화학적 모이어티) 콘주게이트의 사량체성 어셈블리는 작은 규모(dimension)의 서브-라이브러리 A, B, C 및 D로부터 개시하여, 더욱 큰 라이브러리 사이즈를 가능하게 할 것이다.
도 5: ESACHEL 해독화의 하나의 방법:
서브-라이브러리 A의 올리고뉴클레오티드는 3'말단에서 화학적 엔티티를 함유한다. 3' 극단을 향하여, DNA 서열은 서브-라이브러리 B의 올리고뉴클레오티드의 5'극단에서 DNA 서열로 혼성화하도록 디자인된다. 혼성화(hybridization) 영역은 작은 분절(segment)에 의해 차단된다. 서브-라이브러리 A에서, 이 작은 분절은 염기가 없이 포스포디에스테르 골격(도에서 d-스페이서라고 명명)을 공유결합으로 구성한다; 서브-라이브러리 B에서, 상응하는 짧은 분절은 서브-라이브러리의 각 멤버에 대하여 유일한(그러므로, 서브-라이브러리 B를 위한 "코드"로서 작용하는) 서열을 가질 것이다. 대조적으로, 서브-라이브러리 A의 올리고뉴클레오티드는 5'극단 쪽으로 그들의 독특한 코드를 가진다.
바이오패닝 후, 서브-라이브러리 B의 올리고뉴클레오티드는 서브-라이브러리 A의 올리고뉴클레오티드에 안정하게 어닐링(annealing)된 채로 남고, 주형 A에서 DNA 폴리머라제 반응을 위한 프라이머로서 작용할 수 있다. 코드 A 및 코드 B 모두를 지니는, 생성된 DNA 분절은 DNA 분절의 규칙적으로 되풀이되는(constant) 극단에서 혼성화되는 프라이머를 사용하여 (통상의 PCR에 의해) 증폭될 수 있다.
도 6: ESACHEL 해독화의 일반적인 방법:
부분적으로 어닐링하는 올리고뉴클레오티드의 극단에서 화학적 모이어티를 지니는 서브-라이브러리 A 및 B로부터 단리된 특이적 결합제의 동정화는 하나 이상의 칩에서 고정화된 표적 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 의해 확립된다. 바람직하게는, 이러한 칩은 부착된 올리고뉴클레오티드 단편(fragment)과 실리콘 웨이퍼(wafer)로부터 만들어진다. 예를 들어, 칩은 바이오패닝실험 후 얻어진, 서브-라이브러리 A의 멤버의 동정화(및 빈도(frequency))의 해석을 가능하게 할 것이다. 유사하게, 칩 B는 서브-라이브러리 B의 멤버의 동정화(및 빈도)의 해석을 가능하게 할 것이다. 첫 번째 단계에서, 도에서 묘사된 해독화 방법은 특이적 결합 멤버안에서 코드 A 및 코드 B의 짝지움(pairing)에 관한 정보를 제공하지 않을 것이다. 하지만, 칩 A 및 B에서의 해독화는 서브-라이브러리 A 및 B의 후보물질들이 바이오패닝의 연속적인 과정에서 재-어닐링되고 선별되도록 한다. 표적에 대한 스트린전트(stringent) 결합의 증가는 칩에서 동정화된 A 및 B 멤버의 수의 감소로 반영될 것이다. 최종적으로, 후보물질 A 및 B 멤버의 가능한 조합은 개별적으로(또는 더 작은 풀에서) 어셈블리될 것이고, 표적에의 결합에 대하여 평가될 것이다.
도 7: ESACHEL 디콘볼루션(deconvolution)에 대한 PCR-기저 방법:
헤테로이중체로부터의 서브-라이브러리 A 및 B는 다른 라이브러리 멤버에 대하여 코드하는 유일한 서열에 의해 그리고 터미날에서 일정한 DNA 분절에 의해 측면화(flanking)된다. 바이오패닝 후, 프라이머의 적절한 짝은 2개의 스트랜드의 PCR 증폭을 가능하게 하여, 서열이 표준 방법(예를 들어, PCR 산물의 농축 후 서브클로닝 및 서열화)을 사용하여 동정화될 수 있는 PCR 산물을 산출한다. 자가-조립 후 특이적 결합제를 제공할 수 있는 후보물질 ESACHEL 멤버의 수를 제한하여, (하나 이상의 패닝 후 서열화 그리고 이어서 다음 ESACHEL 스크리닝을 위한 서브-라이브러리 구성성분의 제한된 세트의 선택으로 이루어진) 디콘볼루션 공정이 적용될 수 있다.
도 8: ESACHEL 리간드의 공유결합으로 연결된 화학적 모이어티로의 전환:
많은 ESACHEL 구현예에서, 자가-조립 올리고뉴클레오티드의 화학 유도체는 하나 이상의 패닝 과정의 마지막에 단리될 것이다. 여러 적용을 위해, 관심의 표적 분자와의 상호작용의 원인이 되는, 화학적 모이어티와 함께 공유결합으로 연결되는 것이 바람직할 것이다. 링커의 길이, 견고성, 입체전자공학적 화학적 특성 및 용해성은 생성된 분자의 결합 친화도 및 수행능력에 영향을 줄 것이다.
도 9: 킬레이트 효과에 기여하는 화학적 평형:
다이아그램은 표적 분자에 결합하는 2개 자리가 있는 리간드(A-B) 사이의 상호작용의 가능한 상태를 보여준다. nI 상태에서는, A 및 B 모이어티 모두가 그들의 개별적인 결합 포켓(pocket)에 결합된다. nⅡ 및 nⅢ 상태에서는, 모이어티 A 또는 모이어티 B만이 개별적으로 결합된다. nⅣ 상태에서는, 화합물 A-B은 표적로부터 분리된다.
컴퓨터 프로그램은 그들의 개별적인 결합 포켓에 대한 모이어티 A 및 B의 운동학적인 결합 및 해리 상수의, 그리고 A 및 B 사이의 링커 길이의 기능으로서, 비가역적인 분열 조건에서 표적상에서 A-B의 잔류 시간에 킬레이트 효과의 기여의 근접한 평가를 위해 만들어지고 있다. 한 모이어티가 시간 단위당 용해되는 확률은 포프(poff)로 나타낸다. 하나의 모이어티가 시간 단위당 표적에 결합하는 확률은 폰(pon)으로 나타낸다.
도 10: 분자 레퍼토리 Q와 분자 p의 어셈블리:
다이아그램은 낮은-친화도 결합체 p에 결합된 올리고뉴클레오티드 및, 표적 분자(예를 들어 단백질 표적)에 결합을 위해 p와 시너지효과를 갖는 분자 q를 동정할 수 있는 모이어티 q 및 독특한 코드를 포함하는, 올리고뉴클레오티드의 두번째 부류(class) 사이의 헤테로이중체 형성을 나타낸다.
실시예 1:
상기와 같이, ESACHEL 법의 장점중 하나는 펩티드 및 구형 단백질(예를 들어, 항체 도메인)을 포함하여, 다양한 다른 화학적 모이어티들과의 상용성이다.
이 실시예에서, 본 발명자들은 부분적인 헤테로이중체 형성이 가능한 DNA 올리고뉴클레오티드에 공유결합으로 연결된 시스테인-태그된 항체 가변 도메인에 특징이 있는 ESACHEL의 간단한 구현예(도 1)가 어떻게 이종이량체화 후 특이적 항원 결합을 제공하는 한 쌍의 가변 중(heavy) 도메인(VH) 및 가변 경(light) 도메인(VL)을 동정하는지를 보여준다.
HyHEL-10 항체(달걀 리소자임[Neri, 1995]에 특이적; 내부 EcoRI 부위는 단백질 서열의 변경없이 이미 돌연변이되어 있음에 주목)의 L19 항체(피브로넥틴의 ED-B 도메인에 특이적[Pini A, Viti F, Santucci A, Carnemolla B, Zardi L, Neri P, Neri D. Design and use of a phage display library. Human antibodies with sub-nanomer affinity against a marker of angiogenesis eluted from a two-dimensional gel. J Biol Chem. (1998) 273: 21769-21776]) 및 ETH-2 라이브러리(Viti, 2000)로부터 단리된 다른 항체들의 VH 및 VL 도메인의 유전자는, 각각의 V 도메인의 C-터미날 극단에 부착된 시스테인 잔기에 대해 코드하는 하기의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭된다:
Figure 112004040567033-pct00001
Figure 112004040567033-pct00002
생성된 PCR 산물은 표준 분자생물학적인 공정을 사용하여 플라스미드 pQE12의 EcoRI/HindⅢ 부위로 서브클로닝된다(Qiagen, Germany). 생성된 플라즈미드는 V 도메인에 대해 암호화하고, 이것은 그들의 C-터미날에 하기 서열을 운반한다: -Gly-Gly-Cys-His-His-His-His-His-His.
시스테인-태그된 V-도메인을 암호화하는 플라스미드는 E.coli 세포(바람직하게는, 약하게 산화된 세포질 환원 포텐셜을 갖는 Novagen의 Origami 균주에)로 전기영동되고, 발현되고, NiNTA 수지에서 금속 킬레이트 크로마토그래피를 사용하여(Qiagen, Germany) 정제된다.
시스테인-태그된 V 도메인은 PBS(50mM 인산염 완충용액 + 100mM NaCl, pH=7.4)에서 1mM 디티오트레이톨 용액으로 환원된 후, PD-10 컬럼(Amersham-Pharmacia, Dubendorf, Switzerland)에서 탈염화된다.
동시에, 3'말단에 또는 5'말단에 티올기를 지니는 다른 올리고뉴클레오티드는 상업적인 공급자(예를 들어, Microsynth, Balgach, Switzerland)로부터 공급된다. 3'말단에 티올기를 갖는 개개의 DNA 올리고뉴클레오티드는 개개의 VH 도메인에 커플링하는데 사용된다. 5'말단에 티올기를 갖는 개개의 DNA 올리고뉴클레오티드는 개별적인 VL 도메인에 커플링하는데 사용된다.
대표적인 서열 유형은 하기에 예시된다. 이들 류(family)의 올리고뉴클레오티드는 부분적 헤테로이중체 형성이 가능함을 주목하라:
Figure 112004040567033-pct00003
Figure 112004040567033-pct00004
유사한 반응에서, 정제된 티올-함유 DNA 올리고뉴클레오티드는 제조사 지침에 따라, PBS+DMSO에서 몰-초과의 비스말레이미도-헥산(Pierce, Belgium)과 반응한다. 생성된 유도체는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 비반응된 비스말레이미도-헥산으로부터 정제된 다음, >0.1㎎/㎖의 도메인 농도에서, 각각, 몰-초과의 정제된 VH-cys 또는 VL-cys와 반응된다. 생성된 (V-도메인)-DNA 반응 생성물은 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 반응되지 않는 V-도메인으로부터 분리된다.
(V 도메인)-DNA 유도체의 등몰 혼합물은 PBS에서 혼합되고, 1분 동안 70℃로 가열된 다음, 상온에 도달할 때까지 평형을 유지한다. 그리고 나서, 생성된 ESACHEL 화합물 혼합물은 상온에서 10분 동안 PBS에서 비오틴-ED-B의 0.1μM 용액에서 배양하고, 그 다음, 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드 상에 포착되고 표준 공정에 따라서 광범위하게 세척된다.
생성된 비드 제조는 두 개의 분리된 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용되고, (L19_5SH, HyHel10_5SH, GST_5SH) 및 (L19_3SH, HyHel10_3SH, GST_3SH) 올리고뉴클레오티드를 증폭하고(하기 참조), 사용된 올리고는 하기와 같다:
Figure 112004040567033-pct00005
생성된 PCR 산물을 EcoR1으로 소화시키고, 연쇄체를 형성하도록 결찰하고, 적절한 숙주 플라스미드로 서브클로닝한 후, E.coli에서 전기영동시키고 서열화한다. 생성된 서열 분석은 다른 가능한 어셈블리 생성물보다 VH(H19)-VL(L19)의 우선적인 풍부를 의미하는, HyHEL-10 및 GST 코드 보다 L19 코드(CAT AAT 및 ATA TAT)에 대한 강한 성향을 나타내었다.
실시예 2:
이 실시예에서, 본 발명자들은 도 1의 ESACHEL 구현예가 실제적 실행에서 어떻게 수행되는가를 기재한다. 여기서 약술된 실험 전략은 또한 도 4에 기재된 구현예에 적용할 수 있고, 여기서 DNA 삼중체 또는 DNA 사중체가 자가-조립 올리고뉴클레오티드의 극단에 화학적 엔티티를 나타내는데 사용되었다.
두개의 서브-라이브러리가 다음과 같이 구성되었다:
서브-라이브러리 "A"는 n개의 다른 DNA 올리고뉴클레오티드의 3'말단에 n개의 화학적 엔티티를 커플링하여 만들어진다. 많은 다양한 가능한 실행 중에서, 알맞는 것은 개개의 DNA 올리고뉴클레오티드에 n개의 화학적 엔티티의 요오드아세트이미도- 또는 말레이미도-유도체의 커플링으로 나타내지고, 이것은 3'말단에 티올기를 운반한다. 커플링은 몰-초과의 요오드아세트아미도- 또는 말레이미도-유도체(전형적인 농도의 범위: 50-500μM)와 티올-내재 올리고뉴클레오티드(전형적인 농도 범위: 10-100μM)의 단순 혼합에 의해 실온에서 PBS(50mM 인산염 완충용액 + 100mM NaCl, pH=7.4)중에서 쉽게 수행될 수 있고, 그 후 DNA-화학적 엔티티 부가물(adduct)을 크로마토그래피로 정제한다. 티올-함유 올리고뉴클레오티드는 상업적인 공급자로부터 구입가능하다. 그들 각각은 서브-라이브러리 B의 멤버와 헤테로이중체를 형성할 수 있는 일정 서열 구역(예를 들어, 5'-XXXXXCAGCACACAG AATTCAGAAGCTCC-3')을 함유한다(하기 참조). 5'말단에서 DNA 서열 구역 XXXXX은 서브-라이브러리 A의 각 멤버에서 (적어도 부분적으로) 다르고, 그러므로 코드로서 작용한다.
서브-라이브러리 "B"는, 유사하게, m개의 다른 DNA 올리고뉴클레오티드의 3'말단에 m개의 화합물을 커플링하여 만들어진다. 5'말단에 티올기를 지니는 개별적인 DNA 올리고뉴클레오티드에 m개의 화학적 엔티티의 요오드아세트이미도- 또는 말레이미도-유도체를 커플링하는 것은 서브-라이브러리 "A"에 대해 개시된 것과 유사하게 수행된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 상업적인 공급자로부터 구입가능하다. 그들 각각은 서브-라이브러리 A의 멤버와 헤테로이중체를 형성할 수 있는 일정 서열 구역(예를 들어, 5'-GGAGCTTCTGAATTCTGTGTGCTGYYYYY-3')을 함유한다(상기 참조). 5'말단에서 DNA 서열 구역 YYYYY은 서브-라이브러리 B의 각 멤버에서 (적어도 부분적으로) 다르고, 그러므로 코드로서 작용한다.
서브-라이브러리 B 멤버와 서브-라이브러리 A 멤버의 어셈블리는 PBS에서 서브-라이브러리들의 혼합하고, 1분 동안 70℃에서 혼합물을 가열하고(서브-라이브러리 구축에서 사용된 화학적 엔티티의 안정성이 적절하다면), 그 후 실온에서 평형화에 의해 이루어진다. 생성된 ESACHEL 라이브러리는 n×m 멤버를 함유하고, 바이오패닝 실험 및, 그 후 결합 멤버의 해독화에 사용될 수 있다.
실시예 3:
본 실시예는 도 1 및 실시예 2에서 개시된 바와 같이, ESACHEL 구현예에 대해, 여러 가능한 해독화 방법 중 하나를 설명한다.
도 5에서 개략적으로 나타낸 해독화 전략은, 원하는 ESACHEL 결합 특이성의바이오패닝 후, PCR 단편이 생성되고, 각각은 서브-라이브러리 멤버의 쌍의 코드를 운반하고, 이것의 조합물이 바이오패닝 실험에서 얻어지고, 그러므로 상응하는 이종이량체화된 화학적 엔티티의 동정을 가능하게 한다는 원리에 기초한다.
서브-라이브러리 A 및 B의 화학적 엔티티(도 1 및 실시예 2 참조)는 하기 특성을 갖는 DNA 올리고뉴클레오티드의 2개의 풀의 멤버에, 개별적으로 결합된다:
- 올리고뉴클레오티드의 하나의 풀은 3'-말단(풀 A)에서 화학적 엔티티를 지니는 반면에, 다른 풀은 5'-말단(풀 B)에서 화학적 엔티티를 운반한다.
- 풀 B의 올리고뉴클레오티드의 5'극단에서 충분한 수치의 염기는 풀 A의 개개의 멤버과 풀 B의 개개의 멤버의 특이적 이량체화를 허용한다. 이량체화 도메인의 내부에, 풀 B로부터의 올리고뉴클레오티드는 "코드" 영역을 함유하고, 이것은 5'-말단에서 화학적 엔티티에 대하여 코드한다. 풀 A의 올리고뉴클레오티드는 코드 B의 염기에 대한 원하지 않는 짝지움을 차단하기 위해, 충분한 수의 염기(d-스페이서)없는 데옥시리보스(deoxyribose) 골격 성분을 함유한다.
- 서브-라이브러리 A의 올리고뉴클레오티드는 5'극단 쪽으로 그들의 독특한 코드를 가진다.
서브-라이브러리 B의 올리고뉴클레오티드는 서브-라이브러리 B의 올리고뉴클레오티드에 안정하게 어닐링하게 된 채로 남게 되고, 주형 A에서 DNA 폴리머라제 반응에 대한 프라이머로서 작용할 수 있다. 코드 A 및 코드 B 모두를 지니는, 생성된 DNA 분절은 DNA 분절의 일정 극단에서 혼성화되는 프라이머를 사용하여, (통상적으로 PCR에 의해) 증폭될 수 있다(도 5).
코드 A 및 B 모두를 지니는 PCR 산물의 생성에 사용될 수 있는 모형 올리고뉴클레오티드 A 및 B의 예가 다음과 같이 제공된다:
Figure 112004040567033-pct00006
typeA_oligo 및 typeB_oligo를 대략 등몰의 양으로 혼합하였다. 생성된 혼합물을 70℃까지 가열하고, 실온으로 냉각시켜, typeA_oligo 및 typeB_oligo의 이종이량체를 생성하였다. 생성된 혼합물을 PCR 반응에 적절한 완충용액, dNTPs(뉴클레오티드 당 250μM, Pharmacia)와 혼합하였다. 그 다음, Taq-Polymerase(1U, Appligen)를 첨가하고, 5분동안 40℃에서 혼합물을 배양하였다. 다음에, 프라이머 CodeABfo 및 CodeABba의 첨가(400μM)후, (90℃/1분)-(50℃/1분)-(72℃/15초)의 30 순환으로 이루어진 PCR 프로그램을 개시하였다. 프로그램을 완료한 후, PCR 단편의 길이를 상업적인 Novex 젤을 사용하여, 표준 폴리아크릴아미드 젤 방법론으로 확인하였다. 이와 같은 서열 동정화는 EcoRI로 생성물을 소화시키고, 그 후 적절한 플라스미드로 클로닝하고 서열화하여 이룰 수 있다.
실시예 4:
NMR에 의해 SAR를 사용하여 동정화된 킬레이트화 재조합 항체(CRAbs)[Neri, 1995] 및 작은 유기 리간드와 마찬가지로(Shuker, 1996), 표적 분자에 대한 ESACHEL 멤버의 고-친화성 결합은 킬레이트 효과에 의존할 것이다.
친화도 증가에 대한 킬레이트 효과의 기여는 표적 항원과의 접촉에서, 2개(또는 그이상)의 화학적 엔티티 사이의 연결의 길이, 견고성, 입체전자공학적인 화학적 특성 및 안정성에 의존할 것이다. 더구나, 친화도 증가는 표적에 결합하는 개개의 화학적 엔티티의 결합 및 해리율 상수(kon 및 koff)의 크기에 직접적으로 의존한다.
본 실시예에서, 본 발명자들은 상기 매개변수(링커 길이, kon 및 koff)와 관련하여, 킬레이트 효과의 기여에 관한 정보를 제공하는 컴퓨터 모델을 나타낸다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 2개의 다른 화학적 엔티티 A 및 B는 동일한 표적 분자의 독특한 결합 부위에 결합하고, 한정된 길이의 링커에 의해 연결된다. 화학적 결합 평형에 관하여 상호변환할 수 있는 네가지 상태(nI, nⅡ, nⅢ 및 nⅣ)를 정의하는 것이 편리하다:
nI: A 및 B 모두가 그들의 결합 포켓에 결합.
nⅡ: A는 그것의 결합 포켓에 결합하고, 반면 B는 그것의 결합 포켓에 결합하지 않음.
nⅢ: A는 그것의 결합 포켓에 결합하지 않고, 반면 B는 자신의 결합 포켓에 결합.
nⅣ: A 및 B 모두 그들의 결합 포켓에 결합하지 않음.
상응하는 결합 포켓에 대한 개별적인 화학적 엔티티 A 및 B의 결합 특성을 묘사하는 운동역학적 매개변수 konA, koffA, konB 및 koffB가 알려져 있다. 이들 상수로부터, 정해진 시간 증가에서, 결합된 분자가 결합 포켓을 벗어날 가능성(off), 및 비결합된 분자가 자신의 결합 포켓에 결합될 가능성(pon)을 측정할 수 있다.
Figure 112004040567033-pct00007
1차 반응속도론에서, 결합의 반감기는 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure 112004040567033-pct00008
t=0에서 분자 B가 상응하는 결합 포켓에 결합하지 않는다면(그리고 첫 번째 근사 해리과정을 무시한다면), 시간 증가, Δt 후 결합된 분자의 비율은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112004040567033-pct00009
충분히 큰 분자의 앙상블을 선택한다면, 식 [3]은 분자 B가 시간 증가, Δt 에서 자신의 포켓에 결합하는 가능성에 가까워질 수 있다.
지금까지 쓰인 공식은 화학적 엔티티 A 및 B에 상응하는 것이고, 이들은 서로 독립적으로 상응하는 포켓에 결합한다. 하지만 본 발명자들은 A 및 B는 링커에 의해 연결되고, 모이어티 A는 그것의 표적에 결합한다고 가정하였다. 효율적인 농도, 자신의 표적 결합 포켓 부근의 B의 농도를 ec로 표현하는 것이 편리하다.
Figure 112004040567033-pct00010
본 발명의 모형에서, 표적에 대한 A-B 이중자리 분자의 결합 특성에 대한 킬레이트 효과의 기여는 다른 하나가 그것의 결합 포켓에 결합될 때에 두 개의 결합 모이어티 중 하나의 효율적인 농도 증가에 기인한다(도 9). 단순한 모형에서, 본 발명자들은 결합 분자 A가 결합할 경우에 분자 B는 분자 A의 주위의 반구형 공간의 모든 위치에서 동등한 가능성으로 위치하게 되고, 그것으로 인하여 반경 "rad"(미터법으로 측정된)는 링커의 길이와 동일하다. 단순모형은 링커, 반발 효과 등의 입체적인 제약은 무시한다. 동일한 가정이 분자 B는 결합되고 분자 A는 비결합되는 경우에 사용된다. 결과로서, 몰 유효농도 ec는 하기와 같이 계산될 수 있다:
Figure 112004040567033-pct00011
이들 가정에 기초하여, 본 발명자들은 동일한 표적 분자의 두 개의 구별되는 결합 포켓에 결합하는 두 개의 개별적인 모이어티 A 및 B가 길이 rad의 링커와 연결되는 이중자리 결합 분자 A-B의 잔류 반감기에 대한 킬레이트 효과의 기여를 평가하는 컴퓨터 프로그램을 고안하였다. A 및 B가 두 개의 다른 표적 분자에 결합하는 가능성은 무시된다.
n개의 A-B 분자의 개체군에서, 도 9의 4가지 상태는 개별적인 분자에 의해 정주될 수 있고, 개개의 분자의 상태는 관찰할 때마다 다른 것으로 밝혀진다. 본 발명의 모형에서, 본 발명자들은 시간증가분 Δt 안에서 그들의 상태를 변화시키는 개개의 분자 A 및 B의 확률(probability) pon 및 poff을 측정하였다.
실제적인 예로서, 본 발명자들은 시간 t=0에서 모든 분자 A-B는 상태 nI (A 및 B 모두 결합된다)에 있다고 간주한다. 매 시간증가분 Δt에서(프로그램에서는 1초), 그들의 결합 상태를 변화시키는 모이어티 A 및 B의 확률은 4가지의 다른 상태에서 분자 A-B의 새로운 분포를 발생시킨다. 상기 모의실험에서, 비가역적인 해리조건이 사용된다(즉, 상태 nⅣ에서의 해리된 분자 A-B는 표적에 다시 결합하지 않는다). 프로그램은 표적에 결합된 분자 A-B의 개체군(nI, nⅡ 및 nⅢ의 합)이 출발 개체군의 절반으로 떨어질 때까지, 시간 증가에 따라, 이들의 계산을 반복하였다. 시간증가분의 합은 그것의 표적에 결합된 분자 A-B의 반감기의 평가를 제공한다.
분자의 실시예의 초기 배치 또는 매개변수 koffA, koffB, konA, konB 및 rad 중 하나를 변화시킴에 따라, 복합체의 속도 안정화 면에서, 다양하게 연결된 화학적 엔티티의 킬레이트 효과에 대한 기여를 측정할 수 있다.
상응하는 CHELATE 프로그램(PASCAL로 쓰여진)의 코드는 하기와 같다:
Figure 112004040567033-pct00012
Figure 112004040567033-pct00013
Figure 112004040567033-pct00014
Figure 112004040567033-pct00015
실시예 5:
많은 경우에서, 표적 분자(예를 들어, 약제학적인 표적)에 대한, 존재하는 링커의 친화도를 향상시키는 것이 바람직하다. 이 목적을 위해, ESACHEL 기술이 하기와 같이 사용될 수 있다, 즉 최적화되어질 링커로부터 "코드" 올리고뉴클레오티드를 생략. 본 발명자들은 화학적 모이어티 p가 불충분한 친화도로 표적 분자(예를 들어, 단백질)에 결합한다고 가정하였다. 다른 올리고뉴클레오티드 유도체와 자가-조립할 수 있는, 적절한 올리고뉴클레오티드의 하나의 극단(예를 들어, 5' 말단)에 (통상적으로, 도 10에서 묘사한 바와 같이 헤테로이중체 형성에 의해) p를 연결하는 것이 편리할 것이다.
예를 들어, 화학적 모이어티 p는 올리고뉴클레오티드 5'-5'-GGA GCT TCT GAA TTC TGT GTG CTG-3'의 5' 말단에 결합될 것이다. 그 다음, 일반 서열 5'-XX.....XX-Y-CAG CAC ACA GAA TCC AGA AGC TCC-3'의 올리고뉴클레오티드의 3'말단에서 많은 별개의 화학적 모이어티 q를 개별적인 반응에서, 화학적으로 결합하는 것이 편리하고, 반면:
- XX.....XX 구역은 다른 화합물에서 다를 것이다;
- Y는 비오틴화된 염기 유사체를 나타낸다;
- 서열 5'-CAG CAC ACA GAA TTC AGA AGC TCC -3'은 모든 경우에 동일할 것이고, 분자 q의 실시예의 모든 멤버에 대하여, 화학적으로 p에 결합된 서열 5'-GGA GCT TCT GAA TTC TGT GTG CTG-3'과 헤테로이중체 결합을 이룰 것이다.
생성된 라이브러리는, 각각 독특한 올리고뉴클레오티드를 내재하는, 분자 q와 p의 짝일 것이다. 자가-조립된 라이브러리는 적절히 엄격한 조건 하에서 바이오패닝될 수 있다. 바이오패닝 공정의 마지막에 얻어진 결합제는 그들의 코드에 의해 동정화될 것이다. 예를 들어, p와 함께 표적 분자에 대하여 높은 친화도를 갖는 결합제를 가져오는 분자 q의 코드는 올리고뉴클레오티드 칩에 혼성화됨으로써 판독될 수 있고, 여기서 다양한 위치들이 올리고뉴클레오티드로 덮혀지고, 이것은 서브-라이브러리 Q의 멤버의 서열 XX.....XX에 상보적이다. 서브-라이브러리 Q의 멤버에서 비오틴 모이어티는 칩 상의 결합을 검출할 수 있게 한다.
그 다음, 화학적 모이어티 q 후보는 p에 화학적으로 연결될 것이고, 생성된 콘쥬게이트는 관심의 표적 분자에 특이적인 결합제로서 사용될 것이다.

Claims (32)

  1. 둘 이상의 화학적 화합물의 조합 반응 생성물을 포함하는 화학적 화합물의 라이브러리로서, 상기 화학적 화합물 각각은:
    a) 단일 표적 분자와 잠재적으로 결합 상호작용할 수 있는 화학적 모이어티(p,q);
    b) 올리고뉴클레오티드(b,b'), 이의 일부가 자가-조립 모이어티(m,m')임;
    를 포함하고, 화학적 화합물이 이들의 올리고뉴클레오티드(b,b')의 자가-조립 모이어티(m,m')에 의하여 서로에 결합되는 것이고, 상기 조합 반응 생성물은 상기 표적 분자의 부재 시 안정하고, 화학적 화합물 각각의 올리고뉴클레오티드(b,b')가 특이적 화학적 모이어티(p,q)의 동정을 위하여 개별적으로 코드화되는 다양한, 독특한 코딩 서열(b2,b2')을 포함하는 것을 특징으로 하는 화학적 화합물의 라이브러리.
  2. 제 1항에 있어서, 둘 이상의 화학적 화합물 각각이 안정한 조합 반응 생성물을 형성한 다음 함께 공유결합으로 연결되는 화학적 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학적 화합물의 라이브러리.
  3. 제 1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드(b,b')가 화학적 모이어티(p,q)와 공유결합으로 그리고 직접적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 화학적 화합물의 라이브러리.
  4. 제 1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드(b,b')가 자가-조립 서열(b1,b1')과 화학적 모이어티(p,q) 사이에 위치하는 연결 부분(b3,b3')을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화학적 화합물의 라이브러리.
  5. 제 1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드(b,b')의 코딩 서열(b2,b2')은 화학적 모이어티(p,q)와 자가-조립 서열(b1,b1') 사이에 위치되는 것을 특징으로 하는 화학적 화합물의 라이브러리.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조합 반응 생성물이 이량체, 삼량체, 또는 사량체이고, 모이어티들의 개별적 조합이 올리고뉴클레오티드(b,b')의 자가-조립 서열(b1,b1')의 헤테로이중체, 헤테로삼중체, 또는 헤테로사중체를 형성하여 유도되는 것을 특징으로 하는 화학적 화합물의 라이브러리.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 라이브러리는 개별적으로 암호화되는 서브-라이브러리 (A)와 (B)를 포함하고, 여기서 서브-라이브러리(A)는 n개의 다른 DNA 올리고뉴클레오티드(b)의 3' 극단에 커플링된 n개의 화합물들을 포함하고, 그리고 서브-라이브러리(B)는 m개의 다른 DNA 올리고뉴클레오티드(b')의 5' 극단에 커플링된 m개의 화합물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 화학적 화합물의 라이브러리.
  8. 제 7항에 있어서, 서브-라이브러리(A) 또는 서브-라이브러리(B) 각각에서, n 또는 m개의 화학적 엔티티의 요오드아세트아미도-유도체 또는 말레이미도-유도체들은 3' 또는 5' 말단에 티올기를 운반하는 개별 DNA 올리고뉴클레오티드에 커플링되어 있는 것을 특징으로 하는 화학적 화합물의 라이브러리.
  9. 제 7항에 있어서, 서브-라이브러리(A) 또는 서브-라이브러리(B) 각각에서, 식 -O-P(O)2-O-(CH2)n-NH-CO-R (여기서 R은 많은 다른 화학적 엔티티에 대응될 수 있고, n은 1 내지 10의 범위일 수 있다)와 같은 화학 구조를 형성하는, 아미드 유도체가 하나의 극단에 포스포디에스테르 결합을 운반하는 올리고뉴클레오티드에 커플링되어 있는 것을 특징으로 하는 화학적 화합물의 라이브러리.
  10. 제 7항에 있어서, 서브-라이브러리(A)에서, 자가-조립 서열(b1)은 코드(B)에 대해 반대 위치에 있는 d-스페이서에 의해 차단되고, 상기 d-스페이서는 서브-라이브러리(B)를 암호화하는 코드(B)의 염기들과의 원하지 않는 짝지움을 막고, 그리고 서브-라이브러리(A)의 올리고뉴클레오티드(b)는 5' 극단 쪽으로 그것의 독특한 코드(A)를 갖는 것을 특징으로 하는 화학적 화합물의 라이브러리.
  11. 표적 분자에 특이적인 리간드를 바이오패닝하는 방법으로서, 조합 반응 생성물을 표적 분자와 배양시키고, 상기 조합 반응 생성물은 둘 이상의 화학적 화합물로 이루어지고, 이들 화학적 화합물 각각은:
    a) 단일 표적 분자와 잠재적으로 결합 상호작용할 수 있는 화학적 모이어티(p,q);
    b) 올리고뉴클레오티드(b,b'), 이의 일부가 자가-조립 모이어티(m,m')임;
    를 포함하고, 화학적 화합물이 이들의 올리고뉴클레오티드(b,b')의 자가-조립 모이어티(m,m')에 의하여 서로에 결합되는 것이고, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조립 반응 생성물의 화학적 라이브러리가 바이오패닝에 사용되는 것을 특징으로 하는 바이오패닝 방법.
  12. 표적 분자와 결합 상호작용할 수 있는 화학적 모이어티(p,q)를 포함하고, 추가로 올리고뉴클레오티드(b,b')를 포함하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화학적 화합물의 라이브러리의 조합반응 생성물로 표적 분자를 동정하는 방법으로서, 상기 조합 반응 생성물이 제11항에 따른 바이오패닝에 의하여 표적에 결합되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 폴리머라제 사슬 반응(PCR)-단편이 PCR에 의하여 생성되고, 이들 각각이 서브-라이브러리 멤버 (A)와 (B) 쌍의 코드를 운반하고, 서브-라이브러리(A)가 n개의 다른 DNA 올리고뉴클레오티드(b)의 3' 극단에 커플링된 n개의 화합물들을 포함하고, 그리고 서브-라이브러리(B)는 m개의 다른 DNA 올리고뉴클레오티드(b')의 5' 극단에 커플링된 m개의 화합물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 서브-라이브러리(A) 또는 서브-라이브러리(B) 각각에서, n 또는 m개의 화학적 엔티티의 요오드아세트아미도-유도체 또는 말레이미도-유도체들은 3' 또는 5' 말단에 티올기를 운반하는 개별 DNA 올리고뉴클레오티드에 커플링되어 있는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 서브-라이브러리(A)에서, 자가-조립 서열(b1)은 코드(B)에 대해 반대 위치에 있는 d-스페이서에 의해 차단되고, 상기 d-스페이서는 서브-라이브러리(B)를 암호화하는 코드(B)의 염기들과의 원하지 않는 짝지움을 막고, 그리고 서브-라이브러리(A)의 올리고뉴클레오티드(b)는 5' 극단 쪽으로 그것의 독특한 코드(A)를 갖는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
  16. 제 12항에 있어서, PCR-단편들의 길이가 체크되고 이들의 서열 동일성이 EcoRI와 같은 특이적 엔도펩티다제를 위한 제한부위를 갖는 PCR-단편들을 소화하고, 그 다음 적절한 플라즈미드로 클로닝하고 서열화하여 확인되는 동정 방법.
  17. 제 12항에 있어서, 몇개의 특이적 결합 멤버들이 바이오패닝 실험의 끝에 분리되고, 반응 혼합물에 존재하는 다양한 PCR-단편에서 시작하는, 연쇄체가 생성되고, 서열화에 의하여 연쇄화된 서열이 "판독"되어, 코드(A)와 코드(B) 쌍의 동일성 및 빈도를 나타내는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
  18. 제 12항에 있어서, 여러 특이적 결합 멤버들이 바이오패닝 실험의 끝에 분리되고, 그리고 서브-라이브러리(A) 및/또는 (B)가 부분적-어닐링 올리고뉴클레오티드의 극단에 화학적 모이어티를 운반하고, 짝지어지지 않은 DNA 사슬이 하나 이상의 칩 상에 고정된 DNA 올리고뉴클레오티드와 같은 표적 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 칩(A) 또는 칩(B) 각각을 사용하여, 바이오패닝 실험 후 구제된, 서브-라이브러리(A) 또는 서브-라이브러리(B)의 멤버 각각의 동일성 및/또는 빈도 판독이 실시되고, 그리고 칩(A) 및 (B) 상에 해독화에 의하여, 바이오패닝의 연속적인 라운드에서 재-어닐링되어 선별될 서브-라이브러리 (A) 및 (B)의 후보 성분들이 제안되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 표적에 더욱 더 스트린전트한 결합이 각 칩 상에서 동정된 바와 같은 (A) 및/또는 (B) 멤버의 수의 감소로 반영되고, 후보 (A) 및 (B) 멤버의 가능한 조합이 개별적으로, 또는 더 작은 풀에서 조립되고 표적으로의 결합을 위하여 분석되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 해독화를 위하여 독특한 표적 올리고뉴클레오티드를 운반하는 세개 또는 네개의 칩을 사용하여 각각 삼량체성 또는 사량체성 복합체를 형성하기 위하여 화학적 화합물의 라이브러리가 자가-조립되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
  22. 제 18항에 있어서, 선택된 결합 모이어티의 DNA가 칩 혼성화 이전 PCR 증폭되는 것을 특징으로 하는 동정 방법.
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